UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
TESIS DOCTORAL
Efectos de la administración de hormona de crecimiento en la osteointegración de implantes de titanio recubiertos de hidroxiapatita dopada con silicio. Estudio histomorfométrico
en calotas de conejo
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Jorge Carballido Fernández Directores
María Vallet Regí
Isabel Fernández-Tresguerres Hernández-Gil Madrid
© Jorge Carballido Fernández, 2022
U NIVERSIDAD C OMPLUTENSE DE M ADRID
F ACULTAD DE O DONTOLOGÍA
Departamento de Especialidades Clínicas Odontológicas
TESIS DOCTORAL
EFECTOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE HORMONA DE CRECIMIENTO EN LA OSTEOINTEGRACIÓN DE
IMPLANTES DE TITANIO RECUBIERTOS DE HIDROXIAPATITA DOPADA CON SILICIO. ESTUDIO
HISTOMORFOMÉTRICO EN CALOTAS DE CONEJO.
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Jorge Carballido Fernández
BAJO LA DIRECCIÓN DE
Profa. Dra. María Dulce Nombre Vallet Regí
Profa. Dra. Isabel Fernández-Tresguerres Hernández-Gil
Madrid, 2021
U NIVERSIDAD C OMPLUTENSE DE M ADRID
F ACULTAD DE O DONTOLOGÍA
Departamento de Especialidades Clínicas Odontológicas
TESIS DOCTORAL
EFECTOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE HORMONA DE CRECIMIENTO EN LA OSTEOINTEGRACIÓN DE
IMPLANTES DE TITANIO RECUBIERTOS DE HIDROXIAPATITA DOPADA CON SILICIO. ESTUDIO
HISTOMORFOMÉTRICO EN CALOTAS DE CONEJO.
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Jorge Carballido Fernández
BAJO LA DIRECCIÓN DE
Profa. Dra. María Dulce Nombre Vallet Regí
Profa. Dra. Isabel Fernández-Tresguerres Hernández-Gil
Madrid, 2021
AGRADECIMIENTOS
A la Profesora María Vallet Regí, Catedrática del Departamento de Química en Ciencias Farmacéuticas y directora de esta Tesis Doctoral, por su constante interés sobre el desarrollo del trabajo, siempre con palabras de aliento, y por haberme hecho partícipe de la enorme calidad humana y científica del Grupo de Investigación en Biomateriales Inteligentes, que con tanto éxito lidera. Además, gracias a ella y su equipo dispusimos de los implantes utilizados en esta Tesis Doctoral.
A la Profesora Isabel Fernández-Tresguerres Hernández-Gil, Profesora Contratada Doctora del Departamento de Especialidades Clínicas Odontológicas además de directora y tutora de la Tesis Doctoral. ¿Qué decirte Isabel? Solo puedo darte las gracias por tu implicación, no solo durante el desarrollo de esta investigación, también desde que me incorporé al Departamento. Eres un ejemplo de sacrificio y trabajo, dedicada plenamente a la docencia, y una “madre universitaria” para mí, siempre preocupada y pendiente de todo. No me cansaré de darte las gracias.
Al Profesor Jesús Ángel Fernández-Tresguerres Hernández, Catedrático del Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina, por sus ánimos constantes en cada reunión, con palabras que siempre resultaron reconfortantes y me hicieron ser capaz de relativizar los momentos más difíciles de la Tesis Doctoral. Las recordaré siempre. Mi agradecimiento se hace extensivo por haber financiado esta investigación.
A la Profesora Celia Clemente de Arriba, Profesora Titular del Departamento de Cirugía, Ciencias Médicas y Sociales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Alcalá de Henares, por permitirnos hacer uso de sus instalaciones para efectuar el análisis histomorfométrico e histológico de las muestras y ayudarnos a establecer la metodología del mismo.
Al Profesor Jesús Torres García-Denche, Profesor Titular del Departamento de Especialidades Clínicas Odontológicas, por su ayuda en la realización de las cirugías, el seguimiento postquirúrgico y el sacrificio de los animales. Este agradecimiento también te lo debo por estimularme y recordarme siempre que en cirugía debemos salir de nuestro área de confort y desarrollarnos profesionalmente al máximo. Muchas gracias por todo Chus.
A la Profesora Isabel Izquierdo Barba, Profesora Titular del Departamento de Química en Ciencias Farmacéuticas, por ayudarme desinteresadamente y con tanta amabilidad
durante el desarrollo de la investigación. Muchas gracias Isabel, siempre tendré presentes tus palabras de ánimo en cada una de nuestras conversaciones.
Al Profesor Rafael Baca Pérez-Bryan, Profesor Titular del Departamento de Especialidades Clínicas Odontológicas, por hacer que me cautivase la cirugía desde que me dio la primera clase en la licenciatura. Su calidad profesional es admirable y su calidad humana es envidiable. Si Isabel es mi “madre universitaria”, tú eres mi “padre universitario”. Nunca tendré suficientes palabras de agradecimiento por todo lo que he aprendido de ti en todos estos años.
A la Profesora Isabel Leco Berrocal, Profesora Contratada Doctora del Departamento de Especialidades Clínicas Odontológicas, por su ayuda durante la fase de experimentación animal. Isabel, eres un ejemplo de buena persona, además de mujer empoderada y trabajadora incansable. Espero poder seguir aprendiendo de ti muchos años. Muchas gracias por todo “mi Leco”.
Al Profesor Juan López-Quiles Martínez, Profesor Contratado Doctor del Departamento de Especialidades Clínicas Odontológicas y referencia en la Cirugía Oral y Maxilofacial española, por ser mi “maestro” durante mis años como alumno del Máster de Cirugía Bucal e Implantología, y por continuar siéndolo a día de hoy, transmitiéndome sus conocimientos de forma desinteresada. Muchas gracias Juan.
Al Profesor Apolinar García Peñín, Profesor Titular de Patología Quirúrgica Maxilofacial jubilado, porque fue él quien insistió en que me formase como cirujano.
A los Doctores Francisco González Fernández-Tresguerres y Laura Baca González, por su ayuda en esta Tesis Doctoral, implicándose como si fuese suya. Espero veros crecer mucho personal y profesionalmente y poder ayudaros en todo lo que esté en mi mano.
A la Dra. Jatsue Cabrejos Azama, por sus valiosos consejos a la hora de realizar el análisis de las muestras.
A Dña. Maite García de Juan, bióloga y técnico de laboratorio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Alcalá de Henares, por sus enseñanzas y su implicación durante la realización del análisis histomorfométrico e histológico de las muestras.
Admiro tu capacidad de trabajo y tu forma de entender la vida, siempre recordaré nuestras conversaciones y tu cariño.
A D. Santiago Cano Alsua, estadístico del Centro de Apoyo a la Investigación, por el análisis estadístico de los datos obtenidos en esta Tesis Doctoral.
En definitiva a todas aquellas personas que han contribuido a mi formación, tanto en la Licenciatura en Odontología, como en el Máster de Cirugía Bucal e Implantología y en los Estudios de Doctorado. Me siento orgulloso y privilegiado por haberme formado íntegramente en la Universidad Complutense de Madrid.
Merecen un agradecimiento especial mis amigos, pues han soportado mis momentos de desaliento y han sabido reconfortarme con palabras llenas de cariño y de sinceridad.
Más que amigos son familia. No puedo dejar de mencionar a Manu, Marta, Isa, Irene, Nagore, Laura, Elisa, Noelia, Fátima, Josito y Edgar.
Por último, el mayor de los agradecimientos va dirigido a mis padres y a mis abuelos.
Ellos han sido mi ejemplo a seguir en integridad, dedicación, esfuerzo y sacrificio, y las personas que más me han animado a perseguir mis sueños a lo largo de mi vida. Esta Tesis Doctoral va dedicada a vosotros, por quererme tanto y tan bien.
A mis padres, Fernando e Iluminada.
A mis abuelos, Luis , Milagros, Ángel y Adelaida.
