UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA
“ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA
in vitro
DEL EXTRACTO
HIDROALCOHOLICO DE HOJAS DE
Chenopodium ambrosioides
(Paico)
POR EL MÉTODO DE MACRODILUCIÓN EN CALDO FRENTE A
Staphylococcus aureus
y
Escherichia coli,
IQUITOS – 2015”
TESIS
Para optar el título profesional de: QUÍMICO FARMACÉUTICO
Bach. SANCHEZ ASPAJO, SERGIO ENRIQUE Bach. CURITIMA AHUANARI, EDSON
ASESOR:
Q.F HENRY VLADIMIR DELGADO WONG
“ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA in vitro DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE HOJAS DE Chenopodium ambrosioides (PAICO), POR EL METODO DE MACRODILUCION EN CALDO FRENTE A Staphylococcus aureus y Escherichia coli,
IQUITOS 2015”
Bachiller. Sergio Enrique Sánchez Aspajo Bachiller. Edson Curitima Ahuanari
RESUMEN.
El propósito del presente estudio fue determinar la actividad antibacteriana in vitro del extracto hidroalcoholico de hojas de Chenopodium ambrosioides (paico), por el Método de Macrodilución. La muestra fue recolectada en la comunidad Nina-Rumi, provincia de Maynas, distrito de San Juan, departamento de Loreto, Perú. Y se identificó taxonómicamente en el Herbarium Amazonense de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP) y fue depositada para su conservación en el laboratorio de Fitoquímica de la Facultad de Farmacia y Bioquímica. La determinación se realizó en la Facultad de Farmacia y Bioquímica – UNAP. Para el estudio de la actividad antibacteriana in vitro del extracto hidroalcoholico mediante el Método de Macrodilución, se utilizó cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922. Los resultados de la concentración mínima inhibitoria del extracto hidroalcoholico de hojas de Chenopodium ambrosioides fue 8 Mg/ml para Escherichia coli y 4 Mg/ml Staphylococcus aureus, considerándose como inactivo y poco activo con respecto a estas bacterias.
“In vitro ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF THE HYDROALCOHOLIC EXTRACT OF LEAVES OF Chenopodium ambrosioides (PAICO), BY THE METHOD OF MACRODILUCION IN BROTH COMPARED TO Staphylococcus aureus and
Escherichia coli, IQUITOS 2015.”
Bachiller. Sergio Enrique Sánchez Aspajo Bachiller. Edson Curitima Ahuanari
ABSTRACT
The purpose of this study was to determine the in vitro antibacterial activity of the hydroalcoholic extract of leaves of Chenopodium ambrosioides (paico), by the method of Macrodilución. The sample was collected in the Community Nina-Rumi, Maynas province, district of San Juan in Loreto department, Peru. And taxonomically identified in the Herbarium Amazonense of the National University of the Peruvian Amazon (AP) and was deposited for their conservation in the phytochemical laboratory of the Faculty of Pharmacy and Biochemistry. The determination was made in the Faculty of Pharmacy and Biochemistry - AP. For the study of in vitro antibacterial activity of the hydroalcoholic extract by the method of Macrodilución, was used strains of Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Escherichia coli ATCC 25922. The results of the minimum inhibitory concentration of the hydroalcoholic extract of leaves of Chenopodium ambrosioides was 8 mg/ml for Escherichia coli and 4 mg/ml Staphylococcus aureus, considering as inactive and little active with regard to these bacteria.
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a DIOS, porque está conmigo en cada paso que doy,
guiándome por el buen camino, dándome fortaleza, sabiduría y humildad
para continuar. A mis padres FELIPE y SARA, porque son quienes a lo largo
de mi vida trabajaron muy duro para darme lo mejor y hacer de mí un
hombre de bien, y porque han depositado en todo momento su entera
confianza en cada reto que se me presentaba sin dudar ni un solo momento
de mi inteligencia y capacidad. A mis hermanos MARLON GABRIEL Y DIANA
BEATRIZ porque son parte de mi motivo e inspiración de seguir siempre
adelante. A mis sobrinitos KENNY DÁNIEL, STEPHANO GABRIEL Y MIKAYLA
ABIGAIL que siempre serán como mis angelitos de la guarda. A mis abuelitos
VICTOR MANUEL, MERCEDEZ y SALVADOR que desde del cielo me cuidan y
me iluminan todos los días.
DEDICATORIA
“A PAPA DIOS SOBRE TODAS LAS COSAS”
Dedico este trabajo a mis padres OLGA Y GUILLERMO, por brindarme esa
paciencia y cariño en toda situación de mi vida cotidiana, a mis hermanos
GUILLERMO Y PEDRO, para que sigan firmes y perseverantes en la obtención
de su sus sueños y éxitos profesionales a mi abuelita VICTORIA que dios le dé
muchos años más de vida.
AGRADECIMIENTO
Brindamos nuestro más sincero agradecimiento antes que nada a DIOS y a todas aquellas personas que de una u otra forma estuvieron compartiendo con nosotros, tanto en el ámbito profesional como en el personal, conocimientos, consejos, apoyo, experiencias, anécdotas e intercambios de opinión.
A todas esas personas con las que hemos compartido el día a día, así como también aquellas personas más queridas con las que no hemos podido compartir tan de cerca tantos meses cargados de esfuerzo y vivencias, porque están lejos o bien porque ya no están: A todos ellos muchas gracias. La elaboración y culminación de este presente trabajo de investigación no habría sido posible sin la ayuda de las siguientes personas:
Al QF. HENRY BLADIMIR DELGADO WON Asesor del proyecto de Tesis, por haber dedicado una importante parte de su tiempo en compartir sus conocimientos, y sobre todo aconsejándonos en cada paso que se dio, durante el desarrollo de la investigación.
A la Facultad de Farmacia y Bioquímica por formar profesionales con un alto nivel académico y competitivo.
De igual manera agradecer a nuestros Jurados de Tesis por la visión crítica de muchos aspectos científicos, por su rectitud en su profesión como docentes, por sus consejos que ayudan a formarnos como personas e investigadores. Nuestro trabajo ha tenido el apoyo de muchas personas cuyos consejos y apoyo fueron decisivos a lo largo de estos meses y con todas ellas estamos en deuda. A nuestros amigos, por la ayuda desinteresada ofrecida en la realización de este trabajo de investigación; gracias por sus amistad y compañerismo.
