Instituto Tecnológico de Colima
Selección y caracterización de cepas nativas de Bacillus
thuringiensis con actividad tóxica contra larvas del mosquito
transmisor del dengue (Aedes aegypty).
Opción X
Memoria de Residencia Profesional
Que para obtener el titulo de:
Ingeniero Bioquímico
Presenta
Julio César González Nava
Asesor:
Dra. Argelia Juárez Alcaráz
INDICE
1. Introducción 1
2. Justificación 13
3. Objetivos 18
4. Caracterización del área de trabajo 19
5. Problemas a resolver 20
6. Alcances y limitaciones 21
7. Fundamento teórico 22
8. Procedimientos y descripción de las actividades realizadas 31
9. Resultados 35
10. Conclusiones y recomendaciones 39
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Bacillus thuringiensis
1.1-1 Generalidades sobre Bacillus thuringiensis.
Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva, aeróbica, que presenta flagelos perítricos, con un ancho de 1–1.2 µm y una longitud de 3–5 µm y produce una espora lateral
con forma elipsoidal. B. thuringiensis tiene la característica de formar un cristal parasporal durante el proceso de esporulación, dicho cristal parasporal está constituido por una o varias
proteínas llamadas proteína Cry, que le confiere capacidad patogénica hacia varios insectos en
su mayoría lepidópteros, dípteros y coleópteros.
Además de esta toxina, B. thuringiensis produce una serie de factores de toxicidad, entre los que se encuentran la proteína Cyt, las proteínas VIP (proteínas insecticidas
vegetativas) y la β-exotoxína (Höfte y Whiteley, 1989). El cristal de B thuringiensis se encuentra separado de la espora, como se muestra en la Figura 1, donde se observan ambas
estructuras en un esporangio. Esta bacteria se ha aislado de diversas regiones alrededor del
mundo (Martín y Travers, 1989) y de una diversidad de ambientes, incluyendo suelo, insectos,
depósitos de productos almacenados (Schnepf et al., 1998), del filoplano (Smith y Couche, 1991).
Debido a sus propiedades insecticidas B. thuringiensis es producido comercialmente desde 1959, y es considerado como un bioinsecticida seguro por su limitada toxicidad a
insectos y la evidencia de no impacto a mamíferos u organismos no blanco. Ha sido utilizado
como insecticida biológico en el control de plagas agrícolas y control de vectores de
enfermedades, con la utilización de más de 100 productos que han sido desarrollados
alrededor del mundo y constituyen cerca del 90% de todos los bioinsecticidas. Se estima que
al inicio de los noventas había cerca de 40,000 aislados en el mundo (Lambert y Peferoen,
1992), pero esta cifra pudo haberse duplicado a la fecha.
La Figura1: Es una microfotografía de B. thuringiensis svar. thuringiensis berliner
1715 durante la esporulación, en ella se puede observar la espora (Es) y el cristal Protéico
Figura 1. Micrografía de B. thuringiensis svar. thuringiensis berliner 1715 durante la esporulación. Es: espora; CP: cristal parasporal (Agaisse y Lereclus, 1995).
La clasificación sistemática de B. thuringiensis es la siguiente: Reino: Procariota
División: Firmicutes Clase: Firmibacteria Orden: Eubacteriales Familia: Bacillaceae Género: Bacillus
1.1-2 Historia del Bacillus thuringiensis
El primer reporte de B. thuringiensis fue hecho en 1901 por S. Ishiwata, que lo aisló de la larva del gusano de seda Bombyx mori (L.). Por su capacidad insecticida lo denominó sotto bacillus (“sotto” significa muerte súbita en japonés). Sin embargo, una década después, en 1911, Ernst Berliner aisló un organismo similar, de la larva de la palomilla de los graneros
Anagasta kuehniella (Zeller) en un granero en la provincia de Thüringen (Thuringia) en Alemania, de donde toma el nombre, dominándolo Bacillus thuringiensis y por el cual Berliner obtuvo el crédito en la clasificación (Whiteley y Schnepf, 1986).
En 1916 en Japón Aoki y Chiasaki reportaron que la actividad era debido a la presencia
de una toxina en los cultivos esporulados, pero no en cultivos jóvenes de células vegetativas y
que la inactivación de la toxina por ácidos, fenol, cloruro de mercurio y calor, podría tratarse
convirtiéndose en los primeros productos biológicos comerciales a base de B. thuringiensis. Ambos observaron un cuerpo de inclusión secundario o “Restkörper” en adición a la espora
durante el desarrollo del esporangio. En 1928 un proyecto pionero se realizó en Europa con
preparaciones de espora-cristal para el control de barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis). En 1938 la producción comercial de B. thuringiensis fue realizada por los laboratorios Libec, en Francia con el producto Sporeine; desafortunadamente, con el inicio de
la segunda guerra mundial la producción cesó. Aún así, Jacobs en 1951 fue uno de los
primeros que reportaron la efectividad de Sporeine para el control de A. kuehneilla. (Beegle y Yamamoto, 1992).
En los inicios de los años 50, Edward Steinhaus redescubre el B. thuringiensis
estimulando el interés en los Estados Unidos en su uso y aprovechamiento comercial.
Steinhaus realiza pruebas exitosas de laboratorio y campo contra la larva Coliaseurytheme en alfalfa. En 1957 Pacific Yeast Products, produce un formulado a base de B. thuringiensis
llamado Thuricide, iniciando el uso comercial en los Estados Unidos y en años posteriores se
diversifica el mercado en este país y Europa con formulaciones en diferentes presentaciones
(Beegle y Yamamoto, 1992).
En estudios realizados por C. Hannay en 1953, se reporta un segundo cuerpo en el
esporangio (observado anteriormente por Berliner y Mattes), especulando que la inclusión
parasporal juega un papel en la patogenicidad de la bacteria. T. A. Angus (1954) confirma
que el cristal paraesporal es el responsable de la toxicidad y muestra que las esporas por sí
solas no tienen efecto y que el sobrenadante dializado de los cristales disueltos por álcali
tuvieron el mismo efecto tóxico que el complejo espora-cristal cuando fue ingerido por larvas
de B. mori. (Heimpel y Angus, 1959).
En 1970 Haward Dulmage reportó una cepa asilada del gusano rosado del algodonero
Pectinophora gossipyella, nombrándolo HD-1. Esta cepa pertenece al serovar kurstaki y mostró una alta potencia insecticida, al extremo que los laboratorios Abbot lo introdujeron al
Hasta 1976 se conocía que B. thuringiensis sólo era tóxico contra lepidóptero, sin embargo, en ese año Goldberg y Margalit aislaron una cepa del mosquito Culex en el desierto de Negev (Israel). Este aislado representaba un nuevo serotipo (H14) y se le denominó B. thuringiensis svar. israelensis, el cual es altamente tóxico a larvas de Aedes aegypty (de Barjac, 1978). Posteriormente en 1983 A. Krieg et al., aislaron la cepa tenebrionis de la pupa muerta de Tenebrio monitor, la cual resultó altamente tóxica a las larvas del defoliador del olmo (Agelastica alni) y a las larvas de la catarinita de la papa (Leptinotarsa decemlineata), pertenecientes al orden Coleóptera (Lambert y Peferoen, 1992). Estos hallazgos estimularon la
búsqueda de aislados con actividad contra diversos insectos de importancia económica.
1.2. Insecticidas
1.2-1 Definición
Los insecticidas son agentes de origen químico o biológico que controlan insectos. El control
puede resultar de matar el insecto o de alguna manera impedir que tenga un comportamiento
considerado como destructivo (The Pesticide Book, 2004).