“Los libros me enseñaron a pensar y el pensamiento me hizo libre”
-Ricardo de León-
ÍNDICE
1. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN (10) 2. HIPÓTESIS (16)
3. OBJETIVOS (18)
4. INTRODUCCIÓN (20)
4.1 HUESO (21)
4.2 HORMONA DE CRECIMIENTO (GH) (26)
4.2.1 EFECTOS DE LA GH SOBRE EL CRECIMIENTO, EL METABOLISMO Y EL HUESO (27)
4.2.1.1 GH y crecimiento (27) 4.2.1.2 GH y metabolismo (27) 4.2.1.3 GH y hueso (28)
4.2.1.3.1 Efectos in vitro (29)
4.2.1.3.2 Efectos in vivo en animales (30) 4.2.1.3.2.1 GH sistémica (30)
4.2.1.3.2.2 GH local (30)
4.2.1.3.3 Efectos en seres humanos (31)
4.3 IMPLANTES EXPERIMENTALES DE Ti@SiHA (35)
5. MATERIALES Y METODOLOGÍA (37)
5.1 MATERIALES (38)
5.1.1 ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN (38) 5.1.2 MATERIALES DE EXPERIMENTACIÓN (38) 5.1.3 MATERIAL ANESTÉSICO Y DE EUTANASIA (39) 5.1.4 MATERIAL QUIRÚRGICO Y DE NECROPSIA (39)
5.1.4.1 Instrumental para diéresis (39) 5.1.4.2 Instrumental para exéresis (39) 5.1.4.3 Instrumental para sinéresis (39) 5.1.4.4 Instrumental adicional (40)
5.1.5 MATERIAL ANALGÉSICO Y ANTIBIÓTICO
POSTOPERATORIO Y PARA LA ADMINISTRACIÓN SUBCUTÁNEA DE GH (40)
5.1.6 MATERIAL PARA LA HISTOLOGÍA E HISTOMORFOMETRÍA (40)
5.1.7 RECURSOS HUMANOS (41)
5.2 METODOLOGÍA (41)
5.2.1 DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO MUESTRAL (41) 5.2.2 DEFINICIÓN DE LAS VARIABLES DEL ESTUDIO (43) 5.2.3 FASE PRELIMINAR DE LA INVESTIGACIÓN (43)
5.2.3.1 Diseño y fabricación de los implantes de Ti6Al4V (44) 5.2.3.2 Recubrimiento con SiHA de los implantes de Ti6Al4V (45) 5.2.4 FASE DE EXPERIMENTACIÓN ANIMAL (47)
5.2.4.1 Establecimiento de los grupos de estudio (47) 5.2.4.2 Procedimiento quirúrgico (48)
5.2.4.3 Control postoperatorio y administración de GH sistémica (49) 5.2.4.4 Eutanasia y necropsias (49)
5.2.5 ANÁLISIS MICROSCÓPICO (50)
5.2.5.1 Preparación de las muestras para su estudio microscópico (50) 5.2.5.2 Estudio histológico (51)
5.2.5.3 Estudio histomorfométrico (51)
5.2.5.3.1 Porcentaje de osteointegración (BIC) (52) 5.2.5.3.2 Densidad de área de hueso neoformado (53) 5.2.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS (54)
6. RESULTADOS (55)
6.1 ESTUDIO HISTOMORFOMÉTRICO (57)
6.1.1 DENSIDAD DE ÁREA DE HUESO NEOFORMADO (60) 6.1.2 BONE-TO-IMPLANT CONTACT (BIC) (65)
6.2 ESTUDIO HISTOLÓGICO (70) 6.2.1 RESPUESTA CORTICAL (70)
6.2.2 RESPUESTA TRANSCORTICAL Y MEDULAR (70)
6.2.2.1 Respuesta transcortical y medular en conejos tratados con GH (70)
6.2.2.2 Respuesta transcortical y medular en conejos no tratados con GH (71)
7. DISCUSIÓN (73)
7.1 IMPLANTES EXPERIMENTALES DE Ti@SiHA (75)
7.1.1 IMPLANTES DE Ti6Al4V EN CONEJOS NO TRATADOS CON GH (76)
7.1.2 IMPLANTES DE Ti@SiHA EN CONEJOS NO TRATADOS CON GH (77)
7.1.3 IMPLANTES DE Ti6Al4V y Ti@SiHA EN CONEJOS TRATADOS CON GH (82)
7.2 HORMONA DE CRECIMIENTO (GH) (82) 7.2.1 ANÁLISIS MORFOMÉTRICO (85)
7.2.1.1 Bone-to-implant contact (BIC) (85)
7.2.1.2 Densidad de área de hueso neoformado (86) 7.2.2 ANÁLISIS HISTOLÓGICO (87)
7.2.2.1 Respuesta cortical (87)
7.2.2.2 Respuesta transcortical y medular (88)
8. CONCLUSIONES (98) 9. BIBLIOGRAFÍA (101) 10. ABREVIATURAS (116) 11. FIGURAS (120)
12. ANEXOS (131)
13. RESUMEN / ABSTRACT (137)
1. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
11 El titanio es un metal que se descubrió en 1790 y fue ampliamente utilizado como aditivo para la obtención de tintes de color blanco, sin embargo, a partir de la segunda mitad del siglo XX comenzó a utilizarse en medicina, y desde entonces ha sido ampliamente usado en cirugía oral, maxilofacial y traumatología por sus excelentes propiedades químicas y mecánicas, su resistencia a la corrosión y su excelente biocompatibilidad (Long y Rack, 1998).
En los últimos años, el número de implantes dentales ha aumentado de forma constante, colocándose alrededor de un millón de implantes anuales en todo el mundo y su éxito clínico depende directamente de su osteointegración. Los implantes de titanio interactúan con los fluidos y tejidos biológicos, resultando en una fijación directa de los huesos a la superficie del titanio, sin interposición de tejido conectivo, que es fundamental para poder efectuar la carga de los mismos (Albrektsson et al., 1981).
Por sus propiedades biológicas, el titanio se ha utilizado ampliamente para la reconstrucción de defectos óseos craneofaciales y en el resto del esqueleto. Sin embargo, como material inerte carece de bioactividad y eso conlleva un período largo de cicatrización y la posibilidad de fracasar la osteointegración (Li et al., 2014).
Los estudios han demostrado que la morfología de la superficie y su composición química desempeñan un papel importante en el éxito de la osteointegración. La morfología de la superficie de los implantes puede dividirse en macro, micro o nanodiseño de superficie. El macrodiseño hace referencia a rugosidades superiores a 10 μm, que han demostrado una mejora en la fijación temprana y en la estabilidad mecánica a largo plazo. El microdiseño implica rugosidades entre 1 y 10 μm y maximiza la unión entre el hueso mineralizado y la superficie del implante. Por último, el nanodiseño puede simular un microambiente que favorezca el crecimiento de osteoblastos. Las superficies rugosas tratadas han demostrado un mayor porcentaje de osteointegración (en inglés bone-to-implant contact – BIC) y una mayor resistencia al torque de desinserción que las superficies lisas mecanizadas, resultando especialmente interesante en huesos de poca calidad. Por otra parte, la composición química es fundamental para la unión celular, pudiendo inducir a los osteoblastos a liberar elementos bioactivos y formar enlaces químicos. La mayoría de los implantes están realizados en titanio puro comercial o aleaciones de titanio. El titanio puro comercial tiene diferentes grados de pureza, que van desde el grado I al grado IV, siendo el grado
ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
IV el más habitual. Las aleaciones de titanio están compuestas principalmente por titanio grado V (Ti6Al4V), con mayor resistencia y mejores propiedades frente a la fatiga que el titanio puro, y que tuvo su origen en la industria aeroespacial (Le Guéhennec et al., 2007; Chouirfa et al., 2018; Chern et al., 2019).
Tanto la morfología de la superficie como su composición química puede afectar, por tanto, al linaje de células osteogénicas (Le Guéhennec et al., 2007; Chouirfa et al., 2018).
La osteointegración es la consecuencia de una serie de mecanismos moleculares y celulares que acontecen después de la preparación de un lecho para colocar un implante y sigue un patrón muy similar al observado en la cicatrización de fracturas óseas. Para que esta se produzca es necesario que los osteoblastos entren en contacto con la superficie del implante y comiencen a depositar sobre ella matriz osteoide que pueda mineralizarse. Este proceso se ve favorecido por la presencia de la capa de óxido de titanio que se forma en la superficie del implante (Pellegrini et al., 2018).