INDICE DE CONTENIDOS
2.2 CARACTERISTICAS DE LAS CEPAS EN ESTUDIO. 24
2.2.1Staphylococcus aureus. 24
2.5DEFINICIONES OPERACIONALES. 29
2.6HIPOTESIS. 29
CAPITULO III. 32
3.1 METODO Y DISEÑO DE INVESTIGACION. 33
3.1.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACION. 33
3.2FLUJOGRAMA DE INVESTIGACION 34
3.3POBLACION Y MUESTRA. 35
3.3.1POBLACION VEGETAL 35
3.3.2MUESTRA VEGETAL 35
3.3.3CRITERIOS DE INCLUSION 35
3.3.4CRITERIOS DE EXCLUSION 35
3.4 POBLACION MICROBIOLOGICA. 35
3.4.1MUESTRA BIOLOGICA 35
3.4.2CRITERIOS DE INCLUSION 36
3.4.3CRITERIOS DE EXCLUSION 36
3.5INSTRUMENTOS Y MATERIALES. 36
3.5.1INSTRUMENTOS 36
3.5.2MATERIALES 36
3.5.3MATERIALES BIOLOGICOS 36
3.5.4MATERIALES GENERAL DE LABORATORIOS 36
3.5.4.1MATERIALES DE VIDRIO 36
3.5.4.2MATERIALES DE METAL. 37
3.5.4.4.2REACTIVOS 38
3.5.4.4.3EQUIPOS 38
3.6 PROCEDIMIENTOS PARA LA RECOLECCION DE DATOS. 39 3.6.1PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCION DEL EXTRACTO VEGETAL 39
3.6.1.1RECOLECCION DE LA MUESTRA VEGETAL 39
3.6.1.2IDENTIFICACION DE LA MUESTRA VEGETAL 39
3.6.1.3MOLIENDA DE LA MUESTRA VEGETAL 39
3.6.1.4OBTENCION DEL EXTRACTO HIDROALCOHOLICO. 39 3.7 PROCEDIMIENTO DE LOS ENSAYOS DE LA ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA. 40
3.7.1RECUPERACION DE CULTIVOS CONGELADOS 40
3.7.2REACTIVACION DE LAS BACTERIAS. 41
3.7.3CULTIVO EN AGAR 41
3.7.4INOCULACION 41
3.7.4.1 PREPARACION DEL INOCULO 41
3.8DETERMINACION CIM POR EL METODO DE DILUCION EN CALDO
(MACRODILUCION). 42
3.8.1PREPARACION Y ALMACENAMIENTO DE LAS DILUCIONES 42
3.8.2INCUBACION 45
3.9LECTURA DE LOS RESULTADOS 45
3.9.1ANALISIS DE DATOS 46
3.9.2TECNICAS DE ANALISIS E INTERPRETACION DE LA INFORMACION. 46
CAPITULO IV 47
4.1RESULTADOS 48
4.4RECOMENDACIONES 56
4.5BIBLIOGRAFIA 57
1.1INTRODUCCION.
En los últimos años se ha vuelto a las plantas en busca de nuevos principios activos, ya que desde el comienzo de la medicina fueron ellas las que proveyeron las estructuras bases para numerosos medicamentos, sean investigadas con el fin de determinar su eficacia y evaluar su potencial como fuente de nuevas drogas, ya que es de suma importancia descubrir nuevos compuestos que sean más eficaces, y de menor toxicidad.1
Las diversas enfermedades ocasionadas por agentes patógenos e inadecuados comportamientos en los distinto estilos de vida del hombre moderno, está creando una necesidad de buscar nuevas alternativas de tratamiento, con una tendencia de volver a las costumbres ancestrales del uso de plantas para la cura de sus enfermedades, debido a las múltiples ventajas que aporta en el aspecto medicinal como económico.2
La penicilina fue el primer antibiótico descubierto en 19283; sin embargo, ya para 1940, el descubrimiento real de la resistencia bacteriana se dio a conocer en Escherichia coli que inactivaba soluciones de penicilina. Es aquí donde nacen las llamadas penicilinasas4, 5 al terminar la década de los 50 como mínimo el 85 % de las cepas de Staphylococcus aureus eran ya resistentes a la penicilina. 6
Sin embargo, las bacterias han desarrollado diversos mecanismos de resistencia dentro de los cuales uno de los más eficaces es la síntesis de enzimas, tales como las betalactamasas denominadas así por atacar el anillo beta-lactámico que forma parte de la sustancia activa de dichos antibióticos, entre los átomos de C y N para formar compuestos inactivo.6, 7
La resistencia a los antibacterianos ha constituido un problema mundial de salud pública en los últimos 50 años, ya que no se presta debida atención a las betalactamasas8. La
Nuestra región cuenta con una diversidad de recursos naturales, destacando grandes variedades de especies de plantas medicinales; es por ello, la necesidad de búsqueda de nuevas alternativas como la utilización de extractos de plantas que sean efectivos e inocuos para tratar diferentes infecciones ocasionadas por agentes patógenos. La etnobotánica constituye una herramienta muy útil para dirigir estudios de actividad con base a la medicina tradicional.10
Cotrimoxazol es activo frente a más del 95% de cepas de Staphylococcus aureus, actualmente prevalentes en nuestro medio, incluyendo las cepas resistentes a meticilina, tanto de origen nosocomial, como comunitario. La CIM de trimetoprim es ≤0,5 mg/L. La tasa de resistencia puede ser algo más alta en aislados procedentes de pacientes con SIDA, que reciben cotrimoxazol para profilaxis de la infección por P. jirovecii.11, 12
Staphylococcus aureus, la más virulenta de las muy diversas especies de Staphylococcus, ha demostrado su versatilidad al seguir siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad a pesar de contarse con innumerables antibióticos antiestafilocócicos eficaces para combatirlo; origina la enfermedad por mecanismos tanto mediados como no mediados por toxinas. Este microorganismo origina infecciones nosocomiales y de origen comunitario que varían desde procesos relativamente menores de la piel y partes blandas hasta trastornos generalizados que pueden ser mortales.13
Escherichia coli incluye gérmenes generalmente móviles, que producen ácido y gas a partir de la glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros azúcares. Otros antígenos presentes en distintas cepas han sido empleados para su clasificación o identificación. Escherichia coli coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas horas de vida del niño, y establece con el huésped una relación estable de mutuo beneficio.16
Chenopodium ambrosioides (Paico) es una planta que figura como medicamento vegetal alternativo por su alto contenido de (Ascaridol) es considerado un digestivo poderoso, que posee otras propiedades como antihelmíntica, relajante muscular, depresora cardiaca y diurética.17
1.2OBJETIVOS 1.2.1General.
