Servicio al Cliente (EUA): [email protected] Servicio al Cliente (UE): [email protected]
Condiciones de almacenamiento: -65°C a -85ºC
(Los controles de ADN pueden separarse del resto de los materiales del ensayo y mantenerse a una temperatura entre 2°C y 8°C)
Nro. de Catálogo Productos
Cantidad
IdentiClone™ BCL2/JH Translocation Assay
Para la Identificación de Linfoma Folicular y de otros Linfomas y Leucemias Para Diagnóstico In Vitro
Simbología utilizada
Para Diagnóstico In Vitro
Número de Catálogo
Volumen de Reactivo
Número de Lote
Condiciones de Almacenamiento
Fecha de Vencimiento
Representante Autorizado en la Unión Europea
Fabricante
Consulte las Instrucciones para su Uso
IdentiClone™ BCL2/JH Translocation Assay – Gel Detection
Contenidos
1. MARCA REGISTRADA ... 3
2. USO PREVISTO... 3
3. RESUMEN Y DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO... 3
4. PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO... 4
4.1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)... 4
4.2. DETECCIÓN EN GELES... 4
5. REACTIVOS ... 5
5.1. COMPONENTES... 5
5.2. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS... 5
5.3. ALMACENAMIENTO Y MANIPULACIÓN... 6
6. INSTRUMENTOS... 6
6.1. TERMOCICLADOR... 6
6.2. UNIDAD DE ELECTROFORESIS... 6
6.3. UNIDAD DE ILUMINACIÓN UV ... 6
7. RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ... 7
7.1. PRECAUCIONES... 7
7.2. SUSTANCIAS QUE INTERFIEREN... 7
7.3. REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y SU MANIPULACIÓN... 7
7.4. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA... 7
7.5. CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA... 7
8. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO ... 7
8.1. MATERIALES SUMINISTRADOS EN EL KIT... 7
8.2. MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS EN EL KIT... 8
8.3. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS... 8
8.4. AMPLIFICACIÓN... 9
8.5. DETECCIÓN EN GELES –GELES DE AGAROSA TBE... 10
8.6. CONTROL DE CALIDAD... 10
8.7. CONTROLES POSITIVOS RECOMENDADOS... 10
9. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ... 10
9.1. ANÁLISIS... 11
9.2. INTERPRETACIÓN DE LA MUESTRA PROBLEMA... 11
10. LIMITACIONES DEL ENSAYO ... 12
11. VALORES ESPERADOS ... 12
11.1. TAMAÑO ESPERADO DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS... 12
11.2. RESULTADOS DE LA MUESTRA... 13
12. CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS ... 15
13. BIBLIOGRAFÍA ... 15
14. SERVICIO TÉCNICO Y AL CLIENTE... 15
15. ASPECTOS LEGALES... 16
1. Marca Registrada
IdentiClone™ BCL2/JH Translocation Assay – Gel Detection
IdentiClone™ BCL2/JH Translocation Assay MegaKit – Gel Detection
2. Uso Previsto
El IdentiClone™ BCL2/JH Translocation Assay, es una prueba diagnóstica in vitro basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), diseñada para la identificación de las translocaciones genéticas BCL2/JH t(14;18) en pacientes con sospechas de enfermedades linfoproliferativas.
Específicamente, el BCL2/JH Translocation Assay puede utilizarse con los siguientes fines:
Distinguir linfoma de hiperplasia linfoide benigna.
Distinguir linfoma folicular de otros linfomas de células B que puedan tener una apariencia similar.
Monitorizar y evaluar recurrencias de la enfermedad.
3. Resumen y descripción del ensayo
La translocación genética BCL2 t(14;18) (q32;q21) está presente en el 80-90% de los linfomas foliculares y en el 30% de los linfomas difusos de células grandes. La translocación raramente esta presente en otras enfermedades linfoproliferativas. La translocación t(14;18) produce una yuxtaposición del gen BCL2 con el segmento de unión de del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IGH). Esto conduce a un marcado incremento de la expresión de bcl-2 promovido por el potenciador del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. La proteína bcl-2 inhibe la muerte celular programada (apoptosis) produciendo acumulación celular.
La mayoría de los puntos de rotura en 18q21-22 ocurren dentro de la región mayor de puntos de rotura (Mbr) en la región no traducida 3’ del exón 3 (60-70% de los casos), y en la región del cluster menor (mcr) ubicada en la region 3’ hacia el exón 3 de BCL2 (20-25%) de los casos. Algunos puntos de rotura ocurren en loci distantes y no serán identificados por este ensayo en particular. Por lo tanto, un resultado negativo no excluye completamente la presencia de un reordenamiento genético BCL2/JH en la muestra1. Los resultados de este ensayo deben ser siempre interpretados en el contexto de datos morfológicos y otros datos relevantes, y no como única herramienta para el diagnóstico de una neoplasia.
