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Streptococcus del grupo serológico E de Lancefield: su caracterización e identificación

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Academic year: 2020

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(1)STREPTODOCDUS DE. DEL. GRUPO. LANDEF"IELD.. SU E. GUSTAVO V. B. e. MANRIQUE EASTERDAY. SEROLOGIDO. E. CARADTERIZADION IDENTIF"IDADION. *. L. ** INTRODUCCION. Los abscesos de la reglón faríngea y cervIcal del cerdo se han atrIbuído n un germen específico DICho germen es un Streptococcus clasIfIcado seroIogIcamente en el Grupo E por LancefIeld (1933) Desde 1950 se han aIslado frecuentemente Streptococcus del Grupo E de Lancefleld de los abscesos cervIcales del cerdo Colher en una serIe de trabajos comprobo la causa y los metodos de transmIslOn de la enfermedad y muchos otros mvestIgadores comprobaron la lmportancIa de esta bacterIa en los abscesos del cerdo. REVISION DE LITERATURA. Brown en 1919, propuso la claslfH'aclOn de los Strootococcus en tres grupos dIferentes de acuerdo al tIpO de hemóhsIs produCIda en agar sangre alfa (vlrldans), beta (hemohtIco) y gama (no hemohtlco). Las dIfIcultades mherentes a los métodos bloqUlmIcos y de cultIVO en la clasIÍlcacIón de los Streptococcus fueron superadas en 1933, por medIo de los metodos serologlCos Lancefleld (1933) ... ContrIbUCIón del Laboratollo de InvestigacIOnes MédIcas Vetermarlas, ICA Resumen de la tesIs del autor prmcIpal presentada como uno de los requIsItos para optar al titulo de "Master of SCIence" de la Umvelsldad de Wlsconsln •• Patologo Agregado, Laboratorio de Investigaciones Médicas Veten nanas, ICA, CIUdad Umversltarla Bogota Profesor, Departamento de MediCIna Veterlnarm, Umversldad de Wlsconsm, Madlson 'VIsconsln, respec tlvamente. -. 67-.

(2) propuso la clnslflcaclón de los Streptococcus hemolftlcos. e? ei~co grupos A, B. e, D y E de acuerdo con la reaccl6n de precIpitación. DIcha autora demo"ltr6 que In especifIcIdad en la reaccl6n en los Grupos A y B era debIda a un carbohidrato Todos los grupos serológlcos de Streptococcus claSIficados hnstn 1937 fueron mcll1ldos en la diVIsIón plOgémcn de Shermnn, el. excepclo~ del Grupo D, el cual corre~pondc a la diVIsión enterococcuc:¡ y el Grupo N que fue InclUIdo en la dIVISIón lúctlca. Mcenrty (1965) en los Grupos A, B, e, E y G de Streptococcus comprobo la presencia de ramnosa como un componente Integral de la envoltura bacterml, la cual explIca la relnción de los Streptococcus hemolftIeos El mismo autor demostro que la variaClon en el contemdo de exosamma y otros monosaeárldos en la membrana celular de los dIferentes grupos, da una base qufmica &\decuada para las dIferenclas serologlCdl:> Por medIO de annhsl<; qmIDICOq del anbgeno del Grupo E. Slade (1965) demostró la presencln de L-ramnosa, D-glucosa y gluco~amtna El contemdo de protema y fosfato de los antígenos del Grupo A y E fue de uno por CIento para cada uno En 1938, Lancefleld demostró varias sttstanClftS mmunológlcamente dIferentes en los Sh eptococcus una de ellas es un carbohidrato (e) que determma la especIficIdad en los Grupos; las otras son responsables de la especIfICIdad para los bpos dentro de los Grupos, en el Grupo A es de naturaleza protelcn (M), y en los otros Grupos probablemente es un carbohIdrato (S) Merchant y Packer (1961), encontraron que en los Grupos A y C de Streptococcus, los dIversos bpos serologIcos se determman por medIo de antígenos proteICOS en el Grupo B y se cree que para los Grupos D, E, F Y G, por antIgenos de naturaleza polIsacárlda. En el Manual Bergey (Breed et al 1957) el Grupo E de Streptococcus fIgura con las SIgUIentes característIcas' no sobrevive a 60 grados centIgrados por 30 mmutos, no es patogeno, ha sido aIslado de la leche y de la ubre bovma y de habItante desconOCIdo El Grupo E de Streptococcus se ha comprobado en otras espe('les dIferentes al cerdo y se ha aIslado de leSIOnes dIferentes a los abscesos cerVIcales del mIsmo (Brown et al 1926, Gunmson et al 1940, Plumer, 1941, Coffey, 1942, Snoeyemos et al 1952, Morelra-Jacob, 1956 y Payne y Derbyshue. 1963) Coffey (1942) aisló el Grupo E de Streptococcus de una leslOn de la mano de un ordeüador &treptococcus de todos los Grupos se han aIslado del cerdo (Hare et al 1942, Thal y Moberg, 1953, Colher, 1951; HolIIster, 1956, y Krantz y Dunne, 1965) Newson en 1937 aSOCIO por prImera vez el grupo E de Strepto('occus con la producclOn de abscesos cervlcales del cerdo Este ~tutor lo aIslo en cultIvo puro PosterIormente, el Grupo E de Streptococcus fue aIslado de los abscesos cerVIcales del cerdo por Stafseth y Chnton (1941)' Colher (1956-b) y Armstrong (1966) , Se han descrIto vanos metodos para la preparaclOn del antígeno para la prueba de preclpltaclOn -. 68-.

