ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Efecto antihipertensivo de fracciones peptídicas bioactivas obtenidas a partir de frijol lima (Phaseolus lunatus) y frijol jamapa
(Phaseolus vulgaris)
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS EN ALIMENTOS
PRESENTA
M. EN C. JUAN GABRIEL TORRUCO UCO
DIRECTORES
DRA. GLORIA DÁVILA ORTÍZ
DR. DAVID ABRAM BETANCUR ANCONA
México, D.F. Diciembre de 2009.
AGRADECIMIENTOS
A mi Directora de Tesis la Dra. Gloria Dávila Ortíz por todas sus enseñanzas desde el punto de vista científico y humano, así como también a su apoyo incondicional y paciencia brindada para lograr la terminación de éste proyecto de investigación.
A mi Director de Tesis el Dr. David Abram Betancur Ancona, por toda la orientación técnica, científica, apoyo y confianza otorgada para realizar éste trabajo de investigación durante los años del Doctorado.
Al Dr. Luis Antonio Chel Guerrero, por proporcionar en su momento el apoyo profesional, amistad y confianza en la realización de la parte experimental de éste trabajo de investigación.
Mi especial agradecimiento a la Dra. Alma Leticia Martínez Ayala que durante los años del Doctorado estuvo al pendiente en todo momento de las necesidades que requerimos en la realización de éste posgrado. Gracias.
A mi Comité Revisor de Tesis la Dra. Rosalva Mora Escobedo, Dra. Lidia Dorantes Álvarez, Dra. Alma Leticia Martínez Ayala, por su contribución al enriquecimiento de esta Tesis.
A mis compañeros y amigos de generación la Dra. Janet Osorio Araujo, Dra.
Patricia Arce Paredes, Dra. Rocío Martínez Torres, Ivonne Pérez Xochipa, Brenda Hideliza Camacho Díaz, Alaíde Jiménez Serna, Carolina Gumeta Chávez, Mario Alberto de Jesús Domínguez Magaña y Ulises Ramón Morales Durán por su amistad y compañía, durante esta etapa del Doctorado.
Al Dr. Gustavo Fidel Gutiérrez López por su valiosa y desinteresada actitud, motivación y conducción al desarrollo, crecimiento y superación del Programa de
Doctorado en Ciencias en Alimentos y a todo el apoyo y confianza que me brindó desde el inicio y hasta el final de ésta etapa de mi formación como Doctor en Ciencias y sin olvidar a cada uno de los integrantes que conforman dicho Programa. A todos, mil gracias.
Mi especial agradecimiento a la Secretaria del Programa de Doctorado en Ciencias en Alimentos la C. Leticia Peña Rojas¸ por todas sus atenciones, humildad y paciencia que demostró para conmigo a lo largo de los años que duró mi formación doctoral. Por todo lo anterior, mil gracias.
De igual forma, agradezco infinitamente el apoyo otorgado por el Dr. Jesús Santa Olalla Tapia y el Dr. Juan José Acevedo Fernández por facilitar las instalaciones del Laboratorio de Biología de Células Madre de la Unidad de Diagnóstico y Medicina Molecular del Hospital del Niño Morelense y del Laboratorio de Electrofisiología y Bioevaluación Farmacológica de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos, ya que, en estas instalaciones se llevaron a cabo las pruebas biológicas “in vivo” para evaluar el efecto antihipertensivo de las fracciones peptídicas bioactivas obtenidas sobre la presión arterial de ratas experimentales, siendo estas pruebas de suma importancia en la culminación de este proyecto de investigación.
Al Técnico del Laboratorio de Ciencia de los Alimentos de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Autónoma de Yucatán, al Q.I. Felipe de Jesús Flores Narváez por su apoyo y paciencia en la realización de las pruebas biológicas (in vivo), la cual forma parte medular de este proyecto de investigación.
Gracias.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por brindarme el apoyo económico como becario con número de registro 43867 y así poder realizar los estudios de Doctorado. De igual forma por el financiamiento para el proyecto de Ciencia Básica con clave 25796 “Purificación y caracterización de péptidos con
bioactividad antihipertensiva, antioxidante y antimicrobiana aislados de frijoles lima (Phaseolus lunatus) y caupí (Vigna unguiculata)”. Asimismo al apoyo económico de la SIP-IPN con la clave del proyecto: 20082532 y al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) por el otorgamiento de becas para la realización de este trabajo.
Al Laboratorio de Química de Alimentos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Así como también, al Laboratorio de Ciencia de los Alimentos de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Autónoma de Yucatán, por el apoyo y las facilidades brindadas para la realización de la parte experimental de la Tesis Doctoral.