El ensayo IdentiClone™ de InVivoScribe Technologies representa una nueva propuesta para la determinación diagnóstica de clonalidad basada en la PCR. Estos ensayos estandarizados fueron rigurosamente optimizados analizando muestras controles positivas y negativas empleando múltiples master mixes (mezclas de reacción). El desarrollo del ensayo fue seguido por un extenso proceso de validación que incluía la determinación analítica de más de 400 muestras clínicas clasificadas según la Clasificación Revisada Europea/Americana de Linfomas (REAL). Las determinaciones fueron hechas en más de 30 centros de diagnóstico destacados e independientes diseminados a través de toda Europa en el marco de un estudio de colaboración conocido como la Acción Concertada BIOMED-2. Los resultados del estudio BIOMED-2 se encuentran publicados en Leukemia, una revista especializada líder en el área1.
Los ensayos basados en la detección en geles no son capaces de detectar de manera fiable poblaciones clonales que representen menos del 1% de la población total de linfocitos. Debe enfatizarse que los resultados de los ensayos moleculares de clonalidad deben interpretarse siempre en un contexto conjunto de datos clínicos, histológicos e inmunofenotípicos.
El presente ensayo incluye 4 mezclas de reacción. Las mezclas de reacción de la translocación BCL2/JH (BCL2/JH Tubes A, B & C) hibridan en la región de unión (J) del gen de la cadena pesadad de las inmunoglobulinas, y en distintas regiones del gen BCL2. Estas mezclas de reacción son utilizadas para detectar la región mayor de puntos de rotura (Mbr) y la región del cluster menor (mcr) de las translocaciones BCL2 t(14;18). La cuarta mezcla de reacción, la mezcla de reacción Specimen Control Size Ladder (control de muestra con marcador de tamaño) hibrida con varios genes amplificando una serie de productos de aproximadamente 100, 200, 300, 400 y 600 pares de bases para asegurar que la calidad y cantidad de ADN inicial es la adecuada para generar un resultado válido. En todos nuestros ensayos de clonalidad se utiliza un único programa de termociclador y metodologías de detección similares con lo que se mejora la consistencia interna y facilita el entrenamiento en una gama amplia de ensayos diferentes.
4. Principios del Procedimiento
4.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Los ensayos de PCR son utilizados de manera rutinaria para la identificación de translocaciónes genéticas. Estos ensayos apuntan a las regiones Mbr y mcr de las translocaciones BCL2/JH y amplifican ADN genómico situado entre los cebadores que hibridan en el gen BCL2 y en las regiones conservadas de unión (J) del gen IGH (BCL2/JH Tube A, B & C).
Los puntos de rotura que ocurren por fuera de las regiones Mbr y mcr no serán identificados por este ensayo en particular.
Por lo tanto, un resultado negativo no excluye completamente la presencia de un reordenamiento genético BCL2/JH en la muestra1. ADN de una población normal de linfocitos tambien arrojará un resultado negativo.
Figura 1. Representación de un diagrama esquemático de la translocación BCL2/JH t(14;18) mostrando el gen BCL2 a la izquierda y el gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IGH) a la derecha. Las flechas negras indican las posiciones relativas y orientaciones de los cebadores de la región mayor de puntos de rotura (Mbr), de los cebadores de la región del cluster menor (mcr) y del cebador JH, que están incluidos en los 3 tubos de las mezclas de reacción BCL2/JH.
4.2. Detección en Geles
La electroforesis en geles, como la electroforesis en geles de agarosa o en geles de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes (PAGE), normalmente se utiliza para resolver los amplicones de diferentes tamaños de acuerdo a su tamaño, carga y estructura conformacional. Debido a que el ADN está cargado negativamente, cuando se aplica una diferencia de potencial eléctrico (voltaje) a través del gel que contiene los productos de amplificación por PCR, el campo eléctrico impulsa la migración de los amplicones a través del gel. Los fragmentos de ADN de menor tamaño son capaces de migrar fácilmente a través de la matriz del gel, mientras que los fragmentos de ADN más grandes migran más lentamente. Esto ocasiona la separación de los productos de amplificación de acuerdo a su tamaño. El bromuro de etidio, u otro colorante que se intercale en las hebras del ADN, puede ser luego utilizado para teñir y detectar estos productos en el gel.
5. Reactivos
5.1. Componentes
9-309-0020 IdentiClone™ BCL2/JH Translocation Assay – Gel Detection 33 Reacciones 9-309-0040 IdentiClone™ BCL2/JH Translocation Assay MegaKit – Gel Detection 330 Reacciones
Tabla 1
Reactivo Número de Catálogo
Componentes del reactivo
(ingredientes activos) Cantidad
9-309-0020 Nro. de unidades
9-309-0040 Nro. de unidades
T° de Conservación
2-309-0050
BCL2/JH Tube A – Unlabeled
Oligonucleótidos que hibridan en la región mayor de puntos de rotura (Mbr) del gen BCL2 y en la región J del gen IGH en solución salina tamponada.
1500 µL 1 10 -65 to -85°C
2-309-0060
BCL2/JH Tube B – Unlabeled
Oligonucleótidos que hibridan en la región 3’ del cluster mayor de puntos de rotura (3’Mbr) del gen BCL2 y en la región J del gen IGH en solución salina tamponada.
1500 µL 1 10 -65 to -85°C
Mezclas de Reacción (Master Mixes)
2-309-0070
BCL2/JH Tube C – Unlabeled
Oligonucleótidos que hibridan en la región del cluster menor (mcr) del gen BCL2 y en la región J del gen IGH en solución salina tamponada.