(3) a) Extractos de la bacteria preparados por el tratamIento de áCIdo clorhídrIco caliente (Lancefield, 1933). b) El método de la Formamida descrIto por Fuller (1938). e) El uso de enzimas del Streptomyces albus, publIcado por McCarty (1952). d) Extractos preparados por autoclave (Rantz y Randell, 1955) . e) Reuner (1958), describlO el uso de extractos obtemdos con ácido acétIco. f) Streptococcus bsados por un fago VIrulento que produce una enZIma capaz de dIsolver la pared celular, la cual fue usada por Krause (1958), para lIberar el antígeno (CarbohIdrato) en solución. g) Slade (1965), extraJo el anbgeno pohsacárldo de los Streptococcus perteneCIentes a los Grupos A, E, G Y T con áCIdo tricloroacébco, al cmco por CIento a 90 grados cenbgrados Para la reaCClOn de preclpltaclOn son esenCiales sueros de tItulo muy alto, para preparar antI quero de todos los Grupos, excepto del Grupo A, han dado meJor resultado los cultIvos trataclos con formol que los antígenos de gérmenes muertos por el calor (Lancefield 1938). El uso de la téCnIca de los antIcuerpos fluorescentes para la c1aslflcacIon de los Streptococcus fue publIcada por prImera vez por Moody et al (1958). qUIen preparó conjugados espeCifICaS para los Grupos A, B, C, D, F y G Ellos usaron estos reactIvos para clasIÍlcar los StreptocoCCll"3 en frohs preparados de cultIVOS o dIrectamente de la garganta Peeples et al (1961) trabalaron con los mIsmos seIS Grupos de Streptococcus por medIO de la técmca de los antIcuerpos fluorescentes Moody (1963). comparó el método de preCIpltaclon con la reac(.lon de los antIcuerpos fluorescentes y suglrlO que esta ultIma es tan específIca y qUIZás más senSIble que la reaccIón de preCIpItaCIón Karakawa et al. (1964), demostraron que la teCnIca de los antIcuerpos fluoloescentes es especIÍlca para la claslÍlcaclOn de los tIpOS de Streptococcus dentro de los dIferentes Grupos SmIth (1965), uso el metodo de lo~ antIcuerpos fluorescentes para claSIfIcar los Stt eptococcus betaheJIlohtIcos en el JaboratorIO clímco. Sm embargo, el mIsmo autor sugIrlo que la reaCCIón de preclpltacIon se deberla usar para confIrmar los resultados mIentras se adqUIere buena experIencIa con el pl'lmero La mayoría de las pubhcaclOnes que se han hecho en el estudIO de los Streptococcus, con el uso de la téCnIca de los antIcuerpos fluorescentes, han SIdo sobre los Grupos A, e y G debldo a 10 <..0mun de la reaCCIon cruzada entre ellos y ademas porque afectan al hombre No se encontro nmguna publIcaclOn en ]a cual se haya usado la tecmca de los antIcuerpos fluorescentes para la ldentIhflcaclOn de los Streptococcus del Grupo E -. 69-.

