INFORME TÉCNICO
Fermentación maloláctica (FML)
Edita FUNDACIÓN PARA LA CULTURA DEL VINO Plaza del Perú, 1.- Esc. Izda. 1ºA
Tel.: 91 343 07 08 - Fax: 91 343 07 09 [email protected] www.culturadelvino.org Presidente: Magín Raventós
Vicepresidente: Guillermo de Aranzábal Gerente: Emilio Castro Medina
Todos los derechos reservados: © Fundación para la Cultura del Vino Traducción: Teresa Sans Morales Diseño: Unaluna Publicidad Madrid 2006
Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación Bodegas Codorníu
Bodegas Julián Chivite Bodegas La Rioja Alta, S.A. Bodegas Vega Sicilia
Fermentación
I. Introducción a la fermentación maloláctica
(FML): las bacteria lácticas y su mecanismo.
1. Historia de la bacteria maloláctica en el vino
2. La práctica de la fermentación maloláctica
3. Bacterias lácticas y fermentación maloláctica
II. Requerimientos y factores de la fermentación
maloláctica
1. Necesidades nutricionales
2. Factores medioambientales
3. Guía para resolver problemas
-aplicación
práctica-III. Incidencias organolépticas, color y efectos al
realizar la fermentación maloláctica
1. Estudios sobre la pérdida de color
2. Percepción del consumidor de defectos
organolépticos del vino por una fermentación
maloláctica sin control
3. Efectos de los contaminantes microbiológicos
inducidos por la fermentación maloláctica
descontrolada en el vino
4. Incidencia cualitativa de la siembra de
bacteria en los vinos tintos
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación
maloláctica
1. Los tipos de vino y el momento óptimo para la
inoculación. Cómo controlar el proceso.
2. Fermentación maloláctica en barrica.
3. Fermentación maloláctica: cuándo y cómo
V. La Microoxigenación
1. Microoxigenación y fermentación maloláctica
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31
53
85
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7
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127
I
Índice
I. Introducción a
la fermentación
maloláctica
(FML): las
bacterias lácticas
y su mecanismo.
I.1. Historia de la bacteria maloláctica en el vino
Sybille KriegerLallemand
I.2. La práctica de la fermentación maloláctica
Didier TheodoreLallemand
I.3. Bacterias lácticas y fermentación maloláctica
Aline Lonvaud-FunelFaculte d´enologie. Universite Victor Segalen Bordeaux 2
9
19
23
9
19
23
H
I.1. Historia de
la bacteria
maloláctica en
el vino
Dra. Sibylle KRIEGER
Lallemand1.1 Taxonomía de las bacterias lácticas del vino
1.2 Ecología y desarrollo de las bacterias lácticas
1.3 Factores que influyen en la supervivencia y desarrollo de las bacterias lácticas en el vino 1.4 Influencia de la fermentación
maloláctica en la composición del vino
1.5 Alteración del vino por las bacterias lácticas
1.6 Control de la fermentación maloláctica
9
9
E
n 1837, en su libro titulado “AShort Education on Suitable Treatments of Vinificated Juices,”1Freiherr von Babodes-cribió el fenómeno de una “segunda” fermentación en los vinos jóvenes, que comenzaba con un incremento de las temperaturas al final de la pri-mavera (normalmente cuando florecí-an las viñas). Esta “segunda” fermenta-ción liberaba CO2y originaba una tur-bidez renovada en los vinos nuevos. Von Babo relacionó esta actividad con la “fusión de la grasa” de la fermenta-ción alcohólica. Recomendó un trasie-go inmediato a una barrica nueva, con adición de SO2, clarificación y reducción de la temperatura, seguido de un segundo trasiego y estabilización con otra adición de SO2.
Durante los estudios sobre las alteraciones del vino que llevó a cabo en 1866, Louis Pasteur aisló las pri-meras bacterias del vino e inició sus “Études sur le vin”2. También se le puede atribuir la autoría de la
opi-nión general de que todas las bacterias presentes en el vino son organismos perjudiciales. La reducción de ácidos observada en el vino se seguía relacionando con la precipitación del ácido tártrico, aunque en 1891, Hermann Müller-Thurgau3 ya había postulado
que la reducción de ácidos podía ser resultante de la actividad bacteriana. Koch4y Seiffert5confirmaron su
teoría en 1898 y 1901 respectivamente. En 1913, con su histórica investigación sobre la bacteria del ácido láctico (bacterias lácticas) en el vino6, Müller-Thurgau
y Osterwalder, explicaron la degradación bacteriana del ácido málico en ácido láctico y CO2mediante la fórmula:
C
C
44H
H
66O
O
55=
= C
C
33H
H
66O
O
33+
+ C
CO
O
22Bautizaron el fenómeno con el nombre de “desacidifi-cación biológica” o “fermentación maloláctica,” y atri-buyeron la responsabilidad del mismo a la Bacterium gracile. En la década de 1950, la aplicación de nuevos métodos enzimáticos ayudó a explicar las reacciones enzimáticas que se producen durante la degradación del ácido málico7. La aplicación de métodos analíticos
más perfeccionados por Radler8, Peynaud9, Beelman10
y Kunkee11permitió comprender mejor las complejas
demandas de nutrientes de las bacterias lácticas del vino, pues la degradación de ácido málico por sí sola sólo proporciona una ventaja energética menor a las cepas bacterianas12.
I.1. Historia de la bacteria maloláctica
en el vino
10
101.1 Taxonomía de las bacterias lácticas del vino
Desde estos primeros hallazgos, la investigación sobre las bacterias lácticas ha mejorado. Se ha revisa-do el nombre de Bacterium gracile, que hace tiempo se utilizaba a menudo como nombre del organismo que causaba la fermentación maloláctica. Los resulta-dos alcanzaresulta-dos por Vaughn13y Radler8handemostra-do que las bacterias lácticas presentes en el mosto de uva y en el vino pertenecen al género de Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y, más recientemente, Oenococcus14. Muchas bacterias
lácti-cas distintas pasaban al mosto y al vino desde la superficie de las bayas, los vástagos, las hojas, el suelo y el material de bodega. No obstante, debido al medio sumamente selectivo que constituyen los diversos mostos y vinos, sólo unos pocos tipos de bacterias lácticas son capaces de desarrollarse en el vino15, 16, 17.La descripción general siguiente es válida
para todas las bacterias lácticas del vino: • Gram-positiva;
• No móvil y no esporulada; • Anaerobios facultativos;
• Metabolismo quimioorganotrófico - Necesitan un medio rico y azúcares fermentables; • Temperatura óptima para su desarrollo
com-prendida entre 20° y 30°C.
Además de sus formas coccideas (redondas) o cilín-dricas, el metabolismo homo o heterofermentativo del azúcar constituye un criterio decisivo para su cla-sificación. Las bacterias homofermentativas producen ácido láctico a partir de la glucosa y/o fructosa. Las bacterias lácticas heterofermentativas producen dió-xido de carbono, etanol y ácido acético, así como ácido láctico, a partir de los mismos hidratos de car-bono. Los lactobacilos pueden poseer ambos tipos de metabolismo de los hidratos de carbono, y se divi-den en tres grupos:
G
Grruuppoo 11:: Homofermentativos estrictos – Este grupo nunca se ha detectado en el vino. G
Grruuppoo 22:: Heterofermentativos facultativos – Una molécula de glucosa se convierte en dos molé-culas de ácido láctico. Las pentosas fermentan en ácido láctico y ácido acético.
G
Grruuppoo 33:: Heterofermentativos estrictos – Fer-mentan la glucosa en ácido láctico, ácido acéti-co, etanol y CO2. Las pentosas fermentan en ácido acético y ácido láctico.