1.2-2 Historia de los insecticidas
Los humanoides han estado sobre la tierra durante más de 3 millones de años, mientras
que los insectos han existido al menos durante 250 millones de años. Podemos imaginar que
entre los primeros intentos usados por nuestros primitivos antepasados para reducir las
molestias causadas por los insectos estuvieron: hacer hogueras que produjeran humo o aplicar
barro o polvo sobre su piel para repeler los insectos que los picaban o les causaban irritación,
una práctica parecida a los hábitos de los elefantes, cerdos, y búfalos de agua. Hoy, tales
prácticas se clasificarían como repelentes, una categoría de los insecticidas
(http://www.pestworld.com/).
verde para proteger las manzanas de gusanos y pudriciones. Más tarde, encontramos una
cantidad de materiales usados con resultados cuestionables: extractos de pimiento y tabaco,
agua jabonosa, aguacal, vinagre, trementina, aceite de pescado, salmuera, y lejía entre otras
(http://www.pestworld.com/).
Al comienzo de la II Guerra Mundial (1940), nuestra selección de insecticidas se
limitaba a varios arsenicales, aceites de petróleo, nicotina, piretro, rotenona, azufre, gas de
cianuro de hidrógeno, y criolita. La II Guerra mundial fue lo que abrió el control de la Era de
la Química Moderna con la introducción de un nuevo concepto en el control de insectos –los
insecticidas orgánicos sintéticos, el primero de los cuales fue el DDT
(http://www.pestworld.com/).
1.2-3 Características ideales de un insecticida tipo
Gran especificidad. El producto solo afecta al organismo diana dejando inmunes al
resto de seres vivo y el medio ambiente.
Baja toxicidad en humanos. El producto reviste un riesgo bajo tanto para sufrir
intoxicaciones agudas como a exposiciones a bajas dosis.
Baja dosis letal. El insecticida es efectivo con poca cantidad.
Bajo costo. El producto tiene que ser barato.
Obviamente estas características raramente están presentes en un mismo producto
(http://www.pestworld.com).
1.2-4 Mecanismo de acción
Los insecticidas pueden hacer acción sobre uno o diferentes de los estados de
desarrollo del artrópodo y se pueden consideran ovicidas, larvicidas y adulticidas
respectivamente si eliminan los huevos, la larva o el adulto (http://www.pestworld.com/).
Los insecticidas pueden entrar en contacto con el insecto a través de la alimentación cuando
tocan al insecto o, lo más habitual, de forma combinada. La forma más moderna y efectiva de
través de los vasos conductores repartirse por toda la planta y la convierten en venenosa para
la plaga. Así tenemos:
Insecticidas de ingestión
Insecticidas de contacto
Insecticidas combinados de ingestión y contacto
Insecticida sistémico.
La acción del insecticida sobre el organismo diana puede ser la muerte a corto o medio
plazo. A veces, provoca que dejen de comer o impiden la metamorfosis del insecto que a más
largo plazo implica la muerte (http://www.pestworld.com/).
1.2-5 Ventajas y riesgos
El uso de insecticidas combinados con otras innovaciones, es responsable del aumento
de la higiene y salud en la población. En la agricultura ha permitido aumentar los rendimientos
y mejorar la conservación de los alimentos. Por otro lado, ha introducido en el medio ambiente
unos productos tóxicos, los productos de degradación de los cuales es en parte de efectos
desconocidos (http://www.pestworld.com/).
Por tal de limitar el riesgo la evaluación del grado de toxicidad para el hombre de los
insecticidas y otros agroquímicos se hace en organismos oficiales. Se utilizan animales de
laboratorio y se establece la dosis letal normativa DL50. También hay un riesgo variable de
mutaciones, esterilidad, enfermedades diversas y contaminación de tierras, aguas y alimentos
(http://www.pestworld.com/).
1.2-6 Clasificación de los insecticidas
organoclorados son principalmente de interés histórico ya que solo unos pocos sobreviven en
el arsenal de hoy (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.1. Organosulfurosos
Estos pocos materiales tienen una toxicidad muy baja para los insectos y solo son
usados como acaricidas. Contienen dos anillos fenílicos por lo cual se parecen al DDT, pero
tienen azufre en lugar de carbono como átomo central (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.3. Carbamatos
Los insecticidas carbamatos son derivados del ácido carbámico (de la misma manera
que los Ops son derivados del ácido fosfórico). Y de igual manera que los Ops, su modo de
acción es la inhibición de la vital enzima colinesterasa (ChE) (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.4. Formamidinas
Las formamidinas comprenden un pequeño grupo de insecticidas. Tres ejemplos son
clordimeform (Galecron®, Fundal®), que ya no tiene registro en los EEUU, formetanato
(Carzol®), y amitraz (Mitac®, Ovasyn®). Su valor actual está en el control de plagas
resistentes a los Ops y a los carbamatos (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.5. Dinitrofenoles
La molécula básica de dinitrofenol tiene un amplio rango de toxicidades —como
herbicidas, insecticidas, ovicidas, y fungicidas. De los insecticidas, el binapacril (Morocide®)
y el dinocap (Karathane®) fueron los usados más recientemente. El dinocap es un acaricida
efectivo y fue intensamente usado como a fungicida para el control de hongos que causan
mildiús polvorientos. Debido a la toxicidad inherente de los dinitrofenoles, todos ellos han
1.2-6.6. Orgánicos de estaño
Los productos orgánicos de estaño son un grupo de acaricidas que tienen una función
doble como fungicidas. De interés particular es la cihexatina (Plictran®), uno de los acaricidas
más selectivos que se conocen, fue introducido en 1967. El óxido de fenbutatina (Vendex®)
ha sido usado extensamente contra ácaros en frutales deciduos, cítricos, cultivos de
invernadero, y ornamentales (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.7. Piretroides
El piretro natural rara vez ha sido usado con fines agrícolas debido a su costo y a su
inestabilidad en presencia de luz solar. En décadas recientes, muchos materiales sintéticos
parecidos a las piretrinas han aparecido en el mercado. Originalmente fueron llamados
piretroides sintéticos. Éstos son estables en presencia de luz solar y generalmente son efectivos
contra la mayoría de los insectos plagas de la agricultura y se usan a dosis muy bajas de 0.01 a
0.1 kilogramos por hectárea (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.8. Nicotinoides
Los nicotinoides son una de las más nuevas clases de insecticidas con un nuevo modo
de acción. Anteriormente se los ha denominado nitro-quanidinas, neonicotinilos,
neonicotinoides, cloronicotinas, y más recientemente como cloronicotinilos. De la misma
manera en que los piretroides sintéticos son similares a, y modelados a partir de, las piretrinas
naturales, los nicotinoides son similares a y modelados a partir de la nicotina natural (The
Pesticide Book, 2004).
1.2-6.9. Pirroles
áfidos, y el escarabajo de las papas de Colorado. Tiene actividad ovicida en algunas especies.
La EPA tomó la singular medida de rechazar el registro de clorfenapir en el año 2000 para
control de insectos del algodonero por su peligro potencial para los pájaros. Sin embargo, se
aprobaron las etiquetas para uso en ornamentales de invernadero en el 2001 (The Pesticide
Book, 2004).