A día de hoy, en pacientes sanos la osteointegración es exitosa en la mayoría de los casos, sin embargo, algunas condiciones sistémicas que intervienen en el metabolismo óseo parecen afectarla, retrasando la cicatrización ósea y reduciendo la unión entre el hueso y el implante (Wennerberg y Albrektsson, 2010).
Por ello, las tendencias actuales de la investigación en ingeniería tisular se centran en el desarrollo de biomateriales y superficies para mejorar la cicatrización de los tejidos y favorecer la osteintegración, a través de la formación de una capa gruesa de óxido de titanio, la alteración química mediante la incorporación de moléculas, o bien, la investigación en materiales bioactivos que favorezcan la adhesión, además de la actividad osteogénica (Pellegrini et al., 2018).
En ocasiones existen situaciones en el paciente que pueden alterar el remodelado óseo, favoreciendo la reabsorción ósea y resultando en una cicatrización alterada y una formación incorrecta de hueso periimplantario, que conllevan una tasa más elevada de fracaso de los implantes. Estas constituyen un reto para el cirujano y se presentan en enfermedades como la osteoporosis y también en el caso de huesos envejecidos (Liu et al., 2020).
ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
13 Las investigaciones actuales sugieren la posibilidad de utilizar, en las situaciones anteriores, materiales bioactivos como la hidroxiapatita dopada con silicio (SiHA), por sus aparentes propiedades osteoinductivas (Izquierdo-Barba et al., 2019).
Los estudios sobre la SiHA como material de recubrimiento para implantes de titanio han demostrado que la osteointegración, en esos trabajos, depende en gran medida de la presencia de esta cerámica bioactiva, favoreciendo la proliferación osteoblástica y su adhesión a la superficie de los implantes. Por ello, es uno de los materiales más investigados en ingeniería tisular actualmente, aunque se necesitan más estudios al respecto (Mumith et al., 2020).
Además de las investigaciones para mejorar las superficies de los implantes y favorecer el proceso de osteointegración, se han llevado a cabo estudios sobre diferentes hormonas anabólicas que puedan beneficiar la unión del hueso al implante, como los estrógenos o la hormona paratiroidea (PTH). Otra de las hormonas que ha sido, y continúa siendo, estudiada es la hormona de crecimiento (GH), tratando de optimizar la osteointegración. La GH ha demostrado a lo largo de los años que favorece el remodelado óseo, aumenta la masa ósea y mejora la cicatrización de las fracturas en distintos estudios in vivo (Abduljabbar et al., 2017).
La GH puede generar beneficios sobre el hueso cuando es administrada de forma sistémica y cuando se administra de forma local.
La administración sistémica de GH en ratas aumentó de manera sustancial la formación subperióstica de hueso nuevo, incrementando en un 400% las propiedades biomecánicas tras la fractura tibial experimental (Bak et al., 1990; Andreassen et al., 1995).
Además, su administración a través de inyecciones subcutáneas en conejos, en los que se colocaron implantes de titanio puro en las tibias, demostró que la estabilidad secundaria de los implantes (medida a través del análisis de frecuencia de resonancia) al cabo de dos semanas y al cabo de ocho semanas, era significativamente mayor que en el grupo control sin GH. Estos resultados demostraron un beneficio inicial en la osteointegración de los implantes cuando se administró GH de forma sistémica (Stenport et al., 2001).
ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
Respecto a la administración local de GH, el primer estudio en el que se utilizó de forma local para mejorar la reacción ósea peri-implantaria fue el de Tresguerres et al.
(2002). En este trabajo se llevó a cabo una osteoporosis experimental en conejas, mediante ovariectomía bilateral y dieta hipocálcica. Se colocaron unos implantes laminares de titanio en la tibia de las conejas osteoporóticas y se observó que la administración local de una sola dosis de 4 UI de GH (equivalente a 1,3 mg) en forma de polvo liofilizado, colocada en el interior del lecho óseo, justo antes de la inserción del implante, era capaz de estimular la respuesta osteogénica peri-implantaria a las dos semanas. Otros estudios del mismo grupo, realizados en tibias de conejos sin osteoporosis, pero con implantes dentales, mostraron un mayor BIC en el grupo experimental tratado con GH local, respecto al grupo control (Tresguerres et al., 2003, 2005).
Otra investigación del mismo equipo, llevada a cabo por Martin-Monge et al. (2017) con la misma metodología que Tresguerres et al. (2002), pero con implantes de titanio y con la mitad de hormona, mostraron que, al cabo de dos semanas, se producía un mayor BIC en el grupo experimental respecto al grupo control en conejas osteoporóticas.
Estudios experimentales sobre la administración local de GH en perros Beagle, en los que se colocaron implantes mandibulares (inmediatos postextracción), demostraron un aumento del BIC y del área ósea (AO) de hueso neoformado en el grupo experimental.
Los autores, además, indicaron que la administración de GH resulta muy interesante en el campo de la cirugía oral, pero otras disciplinas odontológicas como la periodoncia podrían beneficiarse de sus efectos, por la pérdida ósea paulatina que conlleva la enfermedad periodontal (Gómez-Moreno et al., 2009).
Existen estudios que demuestran el efecto beneficioso de la administración sistémica de GH sobre el hueso, como los trabajos publicados por Andreassen et al. (1995) y Stenport et al. (2001). Por otro lado, otros estudios muestran aumentos en el BIC y en el AO cuando se administra GH de forma local, como las investigaciones llevadas a cabo por Tresguerres et al. (2003), Gómez-Moreno et al. (2009) y Martín-Monge et al. (2017).
Sin embargo, en la actualidad no se han llevado a cabo investigaciones sobre los beneficios de la administración simultánea de GH local y sistémica en la osteointegración.
ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
15 Por otro lado, se han llevado a cabo trabajos de investigación como el realizado por Izquierdo-Barba et al. (2019) con implantes de Ti6Al4V recubiertos de SiHA in vitro, a través de cultivos celulares, para observar la acción de la cerámica bioactiva sobre las células óseas. Además, los mismos autores en el mismo trabajo probaron estos nuevos implantes recubiertos de esta biocerámica bioactiva a través de un estudio in vivo en ovejas, pero no se ha llevado a cabo ninguna investigación con estos materiales en conejos, y en combinación con la administración local y sistémica de GH.
Dado que los implantes de Ti6Al4V recubiertos de SiHA han sido muy poco estudiados in vivo (Izquierdo Barba et al., 2019) y que la GH no se ha administrado nunca simultáneamente de forma local y de forma sistémica para mejorar el proceso de osteointegración, se considera justificada la realización de este trabajo como Tesis Doctoral.
2. HIPÓTESIS
HIPÓTESIS
17 Hipótesis nula
La administración local y sistémica de hormona de crecimiento (GH) y la utilización de implantes de titanio recubiertos de hidroxiapatita dopada con silicio (Ti@SiHA) no inducen efectos en el porcentaje de osteointegración (BIC) ni en la Densidad de área de hueso neoformado en calotas de conejo.
Hipótesis alternativa
La administración local y sistémica de hormona de crecimiento (GH) y la utilización de implantes de titanio recubiertos de hidroxiapatita dopada con silicio (Ti@SiHA) aumentan el porcentaje de osteointegración (BIC) y la Densidad de área de hueso neoformado en calotas de conejo.
3. OBJETIVOS
OBJETIVOS
19 Antes de comenzar el estudio se plantearon los siguientes objetivos:
1. Analizar de forma cuantitativa el efecto de la administración local y sistémica de hormona de crecimiento (GH) en la osteointegración, a través de la determinación del porcentaje de osteointegración (BIC) y de la Densidad de área de hueso neoformado en base a estudios histomorfométricos.
2. Valorar de forma cualitativa el efecto de la administración local y sistémica de hormona de crecimiento (GH) en el hueso peri-implantario a través del estudio histológico de los cortes de calota.
3. Cuantificar el porcentaje de osteointegración (BIC) y la Densidad de área de hueso neoformado alrededor de los implantes de titanio recubiertos con hidroxiapatita dopada con silicio (Ti@SiHA), versus los implantes de titanio sin recubrimiento (Ti6Al4V), mediante análisis histomorfométrico.
4. Valorar histológicamente el efecto de los implantes de titanio recubiertos de hidroxiapatita dopada con silicio (Ti@SiHA), versus los implantes de titanio sin recubrimiento (Ti6Al4V), en el hueso peri-implantario.
4. INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
21
4.1. HUESO
El hueso es un tejido conjuntivo vascularizado e inervado, que está constituido por una matriz extracelular, con una fracción orgánica e inorgánica, y por células. La fracción orgánica está formada por colágeno tipo I, glicoproteínas y proteoglicanos. La fracción inorgánica contiene principalmente calcio y fósforo, organizados en cristales de hidroxiapatita, brushita y monetita. Las células se organizan en osteoblastos, osteoclastos y osteocitos, que interaccionan entre ellas para alcanzar una correcta homeostasis del hueso. (Capariello et al., 2016)
El hueso puede ser cortical y esponjoso. En el hueso cortical la unidad osteológica es la osteona o sistema de Havers, que consta de un conducto longitudinal, que contiene vasos sanguíneos y está rodeado de laminillas calcificadas concéntricas. Estas osteonas se conectan entre sí mediante los canales de Volkman. En el hueso medular no hay osteonas, las laminillas óseas se disponen en forma de trabéculas, que delimitan cavidades donde se encuentra la médula ósea (Parffit, 2000).
El hueso es un tejido dinámico, en el que el hueso viejo es eliminado y reemplazado constantemente por hueso nuevo con el objetivo de mantener la integridad de la estructura ósea y la homeostasis mineral. Este proceso se conoce como remodelado óseo y es llevado a cabo por osteoblastos, osteoclastos, osteocitos, células de revestimiento óseo o células limitantes y vasos sanguíneos, que forman la unidad básica multicelular (BMU) (Parffit, 2000). En ellas, todas las células óseas trabajan conjuntamente para reabsorber una cierta cantidad de hueso primero y formar después esa misma cantidad de hueso en una misma localización.
De esta forma, el tejido óseo se renueva anualmente entorno a un 3-10%, lo que supone una renovación completa del esqueleto cada 10 años. La principal función del remodelado óseo es liberar calcio y factores de crecimiento, presentes en la matriz ósea mineral, al torrente circulatorio para mantener la homeostasis mineral. Además, mediante este proceso, el hueso viejo o dañado se reemplaza por hueso nuevo, manteniendo la integridad del esqueleto. En condiciones normales se encuentra en un equilibrio, en el que la cantidad de hueso viejo reabsorbido es idéntica a la de hueso nuevo formado. Sin embargo, en algunas circunstancias como la osteoporosis o en huesos de edad avanzada, el equilibrio se desplaza a favor de la reabsorción ósea. Por otro lado, es un mecanismo complejo en el que intervienen factores mecánicos como la
INTRODUCCIÓN
carga o el ejercicio físico, mediadores endocrinos como la PTH o la GH y mediadores paracrinos como el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) (Capariello et al., 2016; Fernández-Tresguerres-Hernández-Gil et al., 2006).
El descubrimiento de las moléculas RANK, RANKL y osteoprotegerina (OPG) supuso un hito en el estudio de la biología ósea y, específicamente, en el estudio del remodelado óseo (Tresguerres et al., 2020).
Tradicionalmente se ha estudiado que los osteoblastos son capaces de regular la diferenciación de los osteoclastos a través del complejo RANK-RANKL. RANKL es un ligando del receptor activador del factor nuclear kappa B (NF-kB) expresado en los osteoblastos, mientras que RANK es un receptor que está expresado en los osteoclastos y preosteoclastos. La unión de ambas moléculas estimula la osteoclastogénesis, promueve la diferenciación de los osteoclastos e inhibe su apoptosis, además de activar a los osteoclastos maduros, por lo que favorece la reabsorción ósea. La OPG, segregada por los osteoblastos, puede actuar de forma local y sistémica impidiendo la unión de RANK y RANKL por lo que inhibe la osteoclastogénesis y en consecuencia la reabsorción ósea (Simonet et al., 1997).
Sin embargo, a partir de los estudios llevados a cabo por Xiong et al. (2011) y Nakashima et al. (2011), se sabe que la producción de RANKL por parte de los osteocitos es la que regula la osteoclastogénesis y el remodelado óseo, pues producen más cantidad de molécula y con mayor actividad, siendo el RANKL y el factor estimulante de colonias tipo 1 (CSF-1) moléculas necesarias y suficientes para producir dicho proceso. Además, la producción de RANKL por parte de los osteocitos es la responsable de la reabsorción del hueso en ausencia de cargas. De esta forma, y contradiciendo los primeros estudios sobre el tema, se puede afirmar que el RANKL producido por los osteoblastos o sus progenitores es secundario respecto al del osteocito (Tresguerres et al., 2020).
Los osteocitos representan el 90-95% de las células óseas en el esqueleto adulto, poseen una vida media larga (aproximadamente 25 años) y proceden de los osteoblastos (Tresguerres et al., 2020).
INTRODUCCIÓN
23 Los osteoblastos provienen, a su vez, de células madre mesenquimales de la médula ósea y cuando dejan de producir matriz extracelular pueden pasar a ser osteocitos (entre el 60-80% de ellos), células del revestimiento óseo o morir por apoptosis (Manolagas, 2000). Las células de revestimiento óseo o células limitantes son aplanadas y se encuentran en las superficies óseas donde no se produce ni formación ni reabsorción ósea y los osteoclastos descienden de células madre hematopoyéticas. Cuando la matriz extracelular se mineraliza, los osteoblastos, que son cuboides, quedan atrapados en su interior y se transforman en osteocitos, de forma estrellada, con procesos dendríticos y de menor tamaño que los osteoblastos. Durante este proceso, los osteocitos pasan de expresan proteínas de los osteoblastos (colágeno tipo 1, osteopontina, osteocalcina, fosfatasa alcalina) a expresar proteínas propias ( E11, FGF23, esclerostina) (Tresguerres et al., 2020).
La formación de los osteocitos se conoce como osteocitogénesis y es un proceso activo en el que estos forman una red tridimensional a través de sus procesos dendríticos, que permite la viabilidad celular, la comunicación entre células y la mecanosensibilidad.
Los procesos dendríticos y los canalículos óseos se forman por la expresión de la proteína E11 y la metaloproteinasa MMP14 por parte del osteocito (Zhang et al., 2006;
Bellido, 2014).
El cuerpo de los osteocitos se encuentra en el interior de una laguna ósea y rodeado de fluido óseo, que proporciona a la célula oxígeno y nutrientes, garantizando su viabilidad.
Además, el fluido óseo interconecta el osteocito con el torrente circulatorio favoreciendo la llegada de hormonas como la PTH, la GH, estrógenos o vitamina D, desde diferentes órganos. A su vez, las prolongaciones de los osteocitos están rodeadas de este mismo fluido y están albergadas en los canalículos óseos, permitiendo la interconexión entre diferentes células (osteocitos, osteoblastos, osteoclastos y células madre de la médula ósea) y su llegada al periostio y al endostio (Dallas y Bonewald, 2010; Chen et al., 2015; Bonewald, 2017).
Por tanto, si bien en estudios antiguos se consideraba a los osteocitos células inactivas y sin función aparente, en la actualidad se ha demostrado su capacidad para formar redes de conexión complejas a través de sus procesos dendríticos (Talbot et al., 2018).
Para explicar estas redes de conexión, se describieron las uniones gap en el hueso. Estas uniones están formadas por hemicanales dispuestos como un conjunto de placas en la
INTRODUCCIÓN
membrana plasmática, creando orificios que permiten la comunicación intercelular. En el hueso, los hemicanales están formados principalmente por la conexina 43, que permite la comunicación intercelular cuando se sitúan en el extremo de los procesos dendríticos del osteocito y mediar en la comunicación entre ambientes intra y extracelulares cuando se sitúan en el cuerpo de la célula. (Yang et al., 2020; Moorer y Stains, 2017; Rochefort et al., 2010).
Las alteraciones en la red de comunicación osteocítica implican un aumento en la fragilidad ósea, como ocurre en huesos de edad avanzada o en procesos patológicos como la osteoporosis, en los que existe una disminución en la comunicación a través de los canalículos óseos, además de una disminución de osteocitos y un mayor número de lagunas óseas vacías (Jilka y O’Brien, 2016).