(4) l\tA TERIALES y. 1 Cepas. l\tETODOS. Se usaron 15 cepas de Streptococcus. Tres de. ~treptococcus bero hemohbco del Grupo E sumInistradas por el. Dr R A Packer 1 (Strafuss, E-21, Y .Tohans) Los autores lllc:;laron cuete cepaq, de Igual numero de nbc;cesos de los nódulos lmfátIcos de cerdos de tres haCIendas diferentes (P 20; P. 21 Y P. 23; NIC-1 y NIC-2, 12-XI-I y 12- XI-2) Estac:; siete cepas se clasifIcaron como Streptococcus del Grupo E, de acuerdo n la prueba de preCIIJltaclon La cepa de Streptococcus del Grupo serOloglco D (Strcptococcus fccalts var ltquefacMl1s), fue sumInistrada por e] Dr. W. B. Sarles 2 Streptococcus Grupo A (Strcptococcus pyogencs), Grupo B (Strcptococcus agalactwc 660), Grupo e (StrcptocOCC'ltS zoocp~de1nzcocus) y Grupo M (St1 eptocOCC1lS 139) fueron envIados por el Dr R \V Brown 8 Para el repIque dmrlO, las cepas se cultIvaron en agar sangre al CInCO por CIento con el fm de obtener colomas aIsladas y los cultiVOS en medIOS lIqUldos para preparar antígenos se hICIeron en el medIo descrIto por Delbel et al (1964) Extracto de carne cinco gramos, glucosa dos gramos, fosfato dIpOtáslCO cmco gramos, cloruro de SOdIO cmco gramos, extracto de levadura 10 gramos, triptona (DIfco) 10 gramos, agua destilada un htro, pH 7,0 a 7,2. 2 Estud'lOS bacterwlogzcos. Se hIZO cultIVO bacteriológIco en agar sangre de nódulos hnfátIcos, tonSilas, abscesos, sangre, hígado y bazo de los anImales muertos Las muestras tomadas de anImales VIVOS (mucosa nasal y farmgea), del agua y el ahmento de una porqueriza mfectada, se cultIvaron en agar sangre con 0,02 por Ciento de aZlda de sodIO tal como lo recomIenda DIfco (1965) y en el medIO aZIda de SOdIO y CrIstal VIoleta recomendado por Parker (1943). 3 Pruebas bwqu1,1ntCas Todos los cultivos se incubaron a 17 grados cenhgrados baJO condlClOnes aeroblcas La fermentacIón de los carbohldratos se hiZO en el medio recomendado por Delbel et al (1964), usando bromocresoI purpura como mdlcador oel pH La lectura del pH fmal se hlzo en caldo glucosa do al uno por CIento en un potenclOmetro Beckman 4 La hlorohsIs del hlpurato de sodlo se pfectuo SIgUIendo la técnica de DeIbel y Nlven (1958) La hcuefaccIOn de la gelatma se deterrnmo usando la prueba en tubo (12 por cIento de geJatma) y la prueba en caja de petrl (0,4 por ciento de gelatma) pubhcadas 1 Departamento de HlgIcne Vetermarla, Iowa State UnIVerslty Ames Iowa, U S A ' 1I Departamento de Bacterlologla, UnIversIdad de Wlsconsm l\ladlson WlS U S A ' , • Laboratorlo de enfermedadcs anImales, Ames, Iowa, U S A • ZeromntIc, Beckmann Instruments, Inc, SClenttflc. -70 -.

(5) por DeIbel et al. (1964) y la inoculación y la lectura se hicieron siguiendo el método de Burnet et al. (1957). Las pruebas para el creCImIento a 10 y 45 grados centígrados se hicieron en el caldo en que se prepararon los antígenos El creCImIento a 10 y a 45 grados centígradob se observo hasta 10 y hasta dos días después de la siembra, respectivamente. La mfuslOn ele extracto de carne se usó como el medIO base para el creCImIento de las diferentes cepas en presencIa de cloruro de SOdIO al 6,5 por cIento y pH 9,6 La produccIón de áCIdo y los cambIos en la leche tornasolada be observaron de acuerdo con el método de Coon et al (1957). Para la preparaclOn de la SolucIón de a7ul de metIleno al 0,1 y 0,3 por CIento se Usó la leche descremada El crecImIento de los Streptococcus y la reduccIon de azul de metlleno se teyo (harmmpnte (Jurante siete días, sIguiendo el método de WIlson y MIles (1964). La prueba de la catalasa se hIZO por el método de Wilson y MIles (1964) excepto que las caJas de petrI se cubrIeron con agua oXIgenada al tres por CIento. El antIbIograma se hIZO SIgUIendo el método DIfco (1966) con ocho dISCOS Integrados como una unIdad El metodo de Krantz y Dune (1965) se SIgUIÓ para la tltulaclOn de la hemohsIna soluble con sangre de oveJa 4. Serología. Prueba de prec1.p1.tac1.ón Para la produccIOn de los sueros específicos en conejOS se sIgmo el meto do mejorado publicado por Lancefleld (1938). Se preparo antIsuero para los Streptococcus de los Grupos A, E, C, D y E Los sueros del Grupo E se prepararon usando como móculo las cepas Johans y P-23 Los cultivos de 18 a 24 horas se centrIfugaron y su sedImento se suspendió en solución salma formal1nizada al 0,2 por ciento 1·20 del volumen origmal Se aphcó un cenbmetro y dos cenhmetros CUbIcos de la dIlucIón 1 ·20 dIarIamente, vía venosa, por cmco dlas en la prImera y tercera semanas respectlVamente En la qumta semana, se aphcaron dos centímetros CUbICOS de la dIluclOn 1 10 tambIén vía venosa Los Streptococcus del Grupo D se machvaron medIante el calor a 56 grados centígrados por una hora (Morelra-Jacob, 1956) y se usaron para preparar el antIsuero en coneJos Con la cepa P-23 tambIen se prodUJO suero especIfIco en un cerdo de cuatro meses de edad, usando el cultivo muerto con formol tal como se hIZO en coneJos. El prImer día se Inocularon CInCO centImetros CUbICOS de la dilUCIón 1 20 VIa perItoneal, una semana despues se aphco la segunda serIe de InyeccIOnes por cmco dms consecutIvos, de la dilUCIón 1 10 VIa venosa, la qUlnta semana se le myectaron 10 centímetros cubicos de la dIlUCIón 1 10 vía venosa durante cmco días DIez días después de la últIma moculaCIón se recolectó el suero de todos los ammales y se guardó a cuatro grados centígrados, adICIOnado de mertIolate al 0,01 por CIento Los antIsueros para 10<; Grupos E, C, D, E, F, Y G se obtuvleIon del Centro de Enfermedades InfeCCIosas de Atlanta Los extractos que se usaron como antígenos se prepararon con formaml-. •. -71-.