Para todos, mi más sincero agradecimiento y respeto, Gracias.
DEDICATORIAS
A DIOS
Por darme vida, salud y razón de ser.
A MIS PADRES
Cruz Uco Sánchez y Samuel Torruco May
Por su amor, apoyo, cariño y confianza que siempre me han demostrado. Muchas Gracias.
A MIS HERMANOS
María Isabel, Cruz, Samuel y David.
Por su amistad incondicional, por creer en mí y por ser siempre las personas que de una u otra forma me impulsaron a seguir adelante sin importar las distancias y
el tiempo que estuviéramos separados. Por todo, Mil Gracias.
i ÍNDICE GENERAL
Página Abstract.
Resumen.
1. INTRODUCCIÓN. 1
2. ANTECEDENTES. 3
2.1 Problemas de salud a nivel mundial y nacional. 3 2.2 Hipertensión ó presión arterial alta. 5
2.2.1 Mecanismo de la hipertensión arterial (sistema
renina-angiotensina). 6
2.3 Características estructurales de la ECA. 10 2.4 Tratamiento de la hipertensión arterial. 12 2.5 Las proteínas de la dieta: fuentes de biopéptidos . 14 2.5.1 Actividad biológica de los péptidos bioactivos. 16
2.5.1.1 Péptidos opioides. 17
2.5.1.2 Péptidos antihipertensivos. 17
2.5.1.3 Péptidos antioxidantes. 18
2.5.1.4 Péptidos antimicrobianos. 19
2.6 Obtención de péptidos mediante hidrólisis enzimática. 20 2.7 Tendencia de los alimentos funcionales. 23 2.8 Impacto del procesamiento sobre las proteínas y péptidos
bioactivos. 29
2.8.1 Tratamientos térmicos. 29
2.8.2 Fermentación. 30
2.9 Importancia del frijol lima (Phaseolus lunatus) y frijol jamapa
(Phaseolus vulgaris). 31
3. JUSTIFICACIÓN. 35
4. HIPÓTESIS. 36
5
.
OBJETIVOS. 37ii
5.1 Objetivo general. 37
5.2 Objetivos específicos. 37
6. MATERIALES Y MÉTODOS. 39
a) MATERIALES. 39
6.1 Obtención de la materia prima. 39
b) MÉTODOS. 39
6.2 Preparación de las harinas. 39
6.3 Obtención de los concentrados proteínicos de P. lunatus y
P. vulgaris. 40
6.4 Composición proximal de la harina y concentrado proteínico
de P. lunatus y P. vulgaris. 40
6.4.1 Humedad (método 925.09). 40
6.4.2 Proteína cruda (método 954.01). 40
6.4.3 Grasa cruda (método 920.39). 41
6.4.4 Fibra cruda (método 962.09). 41
6.4.5 Cenizas (método 923.03). 41
6.4.6 Carbohidratos totales (ELN). 41
6.5. Hidrólisis enzimática de los concentrados proteínicos de
P. lunatus y P. vulgaris. 41
6.6 Determinación del grado de hidrólisis. 42
6.7 Evaluación in vitro de la actividad inhibitoria de los hidrolizados
proteínicos sobre la ECA-I. 43
6.8 Electroforesis (SDS-PAGE). 43
6.9 Separación de las fracciones peptídicas mediante ultrafiltración. 44 6.10 Evaluación in vitro de la actividad inhibitoria de las fracciones
peptídicas obtenidas por ultrafiltración sobre la ECA-I. 45 6.11 Composición de aminoácidos de los hidrolizados proteínicos
y de las fracciones peptídicas. 46
6.12 Jugo de naranja de marca comercial enriquecido con las fracciones peptídicas que presentaron mayor actividad inhibitoria
de la ECA-I. 46
iii 6.13 Evaluación de la actividad inhibitoria in vitro del jugo de
naranja enriquecido con las fracciones peptídicas sobre la ECA-I. 47
6.14 Evaluación sensorial. 47
6.15 Pruebas biológicas in vivo. 47
6.15.1 Animales de experimentación y condiciones
ambientales. 48
6.15.2 Preparación de los hidrolizados proteínicos y
fracciones peptídicas a evaluar. 48
6.15.3 Determinación de la presión arterial. 49
6.16 Análisis estadístico. 50
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 51
7.1 Caracterización proximal. 51
7.2 Hidrólisis enzimática y grado de hidrólisis. 56 7.3 Actividad inhibitoria in vitro de la ECA-I. 62
7.4 Electroforesis (SDS-PAGE). 67
7.5 Actividad inhibitoria in vitro de las fracciones peptídicas obtenidas
por ultrafiltración sobre la ECA-I. 71
7.6 Composición de aminoácidos de los hidrolizados proteínicos y
fracciones peptídicas con mayor actividad inhibitoria de la ECA-I. 75 7.7 Actividad inhibitoria in vitro de la ECA-I y evaluación sensorial de
los jugos enriquecidos con las fracciones peptídicas bioactivas. 79
7.8 Pruebas biológicas in vivo. 83
8. CONCLUSIONES. 93
9. NOMENCLATURA. 96
10. BIBLIOGRAFÍAS. 99
iv ÍNDICE DE FIGURAS
Página Figura 1. Modelo del sistema renina-angiotensina (SRA) (De la Serna,
2006).