Determinar el efecto antibacteriano in vitro del extracto hidroalcoholico obtenido de hojas de Chenopodium ambrosioides (Paico), por el método de Macrodilución en caldo frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
1.2.2 Específicos
Obtener el extracto hidroalcoholico de Hojas de Chenopodium ambrosioides.
Evaluar y Determinar la Concentración Inhibitoria Mínima (CMI) del extracto Hidroalcoholico obtenido de la hoja de Chenopodium ambrosioides (Paico), por el método de Macrodilución en caldo frente a Staphylococcus aureus.
Evaluar y determinar la Concentración Inhibitoria Mínima (CMI) del extracto Hidroalcoholico obtenido de la hoja de Chenopodium ambrosioides (Paico), por el método de Macrodilución en caldo frente a Escherichia coli.
2.1MARCO TEORICO. 2.1.1.ecedentes.
La etnomedicina es el estudio de las medicinas tradicionales de los pueblos18. El alivio y
curación de muchas enfermedades desde siempre dependió del uso apropiado de plantas medicinales y también, se requirió de la ayuda del shaman o brujo, el hombre superior que conocía el mundo de espíritus, y que en sus rituales incluía plantas con alto poder de sanación.
Debido a esto, se debe reconocer que la medicina parte de las plantas medicinales, cuyos principios activos han sido el arranque para el desarrollo de medicamentos, muy importantes en la mejora de la calidad de vida de las personas. 19
Las plantas para tratar infecciones por virus, y bacterias son las más comunes 63%, entre ellas se cuentan las más utilizadas para curar abscesos con pus, gonorrea, herpes, sarampión, neumonía y otras enfermedades infectocontagiosas.
Las plantas medicinales, conformadas por sus partes o extractos, son las que se utilizan como drogas y medicamentos para el tratamiento de alguna afección que padece un individuo o animal y que también son precursoras para la síntesis químico – farmacéuticas19. En cuanto a la medicina en el Perú, que las más de 17000 especies de plantas vasculares que existen son el resultado de una historia de adaptación a medios diversos, de coevo lución con otros organismos y de la dinámica de la superficie terrestre. Esta gran diversidad de plantas, proviene de especies propias de los Andes tropicales, de zonas tropicales y sub tropicales de América, Asia, Malasia y África, así como de zonas templadas de América de los hemisferios boreal y austral, incluso regiones frías de la antártica.20
De esta especie se aislaron varios aceites esenciales, identificándose el ascaridol, que mostró acción antifúngica y antimicrobiana 23. La dosis letal del ascaridol en el ratón es de 0.075 mg/k.
El aceite del Chenopodium ambrosioides puede presentar efectos tóxicos por acumulación, aunque pequeñas dosis sean utilizadas en días independientes. 24,25
Las observaciones realizadas por Ayala Flores 26, entre los Achual, Bora, Candoshi-Shapra, Huitoto, Ocaina, Yaguay Shipibo de la Amazonía peruana, demostró el uso común de Chenopodium ambrosioides contra Ascaris lumbricoides y Oxyurus vermicularis. Los quichuas, Siona y Kofándel Ecuador toman una decocción hecha de toda la planta como antihelmíntico; además lo utilizan como purgante, por lo que toman nueve días seguidos el jugo de las plantas aplastadas 27.
Dentro de la composición química y las propiedades farmacológicas del “paico”, la droga que se extrae de las hojas, frutos y tallos tiene un olor aromático agradable y contiene 1.5% de aceite de quenopodio y 64.5% de ascaridol 28.
El ascaridol es el principal responsable del aroma del «paico», así como también de sus propiedades parasiticidas y de sus efectos tóxicos. La variada presencia de disacáridos (pectina), glucósidos (saponinas, flavonoides), taninos, ácidos orgánicos, aceites esenciales, lípidos y vitaminas confieren a la planta total un carácter químico diferente al que tiene exclusivamente el ascaridol, considerado tóxico en dosis inadecuadas, aquí radica la diferencia entre el uso de la planta entera y de sus derivados específicos 24, 25.
Levadura. Dicho efecto es ligeramente menor al producido por 400 mg de ácido acetil salicílico.29
DESTA, (1993): Evaluó el extracto acuoso de la hoja seca, el cual ha demostrado actividad in vitro contra patógenos humanos como Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris y Staphylococcus albus mientras otras partes aéreas han demostrado actividad in vitro sobre Plasmodium falciparum. Se ha registrado una fuerte actividad antifúngica in vitro contra Trichophyton mentagrophytes, Absidia ramosa y Microsporum gypseum.30, 31
ROJAS J. SOLIS H, PALACIOS O, (2010): Determinaron la actividad anti Trypanosoma cruzi in vitro de los aceites esenciales de 10 plantas medicinales, entre ellas: Mentha X piperita L (Menta), Rosmarinus officinalis L (Romero), Chenopodium ambrosioides L (Paico), Eucaliptus globulus Labill (Eucalipto), Artemisia absinthium L (Ajenjo), Melissa officinalis L (Toronjil), Minthostachys setosa Brig (Muña), Cymbopogon citratus (Hierba Luisa), Aloysia triphylla (Cedrón) y Mentha spicata L (Hierba Buena). Los aceites esenciales de Cymbopogon citratus (Hierba Luisa) y Aloysia triphylla (Cedrón) inhibieron significativamente el crecimiento de la forma epimastigote de Trypanosoma cruzi, concluyendo que los aceites esenciales de Cymbopogon citratus y Aloysia triphylla mostraron actividad anti-Trypanosoma cruzi in vitro. 32
2.1.2Efecto Insecticida.