(6) da G a 150 grados centígrados (Fuller t 1938) El sedimento de cinco cenUmE'tro"l cublcoq de cultIvo de 18 horas se trató con 0,1 de formamlda n 150 grados centígrados en baño de aceite p,0r 15 minutos El t~bo se deJó (>nfrJnr y se adIcIonaron 0,25 mdilitros de nlcohol {lCldo (95 parteq de alcohol y CInCO partes de ácido clorhfdrlco dos normal) Se agrego medIo centímetro CÚbICO de acetona y el precIpItado se dl<lolvló en un centímetro cúblco de solución salina y se le agrego una gota de rOJo fenol El }>recipitado de acetona se neutralIzó con un trozo de carbonato de sodio para usarlo como antígeno Lo"! extracto'=! dE.' antígeno tambIén se prepararon de acuerdo con el metodo oe Laneefleld (1933) El sedImento bacterlal de 250 centímetro"! cublcos de CUltIVO se suspendlO en cmco centimetros cubicas 1 20 N de HCl y el tubo se deJo en agua hIrviendo por 10 mmutoC¡t se enfrlO V "le centrIfugo, el c;obrenadante fue neutrahzado v usado para la prueba de preclpltaclOn, ésta se efectuó de acuerdo con el método de Lanrefleld (1933) y por la téCnIca usada en el Centro de Enfermedadeo; InfeCCIOsas de Atlanta (1962). Se usaron cantIdades decreCIentes de extracto (0,4, 0,1 Y 0,025 cenhmetro<l cublcos completando el volumen a 0,4 centímetros cublcos con BoluelOn salma y como control se usó 0,4 mililitros de la misma soluclOn Un volumen constante de 0,2 centímetros CUbICOS de suero SIn dIlmr se agrego a cada tubo, eVItando la mezcla de la" dos sustancIa.;; Lo<l tubos "e dejaron a temperatura ambIente o a 37 grados centlgrados por 10 mInutos, con el fm de observar la formaclOn de un amllo en el SItIO de unIón de los dos reactIvos La lectura fmal se hIZO después de someter los tubos a 1 efrl~eraclOn durante la noche En la prueba de mIcropreclpltaclon se usaron tubos capilares G con las SIgUIentes dImenSIOnes largo 75 mlhmetros, dIámetro Interno 1,1 a 1,2 mIhmetros, espesor de la pared 0,2 mIlímetros y con ambos extremos abIertos Las lecturas se hICIeron a 5, 10 Y 30 minutos. 5 Prueba de los ant'lcuerpos fluorescentes Para preparar el conjugado se usaron los mIsmos sueros mmunes, preparados en conejO y cerdo para la tecmca de preCIpItaCIón La fracclOn gIobuhmca de cada antIsuero se preparó SIguiendo el metodo de Coons (1958) a) DIluÍr el suero con Igual cantIdad de soJuclOn salina 0,15 M enfrIar la mezcla a cuatro grados centIgrados b) Agregar gota a gota la soJuclOn fría saturada de sulfato de amomo en Igual cantIdad a la mezcla salma-suero agItando constantemente c) CentrIfugar a 15 000 revolUCIones por mmuto durante 15 mInutes, en frIO y. "Du Pont de Ncmours & Co, Industrlal & Blochemlcal Department. Wllmmgton Delaware • Yaukee micro hematocrlt tubes, Clay Adams, Inc, New York. -72 -.

(7) FIGURA 1. Streptococcus del Grupo E (cepa J ohl1ns) coloreado con anttcuerpo fluorescente homólogo X 400.. FIGURA 2. Cepa alslada (P-23) coloreada con cOllJugado de Streptococcus del Grupo E X 400.

(8) FIGlJRA 3. FluorescencIa. ausente con Streptococcus del Grupo D presenCla del conJugado del Grupo E de Streptococcus. X 400.. en. FIGURA 4 Fluorescencla ausente con Streptoeoccus del Grupo e presencla del conJugado del Grupo E de Streptococcus X 400. en.