1500 µL 1 10 -65 to -85°C
Mezcla Control de Amplificación
de la Muestra
2-096-0020
Specimen Control Size Ladder – Unlabeled
Múltiples oligonucleótidos que hibridan en diferentes genes endógenos.
1500 µL 1 10 -65 to -85°C
4-088-1750
IVS-0030 Clonal Control DNA 200 μg/mL de ADN en solución TE 1/10 100 µL
100 µL 1 5
2 to 8°C -65 to -85°C or
4-090-0070
IVS-P002 Clonal Control DNA 1600 pg/mL de ADN plasmídico diluido en IVS-0000 Polyclonal Control DNA en solución TE 1/10
100 µL 1 5
2 to 8°C or -65 to -85°C Controles
Positivos de ADN
4-088-1810
IVS-0031 Clonal Control DNA 200 μg/mL de ADN en solución TE 1/10 100 µL
100 µL 1 5
2 to 8°C or -65 to -85°C Control Negativo
(Normal) de ADN 4-092-0010 IVS-0000 Polyclonal Control DNA
200 μg/mL of DNA in 1/10th TE solution 100 µL 1 5
2 to 8°C -65 to -85°C or
Nota: No se ha utilizado conservante alguno en la fabricación de este producto.
5.2. Precauciones y Advertencias
1. Este producto es para Uso en Diagnóstico In Vitro
2. El kit de ensayo será usado como un conjunto. Ningún reactivo debe sustituirse por otro reactivo similar proveniente de otro fabricante. El realizar diluciones, reducir los volúmenes de las mezclas de amplificación o cualquier otra desviación del protocolo original pueden afectar la eficacia de este ensayo y/o anular cualquier sublicencia limitada que se adquiera con la compra de este ensayo.
3. Los materiales son estables hasta la fecha de caducidad que se indica en la etiqueta cuando son manipulados, conservados y almacenados de acuerdo a las instrucciones. No utilizar los productos una vez sobrepasada la fecha de caducidad
4. El cumplimiento riguroso de las instrucciones de uso y el seguimiento del protocolo asegurará un funcionamiento analítico y reproducibilidad óptimos. Debe asegurarse de que el programa del termociclador usado sea el correcto, ya que el uso de otros programas puede dar lugar a datos erróneos o inexactos, como resultados falsos positivos y falsos negativos.
5. No mezclar o combinar los reactivos procedentes de kits con diferentes números de lote.
6. Se recuerda al personal del laboratorio que deben usar todos los equipos de protección personal adecuados y trabajar de acuerdo a las buenas prácticas de laboratorio y a las recomendaciones universales para el trabajo con muestras biológicas. Las muestras deben ser manipuladas en instalaciones homologadas de contención de seguridad biológica
y abiertas solamente en cabinas de seguridad biológica certificadas. Se recomienda el uso de agua destilada de grado biología molecular en la preparación del ADN de la muestra.
7. Debido a la sensibilidad analítica de este ensayo, se debe tener un cuidado extremo para prevenir la contaminación de los reactivos o de las mezclas de amplificación con las muestras, controles o materiales amplificados. Todos los reactivos deben ser cuidadosamente examinados para detectar cualquier signo de contaminación (por ej. Controles negativos que generen señales positivas). Se debe descartar inmediatamente cualquier reactivo con sospecha de contaminación.
8. Para minimizar las posibilidades de contaminación, se deben utilizar guantes limpios cuando se manipulen las muestras y los reactivos. Las áreas de trabajo y las pipetas se deben limpiar de forma rutinaria antes de empezar a realizar cualquier reacción de PCR.
9. El proceso de esterilización en autoclave no elimina la contaminación con ADN. El flujo de trabajo en el laboratorio de PCR debe ir siempre en una sola dirección entre las diferentes áreas de trabajo separadas; comenzando en el área de Preparación de las Mezclas de Reacción; siguiendo en el de la Preparación de la Muestra, pasando a continuación al de la Amplificación, y finalmente al de la Detección. No introducir ADN amplificado en las áreas designadas para la preparación de la muestra o de las mezclas de reacción.
10. Todas las pipetas, puntas y cualquier otro equipamiento utilizado en un área particular debe ser utilizado y mantenido dentro de esa área del laboratorio.
11. Con el objetivo de prevenir la contaminación cruzada, y/o con RNasas y DNasas, siempre que sea posible, se debe utilizar material plástico estéril y desechable.
5.3. Almacenamiento y Manipulación
Si el producto no es usado de forma inmediata, el kit debe ser almacenado entre -65°C y -85°C.
La temperatura de almacenamiento óptima para los controles de ADN es entre 2°C y 8°C, aunque también pueden ser almacenados entre -65°C y -85°C.
Todos los reactivos y controles deben ser descongelados y agitados vigorosamente antes de usarse para asegurar que se han resuspendido completamente. La agitación excesiva puede causar roturas en el ADN.
Los materiales son estables hasta la fecha de caducidad indicada cuando son manipulados y almacenados de acuerdo a las instrucciones. No deben utilizarse pasada su fecha de caducidad.