El osteocito, también participa en la síntesis y mineralización de la matriz osteoide al contribuir a la formación de colágeno tipo I, osteonectina y fosfatasa alcalina. Además, participa en la formación de hueso nuevo en áreas dañadas, reclutando células madre mesenquimales a través de la secreción de osteopontina. Finalmente, regula la formación de hueso a través del complejo Wnt/β-catenina (Raheja et al., 2008; Kramer et al., 2010).
La proteína Wnt estimula la proliferación y diferenciación osteoblástica a través de la activación de la β-catenina. Este complejo es inhibido por la esclerostina, que está codificada por el gen SOST y es capaz de impedir la diferenciación osteoblástica, favorecer su apoptosis, estimular la producción de RANKL por parte de los osteocitos y activar a los osteoclastos. De esta forma, inhibe la formación ósea y participa en procesos patológicos como la osteoporosis (McClung et al., 2014; Virdi et al., 2015;
Ominsky et al., 2017).
La expresión de la esclerostina, proteína sintetizada solo por el osteocito, está regulada por diferentes factores. La administración intermitente de PTH, la prostaglandina E2 (PGE2) o la carga mecánica inhiben su expresión, favoreciendo la formación ósea, incluso en ausencia de reabsorción ósea previa (Bellido et al., 2005; Xiong et al., 2015).
La carga es, por tanto, necesaria para el correcto desarrollo del hueso y la ausencia de carga implica una pérdida de hueso, siguiendo la ley de Wolff. Este proceso se produce por un mecanismo denominado mecanotransducción, en el que el osteocito contenido en su laguna ósea y rodeado de fluido óseo es capaz de detectar las cargas mecánicas e
INTRODUCCIÓN
25 inducir la formación o la reabsorción ósea. Actualmente, se sabe que la carga induce una reducción en los niveles de SOST/esclerostina y, por tanto, favorece la formación de hueso a través del complejo Wnt/ β-catenina y la OPG (Robling et al., 2008; Yan et al., 2020). La mecanotransducción parece producirse en el glicocálix de los osteocitos, por ser la parte más sensible de la célula (Yavropoulou y Yovos, 2016).
Otra de las funciones de los osteocitos es la endocrina. Recientes estudios han demostrado que juegan un papel fundamental en el metabolismo mineral y óseo a través del factor de crecimiento fibroblástico 23 (FGF23) (Wesseling-Perry, 2010). El FGF23 se sintetiza en los osteocitos del hueso mineralizado y es un regulador del metabolismo del fósforo y de la vitamina D y se sabe que sus valores se reducen de forma importante en pacientes con enfermedad renal crónica, produciendo alteraciones en el metabolismo mineral. Esta situación se produce debido a que el FGF23 parece actuar de forma directa sobre la diferenciación osteoblástica y la ausencia del factor de crecimiento genera alteraciones esqueléticas, incluso existiendo fósforo y vitamina D circulantes en cantidades normales (Shimada et al., 2004 ; Sitara et al., 2004 ; Wang et al., 2008).
Los osteocitos, por tanto, controlan el remodelado óseo a través del RANKL y la esclerostina, favoreciendo la formación de osteoclastos u osteoblastos. Las alteraciones en la formación de los osteocitos afectan al remodelado óseo y contribuyen a una menor masa ósea, como ocurre en el caso de huesos de edad avanzada y en la osteoporosis.
Los huesos envejecidos presentan una mayor proporción de matriz mineral respecto a la fracción celular, lo que les confiere fragilidad y mayor tendencia a presentar fracturas.
Además aumenta el número de lagunas óseas vacías y disminuye el número de osteocitos por un aumento de su apoptosis y una disminución de su autofagia (Tresguerres et al., 2020).
La autofagia y la apoptosis son procesos que forman parte de lo que se denomina muerte celular programada (MCP). La primera hace referencia a la capacidad de las células para auto repararse eliminando aquellas partes celulares dañadas, evitando errores acumulados a lo largo del tiempo, y cobra importancia en el caso de los osteocitos por su longevidad. La segunda implica la aparición de cuerpos apoptóticos que son fagocitados por células vecinas sin generar inflamación. Cuando los osteocitos detectan tejido óseo dañado, sufren apoptosis y los osteocitos sanos vecinos sintetizan RANKL y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). A través de este factor de crecimiento, se generan vasos sanguíneos nuevos por los que llegan osteoclastos para
INTRODUCCIÓN
eliminar las células muertas e iniciar el remodelado de la matriz ósea circundante. La apoptosis del osteocito se ha relacionado con el inicio del proceso de remodelado en general y en particular con la reparación del daño debido al acúmulo de fracturas microscópicas (también llamadas micro-cracks), como las encontradas en huesos viejos.
En este sentido, el remodelado óseo puede ser estocástico y dirigido. En general en un adulto normal un 80% del hueso medular y un 95% del hueso cortical están en reposo, y la activación de las BMU ocurre, casi siempre, de forma aleatoria en el espacio y en el tiempo (remodelado estocástico). Por otro lado, un estudio publicado por Burr (2002) sugiere que otra parte del remodelado se dirige, de forma específica, a reparar las fracturas microscópicas que se producen como consecuencia de la carga mecánica y las tensiones locales (remodelado dirigido), desarrollando la teoría mecanostática propuesta por Frost en 1960. Estas fracturas microscópicas son las que aparecen en los huesos viejos. En definitiva, es necesario conocer la biología ósea para desarrollar estrategias terapéuticas, sobre todas aquellas situaciones en las que exista un desequilibrio en el remodelado óseo y la homeostasis mineral (Burr, 2002; Almeida y O’Brien, 2013; Jilka et al., 2013; Tresguerres et al., 2020).
4.2. HORMONA DE CRECIMIENTO (GH)
La GH es una hormona anabólica sintetizada principalmente en el lóbulo anterior de la glándula pituitaria y, en menor medida, en el hígado, los pulmones y el hueso. La hormona hipofisaria es, en realidad, un conjunto de hormonas, en la que la forma mayoritaria es una proteína de 191 aminoácidos y 22kDa, que se llama GH22K, pero también hay otra forma GH20K y otras variantes, cuyo significado se desconoce (Devesa y Devesa, 2021)
Su regulación neuroendocrina es compleja, ya que depende de factores estimuladores hipotalámicos como la hormona liberadora de la hormona de crecimiento (GHRH) o factores inhibidores como la somatostatina (SS) (Giustina et al., 2008). Asimismo, la ghrelina es un factor gástrico que también participa en la regulación de la GH, favoreciendo su secreción (Devesa y Devesa, 2021).
La GH posee una secreción pulsátil y un ritmo circadiano, con picos máximos coincidiendo con las fases del sueño profundo y picos más pequeños que se relacionan con fases de ondas lentas. La secreción de GH presenta un dimorfismo sexual, siendo más altos los pulsos en varones. En los ancianos esta secreción está muy disminuida,
INTRODUCCIÓN
27 por lo que se ha relacionado este declive en la secreción de GH con las alteraciones somáticas que tienen lugar en el proceso de envejecimiento (Toogood et al., 1996). La mayor parte de la GH circulante se encuentra unida a proteínas plasmáticas (GHBP), mientras que únicamente un 20% de la GH presente en el plasma se encuentra en su forma monomérica.
La GH ejerce su acción uniéndose al receptor de GH (GHR), perteneciente a la familia de receptores hematopoyéticos, implicados en procesos de crecimiento y diferenciación celular. Cada molécula de hormona, debe unirse a dos de receptor. Tras la unión al receptor, comienza la transducción mediante la activación de janus kinasa 2 (JAK2), una tirosin quinasa que activa un segundo mensajero, que se trasloca al núcleo, donde activa factores de transcripción de determinados genes, como el gen responsable de la producción de IGF-I (Daughaday, 2000; Moller y Jorgensen, 2009).
4.2.1. EFECTOS DE LA GH SOBRE EL CRECIMIENTO, EL METABOLISMO Y EL HUESO
4.2.1.1. GH y crecimiento
La GH incrementa el metabolismo intracelular de la mayoría de células del organismo, favoreciendo el crecimiento. Es decir, existen receptores para GH en prácticamente todas las células del organismo. Asimismo, además de un efecto endocrino, tiene un efecto autocrino y paracrino, lo que ha llevado a algunos autores a considerarla como un factor de crecimiento local (Harvey y Hull, 1997).