1.2-6.10. Pirazoles
Los pirazoles originales fueron tebufenpirad y fenpiroximato. Éstos fueron designados
principalmente como acaricidas de contacto y estomacales no sistémicos, pero tienen una
efectividad limitada en psylla, áfidos, mosca blanca, y thrips (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.11. Piridazinonas
Piridaben (Nexter®, Sanmite®) es el único miembro de esta clase. Es un insecticida y
acaricida selectivo de contacto, también es efectivo contra thrips, áfidos, moscas blancas y
saltahojas. Está registrado para frutales pomáceos, almendros, cítricos, ornamentales y
ornamentales de invernadero. Piridabén ofrece un control residual excepcionalmente largo, y
acción inmediata en un amplio rango de temperaturas (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.12. Quinazolinas
Las quinazolinas ofrecen una configuración química única, y consisten de un solo
insecticida, el fenazaquín (Matador®). Fenazaquín es un acaricida de contacto y estomacal.
Tiene actividad ovicida, acción inmediata, y controla todos los estados de los ácaros (The
Pesticide Book, 2004).
1.2-6.13. Benzoilúreas
Las benzoilúreas son una clase de insecticidas enteramente diferente que funciona
como regulador del crecimiento de los insectos (RCIs). En lugar de ser un veneno típico que
insecto más por ingestión que por contacto. Su máximo valor está en el control de orugas y
larvas de escarabajos (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.14. Botánicos
Los insecticidas botánicos son de gran interés para muchas personas, por tratarse de
insecticidas naturales, productos tóxicos derivados de plantas. Históricamente, los materiales
vegetales han sido usados durante más tiempo que cualquier otro grupo, con la posible
excepción del azufre. Tabaco, piretro, derris, heleboro, acacia, alcanfor, y trementina son
algunos de los más importantes productos vegetales en uso antes que comenzara la búsqueda
organizada de insecticidas a comienzos de los años 1940s (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.15. Sinergístas o activadores
Los sinergístas no se pueden considerar en sí mismos como tóxicos o insecticidas, pero
son materiales usados con insecticidas para sinergizar o incrementar la actividad de los
insecticidas. El primero fue introducido en 1940 para aumentar la efectividad del piretro.
Desde entonces han aparecido muchos de estos materiales, pero solo unos pocos se mercadean
todavía. Los sinergistas se encuentran en casi todos los aerosoles de uso casero, de animales y
de mascotas para mejorar la acción de los insecticidas de rápida acción: piretro, aletrina, y
resmetrina, contra insectos voladores (The Pesticide Book, 2004).
1.2-6.16. Antibióticos
En esta categoría están las avermectinas, que son agentes insecticidas, acaricidas, y
antihelmínticos que han sido aislados de los productos de fermentación de Streptomyces
avermitilis, un miembro de la familia de los actinomicetos. Abamectina es el nombre común
asignado a las avermectinas, una mezcla que contiene 80% de los homólogos avermectina B1a
1.2-6.17. Fumigantes
Los fumigantes son moléculas orgánicas pequeñas y volátiles que se gasifican a
temperaturas por encima de los 5ºC. Usualmente son más pesados que el aire y comúnmente
contienen uno o más de los halógenos (Cl, Br, o F). La mayoría son altamente penetrantes, y
llegan a lo profundo de grandes masas de material. Se usan para matar insectos, huevos de
insectos, nemátodos, y ciertos microorganismos en edificios, bodegas, elevadores de granos
(silos), suelos, e invernaderos en productos empacados tales como frutas secas, frijoles,
granos, y cereales para el desayuno (The Pesticide Book, 2004).
1.2-7Repelentes de insectos
1.2-7.1. Inorgánicos
Son insecticidas inorgánicos aquellos que no contienen carbono. En su estado natural
usualmente son cristales blancos, parecidos a las sales. Son productos químicos estables, no se
evaporan, y usualmente son solubles en agua (The Pesticide Book, 2004).
1.2-7.2. Feromonas de los insectos
La mayoría de los insectos parecen comunicarse mediante la liberación de cantidades
moleculares de compuestos altamente específicos que se evaporan rápidamente y son
detectados por insectos de la misma especie. Estas delicadas moléculas se conocen como
feromonas. La palabra feromona viene del griego pherein, “llevar,” y hormon, “excitar o
estimular.” (The Pesticide Book, 2004).
1.2-7.3. Reguladores del crecimiento de los insectos.
Los reguladores del crecimiento de los insectos (RCIs) son compuestos químicos que
alteran el crecimiento y desarrollo en los insectos. Los RCIs alteran el crecimiento y el
desarrollo del insecto de tres maneras: como hormonas juveniles, como precocenos, y como
1.2-7.4. Bioinsecticidas.
Los insecticidas microbiales obtienen su nombre de los microorganismos que se usan
para controlar ciertos insectos. Los microorganismos que causan enfermedades en los insectos
no causan daño a otros animales o a las plantas. En el presente hay relativamente pocos
producidos comercialmente y aprobados por la EPA (más de 55 naturales, y 16 organismos
producidos por bioingeniería) para uso en cultivos para alimento humano y animal. A
mediados del 2002, la lista de la EPA de microbiales registrados incluía 35 bacterias, 1
levadura, 17 hongos, 1 protozoario, 6 virus, 8 organismos de bioingeniería y 8 genes de
2. JUSTIFICACIÓN
2.1. El dengue
El dengue (clásico) y la fiebre hemorrágica del dengue (FHD) son enfermedades
infecciosas producidas por un virus (Flaviviridae) y trasmitida por mosquitos. También
llamada fiebre rompehuesos, es una enfermedad infecciosa tropical caracterizada por fiebre y
dolor intenso en las articulaciones y músculos, inflamación de los ganglios linfáticos y
erupción ocasional de la piel (Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
Es causada por cualquiera de cuatro virus estrechamente relacionados (DEN-1, DEN-2,
DEN-3 o DEN-4) que son transmitidos a los humanos por la picadura de un mosquito
infectado. El mosquito Aedes aegypty es el transmisor o vector de los virus de dengue más
importante en el hemisferio occidental (Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
En la figura 2, se muestra la distribución mundial del dengue en el año 2006, como se
puede observar es frecuente en zonas de la India, Sudeste Asiático, Centro y Sudamérica,
Caribe y África central y occidental (wikipedia.org).
Figura 2. Distribución mundial del dengue, 2006. Rojo: Dengue epidémico. Azul: Aedes aegypty.
2.2. Manifestaciones clínicas
El dengue es una enfermedad vírica febril y aguda que se caracteriza por comienzo
repentino. La fiebre puede durar de tres a cinco días (rara vez más de siete días, y suele ser
aparato gastrointestinal y exantema rubeliforme. En algunos casos aparece tempranamente
eritema generalizado (Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
Para la fecha en que la fiebre muestra defervescencia suele aparecer una erupción
maculopapular generalizada, pruriginosa, de duración corta (Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
En cuanto al dengue hemorrágico, se presenta un incremento en la permeabilidad
vascular, manifestaciones hemorrágicas extraordinarias y ataque de órganos específicos
(Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
En cualquier momento durante la fase febril pueden aparecer fenómenos hemorrágicos
de poca intensidad, como petequias, epistaxis o metrorragia. En las personas de piel oscura la
erupción a menudo no es visible (Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
La recuperación puede acompañarse de fatiga y depresión duraderas. Son frecuentes la
linfadenopatía y la leucopenia con linfocitosis relativa; con menor frecuencia se observan
trombocitopenia (menos de 100.000 plaquetas por mm3) e incremento de las
aminotransferasas (Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
2.3. Período de transmisibilidad
El tiempo intrínseco de transmisibilidad corresponde al de la viremia de la persona
infectada. Comienza un día antes del inicio de la fiebre y se extiende hasta el 6° u 8° día de la
enfermedad (Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
El virus se multiplica en el epitelio intestinal del mosquito hembra infectando ganglios
nerviosos, cuerpo graso y glándulas salivales; el mosquito permanece infectado y asintomático
toda su vida, que puede ser de semanas o meses en condiciones de hibernación. Luego de 7 a
2.4. Panorama actual
El dengue es endémico en algunas zonas de los trópicos y han aparecido epidemias en
países tropicales y templados. Carece de tratamiento específico y de vacuna. Con frecuencia
tiene una evolución de seis a siete días, pero la convalecencia es larga y lenta. El dengue
hemorrágico o fiebre hemorrágica del dengue es una forma más grave del dengue y puede ser
mortal si no se trata adecuadamente (Wikipedia.org).