En la tabla siguiente se resume el metabolismo de los hidratos de carbono de las bacterias lácticas corrien-tes en el mosto y el vino.
Tabla 1.
Metabolismo de hidratos de carbono de las bacterias lácticas
Grupo Fermentación Azucar Especies
Lactobacilli
(células forma ovalada)
Heterofermentativa facultativa Grupo 2 Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum Heterofermentativa estricta Grupo 3 Lactobacillus brevis Lactobacillus hilgardii Cocci (células redondas)
Homofermentativa Pediococcus damnosus
Pediococcus pentosaceus
Heterofermentativa Leuconostoc oenos
Oenococcus oeni)
Esta clasificación está sujeta a modificaciones debido a los progresos de la identificación de nuevos aisla-mientos bacterianos a partir del vino, así como a los avances de las técnicas de biología molecular utiliza-das para identificar los aislamientos. Por ejemplo, en 1995 Dicks et al.14 han demostrado que la
Leuconostoc oenos se diferenciaba de otra especie de Leuconostoc no sólo por su crecimiento en medios ácidos, su necesidad de un factor de creci-miento de zumo de tomate y su esquema de fermen-tación de los hidratos de carbono, sino también por la
hibridación ADN/ADN y por los análisis digitales de los esquemas proteínicos celulares solubles. Los estu-dios filogenéticos, en especial los que incluyen secuencias 16S y 23S ARNr, han permitido identificar un sublinaje diferenciado, Leuconostoc oenos, que es independiente y distinto de otras especies de Leuconostoc así como de otras bacterias lácticas en general. Este sublinaje es genotípicamente homogé-neo y constituye un grupo diferenciado de Leuconostoc oenos. Por consiguiente, se le ha asigna-do un nuevo género llamaasigna-do Oenococcus oeni.
11
111.2 Ecología y desarrollo de las bacterias lácticas
Como se ha mencionado más arriba, en las uvas18se
encuentran recuentos reducidos (inferiores a 100 células/g) de bacterias lácticas; en cambio, los recuen-tos de bacterias acéticas y de levaduras son mucho más altos. Las bacterias lácticas aparecen en las hojas y en los tallos de los racimos de la vid, y también se pueden encontrar en el material de bodega. Estudios realizados en varios países indican que la Oenococcus oeni es la especie predominante en la realización de la fermentación maloláctica en el vino, aunque la composición de las bacterias lácticas presentes en el mosto de uva al principio de la fermentación alcohó-lica está dominada por cepas de Lactobacillus. La Pediococcus se encuentra principalmente después de la fermentación maloláctica (FML) así como en los vinos con un pH más alto. Normalmente, los vinos con un pH inferior a 3.5 sólo contienen cepas de Oenococcus oeni, mientras que los vinos con un pH superior a 3.5 pueden contener diversas especies de Pediococcus así como cepas heterofermentativas de Lactobacillus. El estudio de Wibowo et al.17identificó
diversas fases de la de vinificación (Fig. 1) en las que pueden aparecer y desarrollarse distintas especies de bacterias lácticas. Textualmente, dice así, “Después de la trituración, por lo general los mostos contienen poblaciones de bacterias lácticas de 103 a 104 CFU/mL; entre las principales especies presentes en
esta fase figuran Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei, y, en menor medida, Leuconostoc oenos [Oenococus oeni] y Pediococcus cerevisiae. Por lo general, estas especies no se multiplican, y des-aparecen durante la fermentación alcohólica, aunque en contadas ocasiones (alto pH los vinos) se puede producir una ligera proliferación de algunas especies indeseables en su mayoría. La sensibilidad al etanol puede explicar este declive de la viabilidad celular. Después de un intervalo de estancamiento, cuya duración depende en buena medida de las propieda-des del vino, las células supervivientes empiezan a multiplicarse y, una vez que han alcanzado la bioma-sa crítica, se inicia la degradación del ácido málico. La supervivencia de las bacterias malolácticas después de terminar la FML depende en buena medida de las condiciones del vino y del tratamiento aplicado al mismo. El aporte de dióxido de azufre induce una pérdida progresiva de viabilidad de estas bacterias, aunque también es muy importante el pH del vino. Con un pH bajo, las bacterias lácticas del vino mueren progresivamente, mientras que con un pH superior a 3.5, la población de bacterias lácticas puede seguir aumentando. No sólo la Oenococcus oeni, sino tam-bién bacterias perjudiciales para el vino, como Pediococcus y Lactobacillus se pueden multiplicar hasta alcanzar concentraciones de nada menos que de 106a 108CFU/mL, y por ende, deteriorar el vino. Así
pues, en condiciones de pH elevado, se recomienda una estabilización temprana del vino.
Figura 1.
12
121.3 Factores que influyen en la supervivencia y
desarrollo de las bacterias lácticas en el vino
Los factores que influyen en la supervivencia y multi-plicación de las bacterias lácticas en el vino se pue-den dividir en las tres categorías siguientes:• La composición física y química del vino; • Los factores asociados a la vinificación;
• Las interacciones microbianas entre las bacte-rias lácticas y otros microorganismos presentes en el vino.
Comentaremos detalladamente los factores específi-cos, pero por lo que se refiere a la composición del vino, el pH es uno de los parámetros más importantes en la determinación del comportamiento de las bac-terias lácticas en el vino, y también ejerce una acción selectiva sobre las cepas de bacterias lácticas que estarán presentes en el mismo. El pH del vino contri-buye a determinar qué especie bacteriana proliferará, su viabilidad y la tasa de crecimiento de las bacterias lácticas, la velocidad de degradación del ácido málico, y el comportamiento metabólico de las especies bac-terianas. El pH crítico en el vino es 3.5, pues por deba-jo de ese umbral resulta más fácil controlar la micro-biología del vino. Aunque es más difícil inducir la FML con un pH más bajo, sólo las especies de bacterias lácticas menos perjudiciales son capaces de desarro-llarse y de llevar a cabo la FML a esos niveles de pH. El dióxido de azufre (SO2) inhibe fuertemente el desarro-llo de las bacterias lácticas, si bien la sensibilidad de las bacterias lácticas al SO2varía. El dióxido de azufre es más inhibitorio con un pH bajo. El crecimiento y la realización de la FML por bacterias lácticas se inhiben progresivamente a concentraciones de alcohol supe-riores al 6%, siendo el 14% (v/v) el límite superior tole-rado por la mayor parte de las cepas. Las bacterias lác-ticas del vino son mesofílicas, y la temperatura óptima para su crecimiento está comprendida entre 15° y 30°C. Las temperaturas bajas inhiben fuertemente tanto la tasa de crecimiento bacteriano como la velo-cidad de la FML.