SANABRIA R., RAMÍREZ S (2009): Evaluaron el efecto de insecticida y repelente del polvo de Paico (Chenopodium ambrosioides), en cuatro concentraciones (1 al 4%), sobre adultos de Calloso brucús maculatus F. en semillas de poroto pytaí (Vigna unguiculata).
Se tuvo un testigo absoluto constituido por las semillas y los insectos adultos, donde se evaluaron las mismas variables y los resultados fueron comparados con los demás tratamientos. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: semillas tratadas con 2% y 4% del polvo (Chenopodium ambrosioides), presentaron una mortalidad del 78.85% de insectos adultos a los 5 días, seguidas por las tratadas con 3% y 1%, con 74% y 65%, de mortalidad de insectos adultos respectivamente. El polvo de Chenopodium ambrosioides, no repele a Calloso bruchus maculatus en ninguna de las dosis utilizadas.35
2.1.3Efecto Gastrointestinales.
ÁLVAREZ C, RODRÍGUEZ P, CARVAJAL E. (2011). Determinaron que la etnomedicina de algunas regiones de Latinoamérica, el paico (Chenopodium ambrosioides) ha sido empleado en infusión de hojas y flores como carminativo y digestivo, pero principalmente como antihelmíntico. Por lo tanto, el presente estudio se realizó con el fin de evaluar el efecto antiparasitario del extracto de esta planta en gallos de pelea (Gallus domesticus) en un criadero de la ciudad de Tunja-Boyacá, ya que los propietarios de estas aves lo utilizan de manera artesanal como desparasitante natural. Para el trabajo se utilizaron 45 ejemplares, organizados en 3 grupos a los cuales, cada 15 días y durante un mes, se les administró, por vía oral, 0,1 ml/ Kg de extracto de paico (grupo T2), 0.5ml/Kg de un medicamento comercial a base de Levamisol-Ivermectina (grupo T3) y 0.5ml/ave de agua (grupo T1 control). Se recolectaron muestras de materia fecal con el objeto de determinar la presencia de huevos y/o larvas de parásitos, utilizando la técnica de Formol- Éter. Durante el estudio fueron identificados diferentes especies de ascaridia spp, heterakis gallinarum, eimeria sp, huevos y larvas de trichostrongylus. Posterior a la administración del tratamiento con extracto de paico se encontraron huevos de ascaridia galli, heterakis gallinarum, eimeria sp, y al suministrar la última dosis sólo se identificaron huevos de
2.1.4.fecto Antiparasitario
ESTRADA G, CASTAÑO D, RAMIREZ K, (2012): Evaluaron la efectividad del paico (Chenopodium ambrosioides) como antihelmíntico, en especímenes silvestres mantenidos en cautiverio en el hogar de paso de la Universidad de la Amazonía. El producto se suministró por vía oral, en dos dosis iguales con intervalo de ocho días. Debido a su baja palatabilidad, su administración fue ofrecida a través de licuado o extracto de la planta, mezclado con la primera ración de alimento del día. A partir de un análisis estadístico descriptivo de los resultados se encontró que el paico presenta una efectividad del 100% para el control de helmintos en especímenes silvestres mantenidos en cautiverio. 37
2.1.5.fecto Antiespasmódico.
2.1.6 Clasificación taxonómica.
Sinonimia: Paicco, Payco, Paiku, Paiko, Camatai, Cashiva, Cashua, Amasamas, Amush, Amash, Anserina, Hierba de Santa María, Mastruco, Mastruz, Mentruz, Pozote.20
2.1.7. Descripción Botánica.
Es una hierba anual y perenne, erguida o ascendente, fuertemente olorosa, de 40 cm a 1 m de alto, De tallo simple o ramificado. Hojas pecioladas, oblongas y lanceoladas, de 3 a 10 cm de largo por 1 a 5 cm de ancho, gradualmente reducidas hacia la parte superior, subenteras o sinuado – dentadas. Inflorescencia en forma de espigas con numerosas flores, dispuestas en panícula piramidal, con o sin hojas interpuestas. Tiene un periano de 1 mm de largo, glanduloso. Semilla horizontal o vertical, negra brillante y lisa de 0.7 mm de diámetro, margen obtuso.
2.1.8Distribución Geográfica.
Originaria de América, el Paico es una planta medicinal y aromática usada desde tiempos prehispánicos por los indígenas americanos. Posee múltiples propiedades y es beneficiosa para un sinnúmero de enfermedades naturalizada en regiones cálidas y templadas del Viejo Mundo.20
2.1.9Componentes Químicos.
La planta entera es rica en aceite esencial 20, el mayor contenido de este aceite se encuentran en las semillas, se ha determinado la presencia de: ascaridol que es el causante del efecto antiparasitario de esta planta, p – cimeno,(-)- limoneno, (+)- alcanfor, isoascaridol, aritasona, safrole, N – docosano, N- hentriacontano, N – heptacosano, N- octacosano, pineno, methadieno, metilsalicilato, dimeltilsulfoxido, mirceno, geraniol, ácidos butíricos, tartárico, ferulico, vainillico, salicilato de metilo y de terpinilo. Además se reportan en diferentes partes los siguientes compuestos: ambrosido, betaina, chenopodiosidos A y B.34
2.1.10Usos Tradicional.