Debido a su alta concentración salina, las mezclas de reacción de PCR son sensibles a los ciclos de congelado/descongelado. En caso necesario, las mezclas de reacción se deben alicuotar en tubos estériles y herméticos, con tapa de rosca y junta de goma.
6. Instrumentos
6.1. Termociclador
Uso ó Función: Amplificación de muestras de ADN
Especificaciones y Características de Funcionamiento:
Rango Térmico Mínimo: de 15°C a 96°C Velocidad Mínima de la Rampa: 0.8°C/seg
Seguir los protocolos de instalación, operación, calibración y mantenimiento del fabricante.
Ver la sección 8.4 Amplificación para el programa del termociclador.
6.2. Unidad de Electroforesis
Uso ó Función: Separación de fragmentos de ADN
Especificaciones y Características de Funcionamiento:
Capaz de aplicar una diferencia de potencial desde 35V hasta 135V durante tiempos prolongados
Seguir los protocolos de instalación, operación, calibración y mantenimiento del fabricante.
6.3. Unidad de Iluminación UV
Uso o Función: Detección de ADN
Especificaciones y Características de Funcionamiento:
Capaz de emitir luz a una longitud de onda de ~302 nm
Seguir los protocolos de instalación, operación, calibración y mantenimiento del fabricante.
7. Recogida y Preparación de la Muestra
7.1. Precauciones
Las muestras biológicas humanas pueden contener materiales potencialmente infecciosos. Todas las muestras deben manipularse de acuerdo con las normas estándar OSHA sobre patógenos de transmisión sanguínea o las normas de bioseguridad de nivel 2.
7.2. Sustancias que Interfieren
Se sabe que las siguientes sustancias interfieren en la reacción de PCR:
1. Quelantes de cationes divalentes 2. Puntas de pipetas de retención baja
3. EDTA (no significativo a bajas concentraciones) 4. Heparina
7.3. Requerimientos de la Muestra y su manipulación
Este ensayo analiza ADN genómico proveniente de las siguientes fuentes:
1. 5 ml de sangre periférica, biopsia de médula ósea, o aspirado de médula ósea anticoagulado con heparina o EDTA (conservado entre 2°C y 8°C y transportado a temperatura ambiente)
2. Un mínimo de 5mm cuadrados (5mm3) de tejido (conservado y transportado congelado; o conservado y transportado en RPMI 1640 a temperatura ambiente o en hielo)
3. 2μg de ADN genómico (conservado entre 2°C y 8°C y transportado a temperatura ambiente)
4. Muestras o cortes de tejido fijados en formol y embebidos en parafina (conservados y transportados a temperatura ambiente)
7.4. Preparación de la Muestra
Extraer el ADN genómico de las muestras de los pacientes tan pronto como sea posible. Resuspender el ADN a una concentración final de 100 μg a 400 μg por ml en TE 1/10 (1 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.1 mM EDTA) o en agua grado biología molecular o grado USP. Este ensayo es un sistema robusto. Un amplio rango de concentraciones de ADN será capaz de generar un resultado válido. Por lo tanto, generalmente no son necesarios la cuantificación y el ajuste de las concentraciones de ADN. El análisis de la muestra problema de ADN con el Specimen Control Size Ladder asegurará que existe ADN en cantidad y calidad suficientes para generar un resultado válido.
7.5. Conservación de la Muestra
El ADN genómico debe conservarse entre 2°C y 8°C o entre -65°C y -85°C hasta el momento de su uso.
8. Procedimiento del Ensayo
8.1. Materiales Suministrados en el Kit
Tabla 2
Número de Catálogo Descripción
2-309-0050 BCL2/JH Tube A – Unlabeled 2-309-0060 BCL2/JH Tube B – Unlabeled 2-309-0070 BCL2/JH Tube C – Unlabeled
2-096-0020 Specimen Control Size Ladder – Unlabeled 4-088-1750 IVS-0030 Clonal Control DNA
4-090-0070 IVS-P002 Clonal Control DNA 4-088-1810 IVS-0031 Clonal Control DNA 4-092-0010 IVS-0000 Polyclonal Control DNA
8.2. Materiales Requeridos pero No Suministrados en el Kit
Tabla 3
Reactivo/Material Reactivos/Materiales y Proveedores Recomendados Notas ADN Polimerasa Applied Biosystems:
AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (Cat# N808-0241) N/A Agua Bi-Destilada Grado
Biología Molecular o Agua Grado USP
N/A El agua debe ser estéril y libre de
DNasas y RNasas.
Pipetas Calibradas
Rainin:
Pipetas P-2, P-20, P-200, y P-1000 O pipetas SL-2, SL-20, SL-200, y SL-1000
Deben ser capaces de medir volúmenes exactos entre 1μl y 1000μl.