Por lo que se refiere a las prácticas de vinificación, la clarificación del mosto y del vino puede eliminar gran parte de las bacterias lácticas y reducir asimismo la incidencia del desarrollo bacteriano y su efecto sobre la calidad del vino19.Durante la clarificación, se
supri-men algunos nutrientes y partículas en suspensión que estimulan el desarrollo bacteriano. Se ha comuni-cado que los vinos elaborados por termovinificación son menos aptos a la fermentación maloláctica. El momento de la inoculación de las bacterias malolác-ticas (bacterias lácmalolác-ticas) también influye en la cinética de la FML. Por lo que se refiere a las interacciones con otros organismos del vino, los cultivos mixtos de microorganismos introducen la posibilidad de rela-ciones antagónicas y sinérgicas, aunque en algunos casos menores pueden carecer de efecto. En la
vinifi-cación, existe la posibilidad de una interacción de las bacterias lácticas con levaduras, hongos, bacterias acéticas y bacteriófagos, así como interacciones entre especies y cepas de BAL20.El efecto antagónico de la
levadura se ha explicado por la competencia por los nutrientes y la producción de sustancias que inhiben el desarrollo bacteriano, como SO2o ácidos grasos de cadena media. Por otra parte, la levadura puede ayu-dar al desarrollo de las bacterias lácticas en el vino y estimular la FML. Durante el contacto prolongado de las lías con el vino, el proceso de autolisis de la leva-dura libera vitaminas y aminoácidos en el vino. Esto induce un enriquecimiento en nutrientes, con la sub-siguiente estimulación de la fermentación malolácti-ca. No obstante, Costello21ha comunicado que el
des-arrollo de Pediococcus ssp se ve facilitado por la rápi-da muerte celular de Oenococcus oeni, y en condicio-nes de pH alto, el desarrollo temprano del Lactobacillus brevis inhibe completamente el des-arrollo de Oenococcus oeni. Recientemente, Gerbaux31 ha demostrado que las condiciones del
vino que estimulan la FML pueden ser capaces de inhibir el desarrollo de la levadura Brettanomyces tan perjudicial para el vino.
13
131.4 Influencia de la fermentación maloláctica en la
composición del vino
La FML no consiste en una mera descarboxilación del ácido málico en ácido láctico y CO2. Utilizando el vino como sustrato de crecimiento, las bacterias malolácticas eliminan algunos componentes del vino y producen otras a resultas de su metabolismo. La actividad metabólica de las bacterias lácticas no sólo influye en los componentes aromáticos del vino derivados del fruto y de la fermentación alco-hólica22,sino que además confiere estabilidad
bioló-gica al producto final. Por norma general, se fomen-ta el desarrollo de bacterias lácticas cuando se necesita la FML para reducir la acidez del vino. La reducción de la acidez es beneficiosa para la calidad del vino elaborado en regiones vitícolas frías, por-que las bayas presentan naturalmente altas concen-traciones de ácidos orgánicos. Las preferencias actuales de los consumidores de todo el mundo se inclinan por los vinos afrutados de acidez modera-da, lo cual conlleva que la reducción de los ácidos se ha convertido en un aspecto importante para la producción de vinos en los climas más fríos. Este
hecho, combinado con los cambios de sabor positi-vos asociados al desarrollo de bacterias lácticas en el vino, hace de la FML un proceso deseable para casi todos los vinos tintos y para ciertos tipos de blancos. Ahora bien, el desarrollo de bacterias lácti-cas en el vino debe estar rigurosamente controlado para garantizar que se desarrollen bacterias lácticas deseables que no produzcan sabores desagrada-bles ni compuestos que encierren peligro para la salud humana. En la mayor parte de los casos, es importante lograr que la FML concluya rápidamen-te, para ahorrar tiempo de proceso y conseguir una estabilidad temprana del vino. En ningún caso se debería confiar en las cepas indígenas de bacterias lácticas para realizar la FML.
Aparte de producir ácido láctico como principal pro-ducto final del catabolismo del azúcar23,se sabe que
las bacterias lácticas producen otros compuestos con incidencia aromática, entre ellos el acetaldehído, el ácido acético, el diacetilo, la acetoína, y el 2,3-butano-diol. El diacetilo, la acetoína y el 2,3-butanodiol son producto del consumo bacteriano de ácido cítrico, y tienen una incidencia considerable en el perfil aromá-tico del vino. A bajas concentraciones, estos com-puestos parecen aportar complejidad al aroma del vino. A concentraciones superiores a 5 mg/L, el diace-tilo puede resultar dominante, y conferir al vino un claro sabor a mantequilla/avellana. Dependiendo del pH y de la oxidación-reducción potencial del vino, el ácido acético puede ser otro metabolito producido a partir de la degradación de ácido cítrico por bacterias lácticas. También se han comunicado mayores con-centraciones de esteres volátiles, de etilactato, y gra-duaciones alcohólicas más altas en los vinos someti-dos a la FML24. Henick-Kling25ha descrito las
contribu-ciones aromáticas de las cepas individuales de bacte-rias malolácticas.
1.5 Alteración del vino por las bacterias lácticas
La FML no siempre es beneficiosa, y puede causar alteraciones indeseables en las propiedades organo-lépticas del vino. Como se ha mencionado más arriba, son varias las especies de bacterias lácticas que pue-den realizar la FML. Cuando la FML se produce con un nivel de pH inferior 3.5, la suele inducir la bacteria Oenococcus oeni y es menos probable que genere olores indeseables, aunque algunas cepas indígenas tienen la capacidad de hacerlo. Los olores indeseables a mantequilla, leche, queso, metal y tierra, así como cantidades excesivas de ácido acético suelen ir aso-ciados a fermentaciones malolácticas desarrolladas en vinos con un pH superior a 3.5 y realizadas por pediococci o lactobacilos. Las bacterias lácticas pro-ducen aminas biógenas mediante la descarboxilación de aminoácidos. Se cree que la histamina, derivada de la descarboxilación de la histidina, provoca una reac-ción en individuos sensibles si el vino tiene una con-centración superior a 0.1 mg/L. Se considera que, de14
14las diversas bacterias lácticas, Pediococcus sp. y Lactobacillus brevis son las que más histamina produ-cen26. Estos dos géneros se suelen hallar en vinos con
un pH superior a 3.5. Por consiguiente, la síntesis de aminas biógenas parece ser importante únicamente en los vinos con un pH elevado. Si sabe que hay pre-sentes cepas bacterianas capaces de producir aminas biógenas, el productor de vino debe inocular un cul-tivo maloláctico iniciador seleccionado por su capaci-dad de sustituir a las bacterias lácticas indígenas. Las bacterias tienen una ligera capacidad de formar hista-minas, y sólo durante su fase de crecimiento activo. No obstante, se ha demostrado26 que incluso una flora
bacteriana no proliferante puede desarrollar cantida-des considerables de histamina. Por lo tanto, se debe eliminar la población bacteriana de un vino mediante la adición de SO2seguida de una clarificación nada más terminar la FML; esto es especialmente impor-tante en los vinos con un pH alto. También se pueden producir alteraciones organolépticas indeseables a raíz del metabolismo de bacterias lácticas indígenas, como por ejemplo coloraciones parduscas, cambios de color y viscosidad.
1.6 Control de la fermentación maloláctica
Impedir la FML:
Si no se desea la FML, hay que impedir el desarrollo de bacterias lácticas en el mosto y en el vino mediante la eliminación o desactivación de las bacterias presen-tes en dichos medios. Aunque en ocasiones puede resultar difícil inducir la FML, impedir el desarrollo de bacterias lácticas es igualmente difícil. Dependiendo del pH, la adición de 50-100 mg/L de SO2debería des-truir más del 90% de las bacterias viables presentes. El efecto del SO2depende de la acidez del vino: el SO2 es más eficaz con los niveles de pH más bajos. Por consiguiente, en vinos con un alto pH, hay que consi-derar la utilización de una combinación de SO2con lisozimas o la utilización de lisozimas solas. Para la inhibición de la FML se puede utilizar todos los facto-res contrarios a los empleados para favorecer su des-arrollo. Por lo tanto, los parámetros que permiten inhi-bir la FML son los siguientes:
• Maceración mínima; • pH bajo;
• Bajas temperaturas;
• Trasiego y clarificación precoz.