El dengue hemorrágico es causado por infección con uno de los mismos virus que
causan el dengue, habiéndose infectado previamente con alguno de los otros tres. El virus no
se puede transmitir directamente de persona a persona. En 2007, Paraguay ha sufrido una
epidemia con aproximadamente 1.500 casos confirmados (Wikipedia.org).
La enfermedad ya esta empezando a migrar hacia Argentina donde, si bien existen
casos de personas contagiadas tras viajar a zonas afectadas, ya se registraron en Formosa y en
Corrientes casos de contagios autóctonos producidos por el mosquito. También están
apareciendo larvas del mosquito en Uruguay y actualmente ya se pueden encontrar en
Montevideo, su capital. También comenzó a aparecer en las fronteras con Brasil y Argentina.
Además hay casos confirmados en Isla de Pascua, Chile (Wikipedia.org).
En primavera boreal de 2007, se confirmó la muerte de una canadiense infectada en
México durante su estancia en este país, causando que las autoridades canadienses emitieran
alertas contra Cancún, Acapulco y Puerto Vallarta. Al parecer las autoridades mexicanas
buscaron ocultar el hecho, pero indagaciones periodísticas sacaron a la luz esta información
(Wikipedia.org).
Actualmente se están apareciendo casos de dengue en Paraná, Brasil, donde la
acumulación de aguas estancadas y basuras facilitan la proliferación tanto del virus como del
2.5. Dengue en Colima
El pasado mes de Agosto, el epidemiólogo estatal, Rodolfo Flores García, presentó al
gobernador las últimas estadísticas de la epidemiología del dengue en el estado de Colima.
Indicó que de cada 10 mil habitantes en el estado, cien enferman de dengue; y noventa por
ciento de las personas que padecen esta enfermedad, están concentrados entre los municipios
de Armería, Colima, Manzanillo y Tecomán, con un rango de edad entre los 10 y 14 años. En
cuanto al dengue hemorrágico, Flores García expuso que el ochenta por ciento se encuentra
ubicado en el municipio de Manzanillo (Gobierno del estado de Colima, 2007).
2.6. Aedes aegypty
Los vectores que transmiten el dengue son ciertas especies de Aedes aegypty, este
díptero, presenta un ciclo de vida único: Aedes aegypty – humano – Aedes aegypty. El ciclo
de vida comprende varios estados: huevo, cuatro instares larvarios, pupa y adulto. El ciclo de
vida del mosquito se muestra en la Figura 3. (Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
Huevo: Los huevos de A. aegypty, miden aproximadamente 1mm de longitud; poseen forma ovalada y son tersos. Al momento de la postura son blancos, pero rápidamente cambian a
negro brillante http://es.wikipedia.org/wiki/Insecticida (Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
Larva: Las larvas son exclusivamente acuáticas. La fase larval es el periodo de alimentación y
crecimiento. Se identifican por dos prominentes espinas laterales del tórax y una hilera recta
de siete a doce escamas del peine en el octavo segmento abdominal. En condiciones óptimas,
el periodo larval desde la eclosión hasta la fase de pupa, es de 5 días (Chico, Hidalgo y Ochoa,
2003).
Pupa: Las pupas también son acuáticas, no se alimentan; su función es la metamorfosis del
Adulto: Es la fase reproductora de A. aegypty. Es un mosquito oscuro con bandas blancas en las bases de los segmentos torsales y un característico diseño en forma de lira en el mesonoto
(sección del tórax del mosquito). En la Figura 4 se observa a una hembra adulta de Aedes aegypty (Chico, Hidalgo y Ochoa, 2003).
Figura 3. Ciclo de vida del mosquito Aedes aegypty, muestra las diferentes etapas de desarrollo del mosquito, desde huevo hasta convertirse en adulto.
OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Seleccionar y caracterizar cepas de Bacillus thuringiensis que presenten actividad
tóxica contra larvas del mosquito transmisor del dengue (Aedes aegypty).
3.2. Objetivos específicos
Caracterizar morfológicamente las cepas de Bt.
Caracterizar bioquímicamente las cepas de Bt.
4. CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA DE TRABAJO
4.1. Departamento De Biotecnología Y Bioquímica.
El Departamento de Biotecnología y Bioquímica del CINVESTAV unidad Irapuato,
desarrolla investigación en dos grandes áreas de la Biología moderna: La Bioquímica y la
Biología Molecular de Plantas, y la Biotecnología de la Protección de Vegetales. La
estructura del Departamento permite que exista una estrecha vinculación entre la investigación
y la docencia, lo que se refleja en la alta calidad de los egresados. Los investigadores del
Departamento enfatizan la importancia de que el estudiante adquiera una formación
interdisciplinaria, lo cual le permitirá entender aspectos básicos y aplicados de la biología
moderna. En el área de la bioquímica y biología molecular de plantas se investigan aspectos
relacionados con la bioenergética, biomembranas, metabolismo secundario, la bioquímica,
fisicoquímica y biología molecular de diferentes macromoléculas como proteínas, almidones y
lípidos. Asimismo, se desarrolla investigación para la generación de materiales genéticos con
un mejor comportamiento agro-alimentario. Dentro del área de la Biotecnología de la
Protección Vegetal, los proyectos de investigación van enfocados al control biológico de
enfermedades y plagas de importancia agrícola. En esta sección se estudian aspectos
bioquímicos, ecológicos, genéticos y moleculares implicados en aspectos básicos y aplicados
en la interacción planta-patógeno.
4.2. Laboratorio de Bioinsecticidas
El enfoque principal del Laboratorio de Bioinsecticidas se encamina hacia el
aislamiento, selección y caracterización de cepas nativas de Bacillus thuringiensis.
Identificación y caracterización de entomopatógenos nativos. Desarrollo de bioinsecticidas a
partir de cepas seleccionadas, con especial énfasis hacia el control de plagas de la región.
Estudio de los efectos deletéreos de diversas proteínas sobre el desarrollo y viabilidad de
5. PROBLEMAS A RESOLVER
El primer problema a resolver fue conocer las técnicas empleadas para la
caracterización de las cepas nativas, por lo que se necesité asesoría sobre estas técnicas y el
manejo de los equipos para los análisis.
Considerando que cada cepa presentó diferentes tiempos desde la inoculación hasta su
lisis celular, se deberán realizar los bioensayos en tiempos diferentes, es decir se hará el
mismo procedimiento varias veces para capas diferentes.
Coordinar los tiempos para la realización de los bioensayos, con los periodos en los
que el insectario tenga larvas disponibles, fue también un problema presente durante el
6. ALCANCES Y LIMITACIONES
Aunque la selección de cepas nativas de Bacillus thuringiensis, es un trabajo rutinario en el Laboratorio de Bioinsecticidas, puede tener grandes expectativas, sobre todo si se logra
encontrar una cepa de Bt que sea altamente tóxico contra Aedes aegypty, de la cual puedan obtenerse altas concentraciones de la toxina. Ya que esta se podría escalar a nivel industrial
para hacer formulaciones altamente efectivas para el control del mosquito transmisor del
dengue. Ayudando de esta forma a prevenir brotes de esta enfermedad.