La GH es capaz de estimular el crecimiento longitudinal de organismo, tanto directamente, como a través de IGF-I (procedente del hígado o sintetizado localmente en el hueso). Por otro lado, la GH es capaz de aumentar el crecimiento en espesor del hueso tanto de forma directa como indirecta, a través de IGF-I (Giustina et al., 2008).
Este crecimiento en espesor, o por aposición, es fundamental para la adquisición del pico de masa ósea, que tiene lugar en la treintena y es un factor importante de cara a la aparición de osteoporosis en los pacientes ancianos.
4.2.1.2. GH y metabolismo
La GH es anabólica, lipolítica (aumenta la disponibilidad de ácidos grasos libres) y diabetógena. Favorece la síntesis de proteínas, la lipólisis e induce un resistencia
INTRODUCCIÓN
periférica a la insulina, reduciendo el consumo de glucosa por parte del músculo (Nicholls y Holt, 2016). La GH es anabólica porque en condiciones normales de alimentación promueve un aumento en la producción de insulina e IGF-I, mientras que en períodos de ayuno, la hormona aumenta y promueve el uso de ácidos grasos como fuente de energía, en lugar de las proteínas, y al mismo tiempo, preserva glucosa para el cerebro, desplazando el consumo celular de carbohidratos y el catabolismo de proteínas a expensas de los lípidos. La GH es lipolítica porque su administración es capaz de disminuir la masa grasa, especialmente la grasa abdominal, en sujetos con déficit de hormona y en individuos obesos, volviendo a los niveles de grasa que se observan en personas sanas. Por otro lado, la GH es diabetógena porque es capaz de inducir una resistencia periférica a la insulina, a través de mecanismos que todavía no se conocen con claridad, pero podría deberse a una interacción de la hormona con la señal intracelular de la insulina (Bolamperti et al., 2019).
4.2.1.3. GH y hueso
La GH tiene una acción directa en el hueso al actuar sobre los osteoblastos y los condrocitos, aumentando las mitosis de los condrocitos y favoreciendo su conversión a osteoblastos (Abreu et al., 2015). Además, estimula la diferenciación de los osteoblastos (Kassem et al., 1993), desde las células mesenquimales pluripotenciales de la médula ósea (Bolamperti et al., 2018) y estimula su función, aumentando la síntesis de colágeno, osteocalcina y fosfatasa alcalina. Su acción indirecta se produce al estimular la síntesis de IGF-I e IGF-II por el hígado (Fernández-Tresguerres-Hernández-Gil et al., 2006). La GH no participa en el desarrollo intrauterino del esqueleto, pero sí en el crecimiento longitudinal y en el aumento de la masa ósea mineral en la vida postnatal (Lindsey y Mohan, 2016).
IGF-I e IGF-II son pequeñas moléculas peptídicas con similitudes estructurales a la insulina. Mientras que IGF-II es importante para el crecimiento intrauterino, IGF-I regula el crecimiento del esqueleto y su mantenimiento durante la etapa postnatal, siendo el factor de crecimiento más abundante en la matriz ósea a lo largo de la vida.
IGF-I tiene acciones sistémicas endocrinas a través de la circulación y acciones locales ejercidas de forma autocrina y paracrina. El IGF-I circulante es GH-dependiente y media en los efectos de la GH en el crecimiento longitudinal. Mientras que el IGF-I producido en las células óseas es dependiente de la PTH y media en los efectos
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29 anabólicos que esta hormona ejerce en el hueso (Canalis, 2018). Ambos factores de crecimiento están regulados por hormonas, así la GH, los estrógenos y la progesterona los aumentan y los glucocorticoides los inhiben (Mohan y Kesavan, 2012).
La GH y su mediador IGF-I forman un eje que regula el crecimiento longitudinal de los huesos (importante durante la adolescencia) y el crecimiento aposicional de hueso, que contribuye al aumento de la masa ósea mineral (importante durante la edad adulta), fundamental para adquirir una adecuada resistencia ósea. El crecimiento longitudinal se produce en las placas epifisarias donde los condrocitos son reemplazados gradualmente por tejido mineralizado, a través de un fenómeno conocido como osificación endocondral y el crecimiento en anchura se produce por aposición perióstica mediada por los osteoblastos presentes en el periostio. De esta forma, parece que la GH aumenta el número y la función de los osteoblastos y favorece la síntesis de los precondrocitos en las placas de crecimiento epifisario, mientras que el IGF-I estimula la actividad del osteoblasto (Canalis et al., 2018).
El mayor pico de masa ósea se alcanza en la tercera década de la vida, se mantiene estable hasta la quinta década y a partir de ese momento comienza a disminuir. Esta disminución parece coincidir en el tiempo con una disminución de la GH y del IGF-I, por una bajada en los niveles de GHRH y un aumento de la SS (Ohlsson et al., 1998;
Mohan et al., 2003; Lindsey y Mohan, 2016; Toogood et al., 1996) .
A lo largo de los años, se han realizado numerosas investigaciones tratando de evaluar los efectos de la GH in vitro e in vivo sobre el hueso, obteniéndose resultados muy prometedores que demuestran el potencial de la hormona en distintas situaciones:
4.2.1.3.1. Efectos in vitro
Kassem et al. (1993) demostraron en su estudio in vitro que la GH era capaz de estimular la proliferación y la diferenciación de los osteoblastos, aumentando la incorporación de H3 timidina en las células y otros marcadores bioquímicos como la fosfatasa alcalina, la osteocalcina o el propéptido C-terminal del protocolágeno tipo I (PICP). Todos ellos son marcadores de formación ósea y la H3 timidina se utiliza como medida de síntesis de DNA y, por tanto, de crecimiento celular.
Por otro lado, Nishiyama et al. (1996) desarrollaron un estudio para valorar las posibles acciones de la GH sobre la reabsorción ósea y la diferenciación osteoclástica.
INTRODUCCIÓN
Los autores observaron que la GH estimulaba la reabsorción ósea llevada a cabo por los osteoclastos, favoreciendo la diferenciación de los mismos y activando a los osteoclastos maduros de forma indirecta, fundamentalmente a través del linaje osteoblástico. Fueron los primeros en demostrar que la GH in vitro estimula la diferenciación osteoclástica.
Recientemente, Bolamperti et al. (2019) demostraron que la GH es capaz de promover la diferenciación de la estirpe osteoblástica desde las células mesenquimales pluripotenciales a través de la vía de la Wnt y de inhibir la diferenciación de los adipocitos.
4.2.1.3.2. Efectos in vivo en animales 4.2.1.3.2.1. GH sistémica
Jorgensen et al. (1991) demostraron en sus investigaciones que la administración sistémica de GH en ratas jóvenes aumentaba la resistencia mecánica de los huesos y esto, podía explicarse directamente por un aumento en el grosor de la cortical de los huesos largos. El estudio se realizó en tibias y fémures, que se sometieron a tests biomecánicos.
Bak et al. (1990), estudiaron el efecto de la GH en la cicatrización de fracturas óseas en ratas jóvenes. Los autores inyectaron en los animales del grupo experimental GH subcutánea observando los efectos en la cicatrización a los 20 y 40 días. A los 20 días, pudieron comprobar que no existían diferencias en las propiedades mecánicas entre las fracturas cicatrizadas y el hueso intacto. A los 40 días, las propiedades mecánicas habían aumentado en un 400% en el grupo experimental respecto al grupo control.
Bak y Andreassen (1991), estudiaron la acción de la GH sobre la consolidación de las fracturas óseas, pero en ratas viejas. La administración de GH consiguió estimular la cicatrización, aumentando las propiedades biomecánicas tras la fractura tibial experimental pero no a los 40 días como en ratas jóvenes, sino a los 80 días.
4.2.1.3.2.2. GH local
El primer estudio que se realizó con GH administrada de forma local para estudiar su efecto en la osteointegración fue el de Tresguerres et al. (2002). En este trabajo se indujo una osteoporosis experimental, mediante ovariectomía bilateral y dieta
INTRODUCCIÓN
31 hipocálcica, se colocaron implantes laminares en tibias de las conejas osteoporóticas y se aplicó de forma local una dosis de 4 UI de GH (equivalentes a 1,3 mg) en forma de polvo liofilizado, en el interior del lecho óseo, justo antes de la colocación del implante.