Inducción de la FML:
Los análisis químicos y sensoriales han demostrado que las bacterias lácticas influyen en la calidad del vino no sólo a través de la propia FML, sino también a través de otras actividades metabólicas. Si se desea la FML y la producción bacteriana de compuestos aro-máticos, el productor de vino puede propiciar el cre-cimiento de bacterias lácticas manteniendo
condicio-nes favorables al desarrollo y la supervivencia de las bacterias, como temperaturas más cálidas, adición mínima o nula de SO2, y retraso del trasiego. También se puede llevar a cabo una inoculación cruzada con vinos que ya están experimentando la FML. No obs-tante, los métodos más eficaces y recomendables son o bien la inoculación en el vino de cepas de bacterias malolácticas preparadas en laboratorio o adquiridas en el comercio, o el paso del vino sobre bacterias malolácticas activas inmovilizadas. Las bacterias lácti-cas más recomendables para realizar la FML son las cepas de Oenococcus oeni, porque pueden crecer en vinos con pH bajo y pueden degradar el ácido málico sin producir sabores y olores indeseables ni metaboli-tos peligrosos. Además, no degradan los componen-tes del vino necesarios para la calidad y estabilidad del mismo, como son el ácido tartárico, el etanol o el glicerol19.El crecimiento de la Oenococcus oeni será
lento en los vinos con un pH inferior a 3.1 y, depen-diendo de otros factores inhibidoress del desarrollo así como de la densidad celular inicial, el inicio y la culminación de la FML se puede retrasar considera-blemente. En las condiciones de crecimiento más ele-vadas, es decir con un alto pH, las especies Lactobacillus y Pediococcus pueden realizar la FML. La opinión de que dichas especies producen vinos menos aceptables que aquellos en los que se ha des-arrollado la Oenococcus oeni está generalmente aceptada27. En algunos vinos, se puede provocar el
fracaso de la FML por la inoculación de un vino que ya está experimentando la FML. Las principales desven-tajas de este planteamiento son que hay que dispo-ner de un vino adecuado, y que las bacterias conteni-das en el vino inóculo pueden no ser adecuaconteni-das para su desarrollo en el vino en donde se inoculan. Y lo que es más importante, no se conocen bien las caracterís-ticas de dichas bacterias. El reconocimiento creciente de la influencia de la FML en la calidad del vino ha lle-vado a los productores de vino a buscar un mayor control sobre la intervención y el resultado de la FML. La inoculación de cultivos iniciadores definidos, cui-dadosamente seleccionados en la naturaleza, reduce el potencial de alteración por otras bacterias lácticas y/o bacteriófagos, garantizando con ello el rápido ini-cio de la FML, un mayor control de la producción de compuestos aromáticos, sabores y olores en el vino28.
15
15 diversas bacterias lácticas, y en su mayor parte secomercializan en forma liofilizada o congelada, aun-que también se venden algunos cultivos líquidos. Estas cepas se han seleccionado a partir de la FML espontánea por su buena cinética fermentativa, sus resultados en condiciones restrictivas en el vino, y sus propiedades organolépticas deseables. Estas cepas toleran las difíciles condiciones de crecimiento y supervivencia imperantes en el vino y no producen metabolitos peligrosos. No producen compuestos aromáticos que puedan incidir negativamente en la calidad del vino, sino que, por el contrario, aportan contribuciones organolépticas positivas al sabor del vino. Hasta hace poco, la mayor parte de estos culti-vos iniciadores requerían una fase de aclimatación o reactivación en condiciones controladas29.
Normalmente, su reactivación se llevaba a cabo en mosto de uva sin SO2, que se diluía en una proporción de 1:1 con agua y/o vino. Se ajustaba el pH del mosto diluido a un nivel de 3.6 o superior, y se añadían nutrientes bacterianos a una concentración de 0.05% w/v. Por lo general, la reactivación llevaba al menos 24 horas, y se evitaba el choque térmico mediante el desarrollo de las células a una temperatura que no difiriera en más de 10°C de la temperatura del vino al que se iba a añadir el iniciador.
Desde hace poco se comercializan asimismo cultivos iniciadores para la inoculación directa de las bacterias en el vino. Estos cultivos iniciadores se han preaclima-tado durante su proceso de producción para que sobrevivan a su incorporación a un medio hostil en el vino sin que disminuya el recuento de células viables ni se produzca la subsiguiente pérdida de actividad maloláctica. Estas preparaciones de bacterias malo-lácticas se pueden añadir directamente al vino, o se pueden rehidratar en agua durante un breve periodo de tiempo antes de su adición al vino. El objeto de la
fase de rehidratación consiste en conseguir una mejor distribución de las bacterias al añadirlas al vino. Las bacterias malolácticas se pueden inocular en las fases siguientes de la fermentación alcohólica:
• Simultáneamente a la inoculación de levadura; • Durante la fermentación alcohólica;
• Hacia el final de la fermentación alcohólica; • Después de la fermentación alcohólica. El mejor momento para la inoculación de bacterias lácticas sigue siendo objeto de discusión. En Burdeos (Francia) la opinión consiste en recomendar la inocu-lación de bacterias lácticas nada más terminar la fer-mentación alcohólica, para evitar el riesgo de produ-cir ácido acético y D-ácido láctico, la llamada “piqûre lactique”(picado láctico)30. En ocasiones, la FML que se
produce durante la fermentación alcohólica puede provocar una interrupción de la fermentación alcohó-lica. La investigación no ha confirmado unánimemen-te los resultados franceses referenunánimemen-tes al desarrollo de una alta concentración de ácido acético, al antagonis-mo con la levadura o a la interrupción de la fermenta-ción alcohólica que se han asociado al desarrollo pre-coz de bacterias lácticas. Se ha abogado por la inocu-lación de la levadura junto con bacterias lácticas por-que se creía por-que las bacterias tenían más posibilida-des de crecer y aclimatarse en ausencia de etanol. Para controlar con éxito el proceso de vinificación, es importante comprender los mecanismos reguladores que rigen el desarrollo y el metabolismo de las bacte-rias malolácticas en el vino. Es importante seleccionar la cepa más adecuada, elegir el momento más favora-ble para la inoculación, garantizar que la cepa de bac-terias lácticas correcta domine la FML y que la FML culmine en un plazo de tiempo predecible (Fig. 2).
Figura 2.
16
16Referencias
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3
L
I.2. La práctica
de la
fermentación
maloláctica
Didier THEODORE
Lallemand 2.1 Gestión de la fermentación maloláctica en bodega2.2 Determinación del momento de la inoculación
2.3 Problemas potenciales 2.4 Procedimientos analíticos
19
19O
enococcus oeni, es labacte-ria láctica identificada como la especie responsable de llevar a cabo la fermentación maloláctica (FML) en el vino y de hacer importantes aportaciones a la mejora de la calidad de éste. Incluso en condi-ciones ideales, la FML presenta fasti-diosas exigencias nutricionales, y se desarrolla muy lentamente. Por ello no resulta sorprendente que las condicio-nes desfavorables para su desarrollo que presenta el vino puedan hacer sumamente difícil que se inicie y com-plete la FML. Para que se inicie la FML, las poblaciones bacterianas deben alcanzar una con-centración mínima de 106CFU/mL, y las condiciones
físicas del vino hacen difícil que se cumpla este requi-sito.