El principal factor limitante fue el tiempo que durara el estudio, ya que para determinar
la efectividad de la toxina es necesario determinar la concentración letal media (CL 50) de la
toxina. Esta determinación lleva por si sola más de dos meses, que es el tiempo que duró mi
7. FUNDAMENTO TEÓRICO
7.1. Uso de Bacillus thuringiensis como bioinsecticidas
Desde la aparición del primer producto comercial (Sporeina) en Francia en 1938, en el
mercado se han desarrollado más de 100 productos basados en B. thuringiensis, comprendiendo cerca del 90% de los productos bioinsecticidas.
El medio de cultivo es un factor importante en la producción de la bacteria, ya que
requiere que suministre los requerimientos nutricionales de microorganismo y además que
sean de bajo costo.
La producción normalmente contiene una mezcla de esporas, cristales tóxicos y
algunas células vegetativas. La US Environmental Protetion Agency (EPA) requiere que la
producción a base de B. thuringiensis no presente β-exotoxina debido al amplio espectro de acción que presenta ésta, a diferencia de la toxicidad específica de las proteínas Cry. Los
principales productos están basados en los serovares kurstaki, thuringiensis, israelensis, aizawai, morrisoni, alesti, galleriae, darmstadiensis, dendrolimus y sotto (Glare y O´Callaghan, 2000). La mayoría de los productos (ej. Dipel, Thuricide) están basados en B. thuringiensis kurstaki HD1, principalmente por su actividad contra más de 100 especies de lepidópteros. Por ejemplo, Glare y O´Callaghan (2000) enlistan alrededor de 167 especies de
lepidópteros susceptibles a Dipel.
Los productos a base de B. thuringiensis tienen las siguientes ventajas:
Alta especificidad
Inocuidad hacia mamíferos, aves, plantas e insectos benéficos
Baja persistencia en el ambiente
Baja tasa de desarrollo de resistencia por parte de los insectos
Por otro lado, tiene algunas desventajas:
La especificidad se vuelve una desventaja desde el punto de vista agronómico por su
estrecho rango de acción
Se inactiva por la luz ultravioleta del sol
No provoca epizootias, por lo que sus aplicaciones comúnmente deben de ser
repetitivas.
Podríamos Clasificar a los productos a base de B. thuringiensis en: productos de cepas nativas (productos de primera generación); cepas modificadas (productos de segunda
generación); cepas de otras especies transformadas con genes cry (productos de tercera generación); y en plantas transgénicas.
a) Productos de primera generación: Son aquellos productos formulados a base de
cepas nativas. Se utiliza una pequeña proporción de todas las proteínas Cry conocidas y
corresponden al 84% de los productos registrados. La cepa kurstaki HD1 es el ingrediente activo de la mayoría de las formulaciones usadas en el área agrícola. Los productos a base de
B. thuringiensis svar. Israelensis son efectivos contra mosquitos y jejenes, y los productos como Vectobac® y Bactimos® son formulados con esta cepa (Cerón, 2001).
b) Productos de segunda generación: Son aquellos productos que se formulan con una
cepa de B. thuringiensis a la cual se lo introdujo, por conjugación o transformación, genes cry
parentales de una cepa nativa. Condor® es un producto en el cual un plásmidos
auto-transmisibles de aizawa fue transferido por conjugación a la cepa receptora de kurstaki. El producto Foil® está formulado con la cepa EG2424 productora de la proteína Cry1Ac y Cry3A
y exhibe toxicidad contra lepidóptero y coleóptero: Esta cepa resultó de la transferencia de un
plásmido de ~88 Mda, que codifica para la toxina Cry3a de la cepa morrisoni EG2158, a
kurstaki HD263 como cepa receptora.
La recombinación facilita la introducción y expresión de genes cry para la construcción de nuevas cepas con actividad insecticida deseable. El uso de recombinación para la
manipulaciones genéticas que incluyen, curado de plásmido, conjugación, transformación, y
recombinación sitio-específico (SSR): la cepa EG7841-1 se deriva de la cepa nativa kurstaki
EG3125 que contiene los genes cry1Ac y cry2Aa en el plásmido de ~110 Mda y el gen cry1Ab
en el plásmido de ~46 Mda. La curación de la cepa de este último plásmido se designó
EG6012 y se usó como receptor en una serie experimentos por conjugación para introducir
plásmidos que codifican otras proteínas Cry. Un de estos transconjugantes, designado
EG4923, al cual se del introdujo un plásmido de 56 Mda de la cepa HD74 (ahora EG4923),
contenía tres genes cry1Ac y el gen cry2Aa. A una variante de esta cepa se le introdujo el gen
cry1C clonado en el plásmido pEG950 por SSC, resultando la cepa recombinante EG7841-1 que produce 30% más Cry1 que su cepa parental (Baum et al., 1999).
c) Productos de tercera generación: se desarrollaron con el fin de resolver la
inadecuada aplicación y corta toxicidad residual. Estos productos se han obtenido insertando
genes que codifican para toxinas de B. thuringiensis en otros microorganismo. El sistema CellCap es un ejemplo, ya que la formulación consiste en bacterias muertas recombinantes.
Una cepa no patógena de Pseudomonas fluorescens expresa la toxina durante la fase estacionaria de crecimiento y la proteína queda encapsulada en la pared de la bacteria muerta,
sistema que fue desarrollado por la compañía Mycogen (Baum et al., 1999).
Los productos a base de B. thuringiensis svar. Israelensis son exitosamente utilizados alrededor del mundo para el control de larvas mosquito y jejenes; sin embargo, la actividad
residual es corta y la adsorción por las partículas orgánicas acuáticas son dos importantes
limitaciones. Para prolongar la efectividad de esta cepa, varios grupos han investigado la
expresión de genes cry de israelensis en microorganismos que habitan el medio acuático, junto con los mosquitos y jejenes, principalmente las cianobacterias, introduciendo el gen cry4B en
Agmenellum quadruplicatum (Angsuthensombat y Panyim, 1989), los genes cry4B y cytA en
Synechocystis PCC6803 (Chungjatupornchai, 1990), los genes cry4A y cry11Aa en Anabaene
especificas. Los genes que le confieren resistencia a insectos se han introducido en cultivos
como algodón, maíz, arroz, soya, papa, tabaco y alfalfa, entre otros (Jenkins, 1999). En 1995
se aprobó la liberación en campo y comercialización de tres productos: algodón, que expresa
la proteína Cry1Ac (Bollgard®, Monsanto); papa, que expresa la toxina Cry3A (Newleaf®,
Monsanto); y maíz, que expresa la toxina Cry1Ab (Maximizar®, Novartis). A partir de aquí,
otros productos transgénicos se han desarrollado.
El uso de productos de B. thuringiensis se ha incrementado rápidamente con la expresión de genes cry en plantas y el aislado de nuevas cepas activas contra nuevas plagas blanco, aumentando el rango de acción de los formulados a base de B. thuringiensis.