La planta se usa en la casa como repelente de insectos, también se coloca en el brazo como perfume. El zumo de la planta machacada se bebe para tratar afecciones de la bilis, al igual que se usa como laxante, el jugo se usa como antiespasmódico, estimulante cardiaco y para estimular las secreciones de la piel y de los riñones. 40
2.2 CARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS EN ESTUDIO.
Nombre Binomial : Staphylococcus aureus46
Características Morfológicas
Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva esférica (cocos) con un diámetro de 1 a 1,3 micras. Cuando se ve al microscopio aparece en racimos aunque también se evidencia en cadenas cortas. Es inmóvil y no forma esporas. El microorganismo puede crecer tanto con y sin oxígeno (anaerobios facultativos). Sus principales reservorios se encuentran en los seres humanos y los animales. 42
La acción patógena deriva de su propia característica estructural (capsula o capa mucosa, proteína A) que le permite la producción de una isoenzima y toxina especifica (catalasa, hemolisina, coagulasa, estafilocinasa, hialuronidasa lipasa) y le da la capacidad de multiplicarse en todos los sitios del cuerpo causando daño celular localizado en el sitio de infección. 43
La infección endógena se debe a la entrada del microorganismos desde la piel, a través de
Nombre Binomial : Escherichia coli41
Características Morfológicas
Escherichia coli, es un bacilo entérico gram negativo no esporulado móvil por flagelación peritrica, aerobio facultativo, oxidasa negativo, con requerimientos nutritivos muy sencillos, fermentadores de azucares que puede crecer como azucares, aminoácidos, ácidos orgánicos. 44
Como integrante de la flora normal del hombre y de muchos animales, se lo considera un germen indicador de contaminación fecal cuando está presente en el ambiente, agua y alimentos, junto con otros similares agrupados bajo la denominación de bacterias coliformes. 45
Se clasifican en más de 170 serogrupos49, adaptados a diferentes ambientes, incluso dentro del huésped llegando a ser un patógeno mortal, es por ello que su diagnóstico oportuno y su combate con el uso apropiado de antibióticos resultan de suma importancia para disminuir la incidencia 50.
2.3 MÉTODO DE MACRODILUCIÓN.
Las pruebas de dilución han sido utilizadas durante años. Los procedimientos iniciales serán realizados en tubos de ensayo grandes (13 por 100 mm) con volúmenes de caldo de Müeller Hinton por lo menos 1 ml. Este método fue estandarizado en la década de los años 70 por el Estudio Cooperativo Internacional y luego la NCCLS publicó un estándar del método. Este método es llamado Macrodilución en caldo. A partir de los años 60 se comenzaron a utilizar dispositivos serológicos para dispensar y diluir. Esta miniaturización simple de la técnica se conoció como macrodilución en caldo. 51
Fundamentos: Consiste en exponer a las cepas a estudiar a diferentes concentraciones de antimicrobianos, en diluciones a la mitad y observar el crecimiento de los microorganismos para luego definir la CIM (Concentración mínima inhibitoria). 51
El proceso continúa hasta el penúltimo tubo, al que se le quita1 ml, que se descarta. El último tubo no recibe solución de antibiótico y sirve de control de crecimiento. Las concentraciones finales de antibióticos en esta prueba son iguales a la mitad de la serie inicial de dilución, debido al agregado de una concentración igual de inóculo <en el caldo. Se prepara un inóculo bacteriano que contenga 105 a 106 UFC/ml ajustando la turbidez de un caldo de cultivo al estándar y diluyendo luego a 1:200 en caldo. Añadir a cada tubo 1ml del inóculo ajustado. Incubar los tubos a 35°C entre 16 y 20 horas. 52, 53
2.4 SENSIBILIDAD BACTERIANA A LOS ANTIBIOTICOS.
La determinación de la Concentración Inhibitoria Mínimo (CIM) es la base de la medida de la sensibilidad de una bacteria a un determinado antibiótico. La CIM se define como la menor concentración de un gama de diluciones de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antibiótico frente a diferentes especies bacterianas. Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, de manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o semiautomátizados). Estos diferentes métodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en función de su sensibilidad frente al antibiótico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S) Intermedia (I) o Resistente (R) al antibiótico.
Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS:
Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual.
Resistente, si la probabalidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento.
Ciertas moléculas son representativas de un grupo de antibióticos. Los resultados (S, R, I) obtenidos con estas moléculas pueden ser ampliados a los antibióticos del grupo, que en caso no es necesario ensayar.
Los ensayos realizados por la técnicos microbiológicas de disco difusión en agar Müller-Hinton y Macrodilución en caldo Müller-Hinton, siguiendo las normas del National Committe For Clinical Laboratory Standars (NCCLS),X establecen los controles de los antibióticos probados que fueron los tetraciclina (tet), ceftriaxona(ctx), ciprofloxacina (cip), cefoxitina (fox), ampicilina (amp), trimetropim-sulfametoxasol (stx), cloranfenicol (cm), ácido nalidixico (na), gentamicina (gm), y nitrofunrantoina (fu) (oxoid ltd., basingstoke, hampire, england dando como resultado valores de CIM en ug/ml referenciales de algunos antibióticos según los estándares de controles:
TABLA 1: Valores de referencia de sensibilidad a distintos antibióticos.
2.5 DEFINICIONES OPERACIONALES. 2.5.1Variables Independientes
Extracto Hidroalcoholico obtenido de hojas de Chenopodium ambrosioides (Paico).
2.6 HIPOTESIS
Variable
Independiente
Definición
Conceptual
Definición Operacional Indicador Índices Escala de
Variable
Dependiente
Definición Conceptual Definición Operacional Indicador Índices Escala de
Medición inhibición en el crecimiento
3.1METODO Y DISEÑO DE LA INVESTIGACION.
Se empleó el Diseño experimental, descriptivo, prospectivo y Longitudinal.
Experimental: Porque se evalúa un fenómeno dado introduciendo elementos que pueden modificar el comportamiento de las variables en estudio, los que fueron medidos en determinados momentos.
Descriptivo: Porque el estudio describirá e interpretará en forma clara y detallada los hechos obtenidos en la investigación.
Prospectivo: Porque se desarrolla a través del tiempo.
Longitudinal: Porque permite realizar la recolección sistemática de las variables involucradas en función del tiempo.
3.1.1 Diseño de la investigación
Ensayo in vitro, realizada bajo condiciones fotoquímicas controladas, manteniendo siempre el control de muchos factores entre ellos la esterilización de los materiales utilizados en las diferentes pruebas realizadas como detallan:
Esterilización del laboratorio antes y después de las pruebas realizadas para dar mayor seguridad.
Medios de cultivo con PH adecuado para no tener interferencia en los resultados.