2.1 Gestión de la fermentación maloláctica en
bodega
Los factores más importantes que influyen en el des-arrollo bacteriano en el vino son el alcohol, el SO2, la temperatura y el pH. Las bacterias empiezan a presen-tar signos de inhibición del desarrollo con una con-centración de alcohol del 10% aproximadamente. La concentración de SO2libre se debe mantener lo más baja posible, para evitar que inhiba aún más el des-arrollo y la supervivencia de las bacterias lácticas. Las bacterias lácticas se multiplican a temperaturas com-prendidas entre 18° y 20°C, pero su crecimiento se ve fuertemente restringido a temperaturas inferiores. Las bacterias se desarrollan en una horquilla de pH de 3 a 4, observándose un crecimiento más abundante con un pH de 4 que con un pH de 3. La FML se produce más fácilmente con un pH más alto que con un pH más bajo, si bien la presencia de un pH más alto puede favorecer el desarrollo de cepas de bacterias lácticas que pueden tener un fuerte impacto negati-vo en la calidad del vino. Es necesario relacionar el efecto de cada uno de estos parámetros en la FML con el de los parámetros restantes, pues no ejercen su influencia individualmente, sino que ésta depende de la suma de todos los factores. Por consiguiente, se puede estimar que el vino no es un medio conducen-te sin esfuerzo al desarrollo de microorganismos. Para superar las tensiones naturales del medio que es el vino, con objeto de garantizar el desarrollo de las bac-terias lácticas y una FML completa en éste, se reco-mienda añadir un cultivo bacteriano iniciador. La bac-teria Oenococcus oeni es el organismo de elección, y es preferible añadir una cantidad concentrada de dicho organismo. Cuando se añade dicho organismo en cantidades suficientemente importantes, éste se ve obligado a crecer y multiplicarse en las condicio-nes del vino, lo cual significa que la FML comenzará sin tener que esperar a que se desarrolle un número
I.2. La práctica de la fermentación
maloláctica
20
20de células suficientemente importante. Existen culti-vos comerciales de bacterias lácticas aptos para su inoculación en el vino. Estos cultivos están disponi-bles en estado líquido, congelado, o deshidratado por congelación. Algunos de los cultivos deshidratados por congelación han sido adaptados biofísicamente para resistir los rigores del medio del vino, y se pue-den añadir directamente al vino sin necesidad de pasar por una fase de activación. Los demás tipos de cultivo iniciador requieren fases de activación y multi-plicación previas a su introducción en el vino. Este proceso exige pasar por varias etapas planificadas, y conlleva mucho trabajo. Si se realiza correctamente, normalmente garantiza una FML completa, incluso en los vinos más difíciles, pues los cultivos lácticos ini-ciadores han sido seleccionados por su resistencia a las condiciones adversas del vino. Cuando se utilizan cultivos que se pueden inocular directamente en el vino, o que sólo requieren una fase de desarrollo, la intención es inocular una población bacteriana míni-ma de 106CFU/mL sin depender del desarrollo de las
bacterias lácticas del propio vino para alcanzar dicha concentración.
La investigación ha permitido conocer mejor la nutri-ción bacteriana y la influencia del vino en el desarrollo de bacterias lácticas y la nutrición de las levaduras durante la fermentación alcohólica. Se ha demostrado que las levaduras con grandes necesidades nutricio-nales durante la fermentación alcohólica agotan rápi-damente los factores de crecimiento del mosto nece-sarios para el desarrollo de la bacteria láctica justo cuando se desea la FML. El fenómeno se puede produ-cir en todos los mostos de uva, pero resulta especial-mente problemático en las uvas de varietales con un contenido de nutrientes naturalmente bajo. Esta investigación ha desembocado en la recomendación de añadir nutrientes bacterianos después de la fer-mentación alcohólica con objeto de ayudar a la inicia-ción y culminainicia-ción de la FML. Es imprescindible garan-tizar una nutrición adecuada y suficiente de los hon-gos de fermentación así como de las bacterias lácticas.
2.2 Determinación del momento de la inoculación
Es imperativo inocular el vino con un cultivo malolác-tico iniciador que presente una concentración de población de 106CFU/mL para garantizar unapresen-cia de células bacterianas suficiente para degradar el ácido málico. Si la fermentación alcohólica se inicia y concluye rápidamente, la degradación del ácido máli-co por la bacterias lácticas no suele provocar una aci-dez volátil (AV) extrema. Cuando se observan cantida-des excesivas de AV, éstas suelen ser consecuencia de la presencia y crecimiento de bacterias indígenas, con toda probabilidad introducidas en el vino debido a una combinación de condiciones sanitarias deficien-tes y elevado pH del vino. Estas bacterias indígenas se desarrollan en el vino utilizando el azúcar como fuen-te de energía, y produciendo ácido acético.
La investigación ha demostrado que cuando se com-prenden las interacciones entre la levadura de fer-mentación y la bacterias lácticas, la inoculación de un cultivo maloláctico iniciador en diversos momentos de la fermentación alcohólica puede dar buenos resultados. Ahora bien, dependiendo de los procesos de vinificación utilizados – microoxigenación, termo-vinificación o maceración prolongada – la FML se puede retrasar hasta el final de la fermentación alco-hólica. En esos casos, los responsables pueden ser la adición de SO2, la clarificación del vino y los regíme-nes de refrigeración.
En presencia de vinos con un elevado pH, puede resultar beneficioso una adición precoz de lisozima, una enzima específicamente dirigida a las bacterias Gram+. Si se controla estrictamente el momento del aporte, la adición ulterior del cultivo maloláctico ini-ciador deseado se puede llevar a cabo más tarde. La introducción de iniciadores de cultivo maloláctico comerciales ha permitido a los vinificadores integrar mejor sus procesos de vinificación gracias a la gestión de la FML.
21
212.3 Problemas potenciales
A veces, en lugar de mejorar el vino, las bacterias lác-ticas pueden provocar cambios indeseables. Durante la FML ocurrida naturalmente y sin control, realizada por cepas indígenas de Lactobacillus y Pediococcus, se puede producir una alteración de las propiedades organolépticas del producto. Concretamente, se puede formar un exceso de AV o de diacetilo. Además de velar los sabores afrutados primarios del vino, estos compuestos también pueden aportar caracte-res indeseables a su aroma. Por ejemplo, los AV son irritantes para la nariz y provocan un sabor agrio. El diacetilo puede aportar un sabor almendrado o características que pueden evocar el caramelo, la levadura e incluso el pelo de animal mojado. Los aro-mas y sabores indeseados generados por el desarro-llo de organismos de putrefacción pueden producir características similares al yogur ácido, la mantequilla rancia y el sudor. En los vinos tintos, los fenoles voláti-les pueden producir olores a establo, y en los blancos, los mismos componentes pueden provocar la apari-ción de olores a antiséptico. Esos olores pueden ir acompañados de amargor y de taninos metálicos en el paladar. La proliferación incontrolada de
microor-ganismos indeseados puede generar compuestos secundarios, entre ellos, alergenos tales como aminas biógenas (histamina, putrescina y cadaverina), y com-puestos potencialmente cancerígenos como el car-bamato de etilo y la ocratoxina A.
2.4 Procedimientos analíticos
La acción más obvia de la FML es la descaboxilación del ácido málico del vino, y siempre provoca una dis-minución de la acidez total y un incremento del pH. La forma más fácil de seguir el avance de la FML con-siste en realizar análisis químicos para detectar la des-aparición del ácido málico. A continuación se descri-ben algunos de los métodos más utilizados.
• Cromatografía en papel
Es una técnica cromatográfica cuantitativa utilizada para realizar un seguimiento visual de la desaparición del ácido málico. No es precisa, pero sí fácil de utilizar en bodega.
• Técnicas enzimáticas
Esta técnica es más compleja y costosa, pero resulta muy precisa. Utiliza el análisis químico para determi-nar la concentración absoluta de cualquier ácido orgánico en el mosto. Durante la FML, el L-ácido máli-co se máli-convierte específicamente en L-ácido láctimáli-co, de modo que se puede utilizar la medición de la concen-tración de L-ácido láctico como indicador del inicio de la FML. Por lo general, cuando la concentración de L-ácido láctico alcanza 200-300 mg/L, se puede supo-ner con seguridad que se ha iniciado la FML. Normalmente, se considera que la FML ha concluido cuando la concentración de ácido málico baja a valo-res de entre 100 y 200 mg/L.