Termociclador
Bio-Rad:
MJ Research PTC-100 o PTC-200, PTC-220, PTC-240 Perkin-Elmer
PE 9600 o PE 9700
N/A
Mezcladores Vortex N/A N/A
Placas o tubos para PCR N/A Estériles
Puntas de pipetas con
filtro N/A
Estériles, libres de Pirógenos/RNasas/DNasas Tubos para
microcentrífuga N/A Estériles
Unidad de Electroforesis
en Geles N/A Para geles de poliacrilamida
Agarosa Cambrex: MetaPhor® Agarose (Cat# 50180) NuSieve® 3:1 Agarose (Cat# 50090)
N/A
Bromuro de Etidio Invitrogen:
UltraPure™ 10 mg/ml Ethidium Bromide (Cat# 15595-011) N/A Buffer de Corrida TBE Invitrogen:
Novex® TBE Running Buffer (5X) (Cat# LC6675) Diluir 1:5 antes de usar
Buffer de Siembra en el Gel
InVivoScribe Technologies:
6X Loading Buffer (No Dyes) (Cat# 6-098-0010) 6X Loading Dye I (Light Dyes) (Cat# 6-098-0020) 6X Loading Dye II (Very Light Dyes) (Cat# 6-098-0030) Invitrogen:
10X BlueJuice™ Gel Loading Buffer (Cat# 10816-015) Novex® Hi-Density TBE Sample Buffer (5X) (Cat# LC6678)
N/A
Marcadores de tamaño de ADN 100 bp
Invitrogen:
TrackIt™ 100 bp DNA Ladder (Cat# 10488-058) N/A
8.3. Preparación de los Reactivos
Todas las muestras desconocidas deben ser analizadas usando la mezcla de reacción del Specimen Control Size Ladder. Esto se hace para asegurar que no están presentes inhibidores de la amplificación y que hay ADN en cantidad y calidad suficientes para generar un resultado válido.
Los resultados generados con un análisis único son válidos; no obstante, se recomienda realizar el análisis de cada muestra por duplicado siempre que sea posible. Si el análisis por duplicado genera resultados inconsistentes, es necesario volver a ensayar o analizar la muestra.
Los controles positivo, negativo y blanco deben ser analizados para cada una de las mezclas de reacción.
1. Usando guantes, sacar las mezclas de reacción de reacción del congelador. Dejar que los tubos se descongelen completamente y entonces mezclar suavemente.
2. En una cabina de contención tomar una alícuota suficiente de cada mezcla de reacción y transferirla a tubos de microcentrífuga individuales, limpios y estériles. Los volúmenes de las alícuotas deben ser de 45μl para cada reacción. Se recomienda añadir una reacción extra por cada 15 reacciones, para compensar los errores de pipeteo. De esta manera, para cada mezcla de reacción (excepto para el Specimen Control Size Ladder), el número de reacciones (n) debe ser:
n = 2 × # de muestras (correr cada muestra por duplicado)
+ 1 control positivo de ADN (Ver sección 8.7 Controles Positivos Recomendados) + 1 control negativo de ADN (IVS-0000 Polyclonal Control DNA)
+ 1 control sin templado o blanco (agua)
+ 1 para compensar los errores de pipeteo
n = 2 × # de muestras + 4 Total
Por lo tanto el volumen total de alícuota para cada mezcla de reacción debería ser n × 45μl.
Para la mezcla de reacción del Specimen Control Size Ladder, el número de reacciones (m) debería ser:
m = # de muestras (correr cada muestra por duplicado)
+ 1 control negativo de ADN (IVS-0000 Polyclonal Control DNA)
+ 1 control sin templado o blanco (agua)
+ 1 para compensar los errores de pipeteo
m = # de muestras + 3 Total
Por lo tanto el volumen total de alícuota para la mezcla de reacción del Specimen Control Size Ladder debería ser m × 45μl.
3. Añadir 1.25 unidades (o 0.25μl a 5 unidades/μl) de ADN polimerasa AmpliTaq Gold por reacción a cada mezcla de reacción. El total de polimerasa AmpliTaq Gold que es necesaria añadir a cada mezcla maestra de reacción deberá ser n × 0.25μl, y m × 0.25μl para la mezcla de reacción del Specimen Control Size Ladder. Mezclar suavemente con vortex.
4. Para cada reacción, alicuotar 45μl de la respectiva mezcla de reacción + ADN polimerasa en cada pocillo de una placa de PCR o tubo.
5. Añadir 5μl de la muestra correspondiente (muestra problema de ADN, control positivo de ADN, control negativo de ADN, o agua) en cada pocillo que contenga las respectivas mezclas de reacción. Mezclar suavemente con la pipeta varias veces.
6. Tapar los tubos o cubrir la placa de PCR.
7. Las muestras están ahora listas para ser amplificadas en un termociclador.
Si la amplificación no puede realizarse inmediatamente después de la preparación de los reactivos, la placa de PCR o los tubos pueden ser conservados entre 2°C y 8°C por un período de hasta 24 horas.
Guía Rápida: Para cada mezcla de reacción de reacción y n reacciones, mezclar:
n × 45μl Mezcla de Reacción
n × 0.25μl ADN polimerasa AmpliTaq Gold Vorterear suavemente para mezclar.
Alicuotar 45μl de mezcla de reacción + solución de ADN polimerasa en cada reservorio de reacción.
Agregar 5μl del respectivo Templado a cada reservorio.
Volumen total de reacción = 50μl
8.4. Amplificación
1. Amplificar las muestras usando el siguiente programa de PCR:
(Nota: Se recomienda usar la opción calculada para la medición de la temperatura con los termocicladores PTC BioRad MJ Research.)