A las dos semanas, se observó que la GH era capaz de producir un “efecto impulso”, estimulando la respuesta osteogénica peri-implantaria, tanto a nivel cortical como a nivel medular, a pesar de la baja disponibilidad de calcio sistémico.
Este mismo grupo de investigadores (Tresguerres et al., 2003) estudiaron el efecto de la GH en el hueso de un animal sin osteoporosis y con implantes dentales convencionales.
Observaron que la administración de una dosis de 4 UI de GH era capaz de aumentar el BIC, tanto a nivel cortical como a nivel trabecular, aumentando la respuesta osteogénica peri-implantaria, tanto a nivel del hueso cortical como del medular.
En un tercer estudio, este mismo equipo de investigadores (Tresguerres et al., 2005), estudiaron el efecto de la GH administrada localmente a lo largo del tiempo. Usaron implantes laminares y conejas jóvenes sin osteoporosis y las sacrificaron en varios tiempos (1, 2, 3 y 6 semanas). Observaron que la GH era capaz de aumentar el número y grosor de las trabéculas neoformadas procedentes del periostio en la segunda semana, siendo más irregulares que en el grupo control, mientras que en la sexta semana se observaba un tejido neoformado más maduro. Por lo que se concluyó que la GH era capaz de acelerar el proceso de remodelado óseo, estimulando las primeras fases del mismo.
Martin-Monge et al. (2017), siguiendo la metodología de Tresguerres et al. (2002) pero utilizando implantes dentales y la mitad de la hormona (2 UI), mostraron un BIC significativamente mayor en las conejas ovariectomizadas y con GH local, posiblemente debido a que la hormona colocada en el lecho quirúrgico pudo actuar sobre las fases iniciales del remodelado óseo y acelerar la osteointegración de los implantes.
4.2.1.3.3. Efectos en seres humanos
El déficit de GH en niños tiene una etiología distinta al déficit de GH en adultos. En los niños, en la mayoría de los casos, el origen es desconocido por lo que suele diagnosticarse como un déficit de GH idiopático, sin embargo, puede ser secundario a cirugías para extirpar tumores cerebrales que afectan al hipotálamo o a la hipósifis como el craneofaringioma y también puede ser secundario a la radioterapia de tumores
INTRODUCCIÓN
malignos cerebrales. En los adultos, el déficit de hormona es secundario a cirugías para extirpar tumores como el adenoma hipofisario o después del tratamiento de tumores cerebrales malignos con radioterapia (Giustina et al., 2008).
El déficit de GH en la infancia provoca menor estatura y además produce menos masa muscular y ósea en los niños. Esta disminución en la estatura se presenta en un 40% de los casos, incluso después de recibir terapia de reemplazo con hormona de crecimiento recombinante humana (rhGH). Además, la concentración sérica de IGF-I está disminuida y cuando se analiza la densidad mineral ósea (DMO) vertebral en estos niños, se observan valores del T-score entre -1 y -2 desviaciones estándar, lo que indica una densidad baja, mientras que los valores del T-score en adultos con déficit de GH suelen estar en -1 desviación estándar o por encima. Esto puede explicarse porque, en los niños, aun no se ha alcanzado el pico máximo de masa ósea y, en general, el déficit hormonal tiene una duración mayor. En adultos con déficit de GH, el grado de pérdida ósea tiene una relación directa con la edad, la duración del proceso patológico y su severidad. En estos casos, cuando presentan únicamente un déficit de GH, sin estar afectadas el resto de las hormonas, puede observarse osteopenia y osteoporosis (Giustina et al., 2008; Ohlsson et al., 1998).
En adultos en tratamiento con terapia de reemplazo mediante rhGH, el remodelado óseo aumenta y puede observarse en los marcadores bioquímicos de formación y reabsorción ósea. La administración de GH genera un proceso bifásico, en el que inicialmente hay un período de reabsorción ósea después de los primeros 3 meses de tratamiento y posteriormente hay una marcada formación ósea más allá de los 6 meses de terapia. Por lo tanto, la formación de hueso se consigue con períodos largos de tratamiento, independientemente de la pauta de administración de la GH. Además, produce un aumento de los niveles de calcio en suero y orina, por una mayor absorción a nivel intestinal y una mayor reabsorción a nivel renal (Giustina et al., 2008; Ohlsson et al., 1998).
El efecto de la administración de GH en la DMO depende de la duración del tratamiento y suele ser variable. Inicialmente, por la reabsorción ósea que se produce a partir del tercer mes de tratamiento, la DMO disminuye. Si bien, aunque a partir del sexto mes de tratamiento aumenta la formación de hueso y la masa ósea, la DMO no aumenta hasta pasados 18 meses desde el inicio de la terapia de reemplazo en adultos y entre 6 y 12 meses después en niños (Giustina et al., 2008; Ohlsson et al., 1998).
INTRODUCCIÓN
33 La DMO en el caso de mujeres postmenopáusicas con osteoporosis, tiene valores iguales o inferiores a -2,5 desviaciones estándar en el T-score vertebral, según los criterios de la OMS. El estudio más largo realizado en este tipo de pacientes, lo llevaron a cabo Krantz et al. (2015). Los autores trabajaron con 80 mujeres osteoporóticas divididas en tres grupos: un grupo control, un grupo en tratamiento con 1 UI de GH subcutánea y otro grupo con 2,5 UI de GH subcutánea. La administración de GH se llevó a cabo durante 3 años y el seguimiento de los pacientes se efectuó durante 10 años, es decir, incluyendo los 7 años posteriores a la finalización del tratamiento hormonal. La investigación arrojó unos resultados prometedores, pues la DMO fue significativamente mayor en los grupos experimentales respecto al grupo control, fundamentalmente durante el cuarto y el quinto año del estudio, y en las pacientes en las que se administraron 2,5 UI de GH, la DMO continuó siendo ligeramente mayor, respecto a los otros dos grupos, a los 10 años. Por otro lado, el porcentaje de fracturas óseas se redujo a la mitad en las pacientes en tratamiento con GH respecto al grupo control. A través de estos resultados, se confirmó el efecto beneficioso de la GH sobre el hueso en mujeres con osteoporosis.
En sujetos sanos también se estudió el efecto de la administración sistémica de GH. Una de esas investigaciones la llevaron a cabo Brixen et al. (1990) en hombres jóvenes. En ella, los autores seleccionaron 20 adultos con edades comprendidas entre los 22 y los 31 años, sin patologías sistémicas ni tratamiento farmacológico de ningún tipo. Les administraron 0,1 UI de GH subcutánea por kilogramo de peso dos veces al día durante 7 días en el grupo experimental y un placebo administrado de la misma forma en el grupo control. El análisis de los resultados mostró un aumento sérico en los niveles de IGF-I durante el tratamiento, además aumentaron los niveles séricos de fosfatasa alcalina, de calcio y de fósforo, como indicadores de formación ósea. Por otro lado, observaron un aumento en el ratio hidroxiprolina/creatinina y en el ratio calcio/creatinina, como marcadores de reabsorción ósea. A través de estos datos se pudo concluir que la administración de GH, aun siendo pautada en cortos períodos de tiempo, producía un efecto claro en el metabolismo del hueso, participando activamente en el proceso de remodelado óseo.
Un importante estudio de la administración de GH sobre sujetos sanos en la senectud, lo llevaron a cabo Rudman et al. (1990). En su investigación incluyeron 21 hombres con edades comprendidas entre los 61 y los 81 años que dividieron en dos grupos (control y
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experimental). El estudio duró 12 meses y a partir del séptimo mes, inyectaron 3 veces a la semana 2,6 UI de GH subcutánea al grupo experimental. Al analizar los resultados, encontraron mayores niveles séricos de IGF-I en este grupo, mayor DMO vertebral y un aumento significativo de la masa corporal magra, que hace referencia al conjunto de músculos del cuerpo, es decir, la composición corporal libre de grasa. La disminución en la masa corporal magra, que acontece en la vejez, suele coincidir con una disminución en la actividad del eje GH/IGF-I. Los hallazgos de este estudio sugieren que esta disminución de la masa corporal y de la DMO podrían solventarse mediante la administración de GH en la vejez.