• Recuentos microbiológicos
Esta técnica aísla y cuenta el número de bacterias lác-ticas presentes en el vino. Su tasa de crecimiento es muy lenta, de modo que puede llevar hasta siete días determinar el número de Oenococcus oeni viables. La tasa de crecimiento de bacterias indeseables, como Lactobacillus y Pediococcus, es más alta, de modo que el recuento de estos organismos se puede obte-ner en un plazo de dos días.
• Observación microscópica
Este método se basa en la observación directa de un vino mediante un microscopio de buena calidad. No es cuantitativo, pero si lo aplica un técnico con expe-riencia, proporciona una evaluación rápida y valiosa de la microflora presente en el vino.
B
I.3. Bacterias
lácticas y
fermentación
maloláctica
Aline LONVAUD-FUNEL
Faculté d’enologie. Université victor segalen bordeaux 23.1 Las bacterias lácticas: generalidades 3.2 Principales metabolismos en el vino 3.3 Vías de utilización de ciertos
aminoácidos
3.4 Metabolismos de alteración 3.5 Lugar de las bacterias lácticas en el
ecosistema microbiano de la uva-vino
23
233.1 las bacterias lácticas:
generalidades
L
as bacterias lácticas (BL) sonmicroorganismos comunes en numerosos entornos. Están pre-sentes en gran número de vegetales y en la leche, y participan en la elaboración de todo tipo de produc-tos fermentados, bebidas y alimenproduc-tos. Las BL del vino son muy parecidas a las de la sidra, con las que presentan gran-des similitugran-des en cuanto a materia prima y proceso de elaboración. Por lo tanto, la especie Oenococcus oeni desempeña el mismo papel en sendos medios. En otras bebidas o verduras fermentadas, hay mayor pre-sencia de lactobacilos, lactococos y estreptococos, que son los encargados de realizar las transformacio-nes.- Definición
Las BL son bacterias de coloración Gram positiva. Esta sencilla prueba de color permite distinguirlas rápida-mente de las bacterias acéticas, Gram negativas, que también están siempre presentes en el mosto y en el vino. Todas las BL producen ácido láctico a partir de los azúcares. Cultivadas en un medio que contenga glucosa y todos los demás nutrientes imprescindibles para su desarrollo, se multiplican en el mismo acidifi-cándolo intensamente.
- Clasificación
La forma de las células es bien visible tras una prueba de coloración Gram. Es redondeada en el caso de los cocos y alargada en el de los bacilos. En el entorno enológico, existen cocos y bacilos. La vía metabólica de fermentación del azúcar es el criterio que permite clasificar a las BL como bacterias homofermentativas y heterofermentativas. Las primeras producen exclusi-vamente ácido láctico a partir de la glucosa, y las otras forman asimismo ácido acético, etanol y CO2como principales metabolitos.
Algunas BL se comportan como homofermentativas en condiciones de cultivo óptimas, pero como hete-rofermentativas en otras condiciones. Esas bacterias, a diferencia de las homofermentativas estrictas, fer-mentan las pentosas por la misma vía que las hetero-fermentativas. Son heterofermentativas "facultativas". Hasta ahora, no se ha descrito en el vino ningún lac-tobacilo homofermentativo estricto. Las especies identificadas se clasifican entre los cocos y bacilos heterofermentativos, y los cocos homofermentativos.
I.3. Bacterias lácticas y fermentación
maloláctica
24
24- Identificación
Los métodos clásicos de identificación se basan en la observación de varios caracteres (denominados caracteres fenotípicos). La clasificación de una cepa se determina en función del parecido de esos caracteres con los de las cepas tipo. Las pruebas de identifica-ción se realizan sobre aislamientos puros, es decir sobre bacterias aisladas tras su cultivo en medio nutri-tivo gelificado.
Las colonias aisladas se vuelven a poner en cultivo con glucosa como único azúcar para determinar el tipo fermentativo (heterofermentación/homofer-mentación). Después, en las mismas condiciones, se sustituye la glucosa por otros azúcares diversos, hexo-sas, pentosas y “osas” varias, que permiten obtener el perfil bioquímico. En función de su capacidad de metabolizar tales o cuales azúcares, las bacterias se clasificarán dentro de una u otra especie. El método más cómodo de clasificación consiste en utilizar las galerías "API 50CH" en las cuales se miniaturiza una cuarentena de pruebas en una misma placa. La iden-tificación se lleva a cabo cotejando el resultado de todas las pruebas con las claves facilitadas en el manual de clasificación de Bergeys. Aunque el méto-do sea sencillo, lleva mucho tiempo, pero lo peor es que a veces los resultados son ambiguos.
En lo sucesivo la identificación se basa en el análisis del ADN, es decir en el verdadero patrimonio genéti-co de la célula, y no en su reflejo a través de caracte-res fenotípicos más o menos fáciles de poner en evi-dencia. Existen varios métodos disponibles, el más seguro consiste en secuenciar una parte del genoma
muy característico de la especie, correspondiente a los genes que codifican el ribosoma esencial de la célula, es decir el ARN 16S. Esta región contiene par-tes muy conservadas en todas las bacterias de una misma especie, así como otras variables en función de las cepas. Basándose en este principio, el método de PCR permite identificar un aislamiento consideran-do la región conservada en la especie. Consiste en estudiar esa región por amplificación genética, eli-giendo "inicios" cuya la secuencia es específica de la especie. La identificación también se puede llevar a cabo mediante hibridación del ADN con una sonda específica. Por último, a nivel de la cepa, el método más seguro consiste en analizar el perfil genético generado por la hidrólisis del cromosoma bacteriano. Todos estos métodos se utilizan para identificar cepas aisladas por cultivo en un medio nutritivo, aunque también se puede hacer inventario de las bacterias presentes en una mezcla como el vino o el mosto de uva, sin cultivo previo. El método (PCR-DGGE) se basa en la diferencia de migración de ADN 16S en función de las especies.
Figura 2.
Hibridación de colonias con la sonda de ADN genómico Oenococcus oeniOenococcus oeni Pediococcus damnosus Lactobacillus brevis
Figura 1.
Fotografias de bacterias aisladas del vino, tomadas al microscopio electrónico
E
Essppeecciieess mmááss ccoommuunneess ddee bbaacctteerriiaass llááccttiiccaass ddeell vviinnoo
Lactobacilos Heterofermentativo facultativo Lactobacillus plantarum -L. casei
Lactobacilos Heterofermentativo L. brevis, L hilgardii
Cocos Homofermentativo Pediococcus parvulus, P. damnosus
25
253.2 Principales metabolismos en el vino
- Fermentación de los azúcares
Los azúcares son las principales fuentes de energía para el crecimiento de las bacterias. Dependiendo de las especies de lactobacilos y de cocos, se fermentan bien por vía de la glicolisis (homofermentación) bien por la vía de las pentosas (heterofermentación); sin embargo, sólo esta última genera el ácido acético que incrementa la acidez volátil del vino. No obstante, en una vinificación normal, sin incidentes, cuando se multiplican las BL, en el medio sólo persisten los azú-cares sin fermentar por las levaduras. Por lo general, se trata de algunas centenas de mg/l de glucosa y de fructosa, y de las pentosas del zumo de uva (arabino-sa, xilosa).
Figura 4.