8 Figura 2. Estructura y conformación de la ECA encontrada en plasma, en
células somáticas y testiculares mostrando los sitios activos catalíticos, dependencia del zinc y las regiones N y C terminal
(Johnston, 1992). 11
Figura 3. Mecanismos de formación de angiotensina-II (Ang-II) en el SRA
(De la Serna, 2006). 12
Figura 4. Principales medicamentos utilizados como inhibidores de la ECA. 14 Figura 5. Clasificación de enzimas según su actividad catalítica (Torruco-
Uco y col., 2008). 22
Figura 6. Cambio del papel de los alimentos según su actividad como
medicamentos. 24
Figura 7. Productos que contienen péptidos bioactivos que inhiben la
actividad de la enzima convertidora de angiotensina-I (ECA-I). 28 Figura 8. Granos de frijol lima (Phaseolus lunatus) (a) y frijol jamapa
(Phaseolus vulgaris) (b). 32
Figura 9. Separación de las fracciones peptídicas bioactivas de P. lunatus y P. vulgaris por ultrafiltración con cuatro membranas de diferentes
cortes moleculares. 45
Figura 10. Hidrólisis enzimática del concentrado proteínico P. lunatus con (●)
Alcalasa® y (●) Flavourzima®. 59
Figura 11. Hidrólisis enzimática del concentrado proteínico de P. vulgaris con
(■) Alcalasa® y (■) Flavourzima®. 60
Figura 12. Actividad inhibitoria “in vitro” de los hidrolizados proteínicos de P.
lunatus con Alcalasa® (a) y con Flavourzima® (b) sobre la ECA-I. 64 Figura 13. Actividad inhibitoria “in vitro” de los hidrolizados proteínicos de P.
vulgaris con Alcalasa® (a) y con Flavourzima® (b) sobre la ECA-I. 65 Figura 14. Patrón electroforético (SDS-PAGE) en gel de poliacrilamida de los
hidrolizados proteínicos de P. lunatus con a) Alcalasa® y b)
Flavourzima®. 69
v Figura 15. Patrón electroforético (SDS-PAGE) en gel de poliacrilamida de los
hidrolizados proteínicos de P. vulgaris con a) Alcalasa® y b)
Flavourzima®. 70
Figura 16. Actividad inhibitoria in vitro de las fracciones peptídicas de P.
lunatus con a) Alcalasa® y b) Flavourzima® sobre la ECA-I. 73 Figura 17. Actividad inhibitoria in vitro de las fracciones peptídicas de P.
vulgaris con a) Alcalasa® y b) Flavourzima® sobre la ECA-I. 74 Figura 18. Actividad inhibitoria in vitro de los jugos de naranja enriquecidos
con las fracciones peptídicas bioactivas < 1 kDa de P. lunatus y P.