Programa Estándar para AmpliTaq Gold Paso 1: 95°C por 7 minutos
Paso 2: 95°C por 45 segundos Paso 3: 60°C por 45 segundos Paso 4: 72°C por 90 segundos Paso 5: Ir a paso 2; repetir 34 veces Paso 6: 72°C por 10 minutos Paso 7: 15°C por tiempo indefinido
2. Retirar los tubos o la placa de amplificación del termociclador.
Aunque el ADN amplificado es estable a temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo, los productos de PCR deben almacenarse entre 2°C y 8°C hasta la detección. La detección debe realizarse dentro de los 30 días posteriores a la amplificación.
8.5. Detección en Geles – Geles de Agarosa TBE
1. Preparar un gel de agarosa MetaPhor o NuSieve 3:1 al 2% en solución tampón TBE 1X.
2. Colocar el gel en la unidad de electroforesis y cubrirlo con solución tampón TBE.
3. Mezclar 20μl de cada producto de PCR con 4μl de buffer de siembra 6X.
4. Sembrar todos estos 20μl de la mezcla en cada reservorio individual del gel y sembrar 4μl de Marcadores de tamaño de ADN 100 bp flanqueando las muestras.
5. Correr el gel a 100V durante 90 minutos. El voltaje y el tiempo de corrida dependen del tamaño del amplicón de PCR, de la longitud del gel y del porcentaje de agarosa en el gel. El voltaje y el tiempo de corrida pueden ser adaptados de acuerdo a estos últimos.
6. Teñir los geles con Bromuro de Etidio u otro colorante equivalente.
7. Colocar el gel sobre la unidad de ilumincación UV para visualizar las bandas.
8. Fotografiar e interpretar los resultados. (Ver secciones 9 Interpretación de los Resultados y 11 Valores Esperados debajo.)
8.6. Control de Calidad
En el kit se suministran controles positivos y negativos (o normales) y deben ser analizados cada vez que se desarrolla el ensayo para asegurar el desarrollo apropiado del mismo. Adicionalmente, se debe incluir un control sin ADN (por ej.
agua) para controlar la posible contaminación de la mezcla de reacción o la contaminación cruzada de las reacciones de PCR debidas al empleo de técnicas asépticas inadecuadas. También se debe incluir un control de la solución tampón para asegurar que el tampón utilizado para resuspender las muestras no ha sido contaminado. Los valores de los controles positivos se encuentran en la sección 11.1 Tamaño Esperado de los Productos Amplificados. Controles adicionales y controles de sensibilidad (diluciones de los controles positivos en el control negativo) se encuentran disponibles en InVivoScribe Technologies.
8.7. Controles Positivos Recomendados
Los tamaños de los productos amplificados mostrados en la tabla se obtuvieron usando una plataforma ABI 3100 o por electroforesis en geles.
Tabla 4 Mezcla de Reacción
Secuencia Blanco
ADN Control Número de
Catálogo
Tamaño del Producto en Pares de Bases1
BCL2/JH Tube A Mbr de BCL2/JH Rango de Tamaños Válido IVS-0030 Clonal Control DNA
--- 4-088-1750
100-2500 254, ~750a BCL2/JH Tube B 3’ Mbr de
BCL2/JH
Rango de Tamaños Válido IVS-P002 Clonal Control DNA
--- 4-090-0070
100-2500
~140 BCL2/JH Tube C mcr de
BCL2/JH
Rango de Tamaños Válido IVS-0031 Clonal Control DNA
--- 4-088-1810
100-2500 382, ~800a Specimen Control
Size Ladder
Genes Múltiples Rango de Tamaños Válido IVS-0000 Polyclonal Control DNA
--- 4-092-0010
100, 200, 300, 400, 600b 100, 200, 300, 400, 600b Nota a: La banda de ~750pb (BCL2/JH Tube A) y la banda de ~800pb (BCL2/JH Tube C) generalmente son bandas débiles.
Nota b: Debido a que los fragmentos de PCR de menor tamaño son preferencialmente amplificados, no es inusual que el fragmento de 600pb presente una señal disminuida o que se pierda completamente.
9. Interpretación de los Resultados
Aunque un resultado positivo es altamente sugestivo de un proceso neoplásico, tanto los resultados positivos como los negativos deben interpretarse en un contexto global con toda la información clínica y los resultados de los ensayos del laboratorio. El rango de tamaños para cada una de las mezclas de reacción ha sido determinado analizando muestras control positivas y negativas. Para una interpretación exacta y significativa es importante tener en cuenta que se deben ignorar las bandas que aparezcan fuera del rango de tamaños válido para cada una de las mezclas de reacción.
9.1. Análisis
1. Muestras que no amplifican después de ser ensayadas repetidamente deber ser informadas como “No se puede informar un resultado de esta muestra debido a que no se obtiene ADN en cantidad o calidad suficiente para su análisis”.
2. Muestras que generan un resultado negativo deben ser repetidas si el control positivo de la reacción no amplificó.
3. Si las muestras analizadas por duplicado generan resultados diferentes, el ensayo debe ser repetido o vuelto a evaluar para aclarar un posible cambio de muestras.