(9) FIGURA 6 La mezcla. de cultIvoS del Grupo B y E de Streptococcus muestra fluorescencIa. de una sola cadena en presencia del cOllJugado del Grupo E de Streptococcus X 400. FIGURA 6 La mezcla de los cultiVOS del Grupo A y E de Streptoeoecus muestra fluorescencIa de una sola cadena en presencia del conJugado del Grupo E de Streptococcus X 400.

(10) d) Lavar el precipItado con soluclón medIO saturada de sulfato de amonio y centrIfugar nuevamente. e) Disolver el precipitado en solución salina fría en la proporción 1:3 del volumen origmal del suero y adIcionar mertiolate al 1 :10.000. f) Dlahzar en SolucIón salma buferada hasta cuando el dIalIzado esté hbre de lones amonio La determinacIón de proteínas se hIZO de acuerdo con el método de BlUret, (Gornan et al 1949) Se dIluye la muestra 1 10 en solución salma, se toman dos centímetros cúbicos de esta dIlución y se agregan ocho centímetros CÚbICOS del reactivo de Biuret El tubo control para transmISIón de 100 por CIento se prepara con dos centímetros CÚbICOS de salma y ocho centímetros CÚbICOS de reactivo de Biuret Después de mezclar se dejan los tubos en reposo durante 30 mInutos antes de hacer la lectura en el espectrofotómetro 7 usando una longItud de onda de 540 mIllmIcrones La Soluclon se deterlnlna con base en la curva estandar de proteIna, se adICIOna el lsothiocIanato 8 de acuerdo con el método de RlggS et al. (1958), en la proporcIOn de dos mIlIgramos de fluorescema por cada 100 mIlIgramos de proteína y uno por CIento de soIucIOn bufer carbonato-bicarbonato de pH 9,0, se mezcla y se deJ a en reposo por 18 horas a cuatro grados centígrados El conjugado se dlahza en SolucIón salIna buferada de pH 7,1, hasta cuando no se detecte más colorante en el dxahzado y se pasa después por columna de Sefadex G 25 o con el fm de elImmar cualqUIer excedente de fluoresceína El conjugado se centrIfuga para remover las partIculas precIPitadas y se guarda preservado a-20 grados centígrados o se adICIOna merbolate al 0,01 por CIento La preparacIOn y coloraclOn de las lammas se efectuo SIgUIendo el método de Moody et al (1958) El sedImento de un CUltIVO ele 18 horas se suspendlO en soluclOn salma hasta obtener una opaCIdad correspondIente al tubo cuatro del nefelometro de McFarland. Se coloco una gota en una lamma prevIamente lavada en alcohol, se desecho el exceso de la suspensIón y se deJO secar al medIO ambIente, la preparaclOn se ÍlJo con acetona por un mInuto y se cubrIO con una gota de conjugado despues de dejar secar la lamIna Las lamInas se dejaron a temperatura ambiente, en atmosfera húmeda por 30 mmutos, el exceso de conjugado se elImmo y las lámmas se lavaron con salma buferada durante 10 mInutos. Después de lavada la preparacIOn se le adICIOno una gota de glIcerma bufelada (pH 7,1) Y se cubrlO con lamInIlla para exammar con un mIcroscopIO ZeLSs eqUIpado con una lampara Osram HBO • Spectromc 20 Bausch & Lomb Optlcal Co, Rochester, N 8 BaltImore BlOloglcal Laboratorles, Baltlmore, ~Id • Pharmacla, Upsala, SueCIa. -73 -. Y.