Distintas vías de fermentación de los azúcares por las BL
Los azúcares residuales son suficientes para suminis-trar la energía necesaria para el crecimiento de las BL y permitir la formación de la biomasa que posterior-mente lleva a cabo la fermentación maloláctica (FML). La producción de acidez volátil es siempre muy limi-tada, y sólo llega a cobrar importancia en caso de
inci-dentes en la fermentación alcohólica, si la competen-cia entre levaduras y bacterias se inclina a favor de estas últimas, o si la fermentación se desacelera o se interrumpe por otros motivos. En esa situación, se fer-mentan varios gramos de hexosas por litro, y la acidez volátil aumenta sensiblemente. Es el llamado picado láctico. Este incidente es especialmente de temer cuando tanto el pH de la vendimia como la concen-tración de los azúcares son muy altos.
- Transformación del ácido málico
Es la reacción principal de la FML. Químicamente, consiste en la mera descarboxilación del ácido L-máli-co del vino en ácido L-láctiL-máli-co. Bioquímicamente, es el resultado de la actividad de la enzima maloláctica, característica de las BL. Esta transformación tiene un doble efecto. Por una parte, desacidifica el vino, es decir eleva el pH, tanto más cuanta más alta fuera la cantidad inicial de ácido málico. Por otra parte, tam-bién suaviza el vino, al hacer desaparecer el sabor ácido y duro del ácido málico y sustituirlo por el sabor más suave del ácido láctico.
Esta es la reacción principal que hace que la FML modifique muy sensiblemente los caracteres organo-lépticos del vino, y el motivo por el cual la segunda fermentación resulta especialmente recomendable para la mayor parte de los vinos tintos y muchos blan-cos. La duración de la transformación del ácido máli-co depende de la cantidad inicial de ácido éste y del nivel de población total de la bacteria que haya con-seguido multiplicarse en el vino. Sin embargo, para una misma biomasa formada, se puede desacelerar como consecuencia de ciertos inhibidores del vino, que de momento todavía no están bien identificados. El pH, el grado alcohólico, la temperatura y la concen-tración de dióxido de azufre son los principales pará-metros que controlan el crecimiento y el nivel de la población total.
- Degradación del ácido cítrico
Mientras que, antes de la FML, el vino contiene varios g/l de ácido L-málico, por lo general sólo contiene entre 200 y 300 mg/l de ácido cítrico. Ahora bien, aun-que su concentración sea baja, el ácido cítrico tiene una gran importancia, pues su vía metabólica condu-ce por una parte a ácido acético, es decir a un aumen-to de la acidez volátil, y por otra parte a las moléculas acetoínicas, la más importante de las cuales es el dia-cetilo. Este compuesto aromático, que tiene un olor a mantequilla, se detecta fácilmente en la cata desde concentraciones relativamente bajas, del orden de 5-6 mg/l en los vinos blancos y 8-9 mg/l en los vinos tin-tos. Por debajo de ese umbral, el diacetilo contribuye al bouquet del vino y a su complejidad. Por encima, puede llegar a resultar francamente desagradable. No obstante, para algunos vinos sí que se busca esa nota mantecosa.
Figura 3.
26
26Figura 5.
Vía de degradación del ácido cítrico por las bacterias lácticas
El diacetilo se puede reducir a acetoína debido a las actividades enzimáticas de las bacterias, y también de las levaduras, de manera que si se prolonga el contac-to del vino con las lías, disminuye su concentración. Esa puede ser una buena manera de suprimir un exceso. Por el contrario, el trasiego precoz permite conservarlo.
La degradación del ácido cítrico es un carácter muy común de las bacterias del vino, si bien es más lenta que la del ácido málico. Por ello, a veces al final de la FML el vino todavía contiene la mayor parte del ácido cítrico inicial. No obstante, la observación general es que incluso después de la adición de azufre, la activi-dad bacteriana continúa y la concentración final del vino acaba por ser nula. El aumento del ácido acético observado durante y en ocasiones después de la FML se debe a esta degradación.
3.3 Vías de utilización de ciertos aminoácidos
- Degradación de la arginina
La mayor parte de los lactobacilos del vino y numero-sas cepas de O. oeni catabolizan la arginina del vino. Es uno de los aminoácidos más importantes, y en el vino, después de la FA, procede sobre todo del meta-bolismo de las levaduras y de su autolisis.
La vía de degradación es la de la arginina deiminasa. Consta de tres etapas, catalizadas por tres enzimas cuyos genes se han caracterizado en la O. oeni. El aná-lisis de un gran número de cepas de esta especie per-mite concluir que estos genes están situados en una región del cromosoma presente o ausente en su tota-lidad, dependiendo de las cepas. Incluye asimismo los genes que codifican las proteínas de transporte de la arginina. Como esta vía metabólica suministra energía a las bacterias, las cepas que poseen todos los genes tienen una ventaja sobre las demás, algo que puede resultar importante para su supervivencia o su creci-miento.
A nivel enológico, la consecuencia es la formación de citrulina, precursor del carbamato de etilo. Sin embar-go, las concentraciones formadas son débiles, y la
fuente principal de carbamato de etilo sigue siendo la urea producida por la levadura durante la fermenta-ción alcohólica.
- Descarboxilación de ciertos aminoácidos
Las BL pueden producir aminas biógenas por la mera reacción de descarboxilación de los aminoácidos correspondientes. La histamina y la tiramina son las principales aminas cuya concentración aumenta durante y después de la FML. Se forman a partir de la histidina y de la tirosina respectivamente. Las enzimas descarboxilasas necesarias para esas transformacio-nes se han purificado y estudiado en bacterias lácticas del vino. Son muy frecuentes en los lactobacilos hete-rofermentativos (L. brevis y L. hilgardii), si bien tam-bién se han aislado cepas de O. oeni productoras de histamina.
Los genes que codifican la histidina y la tirosina des-carboxilasas han sido secuenciados y bien localizados dentro de un conjunto de genes que también inclu-yen los que codifican las proteínas de transporte que intercambian el aminoácido y la amina al nivel de la membrana celular. La capacidad de producir aminas biógenas es totalmente dependiente de la presencia de dichos genes. Por lo tanto, si se detectan esos genes en la población, eso significa que el riesgo de producción de amina biógena es alto, en caso de que se multipliquen esas bacterias en concreto.
Figura 6.
Esquemas de los sistemas de producción de histamina y tiramina por las BL del vino.
27
27 A partir de esta observación, se ha desarrollado unaprueba basada en la amplificación de estos genes por PCR. Si la prueba da positivo antes de la FML, consti-tuye una buena indicación para la utilización de leva-duras malolácticas. En efecto, aunque no se pueda eli-minar las bacterias indeseables, se puede frenar su crecimiento mediante una siembra masiva de O. oeni seleccionadas. Luego, desde el momento en que se haya degradado el ácido málico, se puede realizar un sulfitado adecuado que permitirá reducir aún más su población, y por ende su actividad. Si la prueba de detección de las bacterias productoras de aminas biógenas da positivo después de la FML, indica la necesidad de sulfitar rápidamente y lo más eficaz-mente posible, pero también de evitar el contacto prolongado con las lías. Durante la crianza de estos vinos, será necesario vigilar la microflora láctica.
- Metabolismo de los aminoácidos azufrados
La cisteína y la metionina son metabolizadas por las bacterias que forman compuestos azufrados diversos, entre ellos el hidrógeno sulfurado y el metano-tiol, poco apreciados.
El metabolismo de la metionina está mejor estudiado, y conduce, además del metanotiol y del sulfuro de dimetilo, a moléculas más complejas de probada inci-dencia organoléptica. Las bacterias lácticas del vino producen estos compuestos, metionol y ácido metil-3-sulfanilo propiónico pero la O. oeni es la que los produce en mayores cantidades. Su concentración aumenta durante la FML, y podrían figurar entre las numerosas moléculas aromáticas que participan en el cambio complejo del aroma de los vinos por influen-cia de las BL.