4. Todos los controles del ensayo deben ser examinados previamente a la interpretación de los resultados de la muestra problema. Si los controles no generan los resultados correctos, el ensayo no es válido y las muestras no deben ser interpretadas.
La siguiente tabla describe el análisis de cada uno de los controles y las acciones a seguir basándose en los resultados obtenidos.
Tabla 5
Tipo de Control Resultado Esperado Resultado Aberrante
Control Sin Templado No presenta amplificación, continuar con el análisis.
Amplificación presente, repetir el ensayo.
Control Policlonal El tamaño del producto es consistente con el tamaño esperado de acuerdo a la lista de la sección 11.1 Tamaño Esperado de los Productos Amplificados. No hay reordenamientos clonales presentes.
Continuar con el análisis.
Presenta reordenamientos clonales, repetir el ensayo.
Control Positivo
(Este también puede ser un control de extracción si se añade un material control positivo a través de los procesos de extracción)
El tamaño del producto es consistente con el tamaño esperado de acuerdo a la lista de la sección 11.1 Tamaño Esperado de los Productos Amplificados. Continuar con el análisis.
Repetir el ensayo.
Specimen Control Size Ladder (Este control de amplificación es esencial para muestras de calidad y cantidad desconocida.)
Si todas las bandas de 100, 200, 300, 400, y 600pb están presentes, continuar con el análisis. Debido a que los fragmentos de PCR de menor tamaño son preferencialmente amplificados, es normal que el fragmento de 600pb presente una señal disminuida o que se la pierda completamente. Continuar con el análisis.
Si no se observan bandas, repetir el ensayo a menos que la muestra resulte positiva. Si sólo se observan 1, 2, o 3 bandas, re-evaluar la muestra para determinar una posible
degradación del ADN a menos que la muestra resulte positiva.
9.2. Interpretación de la Muestra Problema
Cuando los controles generan los resultados esperados, las muestras clínicas deben ser interpretadas como se detalla a continuación:
• Una o dos bandas positivas prominentesa dentro del rango de tamaños válido se informa como:
“Positivo para la detección de una translocación BCL2/JH t(14;18) consistente con la presencia de una población celular clonal. En un contexto global de criterios diagnósticos, las poblaciones celulares clonales pueden indicar la presencia de una neoplasia hematológica.”
• La ausencia de bandas positivasa dentro del rango de tamaños válido se informa como:
“Negativo para la detección de una translocación BCL2/JH t(14;18).”
Nota a: Los criterios para definir una banda positiva son los siguientes:
Los productos generados de muestras que caen dentro del rango de tamaños válido y presentan bandas discretas y definidas son consistentes con una banda positiva.
10. Limitaciones del Ensayo
Este ensayo no identifica el 100% de las poblaciones célulares clonales.
Este ensayo no puede detectar de manera fiable una cantidad menor de 1 célula positiva por cada 100 células normales.
Los resultados de las pruebas moleculares de clonalidad siempre deben ser interpretados en el contexto global de datos clínicos, histológicos e inmunofenotípicos.
Los ensayos basados en la técnica de PCR están sujetos a interferencia por la degradación del ADN o por la inhibición de la PCR debida a EDTA, heparina y otros agentes.
11. Valores Esperados
11.1. Tamaño Esperado de los Productos Amplificados
Los tamaños de los productos amplificados mostrados en la tabla se obtuvieron usando una plataforma ABI 3100 o por electroforesis en geles.
Tabla 6 Mezcla de Reacción
Secuencia Blanco
ADN Control Número de
Catálogo
Tamaño del Producto en Pares de Bases1
BCL2/JH Tube A Mbr de BCL2/JH Rango de Tamaños Válido IVS-0000 Polyclonal Control DNA IVS-0030 Clonal Control DNA IVS-0031 Clonal Control DNA
--- 4-092-0010 4-088-1750 4-088-1810
100-2500 --- 254, ~750a --- BCL2/JH Tube B 3’ Mbr de
BCL2/JH
Rango de Tamaños Válido IVS-0000 Polyclonal Control DNA IVS-P002 Clonal Control DNA IVS-0030 Clonal Control DNA IVS-0031 Clonal Control DNA
--- 4-092-0010 4-090-0070 4-088-1750 4-088-1810
100-2500 ---
~140 --- --- BCL2/JH Tube C mcr de
BCL2/JH
Rango de Tamaños Válido IVS-0000 Polyclonal Control DNA IVS-0030 Clonal Control DNA IVS-0031 Clonal Control DNA
--- 4-092-0010 4-088-1750 4-088-1810
100-2500 --- --- 382, ~800a Specimen Control
Size Ladder
Genes Múltiples Rango de Tamaños Válido IVS-0000 Polyclonal Control DNA
--- 4-092-0010
100, 200, 300, 400, 600b 100, 200, 300, 400, 600b Nota a: La banda de ~750pb (BCL2/JH Tube A) y la banda de ~800pb (BCL2/JH Tube C) generalmente son bandas débiles.
Nota b: Debido a que los fragmentos de PCR de menor tamaño son preferencialmente amplificados, no es inusual que el fragmento de 600pb presente una señal disminuida o que se pierda completamente.