Cuando se va a iniciar una terapia con GH, se deben considerar de manera especial aquellos pacientes con infecciones sistémicas, grandes traumatismos o grandes quemados. La razón es la posibilidad que tienen de desarrollar una resistencia a la hormona, cuya etiología es multifactorial, y que conlleva una inhibición de sus efectos deseables. Se caracteriza por presentar niveles altos de GH, bajos niveles de IGF-I y una respuesta anabólica pobre (Locatelli y Bianchi, 2014). Además, otra de las principales preocupaciones que existe en pacientes en tratamiento con GH es la posibilidad de desarrollar tumores, como consecuencia de sus propiedades mitogénicas y proliferativas.
El riesgo parece incierto, si bien en estudios a largo plazo sobre la mortalidad y las causas de muerte en pacientes en tratamiento con GH, ninguno de los pacientes falleció por procesos tumorales, y tampoco por eventos cardiovasculares (Locatelli y Bianchi, 2014; Sävendhal et al., 2012). Sin embargo, en adultos pueden aparecer efectos adversos como la resistencia a la insulina o el síndrome del túnel carpiano. La primera suele afectar a pacientes obesos, en tratamiento con glucocorticoides o con una historia familiar de diabetes mellitus. En el caso del síndrome del túnel carpiano, suele presentarse en pacientes adultos con déficit de GH, que se encuentran inmersos en el tratamiento de reemplazo de la hormona. Los niños pueden desarrollar, como complicaciones derivadas del tratamiento con GH, hipertensión intracraneal y epifisiolisis de la cabeza femoral. Si aparece cualquiera de las complicaciones mencionadas, tanto en adultos como en niños, se debe suspender el tratamiento con GH e iniciar el tratamiento específico para la patología (Blethen y MacGillivray, 1997).
INTRODUCCIÓN
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4.3. IMPLANTES EXPERIMENTALES DE Ti@SiHA
La osteointegración, definida como la unión directa, estructural y funcional entre el hueso vivo y un implante sometido a carga funcional, es necesaria para estabilizar las prótesis sobre implantes y aumentar su eficacia. Una de las causas que puede dificultarla es la superficie del implante, cuando ésta no favorece el crecimiento de hueso nuevo. Por esta razón, la investigación sobre materiales que faciliten la osteointegración debe ser clave en el desarrollo de nuevos diseños de implantes osteointegrados (Bränemark et al., 1977; Healy et al., 1999).
En la actualidad, una de las alternativas para mejorar la osteointegración, en situaciones en las que el hueso presenta características desfavorables, son los andamiajes macroporosos metálicos funcionalizados. Los metales con una estructura de poros interconectados tienen especial interés por su capacidad para facilitar el crecimiento de tejido, permitiendo la penetración de las células y de los vasos sanguíneos en el interior de su estructura, que suministran los nutrientes necesarios al tejido en regeneración, además de manifestar unas propiedades mecánicas adecuadas (Heinl et al., 2008).
La funcionalización de la superficie de las estructuras metálicas de Ti6Al4V con cerámicas bioactivas constituye una alternativa muy prometedora, pues favorecen la fijación de factores de crecimiento involucrados en la osteogénesis. En este sentido, la hidroxiapatita dopada con silicio (SiHA) se ha convertido en una de las biocerámicas más atractivas para su utilización en traumatología y en cirugía oral y maxilofacial (Izquierdo-Barba et al., 2019).
La fracción mineral del hueso está formada, fundamentalmente, por hidroxiapatita (HA), una cerámica cristalina constituida por fosfato cálcico, que le confiere rigidez y resistencia a la compresión. Los materiales a base de fosfato cálcico como la hidroxiapatita sintética (Ca10[PO4]6[OH]2) son ampliamente utilizados en cirugía porque se unen directamente al hueso después de su implantación, y su composición se asemeja a la fracción mineral ósea, sin embargo, los implantes a base de HA requieren un tiempo más largo para la aparición de aposición ósea sobre su superficie, lo que alarga significativamente el período de rehabilitación del implante. La SiHA ha demostrado una mejora en la bioactividad comparada con la HA en estudios in vivo e in vitro.
INTRODUCCIÓN
Por lo tanto, el desarrollo de SiHA mejora la tasa de crecimiento óseo y con ello la fijación ósea temprana (Thian et al., 2005; Porter et al., 2004; Webster et al., 2001;
Feito et al., 2011; Manzano et al., 2011; Patel et al., 2002).
El efecto favorable de la SiHA se ha explicado a través de mecanismos activos y pasivos, como un aumento en la solubilidad del material, cambios topográficos, reducción del tamaño de partícula, modificaciones de la carga superficial y liberación de iones de silicio y calcio que actúan directamente sobre las células óseas (Izquierdo- Barba et al., 2019).
Su bioactividad y, por tanto, su capacidad de unión al hueso, ocurre por una disolución parcial de la cerámica, aumentando las concentraciones locales de calcio y fósforo.
Posteriormente los iones de calcio y fósforo liberados, junto con iones carbonato y proteínas del medio biológico forman una capa en la superficie del implante en la que los osteoblastos pueden proliferar y diferenciarse (Izquierdo-Barba et al., 2019).
Se sabe, además, que el silicio es crucial en las primeras etapas de la calcificación e influye en la actividad biológica de los biomateriales a base de fosfato cálcico, al modificar sus propiedades y por los efectos directos sobre los procesos fisiológicos del hueso (Thian et al., 2006; Patel et al., 2005).
Los implantes de titanio recubiertos con hidroxiapatita dopada con silicio (Ti@SiHA), han demostrado en estudios in vitro favorecer la proliferación de preosteoblastos en cultivos celulares. En estudios in vivo sobre ovejas, se observó la presencia de hueso nuevo formado en el interior de los macroporos de los implantes de Ti@SiHA, además de la formación de hueso nuevo en la periferia del defecto óseo. Este crecimiento podría iniciarse directamente en el interior de los implantes o llegar al interior del implante partir de las zonas periféricas del defecto óseo, pudiendo indicar propiedades osteoinductivas por parte de la SiHA o ser debidas a su capacidad de adsorción (Izquierdo-Barba et al., 2019).
Precisamente la adsorción es una de las ventajas de estos materiales por la posibilidad de incorporarles factores de crecimiento como VEGF o el factor de crecimiento fibroblástico tipo 2 (FGF-2), que una vez inmovilizados en el implante pueden ser útiles para mejorar sus propiedades y favorecer la regeneración tisular, especialmente en el tejido óseo (Izquierdo-Barba et al., 2019; Matesanz et al., 2012).
5. MATERIALES Y METODOLOGÍA
MATERIALES Y METODOLOGÍA
5.1. MATERIALES
5.1.1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Se utilizaron 24 conejos machos sanos de la cepa Nueva Zelanda de 6 meses de edad y 4kg de peso.
Las condiciones de estabulación en el Animalario de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense de Madrid fueron:
• Temperatura: 22-24 ºC
• Luz: 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad
• Humedad: 55-70%
• Ventilación: 15 renovaciones por hora
• Alimentación: dieta de mantenimiento de conejo (Panlab S.L, Barcelona, España)
5.1.2. MATERIAL DE EXPERIMENTACIÓN
Se utilizaron implantes macroporosos de titanio grado V (Ti6Al4V) fabricados a través de un proceso denominado Electron Beam Melting (EBM) en colaboración con el Instituto Tecnológico de Canarias (ITC), que constituyen el grupo control sin recubrir.
Para el grupo experimental, estos implantes se recubrieron de hidroxiapatita dopada con silicio (Ti@SiHA) mediante una técnica de inmersión denominada dip-coating por el Grupo de Investigación en Biomateriales Inteligentes (GBI) del Departamento de Química en Ciencias Farmacéuticas de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid.
Todos los implantes utilizados en las calotas de los conejos tienen unas dimensiones de 5x5x2 mm.
Además, se utilizó hormona de crecimiento recombinante humana (rhGH) de 3,33 mg (Saizen®, Merk Serono S.p.A, Modugno, Bari, Italia) que consta de dos viales. Uno de ellos contiene rhGH 3,33 mg liofilizada y el otro vial contiene disolvente a base de cloruro sódico al 0,9% en agua para inyección y alcohol bencílico al 0,9%. El vial con la rhGH liofilizada se utilizó para la administración local de GH, mientras que la mezcla de ambos viales permitió su administración subcutánea y, por tanto, sistémica.