Auto clavado de los medios de cultivo, cloruro de sodio 0.9 % y de los materiales utilizados antes, durante y después de las pruebas realizadas, para no crear falsos positivos.
Conservación de los medios y de las cepas bacterianas en refrigeración óptima.
Siembra del cultivo en condiciones de esterilidad para no crear, interferencias en el trabajo.
La distribución del grupo en estudio fue el siguiente esquema:
Método de Macrodilución en medio líquido (Determinación de la concentración mínima inhibitoria)
Grupo Experimental: Tubo conteniendo el extracto hidroalcohólico de hojas de Chenopodium ambrosioides (Paico) a concentraciones 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32 mg/2ml.
Grupo Control Positivo: Gentamicina 160 mg/2ml.
Grupo Control Negativo: Tubo conteniendo solo de medio de cultivo.
Se determinó por observación directa de la turbidez de los medios de cultivo, la mínima concentración de extracto que inhibió el crecimiento visible de los microorganismos. Esta observación se realiza tomando como referencia el tubo control negativo.
3.2 FLUJOGRAMA DE INVESTIGACION.
3.3 POBLACION Y MUESTRA. 3.3.1 Población Vegetal.
La población estuvo constituida por la especie vegetal de Chenopodium ambrosioides (Paico). Estos se obtuvieron de las plantaciones de la comunidad de Nina Rumi, Distrito de San Juan, Provincia de Maynas, Departamento de Loreto.
3.3.2 Muestra Vegetal.
Hojas de Chenopodium ambrosioides (Paico).
3.3.3 Criterios de Inclusión
La Hoja no presentó bacterias u hongos.
La especie vegetal será identificada en el “Herbarium Amazonense”
3.3.4 Criterios de Exclusión
La Hoja presentara bacterias u hongos.
La especie vegetal será identificada por un profesional botánico. 3.4 POBLACIÓN MICROBIOLOGICA.
La población está conformada por 02 microorganismos tipificados: Staphylococcus aureus, y Escherichia coli los mismos que serán ensayados frente a diferentes concentraciones de cada uno de los extractos vegetales obtenidos. Estará conformado por el número de colonias que se emplearan para el preparación del inoculo bacteriano, que oscilara entre 3 a 5 colonias de tamaño y morfología similar.
3.4.1 Muestra biológica.
Las muestras microbiológicas fueron constituidas por las bacterias:
Staphylococcus aureus ATCC 25923.
3.4.2Criterios de Inclusión
Las bacterias fueron morfológicamente iguales. Solo fueron empleadas bacterias jóvenes.
3.4.3 Criterios de Exclusión
Las bacterias no fueron morfológicamente iguales. Cepas que presentó contaminantes.
Frasco ámbar con tapa rosca
3.5.4.2Material de Metal.
Asa de Kolle para siembra bacteriológica.
Cuchillo mediano.
3.5.4.3Otros Materiales y materiales de seguridad.
Algodón.
Detergentes.
Guantes quirúrgicos.
Hisopos para medios de cultivo.
Mascarillas.
Guantes quirúrgicos descartables N° 7 ½
3.5.4.4Medios de cultivo y soluciones utilizadas.
Cloruro de bario, preparación de estándar 0.5 de Mc.Farland.
Ácido sulfúrico, preparación de estándar 0.5 de Mc.Farland.
Caldo Tripticasa soya.
3.5.4.4.3EQUIPOS.
Autoclave AUTESTER MOD. 437 - P
Balanza analítica (Mettler todelo AG 204 )
Baño Termostatado SELECTA PRECISTERM.
Cámara de flujo laminar (Magmehelic “Forma Cientific Model 13089-799).
Cámara fotográfica profesional SONY DSC – S3000
Centrifuga CHRIST
Potenciómetro – pH meter CORNING PR 15
Cocina eléctrica. (PRACTICA/Modelo: Cocina eléctrica HP1)
Estufa de cultivo a 35 ºC. (Merck / Model: 1235-2).
Incubadora. JSB. MOD-ST 22 QV
Pipeteador automático LABMATE SOFT
Cabina de bioseguridad NUAIRE CLASS II
Mechero de bunsen
Micropipetas de 10, 20, 30 y 40 uL.
Refrigerador de 2-8 ºC (MABE Colombia / Modelo: RML10WHPN50).
3.6 PROCEDIMIENTO PARA LA RECOLECCION DE DATOS. 3.6.1 Procedimiento para recolección del extracto vegetal.
3.6.1.1Recolección de la Muestra vegetal.
Las Hojas de Chenopodium ambrosioides, fueron recolectados de las plantaciones de la comunidad de Nina – Rumi, carretera Zungarococha, San Juan, Iquitos. Tomándose en cuenta los criterios de inclusión y exclusión.
3.6.1.2Identificación de la muestra vegetal.
La identificación de la muestra vegetal se realizó en el “Herbarium Amazonense”. 3.6.1.3Molienda de la muestra vegetal.
Una vez identificada y seleccionada la materia prima, esta fue depositada en el laboratorio de Fitoquimica de la Facultad de Farmacia y Bioquímica, donde fue secada y almacenada en recipientes adecuados.
3.6.1.4Obtención del extracto Hidroalcoholico.
El extracto hidroalcoholico se obtuvo por maceración, de la muestra con etanol/agua (70:30), durante 7 días.
ESQUEMA: ESQUEMA DE OBTENCION DEL EXTRACTO HIDROALCOHOLICO DE HOJAS DE Chenopodium ambrosioides.
3.7 PROCEDIMIENTO DE LOS ENSAYOS DE LA ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA
3.7.1 Recuperación de cultivos conservados. Congelados
Descongelar los tubos con las bacterias petrificadas a temperaturas ambiente o en baño de agua a 36° C – 37° C, por una hora y transferir a con el asa bacteriológica una pequeña muestra (bacterias en estudio), y mezclando por agitación en los tubos que contienen caldo nutritivo como medio apropiado para ejercer la reactivación de las bacterias.
3.7. 2 Reactivación de bacterias:
3.7.3Cultivo en agar.