(11) Los controlec:; conC:;lstleron en preparacIones coloreadas con un conjugado heterólogo (suero de ternero contra la Rinotrnqueitis InfeCCIOsa de los bovmos) 10 Y un conjugado de globuhna normnl de conelO La pI ueba de bloqueo o;c h170 preparando láminns de Streptococcus del Grupo E con globuhnas de conejO y luego se aphco el conjugado homólogo RESULTADOS 1 Bactc1"1ología Se hIZO el aIslamIento en forma regular, de Streptococcus beta hemoht1co del Grupo serológlco E de Lnncefield, de los abscesos cervIcales y en algunos casos de las tonsilns de cerdos de matadero La claslflcaclOn serologlca se luzo prImero por la reacción de preclpltaclOn y posterIOrmente medIante la prueba de los anticuerpos fluorescentes La mayoría de las cepas de Streptococcus del Grupo E presentaron una marcada homogeneIdad en sus caracterlstIeas flC:;lOloglcas (Tabla 1) Todas las cepas produjeron una clara y amplia zona de hemóhSIS después de 48 horas de IncubacIón Y crecIeron bien en el caldo de extracto de carne~ presentando turbIdez unIforme, sin formaClOn de pehcula y con producclOn de una cantIdad moderada de sedImento, el comportamIento en la fermentacIón de los carbohidratos fue SImIlar para todas las cepns La producción de ácido generalmente se mamfesto despues de 24 horas de Incubación en mamtol, trealosa, maltosa y glucosa; no hubo fermentación en inuhna, raffmosa y lactosa El sorbItol y la escuhna presentaron fermentaclOn moderada. La leche tornasolada fue redUCIda moderadamente por todas las cepas del Gl upo E y no hubo efecto en leche con azul de metileno al 0,1 y al 0,3 por CIento NInguna de las cepas creció en caldo con cloruro de sodIO al 6,5 por CIento, ni en caldo con pH fmal de 9,6 nI a temperaturas de 10, y 45 grados centígrados. El pH prodUCIdo en caldo con deJ.."trosa al uno por ciento varIó de 4,8 a 5,2, mnguna cepa hldrohzo el hlpurato de SOdIO o licuó la gelatma, todas produ leron hemohsIna soluble La cepa del Grupo D de LanceÍleld, Streptococcus fecaltS var ltquefac~ens se dIferencIO flsIologlcamente de las cepas del Grupo E, por su creCImIento en caldo con cloruro de SOdIO al 6,5 por CIento, en caldo con pH 9~6, a 10 y 45 grados centIgrados, por su accIón caracterlsbca en leche tornasolada y en leche con 0,1 por ciento y 0,3 por CIento de azul de rnetIleno, por su fermentación de la lactosa y la hIdrohSlS de la gelatma y fmalmente porque no prodUjO hemohsls beta en agar sangre T~das las cepas, de Streptococcus del Grupo E, fueron sensibles a in tetraClchna, clorornlcetm, erltromlClna y novoblOcina; mo10 SumInIstrado por E L Shroyer Departamento de l\ledlclna VeterInarIa, Umversldad de Wlsconsm l\IadIson, WIS U S A. -74 -.

(12) deradamente sensibles n 1~ penicIlma y resistentes a la estreptomICIna, ltanamlcln y neomICIna. N o fue posIble mslar Streptococcus del Grupo E, de la mucosa faríngea o nasal de los cerdos de una porquerIza mfectada, así como del agua y del alImento de esta mIsma plara 2. Prueba de preetpltaclón Los sIete cultivos aIslados de los abscesos cervIcales de cerdo, se clasIficaron como Streptococcus del Grupo E, por la reacción de preCIpitacIón usando suero específICO conocIdo Estos orgamsmos no reaCCIOnaron con los sueros de los grupos A, B, e, D y M (Tabla 2) La mayoría de las pruebas de precipItación se hICIeron con extractos preparados con formaImda Los fIltrados de los cultIvos usados como antígenos no reacClonaron con el antIsllero del Grupo E Los extractos preparados con Streptococcus de los Grupos A, B, e y M preCIpItaron espeCIfIcamente con el suero homologo, y antIsuero del Grupo D, presentó un baJO DIvel de antIcuerpos Los sueros específIcos preparados en cerdo con la cepa P-23 y en coneJo con las cepas P-23 y Johans, reaCCIOnaron con los extractos de todas las cepas aIsladas preparados con formamlda o con áCIdo clorhídrIco en la prueba de precIpItacIOn Estos sueros no reaCCIOnaron con el fIltrado de los cultlvos de las mIsmas cepas Las reaCClones fueron especIfIcas ya que dichos sueros no preCIpItaron con los extractos de los Grupos A, B, e, D y M Los tItulos de los antIsueros fueron coneJo P-23 1 20, coneJo Johans 1 40 y cerdo P-23 1 20 Algunos de los lotes de antIgeno formarnIda se dIluyeron hasta 1 :15 y dieron reaCClOn de preCIpItacIón posItIva con el anbsuero homólogo SIn dIlUIr El antIsuero de Streptococcus del Grupo E reCIbIdo del Centro de Enfermedades InfeccIOsas de Atlanta, preCIpItó mucho más rápIdo con todos los extractos del Grupo E (1 a 2 mInutos) SIn embargo, dICho suero no reaCCIOno en la prueba de preclpItaclOn dIluido 1 15 3 Tecntca de los antlcue1·pos Ilu01 escentes Se obtuvo reaCCIOn brIllante fluorescente con todas las cepas aIsladas y los cultIvos de referenCIa de los orgamsmos del Grupo E, con el conjugado homólogo (FIgUraS 1 y 2) , no se observo fluorescencIa cuando se uso el conJ ugado del Grupo E, para colorear las lámmas preparadas con Streptococcus de los Grupos A, B. C, D y M (FIguras 3 y 4) La mezcla de cultIvos del Grupo E, con cada uno de los Grupos A, B, C, D y M se coloreo con el conJugado del Grupo E y solo se observo fluorescencIa con el cultIvo de Streptococcus Grupo E (FIguras 5 y 6) Los orgamsmos del Grupo E coloreados con el conJugado heterólogo, no dIeron fluorescencIa En la prueba de bloqueo se observo mhIbIclOn caSI completa de la coIoracIOn de antIcuerpos fluorescentes, cuando se ap]¡co el conjugado del Streptococcus del Grupo E - 75-.