7.2. Ciclo de vida y cuerpo parasporal
El ciclo de vida de B. thuringiensis es similar al de las otras especies de Bacillus; sin embargo, ciertos eventos esporogénicos y de formación de cristal son únicos. El ciclo se
divide en dos fases principales: crecimiento vegetativo y esporulación (Figura 5). Durante el
crecimiento vegetativo, la bacteria se multiplica exponencialmente en condiciones aeróbicas,
hasta que la fuente de nutrientes escasea. La esporulación coincide con el cambio de la fase de
crecimiento exponencial a fase estacionaria. En este momento comienza la esporulación y
simultáneamente se producen uno o más cristales parasporales La secuencia del desarrollo de
espora y formación del cristal paraesporal se resume en siete pasos (Batchel y Bulla, 1976)
(Figura 6):
I. Formación de un filamento axial que aparentemente no involucra al mesosoma
(7h).
II. Formación del septo prosporal involucrando al mesosoma (7-8 h)
III. Cubrimiento del mesosoma con la aparición de inclusión ovoide, cristal
paraesporal y formación de la protospora (8-9 h).
IV a VI. Formación del exosporio, pared celular primaria, cortex y cubiertas de la espora
acompañada por la formación del núcleo de la espora (9-12 h).
VII. Maduración de la espora (después de 12 h), acumulando iones de Ca2+ y ácido
La espora es elipsoidal y ocupa una posición subterminal dentro de la célula, es
altamente refringente y resistente a temperaturas extremas, desecación y a muchos
desinfectantes (ej. Etanol al 95%) (Sneath, 1986).
Simultáneamente a la esporulación tiene lugar la síntesis de uno o varios cuerpos
(cristales) parasporales, que representan del 20 al 30 % del peso seco del esporangio. El cristal
paraesporal se ubica en el interior del esporangio y generalmente fuera del exosporio, sin
embargo, se han descrito cristales dentro del exosporio (López-Meza e Ibarra, 1986). Una vez
que se ha completado el proceso de esporulación el esporangio sufre lisis de la pared (proceso
de autolísis), liberando la espora y el cristal al medio. Posteriormente si las condiciones son
Figura 5. Diagrama del ciclo de vida de B. thuringiensis (Modificado de Lambert y Peferoen, 1992). Lisis
Esporulación
Cristal Espora
Germinación
Esporangio Célula
vegetativa
Figura 6. Diagrama de proceso de esporulación de B. thuringiensis. M, mesosoma: FA, filamento axial: SP, septo protosporal: IO, inclusión ovoide: CP, cristal parasporal: EX, exosporio: C, cortex: CP, exosporio: E,
espora madura (Tomado de Bechtel y Bulla, 1976).
FA M SP
IO
CP
SP
EX
CP
I II III
III IV - VI
CP E
C
7h 7h 7h 7-8h 7-8h 8h
8h 8-9h 8-9h 10h 11- Esporangio
7.3. Proteínas bioinsecticidas
Bacillus thuringiensis produce una serie de factores de virulencia entre los que se encuentran proteasas, quitinasas, proteínas VIP (proteínas insecticidas vegetativas), que se
producen en la fase vegetativa de crecimiento (Estruch et al. 1996), β-exotoxina, una molécula termoestable de bajo peso molecular y con un amplio espectro de acción (Levinson 1990), y
las proteínas Cry que son toxinas que se producen durante la fase de esporulación formando
cristales parasporales y que son, por mucho, las más estudiadas (Schnepf et al. 1998, Höfte y Whiteley, 1989). Diversas cepas de B. thuringiensis producen además endotoxinas citolíticas pequeñas (25-28 Kda) o proteínas Cyt que muestran una amplia actividad inespecífica.
7.4. Modo de acción.
Las pruebas existentes indican que la acción de las proteínas Cry se produce a nivel de
la membrana apical de las células epiteliales por lo que B. thuringiensis debe ser ingerido por la larva susceptible para poder ejercer su acción. La toxicidad depende de un proceso complejo
de pasos que incluyen la solubilización de los cristales, el procesamiento proteolítico de la
protoxina a forma activa, la alta afinidad de unión con el receptor de la membrana epitelial e
inserción irreversible de la toxina dentro de la membrana. Cuando los cristales parasporales se
encuentran en el intestino medio, comienzan a solubilizarse por la acción del pH básico,
propio de esa región del intestino (Heimpel y Angus, 1959), liberando la proteína disuelta o
protoxina (forma inactiva) que se digiere principalmente por la acción proteolítica de las
proteasas digestivas, principalmente del tipo serin-proteasas (del tipo de tripsina y
quimotripsina), produciendo el fragmento tóxico de un tamaño aproximado de 60 kDa,
independientemente del tamaño de la protoxina, (Lecadet y Martouret, 1987). Esta toxina
activada es conocida como δ-endotoxina, cuya activación se produce por la digestión
progresiva de la proteína por el extremo C-terminal produciendo un núcleo resistente a la
proteólisis (Tojo y Aizawa, 1983) Las δ-endotoxinas atraviesan la membrana peritrófica y se
unen con una alta afinidad a una molécula proteica (receptor) que se encuentra integrada a las
membranas de las microvellosidades de las células epiteliales de intestino. Se conocen al
menos dos tipos de receptores de membrana, específicos a varias toxinas Cry, y se les ha
identificado como una N-aminopeptidasa de entre 120 y 170 kDa, y una proteína tipo
variedades de N-aminopeptidasas han sido identificadas como moléculas de unión para Cry1A
en varias especies tales como Manduca sexta.
Una vez que la proteína se une al receptor de la membrana, sufre cambios
conformacionales para que el dominio I interaccione y se inserte en la membrana apical. Al
dominio II (región más variable de la molécula) se le adjudica un papel en el reconocimiento y
unión al receptor. El dominio III está involucrado en la unión y reconocimiento así como la
resistencia a la proteólisis. Una vez que la δ-endotoxina se ha adherido a la membrana de la
célula epitelial, el dominio I interactúa y se inserta en la superficie de la célula, rompiendo la
unidad de membrana y formando un poro catiónico. El dominio I sufre un re-arreglo similar a
la abertura de una sombrilla (modelo de la sombrilla), los tres pares de α-hélices de este
dominio se abren y se inserta la hélice interna en la membrana, colocando el dominio III en la
superficie de la membrana cubriendo las hélices insertadas, la inserción de la δ-endotoxina
parece ser irreversible. Posteriormente ocurre la polimerización de la proteína insertada,
resultando la formación de un poro, los cuales son parecidos a tetrámeros y forman un canal
iónico selectivo de K+ (Whalon y Wingerd, 2003). La formación del canal lleva a dos cambios
fisiológicos en el insecto: primero se rompe el gradiente de K+ en las células epiteliales lo que
aumenta la concentración de K+ en la célula; y segundo, se rompe el equilibrio osmótico y la
célula absorbe agua hasta que se revienta. Los huecos causados por la pérdida de células
epiteliales permiten el paso del contenido alcalino del lúmen intestinal hacia la hemolinfa,
aumentando su pH y, consecuentemente, ocurre la parálisis del insecto. Posteriormente, las
bacterias intestinales pasan a la hemolinfa, causando una septicemia. La mayoría de los
insectos mueren como resultados de una parálisis del intestino, causando inanición y de una
8. PROCEDIMIENTOS Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS
A continuación se describen los materiales y los procedimientos que se utilizaron para
el desarrollo del presente estudio.
8.1. Cepas de estudio.
Para el presente estudio se utilizaron 57 cepas de Bacillus thuringiensis (Bt442 – Bt498) de la colección del Laboratorio de Bioinsecticida del CINVESTAV-Irapuato, México.
Dichas cepas fueron aisladas de una diversidad de fuentes como tierra, barredura de silos,
telarañas, etc. Las cepas se encuentran en la colección, liofilizadas y almacenadas a -20° C.