11.2. Resultados de la Muestra
Los resultados que se muestran a continuación fueron generados utilizando las mezclas de reacción indicadas. Los productos amplificados fueron corridos en un gel de agarosa al 2%.
Para cada mezcla de reacción:
El carril 1 muestra los datos generados al ensayar un control alternativo de ADN 100% clonal.
El carril 2 muestra los datos generados al ensayar el control recomendado de ADN 100% clonal.
El carril 3 muestra los datos generados al ensayar una dilución al 1% del control recomendado de ADN clonal.
El carril 4 muestra los datos generados al ensayar el control de ADN policlonal, IVS-0000 Polyclonal Control DNA.
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Para la mezcla de reacción del Specimen Control Size Ladder:
El carril 1 muestra un marcador de tamaños de ADN de 100pb.
El carril 2 muestra un marcador de tamaños de ADN de 50pb.
Los carriles 3 y 4 muestran los datos generados al ensayar dos muestras diferentes de ADN genómico.
Figura 5
12. Características Analíticas
La evaluación inicial de este ensayo fue realizada en 3 laboratorios en muestras de ADN derivadas de 124 casos de linfoma folicular (FCL), donde es conocido que se presentra la translocación t(14;18). 109 casos fueron identificados con el gen de fusión BCL2/JH (88%) utilizando este ensayo de PCR. La determinación y evaluación final fue realizada en muestras en 11 laboratorios independientes. Resultados falsos positivos (0.4%) fueron observados solamente en 12 de 3036 análisis.
Este ensayo IdentiClone™ BCL2/JH Translocation Assay resultó ser más sensible que el análisis mediante Southern blot.
La sensibilidad varió muy poco entre las diferentes mezclas de reacción. No obstante, la sensibilidad global del ensayo resultó ser de entre 1 célula positiva en 102 células normales y 1 célula positiva en 103 células normales.
En conclusión, nosotros hemos desarrollado y evaluado las características analíticas de un ensayo robusto de PCR múltiple de 3 tubos con el objetivo de maximizar la detección del punto de rotura de la translocación t(14;18). Esta estrategia es capaz de amplificar a lo largo de la región de puntos de rotura en la mayoría de los casos de linfoma folicular con una translocación citogenéticamente definida.
13. Bibliografía
1. Van Dongen, JJM et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003, 17(12):2257-2317.
14. Servicio Técnico y al Cliente
Fabricante Representante Autorizado y
Asistencia Técnica en la UE InVivoScribe Technologies, Inc. InVivoScribe Technologies, SARL
6330 Nancy Ridge Drive, Suite 106 Le Forum – Bât B
San Diego, California 92121-3230 515 Avenue de la Tramontane
USA ZI Athelia IV
13600 La Ciotat, France
Teléfono: +1 858 623 8105 Teléfono: +33 (0)4 42 01 78 10
Fax: +1 858 623 8109 Fax: +33 (0)4 88 56 22 89
Servicio Técnico: [email protected] Servicio Técnico: [email protected] Servicio al cliente: [email protected] Servicio al Cliente: [email protected]
Sitio Web: www.invivoscribe.com Sitio Web: www.invivoscribe.com
Horario de atención: 7:00AM – 5:00PM PST/PDT Horario de atención: 9:00AM – 5:00PM CET/CEST
Los representantes técnicos y de atención al cliente están disponibles de lunes a viernes para responder a todas sus preguntas, mediante consultas telefónicas, por correo electrónico o en la web.
15. Aspectos Legales
Este es un producto de diagnóstico in vitro. La metodología empleada está protegida por las patentes número 5,296,351 y 5,418,134 de los Estados Unidos de América; por la patente número 626,601 de Australia y por la patente número 2,781,438 de Japón, todas las cuales están bajo licencia exclusiva de InVivoScribe Technologies (“IVS”).
Esta metodología también requiere métodos de amplificación de ácidos nucleicos como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). En determinados países, esta tecnología está o puede estar cubierta por derechos bajo patente de Hoffmann-LaRoche, Inc. y de F. Hoffmann-LaRoche Ltd. Ninguna licencia para el uso de la metodología de PCR cubierta por alguna de estas últimas patentes es otorgada al comprador, expresamente o por implicación, por la simple compra de estos productos.
Como lo es para cualquier uso dentro de los Estados Unidos de América, Australia y Japón (incluyendo el envío de resultados a estos países): La adquisición de este producto incluye una sublicencia limitada para la práctica no comercial y sin fines de lucro de esta tecnología si, y solo si, el comprador está registrado en IVS exclusivamente como un usuario de productos IVS sin fines de lucro. Ninguna licencia para tal uso es otorgada por la simple compra de estos productos. Para solicitar un formulario de registro de usuario exclusivo de productos sin fines de lucro, para discutir los términos de una potencial sublicencia para realizar una práctica más amplia de estos métodos, o por otras inquietudes, por favor contacte con IVS mediante correo electrónico a: [email protected], o por teléfono al número +1 858 623 8105.
IdentiClone™ es una marca registrada de InVivoScribe Technologies.
P/N 280111 Revisión B 2009/05