(13) DISCUSION. Fueron nIalado.:; SIn dIfIcultad, de los abscesos de c~rdos infectndos, Streptococcus do] Grupo serOlógIco E de Lnncofleld. En lámmas coloreadas de los absce~os, los mlcroorgamsmos fueron muy abundantes y sIempre se obtuvIeron cultIvos puros de estos c.."'Cudados Los prImeros cultIvos hechos de la mucosa nasofaríngea, del agua y del alImento resultaron contammados con varms clases de bacterIas estns mIsmas mucstras se cultivaron en el medio recomendad'o por Packer (1943), que usa como medIO selectivo para Streptococcus patogenos, aZIdn de sodIO y crIstal Violeta y no se observo creCimIento Colhcr (1956-b) anoto quc este medIO de aZlda de sodio y cristal Violeta es de gl nn ayuda para el aIslamiento de los StreptococellS pntogenos de1 Grupo E, en presencIa de otros organismos. Posteriormente se demostro que las cepas de Streptococcus del Grupo E son mhIbIdas por las concentraciones de azida de sodio y crIstal VIOleta usadas por Pncker (1943) Observación similar a las propIedades mhlbltorms de este medIO para Erys'tpelothrix m.std'l.osa fue publIcada pOI Stepheson (1966) La concentración de la aZlda de sodIO nI 0,02 por CIento recomendado por Difco (1965), permltIo el crecImiento de todas las cepas de Streptococcu~ del Grupo E Colller (1956-c) aIsJo Streptococcus del Grupo E. de la mucosa nasofaríngea del cerdo, pero en su publicación no menCIOna el medIO empleado Los Streptococcus del Grupo E fueron senSibles a la tetracichna y mostraron moderada sensIblhdad a ]a pemcIlma, lo que está de acuerdo con las publIcaCIOnes de Colher (1956-a) y Armstrong (1966), segun las cuales estos germen es son senSIbles a los dos anttbIObcos Por otra parte, Gouge et al (1957). trabaJando con cerdos mfectndos experImentalmente, demostraron el efecto preventIvo de la clortetracIchna en la InCIdencIa de los abscesos cerVIcales del cerdo La homogeneIdad de las cepas de Streptococcus del Grupo E en sus característIcas culturales, bIoquímIcas y serológIC3s demostradas en este estudIO, están de acuerdo con las observaciones hechas por Lancefleld (1933), Coffey (1942) ; Colher (1951); Delbel et al (1964) y Armstrong (1966) Sm embargo, Streptococcus del Grupo E, se IdentIfIcan mucho mas fácIl y especlflcamente por medIO de las pruebas de PI eClpltacIOn o antIcuerpos fluorescentes que por las reaCCIOnes flsIOlogIcas ReaCCIOnes cruzadas entre los dIferentes Grupos de Streptococeus han SIdo descrItas en la prueba de preclpltacIOn por Lancefleld (1933), FuIler (1938), Cummms y Slade (1961); Karakawa et al (1965), Krantz et al (1965) y Smlth (1965). Tales reacciones cruzadas no se presentaron en este estudIO La ausenCIa de reaCCIOnes cruzadas pudo ser debIda al uso de antígenos preparados con forrnamlda, Fuller (1938), proceso por medIO del cual las bacterIas son dIsueltas y las sustancIas proteicas, -76 -.