3.4 Metabolismos de alteración
- Degradación del glicerol
El glicerol es un componente fundamental del vino, formado por las levaduras. La mayoría de las veces no queda metabolizado después de la fermentación alcohólica. Sin embargo, algunas cepas de lactobaci-los disponen de una vía especial que conduce al 1,3 propanodiol. La primera etapa la cataliza la glicerol-deshidratasa, y produce 3 hidroxi propionaldehído, que se reduce inmediatamente a 1,3 propanodiol. Sin embargo, una cantidad muy reducida del aldehído escapa a la reducción, y forma acroleína, con una doble incidencia en la calidad del vino: por una parte desaparece el glicerol, a veces completamente, y por otra parte, la acroleína, incluso en reducidas cantida-des, se combina con los polifenoles del vino y forma moléculas de sabor amargo. Es la enfermedad del “amargor”.
Figura 7.
Detección por PCR de las bacterias productoras de amargor en el vino
-Producción de glucano
Durante la FML, las BL forman exopolisacáridos en el vino. De momento, todavía no se conocen bien, y probablemente participan en reacciones con los demás compuestos del vino. Sin embargo, algunas sintetizan un glucano muy particular, que tiene la pro-piedad de incrementar considerablemente la viscosi-dad del vino, incluso a una concentración relativa-mente débil. Es la enfermedad de la “grasa” o de los vinos “ahilados” que en ocasiones sobreviene en cuba o en barrica, pero también con gran frecuencia en botella. Hasta ahora, las bacterias aisladas más a menudo en estos vinos alterados se han identificado como Pediococcus parvulus o P. damnosus, pero sólo se trata de cepas concretas de estas especies, bien adaptadas para crecer en el vino. Esas cepas poseen un gen particular que codifica una enzima implicada en la síntesis del glucano. Se pueden detectar con la prueba PCR apropiada.
Figura 8.
Detección por hibridación ADN/ADN de bacterias de la enfermedad de la grasa. (Izda. Todas las colonias cultivadas a
partir de una muestra de vino. Drcha. Sólo se revelan las colonias de la enfermedad de la grasa)
Los vinos afectados por la enfermedad de la grasa no tienen por qué presentar más defecto que su viscosi-dad. En ese caso, se pueden tratar para recuperarlos. Una acción mecánica por batido o fragmentación del vino que permite recobrar una viscosidad adecuada. Después, la estabilización debe recurrir a procedi-mientos muy eficaces, como el tratamiento térmico y la filtración esterilizante, con un sulfitado adecuado para suprimir cualquier riesgo de desarrollo ulterior de las bacterias perjudiciales.
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283.5 Lugar de las bacterias lácticas en el ecosistema
microbiano de la uva-vino
En el mosto de uva, las BL forman parte del complejo sistema de múltiples especies de levaduras y bacte-rias. Inicialmente, están presentes en la superficie de la baya, aunque muchas veces son difíciles de aislar en la viña. En la vendimia recién recogida, prensada y encubada, la población de BL es del orden de 102 a 104 UFC/mL. Varía en función de las condiciones meteorológicas durante los últimos días de la madu-ración. En realidad, depende de las innumerables interacciones entre las decenas de especies de otros microorganismos que colonizan el medio, en la superficie de la uva, y después en la uva reventada por el prensado.
En las condiciones habituales de vinificación, que la mayor parte de las veces suponen un sulfitado de la vendimia, la población de BL deja muy rápidamente paso a las levaduras que desencadenan la fermenta-ción alcohólica (FA). En un medio cuya composifermenta-ción química cambia constantemente y donde todos los microorganismos luchan por desarrollarse, general-mente las BL consiguen multiplicarse de forma muy transitoria, tras lo cual entran en regresión hasta el final de la FA. En ese momento, su población es mucho más reducida que las de las levaduras, y su nivel depende en buena medida del pH y del grado alcohólico del vino. En condiciones difíciles, de pH relativamente ácido (pH <3,4) y fuerte graduación alcohólica ( > 13 %) muchas veces la población es inferior a 102 UFC/mL. Por el contrario, puede rebasar 104 UFC/mL en las condiciones opuestas, sobre todo si el pH es > 3,5. Esta es la población que deberá mul-tiplicarse para iniciar la FML.
Un fenómeno muy importante que se desarrolla durante la FA, es la selección de las bacterias de la especie O. oeni. En la gran mayoría de los casos, las bacterias de esta especie son las únicas que invaden el medio después de la FA para realizar la FML. La selección natural operada entre una mezcla muy variada de especies de BL presentes en el mosto se
lleva a cabo por efecto del cambio de composición del medio. Inicialmente se identifican lactobacilos y cocos pertenecientes a una decena de especies dis-tintas. Luego, muchos de ellos desaparecen progresi-vamente, o al menos se vuelven muy minoritarios, dejando que la O. oeni colonice el medio.
No se conocen con precisión los mecanismos de esta selección. Sean cuales fueren, el hecho es que la O. oeni se adapta mejor que las demás especies al cam-bio del entorno. Además de la acidez del medio, estas bacterias soportan mejor que las demás las posibles carencias nutritivas y la toxicidad creciente resultante del metabolismo de las levaduras.
Cuando ha cesado por completo la actividad de las levaduras o a veces incluso antes, la población de BL, compuesta principalmente de O. oeni prosigue su adaptación al medio, y, dependiendo de los factores limitativos con que se enfrente, desencadena un ver-dadero crecimiento, que puede ser muy rápido, cues-tión de días o semanas. Finalmente, esta biomasa cobra entidad suficiente para que se observe la degradación del ácido málico. Ese es el verdadero comienzo de la FML. Mientras quede ácido málico por degradar, continúa la actividad, y la biomasa se man-tiene elevada. Cuando todo se ha transformado, la biomasa se elimina por el sulfitado, que pone punto final al proceso de vinificación. Entonces hay que estabilizar el vino de cara a cualquier desarrollo micro-biano, pues va a empezar la crianza, que en principio no representa más que transformaciones de tipo fisi-coquímico.
La mayoría de las veces, el sulfitado elimina masivamen-te la población de O. oeni que ha llevado a cabo la FML pero no consigue librar totalmente al vino de todas las bacterias. En ese momento, la microflora puede ser de nuevo totalmente mixta, y compuesta de diversas espe-cies de lactobacilos y de pediococos además de O. oeni. El sulfitado reduce la población total, pero algunas cepas especialmente resistentes a las condiciones cada vez más hostiles se seleccionan espontáneamente, pudiendo originar alteraciones bacterianas.
Recuento de bacterias lácticas durante la vinificación de Cabernet Sauvignon (UFC ml-1)
Especies Días 0 3 6 10 18 Œnococcus œni Nd Nd Nd 4.3x103 3.4x106 Leuconostoc mesenteroides 2.9x102 1.7x104 9.6x104 3.2x103 Nd Pedicoccus damnosus 6.0x102 3.8x104 3.7x104 4.9x103 Nd Lactobacillus hilgardi 1.1x103 8.0x104 4.0x104 4.4x103 Nd Lactobacillus brevis Nd 2.0x104 4.5x104 Nd Nd Lactobacillus plantarum 7.5x101 2.0x104 Nd Nd Nd Lactobacillus casei 7.7x101 2.0x104 Nd Nd Nd Total 2.5x103 1.7x105 1.5x105 1.8x104 3.4x106 Nd: non détécte