Para su activación fueron inoculadas en tubos de ensaye que contenían 3 ml de caldo leche
peptonizada, se mantuvo en incubación a 30º C y 220 rpm hasta que se presentó la autolisis en
las células.
8.2. Extracción de DNA plasmídico
Después de la autolisis celular de las cepas crecidas, se obtuvo por centrifugación (6
minutos a 5500 rpm) la pastilla celular para extraer de ella el DNA, con el siguiente
procedimiento.
1. Se lavó con 500 µl de solución Tris 25mM, EDTA 10mM, pH 8 (resuspender con
ayuda de un vortex).
2. Se centrifugó por 4 minutos a 5000 rpm para y se obtuvo la pastilla celular eliminando
el sobrenadante.
3. Posteriormente se agregaron 400 µl de solución Tris 50mM, EDTA 10mM, pH 8 (a
esta solución se agrega previamente 20 µg de muramidasa por cada ml).
4. Se incubó 2.5 h a 37 ºC y 100 rpm.
5. Se agregaron 100 µl de solución Tris 25mM, SDS 12.5%, NaOH 0.2 N, pH 13.
6. inmediatamente se agitó por inversión (20 veces aproximadamente).
7. Se calentó a 68 ºC durante 15 minutos.
9. se agregaron 250 µl de NaCl 5M.
10. Se reposó durante 6 minutos a -20 ºC
11. Se centrifugó por 10 minutos a 13000 rpm.
12. Posteriormente se agregaron 200 µl de acetato de Sodio (CH3COONa) 3M pH 5.
13. Se incubó a -20 ºC durante 30 minutos.
14. Se centrifugó 15 minutos a 13000 rpm.
15. El sobrenadante se transfirió a un tubo Ependorf de 2 ml.
16. Se adicionaron 900 µl de isopropanol frío (-20 ºC).
17. Se incubó a -20 ºC durante 20 minutos.
18. Posteriormente se centrifugó por 20 minutos a 13000 rpm.
19. El sobrenadante fue decantado.
20. La pastilla se lavó con etanol al 70% (agitar con la mano).
21. Se centrifugó por 20 minutos a 13000 rpm.
22. se decantó el etanol.
23. La pastilla de DNA se secó a 37 º C durante 15 minutos.
24. Se resuspendió en 100 µl de solución Tris 10mM, EDTA 0.1mM.
25. El DNA se mantuvo en refrigeración o congelado a -20 º C hasta su uso.
8.3. Análisis rep-PCR
La extracción del DNA cromosómico se realizó utilizando el método reportado por
Rosso (1997) modificado. Una asada de la cepa en estudio, se inoculó en un matraz de 250 ml
que contenía 30 ml de LB (Luria-Bertoni) y se incubó a 30° C hasta alcanzar una D.O.600 =
1.0. El cultivo se centrifugó a 3,000 g, por 5 minutos a 4°C y la pastilla se resuspendió con 10
ml de amortiguador J (Tris-HCl 1.0 M, EDTA 0.1 M y NaCl 0.15 M, pH 8) y se centrifugó a
las mismas condiciones. La pastilla se resuspendió en 4 ml de amortiguador J, se adicionaron
400 µl de lisozima (40 mg/ml) y se incubó durante 30 min. a 37°C. Posteriormente se
adicionaron 50 µL de RNAsa (10 mg/ml), y se incubó 15 min. a 50°C. Luego se adicionaron
con el mismo volumen de isopropanol. El DNA se recuperó por centrifugación a 17000 g por
20 min. a 4°C. La pastilla se lavó con etanol al 70% y se secó al aire. El DNA se resuspendió
con 200 µl de TE pH 8 (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA) La cantidad de DNA obtenida fue
determinada por espectrofotometría a 260 nm y se visualizó la integridad del DNA en geles de
agarosa al 1%. Las muestras de DNA extraídas fueron almacenadas a -20°C hasta su uso.
8.4. Bioensayos cualitativos
Para la realización de los bioensayos cualitativos, se preparó un vaso para cada cepa a
probar a cada vaso se agregaron 100 ml de agua, se agregaron 20 larvas de Aedes aegypty del
cuarto instar temprano, a cada vaso se agregaron 100 µl de la pastilla de Bt que se resuspendió
en agua destilada. Se dejó reposar 24 horas y se leyó la mortalidad para cada cepa.
Después del bioensayo, se agregó extrán y cloro a cada vaso para matar las larvas
sobrevivientes, se dejó reposar 24 horas, se desechó el agua pasándola por una red para retener
las larvas, estas se congelaron 24 horas a –20º C y después se desecharon.
8.5. Obtención de esporas y cristales
En matraces Enlermeyer de 500 ml con 100 ml de leche peptonizada, se inocularon por
duplicado las cepas Bt 452 y Bt 453; se mantuvieron en incubación a 28º C y 200 rpm hasta la
autolisis celular. Una vez autolisados, se separó del medio por centrifugación a 4500 rpm por
30 minutos. Posteriormente se realizaron 3 lavados con agua destilada a 13000 rpm durante 10
minutos. La pastilla obtenida se resuspendió en agua destilada y se mantuvo a – 20º C.
8.6. Purificación por gradientes de NaBr
La pastilla celular se resuspendió en 5 ml de solución de NaBr al 20%, y se agregó a
los gradientes de NaBr previamente preparados. Los gradientes se ultracentrifugación a 20000
rpm a 4ºC durante una hora. Se separaron cada una de las bandas formadas en el gradiente y se
liofilizaron. Con estas bandas se corrió un gel de poliacrilamida. La electroforesis de
8.7. Bioensayos cuantitativos
Se realizó cada bioensayo cualitativo por triplicado; se prepararon los vasos para
bioensayo de igual manera que en los bioensayos cualitativos pero esta vez se manejaron
concentraciones conocidas de cristales purificados y liofilizados. En el bioensayo se
manejaron tres dosis 10 mg /ml, 1mg/ml y 0.01mg/ml.
8.8. Electroforesis de DNA plasmídico
Para visualizar los patrones de plásmidos se utilizaron 5 µl de suspensión de DNA, los
cuales fueron visualizados en geles de agarosa horizontal al 0.6 % con 8 pozos, utilizando
Tris-borato-EDTA (45 mM Tris-borato, 1mM EDTA) 1X. Los geles fueron sometidos a 63
volts, durante 1.5 – 2 h. dependiendo de la presencia de plásmidos de bajo peso molecular.
Posteriormente fueron teñidos de 5 minutos en bromuro de etidio a una concentración de 0.4
µg/ml. Y desteñidos en agua desionizada por 10 minutos. Los geles obtenidos fueron
fotografiados en el sistema Gel Doc 2000TM Gel Documentation system (BioRad Corporation)
bajo luz ultravioleta y almacenados como imágenes TIFF. En cada gel se utilizó el marcador
de peso molecular de “Supercoiled” (Invitrogen) y la cepa kurstaki HD1 como cepa de referencia.
8.9. Electroforesis de los productos de Rep-PCR
Para una visualización rápida de las amplificaciones obtenidas por Rep-PCR, se
utilizaron 5 µl del producto de PCR y para un estudio más detallado se utilizaron 10 µl del
producto, los cuales fueron analizados en geles de agarosa al 1.2% (11 cm x 14 cm) en 1X
Tris-acetato-EDTA (40mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) a 2 V/cm, durante 5 h. Posteriormente
fueron teñidos en bromuro de etidio a una concentración de 0.4 µg/ml y desteñidos en agua
desionizada. Los geles obtenidos fueron fotografiados en el sistema Gel Doc 2000TM Gel
9. RESULTADOS
9.1. Primer bioensayos cualitativo
Después de crecer las cepas de Bacillus thuringiensis, se realizó un primer bioensayo,
los resultados de este se muestran en la Cuadro 1. En este cuadro podemos observar que se
presentan dos cepas con una alta actividad mosquitocida (Bt 452 y Bt 453), en adelante solo se
trabajó con estas cepas.