Deja enfriar las placas que fueron retiradas de la estufa a 180° C x 1 hora, retirando el papel de despacho en la cual estaban envueltas, para proceder a plaquear con agar Müeller Hinton, luego incubar las cepas bacteriológicas a la estufa a 37° C por 24 horas, para usarlo como control positivo (No debe crecer microrganismos en el agar Müeller Hinton luego de las 24 horas.
Al extraer las placas del interior de la estufa, observar que no exista ningún tipo de crecimiento de microorganismos, de no ser así la placa será descartada para el experimento.
De los dos tubos (contienen Caldo nutritivo y bacterias incubadas por 24 horas), se extrae la muestra y se siembra por estrías con el asa bacteriológica esterilizada en las placas con contenido de agar Müeller Hinton que se incubaron de 35 - 37 °C durante 24 horas.
b.Se transfirió a los tubos que contiene 10 ml de Cloruro de sodio 0.9 % (NaCl), hasta obtener la turbidez de la escala 0.5 de Mac. Farland y para un mejor homogenizado se utilizó el Vórtex. Por comparación visual se usó una luz apropiada y se miró los tubos contra un fondo blanco con líneas negras como contraste.
tubos de la suspensión bacteriana que contienen 9.9 ml de Caldo Müeller Hinton, conteniendo un total en total 10 ml cada tubo.
e.La inoculación con la suspensión estandarizada debe hacerse dentro de los 15 minutos de preparada la misma, para evitar que el número de microorganismos aumente por duplicación.
3.8 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION INHIBITORIA MINIMA POR EL METODO DE DILUICION EN CALDO (MACRODILUCION).
La inoculación con la suspensión estandarizada debe hacerse dentro de los 15 minutos de preparada la misma, para evitar que el número de microorganismos aumente por duplicación.
3.8.1 Preparación y almacenamiento de las diluciones. Método de Macrodilución en caldo.
Se pesó 640 mg del extracto en viales tipo espendorf estériles, diluidos en 1 ml de disolución metanol/agua (1:1) para alcanzar una concentración de prueba de 640 mg/ ml (Solución madre o Stock).
Después de este proceso se añadió a todos los tubos 1 ml de la suspensión bacteriana. El volumen final mínimo, en cada tubo, fue de 2 ml.
Los extractos que no se disolvieron por agitación fueron mantenidos por algunos minutos en baño maría (temperatura de 40°C) y colocados nuevamente en el Vórtex
.
Preparación de controles
Los extractos que no se disolvieron por agitación fueron mantenidos por algunos minutos en baño maría (temperatura de 40°C) y colocados nuevamente en el Vórtex El control positivo empleado en la prueba fue el antibiótico gentamicina (160 mg/2ml), del cual se utilizó 0.64 ml y se enrasó hasta 5 ml de agua destilada en un tubo estéril para obtener una solución madre o stock de 10240 μg/ml.
De la solución madre se sacó 0.2 ml y fue añadido al tubo N° 01 que contuvo 1.8 ml de caldo Müeller Hinton.
Las concentraciones fueron comprendidas entre los rangos de 512 μg/ml a 2 μg/ml.
3.8.2Incubación.
El tiempo de incubación para la mayoría de los microorganismos fue de 16 a 20 horas, para la técnica de Macrodilución
3.9Lectura de los resultados.
La CIM fue la menor concentración de antibióticos capaz de inhibir completamente el desarrollo bacteriano en el tubo.
El punto final quedo definido a simple vista por la falta de turbidez del caldo.
3.9.1 ANALISIS DE DATOS
El procesamiento de datos con respecto a las variables de estudio se realizó mediante el software estadístico SPSS 19.0 para Windows y Minitab versión en español, los cuales nos permitió elaborar cuadros de distribución de frecuencia, gráficos y calcular los datos estadísticos necesarios para el estudio.
3.9.2 TÉCNICAS DE ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LA
INFORMACIÓN.
4.1RESULTADOS.
4.1.1Obtención del extracto hidroalcoholico de Chenopodium ambrosioides “Paico” Tabla N°1: Porcentaje del Rendimiento del Extracto hidroalcoholico de hojas de Chenopodium ambrosioides “Paico”.
Nombre científico Parte utilizada
Cantidad Rendimiento (%) Chenopodium ambrosioides Hojas 500 g 10.6 %
4.1.2 Método de Macrodilución: Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM).
En la tabla 2, se demuestra que la concentración mínima inhibitoria se observó en el
TABLA N°3: Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), del extracto hidroalcoholico de hojas de Chenopodium ambrosioides frente a Escherichia coli ATCC 25922
En la tabla N° 3, se demuestra que la concentración mínima inhibitoria se observó en el
TABLA N°4: Actividad antibacteriana del extracto hidroalcoholico de hojas de Chenopodium ambrosioides según Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), frente a S. aureus, E. coli.
GRAFICO N°: Comparación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) del extracto hidroalcoholico de hojas de Chenopodium ambrosioides frente a
Staphylococcus aureus, y Escherichia coli.
8.0
Este grafico muestra la comparación del promedio de concentraciones mínimas inhibitorias observadas en las lecturas de Macrodilución del extracto hidroalcoholico de hojas de Chenopodium ambrosioides, frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
4.2DISCUSIÓN:
En el presente trabajo de investigación se estudió el extracto hidroalcoholico de las hojas de Chenopodium ambrosioides, el cual es una especie vegetal tradicionalmente utilizada en la región como purgante, repelente de insectos, laxante, antiespasmódico y calmar el dolor de cabeza y estómago. 40
El método utilizado para la obtención del extracto hidroalcoholico de hojas de Chenopodium ambrosioides fue la destilación por arrastre con vapor de agua. Esta técnica es muy utilizada a pequeña escala y a escala industrial debido a su alto rendimiento, la pureza del extracto obtenido y porque no se requiere tecnología sofisticada. La concentración del extracto se realizó por eliminación de disolventes a presión reducida en un Rotavapor, a una temperatura de 46ºC y a una presión de 690 mmhg por espacio de 3 horas aproximadamente, posteriormente se dejó secar a temperatura ambiente por 7 días.