(14) que son las responsables de estas reaCCIones, son elImInadas Por otra parte es probable que nInguna de las cepas usadas dIeran reacción cruzada baJo cualqmer condIc!On Cummins y Slade (1961), elImInaron la presencIa de reaCCIOnes cruzadas usando suspensIones de pared celular purIfIcadas en la preparaclOn del antígeno para la precipItación. El baJo nivel de antIcuerpos del antIsuero del Grupo D, observado en el presente trabaJo, está de acuerdo con la observaCIón de DeIbel (1964), qUlen anotó que el antIgeno de Streptococcus del Grupo D se encuentra entre la membrana cltoplasmátIca y la membrana celular, por 10 cual no está presente en cantIdad sufIcIente para prodUCIr un antlsuero de título alto La técnIca de los antIcuerpos fluorescentes para la IdentIfIcación de los Streptococcus de los Grupos A, B. C, D, F y G ha SIdo empleada por Moody et al (1958), Peeples et al. (1961); Moody (1963) , Karakawa et al. (1964) y Smlth (1965). En el presente trabaJO se preparó y se usó un conjugado especIfIco para la IdentIfIcaCIón de los Streptococcus del Grupo E en lánllnas hechas de CUltIvOS puros y contamInados La técnica de los antIcuerpos fluorescentes puede ser de mucha utIlIdad en la clínIca, en el diagnóstIco y en el estudIO de la patogéneSIS de esta enfermedad Sería Interesante hacer un estudIO comparatIvo en la clasIfICacIón de los Streptococcus de los tejIdos Infectados, por medIO de los antIcuerpos fluorescentes y la prueba de precIpItación RESUMEN. Se hIZO la caracterIzaCIOn e IdentIfIcaCIón de Streptococcus del Grupo E de LancefIeld, por metodos culturales y fISIOlogICOS, comparándolo con Streptococcus del Grupo D Se compararon serologIcamente el Grupo E y los Grupos A, B, C, D y M La IdentIfIcaCIón de los Streptococcus es más facd y especIfIca por métodos serologIcos que por medIO de las reaCCIOnes flsIologlcas La prueba de los antIcuerpos fluorescentes es un medIO rápIdo y específICO para la IdentIfIcaCIón del Streptococcus del Grupo E de cultIvos contamInados BIBLIOGRAFIA ARMSTRONG. Ca H. 1966 A ParbaI Evaluabon oí the Morphologlc, PhYS10lo and Serologlc CharacterlstIcs oí Streptococcus Group E Recovered írom CervIcal Lymphadenlbs of SW1ne Dlssertabon Abstracts (B) 27 254. glC. BnEED, R S. E G D MURRAY and N R SMITH 1957 Bergey's Manual fOI' Determmatlve BacterlOlogy 7th ed. Wllhams & Wdkms Co, Bul. t1more. -77 -.

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(18) TADLA 1 COMPARACION DE LAS REACCIONES FISIOLOGICAS DE LAS CEPAS DE STREPTOCOCCUS AISLADAS CON CEPAS CONOCIDAS DE LOS GRUPOS D y E. CEPAS DE REFERENCIA CARACTERlSTICAS FISIOLOGICAS. el'. '"'". Gelatma 0,4% Gelatma 12% Crecimiento a pH 6,6 CreCImIento en 6,5% NaCI pH fmal en caldo CreCImIento a 45°C CreCImiento a lO·C Leche tornasolada ACCIón sobre Mamtol Maltosa Lactosa Sacarosa Rafmosa Escuhna GIl cosa Sorbltol Trealosa Inulma Azul de metlleno 0,1 % Azul de mebleno 0,3% Hlpurato de sodio Hemohsma soluble. Grupo D· Johans StrnfUS9. + + + + 4,5 + + A/R/C A A A A A. A. A. 5,15. 4,8. CEPAS. E-21. P 20. P 21. P 23. Nle-l. NII:..2. 12-XI.l. 12-XI·2. 6,1. 5,2. 4,85. 4,85. 4,8. 4,85. 4,9. 4,8. Sl/R. Sl/R. R. SlIR. R. A A. Sl/A A. Sl/A A. SI/A A. A A. A A. A. A. A. A. A. A. SIJA A Sl/A. SljA Sl/A A A Sl/A Sl/A. SlIA A Sl/A. =. Sl/R Sl/R. Sl/R SlIR. R. A A. Sl/A A. A A. A A. A. A. A. A. Sl/A SI/A SI/A A A A Sl/A Sl/A SlJA. Sl/A Sl/A S1IA A A A SlIA Sl/A SUA. +. +. + + +. +. +. +. • StreptocoCCUB fculra vaS' lIc¡ocfnc!ens. A - Achlo SI / A LIgeramente 'e1da. AISLADAS. n=. e ;::. Rcducdón Congulllcl6n. +. +. +. +.

(19) TAnLA :t nEACC10N DE pnEClI'lTACION DE LAS CEPAS DE STI'tEPTOOOCOUS y LAS OEPAS DE REFERENCIA. Grupo de LnncdleJd. ANTIGENO (EXTRACTO). A. D. O. D. ----------------------------------------. E. CEPAS AISLADAS P20. +. P-21. + + + + + +. P 23 12-XI-l 12 XI-2 Nlc-l NIC. 2. CEPAS DE REFERENCIA SlreptocoCCltS fecallS var qucfacums. It-. ±'". D. StreptocoCCU8 pyoge1les. A. StreptococCIC8 zooeptdemlcu8. C. StrcptocoCCllS agalactlae. B. Streptococcus 139. 1\1. Cepa Johans. E. Cepa E-21. E. Cepa Strafuss. E. • ReaccI6n déb21. -82-. +. + +. + + +. +.

(20)

Figure

FIGURA  1.  Streptococcus  del  Grupo  E  (cepa  J  ohl1ns)  coloreado  con  antt- antt-cuerpo  fluorescente  homólogo  X  400
FIGURA  4  Fluorescencla  ausente  con  Streptoeoccus  del  Grupo  e  en  presencla  del  conJugado  del  Grupo  E  de  Streptococcus  X  400
FIGURA  6  La  mezcla.  de  cultIvoS  del  Grupo  B  y  E  de  Streptococcus  muestra  fluorescencIa

Referencias

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