Se realizaron diluciones de hasta 10-6 de las dos cepas de estudio y se sembró en placa
con agar para métodos standard (AMS) las últimas dos diluciones; las placas sembradas se
incubaron durante 24 horas a 28º C. Posterior mente se numeró y picó cada colonia aislada
para su resiembra en placas con gota de AMS, se incubaron durante 72 horas a 28º C.
Posteriormente se observó al microscopio la morfología del cristal en cada una de las
cepas para verificar que no hubiera contaminación por otra cepa. De la cepa Bt 453 se picaron
24 colonias aisladas, mientras que de Bt 453 se picaron 23 colonias.
Todos los cristales observados para ambas cepas, presentaron morfología bipiramidal.
Se inoculó una caja de AMS con cada una de las cepas (Bt 452 y Bt 453) se incubó a 28ºC
hasta la autolisis celular.
9.2. Segundo bioensayo cualitativo
El segundo bioensayo, solo se diferenció del primero en que se agregó una asada de la
cepa a analizar en lugar de los 100 µl de la pastilla celular resuspendida. El bioensayo se
realizó por triplicado. Los resultados del bioensayo se presentan en el cuadro 2. Se revisó la
base de datos de la colección de cepas del Laboratorio de Bioinsecticidas y se descubrió que la
cepa Bt- 452 expresa la proteína Cry1 A, mientras que la cepa Bt-453, expresa la Cry1 E. Esto
llamó nuestra atención porque a la fecha no existen reportes en los cuales se muestre actividad
de la proteína Cry1 E contra dípteros. Motivo por el cual el resto del trabajo se centrara sobre
Cuadro 1. Resultados del primer bioensayo cualitativo, se observa una elevada actividad mosquitocida de las cepas: Bt-452 y Bt-453.
No. Cepa Tratados/Muertos
%
Mortandad No. Cepa Tratados/Muertos
% Mortandad Testigo 1 20/0 0 Bt 470 20/0 0 Testigo 2 20/0 0 Bt 471 20/0 0
Bt 442 20/0 0 Bt 472 20/0 0
Bt 443 20/0 0 Bt 473 20/0 0
Bt 444 20/0 0 Bt 474 20/0 0
Bt 445 20/4 20 Bt 475 20/0 0
Bt 446 20/0 0 Bt 476 20/0 0
Bt 447 20/0 0 Bt 477 20/0 0
Bt 448 20/1 5 Bt 478 20/0 0
Bt 449 20/0 0 Bt 479 20/0 0
Bt 450 20/0 0 Bt 480 20/1 5
Bt 451 20/0 0 Bt 481 20/0 0
Bt 452 20/18 90 Bt 482 20/0 0 Bt 453 20/20 100 Bt 483 20/0 0
Bt 454 20/1 5 Bt 484 20/0 0
Bt 455 20/0 0 Bt 485 20/0 0
Bt 456 20/0 0 Bt 486 20/0 0
Bt 457 20/0 0 Bt 487 20/1 5
Bt 458 20/2 10 Bt 488 20/0 0
Bt 459 20/0 0 Bt 489 20/2 10
Bt 460 20/0 0 Bt 490 20/0 0
Bt 461 20/0 0 Bt 491 20/0 0
Bt 462 20/2 10 Bt 492 20/0 0
Bt 463 20/0 0 Bt 493 20/0 0
Bt 464 20/0 0 Bt 494 20/1 5
Bt 465 20/2 10 Bt 495 20/0 0
Bt 466 20/0 0 Bt 496 20/0 0
Bt 467 20/0 0 Bt 497 20/2 10
Bt 468 20/0 0 Bt 498 20/0 0
Bt 469 20/0 0
Cuadro 2. Resultados del segundo bioensayo cualitativo, se observa que bajó la actividad mosquitocida, sin embargo en el Cry1 E, esta debería ser inexistente.
Repetición 1
Repetición 2
Repetición
9.3. Perfil plasmídico
El DNA plasmídico extraído se corrió en el gel de agarosa 6%, en los carriles se
corrieron las siguientes muestras.
1. HD73 S
2. Bt – 453
3. Bt – 452
4. Supercoliled MM (marcador de peso molecular)
5. HD73 3-8-5
6. HD73 1
7. Hd73 2
Las cepas de HD, son cepas típicas de Bti y se utilizaron para comparar la existencia de
plásmidos en las cepas Bt – 453 y Bt – 452, que mostraron toxicidad en los bioensayos. En la
figura 7 se puede observar que los perfiles plasmidicos son diferentes. Por tanto, se puede
decir que la toxicidad de las cepas probadas se encuentra en estos plásmidos que no están
presentes en las cepas típicas.
Figura 7. Comparativa del perfiles plasmídicos
9.4. Bioensayo Cuantitativo (Cry – 1e)
El cuadro 3, muestra los resultados del bioensayo cualitativo realizado para la cepa Bt-
453, que presenta el gen Cry – 1e, el resultado es inesperado ya a la fecha no existen reportes
que muestren que el gen Cry- 1e sea tóxico para mosquitos. Podemos apreciar en los
resultados que se requieren bajas concentraciones de la toxina para que esta resulte altamente
eficiente en el control de las larvas.
Cuadro 3. Resultados del bioensayo cuantitativo
Concentración
Repetición 1
Repetición 2
Repetición
3 % total
Testigo 20/0 0
0.1 mg/ml 20/1 20/1 20/1 5
1 mg/ml 20/13 20/7 20/10 50
10mg/ml 20/20 20/18 20/20 96.66
9.5.Análisis rep-PCR
En la figura 8, se observan los segmentos palindromicos repetidos, en el genoma de la
cepa Bt – 453, amplificados por rep – PCR, estos resultados nos ayudan a establecer la
relación filogénetica de la cepa estudiada con otras cepas ya identificadas. Este análisis no se
10. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Durante el desarrollo del trabajo se cumplieron la mayor parte de las metas propuestas.
El presente estudio arrojó resultados inesperados; esta podría ser la primera vez que se reporta
la toxicidad del la proteína Cry -1e contra larvas del mosquito transmisor del dengue (Aedes aegypty). Claro que para afirmar esto, se debe continuar con el estudio.
La cepa Bt – 453 mostró la morfología típica de las cepas de Bti, sin embargo, en su
perfil plasmídico presenta plásmidos que no se encuentran en las cepas comunes de Bti.
El bioensayo cuantitativo, muestra que la toxina de la cepa Bt – 453, tiene una
eficiencia de 96.66% en la eliminación de larvas de Aedes aegypty, a una concentración de 10 mg/ml. Aunque es recomendable determinar la CL50 (concentración letal madia) de la toxina.
Por los resultados obtenidos, es recomendable continuar con la caracterización de la
cepa, pues si se realiza una buena investigación; los resultados obtenidos serían de gran interés
y sería viable la publicación del primer artículo que demuestre la toxicidad del la proteína Cry
11. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
11.1 Artíclulos científicos
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11.2.Libros citados
George W. Ware y David M. Whitacre, The Pesticide Book, 6th ed*,MeisterPro Information Resources, 2004
11.3.Páginas Web citadas