54,55
En nuestro estudio obtuvimos un porcentaje de rendimiento del 10.6% del extracto de Hojas de Chenopodium ambrosioides, el cual nos sirvió para desarrollar la actividad antibacteriana en S. aureus y E. coli.
de 4mg/ml, lo cual indica que a partir de esta concentración se evidencia aclaramiento de la turbidez de los tubos de ensayo; comprobándose que se disminuye o inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus a partir de esta concentración.
En la Tabla N°3, se aprecia la evaluación de la actividad antibacteriana del extracto hidroalcoholico de Chenopodium ambrosioides, frente a Escherichia coli, por el método de Macrodilución, donde se determinó la Concentración Inhibitoria mínima (CIM) en el Tubo C6 cuya concentración del extracto fue de 8mg/ml, lo cual indica que a partir de esta concentración se evidencia aclaramiento de la turbidez de los tubos de ensayo; comprobándose que se disminuye o inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus a partir de esta concentración56.
Otros autores, realizaron estudios con Chenopodium ambrosioides, para determinar principalmente su actividad antifungica como Kumar R, Kumar A, Dubey N.K, Tripathi Y.B que evaluaron el aceite de Ch. ambrosiodies como fuente de potencial antifungico, antioxidante y antiaflatoxigenico. Demostrando un inhibición del crecimiento de Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Botryodiplodia theobromae, Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, Macrophomina phaseolina, cladosporioides Cladosporium, Helminthosporium oryzae y Pythium debaryanum.
Que estudio la actividad antimicótica de dos monoterpenos de Chenopodium ambrosioides, con buenos resultados.
En la comparación de la actividad antibacteriana de Chenopodium ambrosioides, frente a ambas bacterias se puede evidenciar que se obtuvo como resultado Moderado Activo en Staphylococcus aureus y Poco activo frente a Escherichia coli, según la interpretación del protocolo de estudio de la actividad antimicrobiana del Imet – Essalud.
4.3 CONCLUSION.
El presente estudio se realizó con el propósito de determinar la actividad antibacteriana in vitro de los extracto hidroalcohólico de hojas de Chenopodium ambrosioides (paico) frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli mediante el método de macrodilución. Por lo que llegamos a las siguientes conclusiones:
El extracto hidroalcohólico de Chenopodium ambrosioides (paico), evaluado mediante el método de macrodilución, se obtuvo como resultado una concentración inhibitoria mínima de 8 mg/ml para Staphylococcus aureus clasificándolo como poco activo y 16 mg/ml para Escherichia coli, que se clasificó como inactivo, esto en comparación con el control positivo (Gentamicina).
4.4. RECOMENDACIONES
1.Incentivar a los estudiantes que se continúe con estudios de tipo experimental acerca de plantas de uso medicinal.
2. Emplear nuevas metodologías para la evaluación de la actividad antibacteriana de la planta Chenopodium ambrosioides (Paico).
3. Que se realice el tamizaje fitoquímico de las hojas de Chenopodium ambrosioides (Paico) para determinar los grupos químicos constituyentes responsables de su acción bacteriológica frente a las cepas en estudio.
4. Que se realice el aislamiento e identificación por métodos espectrométricos y cromatográficos para el reconocimiento químico de los metabolitos responsables de su actividad bacteriológica.
5.Que se realice el estudio in vitro de otros órganos de Chenopodium ambrosioides (Paico) para determinar su posible actividad antibacteriana frente a otras bacterias patógenas.
6. Que se realicen ensayos pre-clínicos y clínicos para su aplicación en preparados farmacéuticos contra las bacterias sensibles.
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4.6ANEXOS.
ANEXO N° 01
ANEXO N° 02
FORMATO DE RECOLECCIÓN DE LOS DATOS DE LA ESPECIE Chenopodium
ambrosioides (Paico) Posición de Hojas:……….Presencia de Órganos Accesorios en Hojas:…………. Forma del Tallo:……….Órganos Accesorios en Tallo:……… Características de la Corteza:………….…Látex:………….Color de Látex:………….….... Tipo de Inflorescencia:………….Posición de Inflorescencia:…………... Tipo de Flor por Sexo:...Nº de Pétalos:...Unión de Sépalos:…….…….. N de Estambres:...Posición de Estambres:……... Posición de Ovarios:…………...Nº de Carpelos:……….…..……… Tipo de Fruto:……….Consistencia:…………..…..Dehiscencia:…….……..….
DATOS ETNOFARMACOLÓGICOS:
Uso Medicinal 1:……….…Parte Usada:………... Cantidad Usada .:……… Forma de Preparación:…………...
Uso Medicinal 2:……….…Parte Usada:………... Cantidad Usada .:……… Forma de Preparación:…………...
Uso Medicinal 3:……… Parte Usada:………... Cantidad Usada .:……… Forma de Preparación:…………...
COLECTA DE MATERIAL BIOLÓGICO:
Peso:………...…………...…... Parte Colectada:………...
ANEXO N° 03
ANEXO N° 04
.ANEXO N° 05
a) Representación de la visión por medio del microscopio de las colonias Staphylococcus aureus b) Medio de cultivo sólido Agar sangre utilizado para el crecimiento bacteriológico c) Características fenotípicas de los cocos Gram-positivo presentando la forma de racimos de uvas.
ANEXO 06
OBTENCION DEL EXTRACTO HIDROALCOHOLICO DE HOJAS DE Chenopodium ambrosioides.
SECADO DEL EXTRACTO HIDROALCOHOLICO DE HOJAS DE Chenopodium ambrosioides EN PLACAS.
ANEXO 08
ANEXO 09
REACTIVACION DE BACTERIAS ENE LE TUBO CON CALDO NUTRITIVO
ANEXO 10
ANEXO 11
SEMBRIO E INCUBACION DE BACTERIAS PARA LA PREPARACION DEL INOCULO BACTERIANO EN MEDIO DE CULTIVO ESPECIFICO DE CALDO MÚLLER HINTON
ANEXO 12
PREPARACION DE SUSPENSIÓN BACTERIANA.
ANEXO 14
ANEXO 16
ANEXO N° 17
ANEXO N°18
Resultados de la concentración mínima inhibitoria por el método de Macrodilución en caldo para Staphylococcus aureus.