vulgaris. 80
Figura 19. Evaluación sensorial de los jugos enriquecidos con las fracciones
peptídicas bioactivas < 1 kDa de P. lunatus y P. vulgaris. 82 Figura 20. Efecto de los hidrolizados proteínicos a tres diferentes
concentraciones, sobre la presión arterial sistólica en ratas Wistar hembras. (■) Solución salina (control negativo), (■) Captopril (control positivo), (▲) Hidrolizado P. lunatus-Alcalasa 90 min y (▲)
Hidrolizado P. vulgaris-Alcalasa 60 min. 85
Figura 21. Efecto de los hidrolizados proteínicos a tres diferentes concentraciones, sobre la presión arterial diastólica en ratas Wistar hembras. (■) Solución salina (control negativo), (■) Captopril (control positivo), (▲) Hidrolizado P. lunatus-Alcalasa 90 min y (▲)
Hidrolizado P. vulgaris-Alcalasa 60 min. 86
Figura 22. Efecto de las fracciones peptídicas (< 1 kDa) a tres diferentes concentraciones, sobre la presión arterial sistólica en ratas Wistar hembras. (■) Solución salina (control negativo), (■) Captopril (control positivo), (●) Fracción P. lunatus-Alcalasa 90 min y (●)
Fracción P. vulgaris-Alcalasa 60 min. 88
Figura 23. Efecto de las fracciones peptídicas (< 1 kDa) a tres diferentes concentraciones, sobre la presión arterial diastólica en ratas Wistar hembras. (■) Solución salina (control negativo), (■) Captopril (control positivo), (●) Fracción P. lunatus-Alcalasa 90 min y (●)
Fracción P. vulgaris-Alcalasa 60 min. 89
Figura 24. Disminución de la presión arterial sistólica (A) y diastólica (B) mediante el empleo de Captopril®, hidrolizados proteínicos y
vi fracciones peptídicas de P. lunatus y P. vulgaris obtenidos
mediante hidrólisis enzimática con Alcalasa®. 92
vii ÍNDICE DE CUADROS
Página Cuadro 1. Clasificación de los niveles de presión sanguínea en adultos. 6 Cuadro 2. Efectos de la Ang-II sobre los receptores AT1 y AT2. 9 Cuadro 3. Principales enzimas exógenas comerciales utilizadas en la
obtención de péptidos con diferentes actividades biológicas. 21 Cuadro 4. Componentes bioactivos en alimentos y su posible objetivo
fisiológico en enfermedades.
26
Cuadro 5. Composición proximal de las harinas y concentrados proteínicos
de P. lunatus y P. vulgaris. 52
Cuadro 6. Composición de aminoácidos de los hidrolizados y fracciones peptídicas de P. lunatus con Alcalasa® y Flavourzima® obtenidas
por hidrólisis enzimática. 77
Cuadro 7. Composición de aminoácidos de los hidrolizados y fracciones peptídicas de P. vulgaris con Alcalasa® y Flavourzima® obtenidas
por hidrólisis enzimática. 78
ABSTRACT
In the present work it was carried out the evaluation of the in vitro and in vivo physiological effects of protein hydrolysates and bioactive peptidic fractions from the enzymatic hydrolysis of the Lima bean (Phaseolus lunatus) and Jamapa bean (Phaseolus vulgaris) seed protein concentrates on the angiotensin-I converting enzyme inhibitory activity (ACE-I) antihypertensive effect. The protein content in the P. lunatus and P. vulgaris concentrates, had values of 71.8 and 63.8%
respectively. The highest degree of hydrolysis (DH) in P. lunatus with Alcalase® was 37.94% at 45 min of reaction and with Flavourzyme® was 22.03 at 90 min, while in P. vulgaris with Alcalase® was 49.48% at 30 min and reached 26.05% at 90 min of hydrolysis with Flavourzyme®. The in vitro inhibitory activity of the P.
lunatus hydrolysate obtained with Alcalase® was IC50 = 0.056 mg/ml at 90 min and with Flavourzyme® was 0.0069 mg/ml respectively at the same time of reaction. On the other hand, the P. vulgaris hydrolysate obtained with Alcalase® showed IC50 = 0.061mg/ml at 60 min of reaction and the obtained with Flavourzyme® showed IC50
0.127 mg/ml at 45 min. Both legume protein hydrolysates presented low molecular weight bands in the electrophoresis (SDS-PAGE) patterns ranging from 31 to 6.5 kDa with Alcalase® while, with Flavourzyme® were 97.5 to < 6.5 kDa. The hydrolysates that showed the best ACE-I antihyperthensive activity were fractionated by ultrafiltration, obtaining five peptidic fractions A (> 10 kDa), B (5-10 kDa), C (3-5 kDa), D (1-3 kDa) and E (< 1 kDa). The highest fraction ACE-I inhibitory activity (in vitro) in P. lunatus with Alcalase® was the fraction E (< 1 kDa) with IC50 = 30.3 µg/ml, and with Flavourzyme® was the fraction A (> 10 kDa) with IC50 = 17.5 µg/ml, while in the P. vulgaris treated with Alcalase® and Flavourzyme® higher inhibitory activity in the fraction E (< 1 kDa) with both enzymes with values IC50 of 63.8 and 65.8 µg/ml, respectively were obtained. Amino acid composition of protein hydrolysates and peptidic fractions exhibited a high content of essential and hydrophobic amino acids such as Trp (W), Thr (T), Val (V), Phe (F), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Cys (C), Tyr (Y) and His (H). The enrichment of commercial mark orange juice with peptidic fractions with higher ACE-I inhibitory activity and its
treatments presented in vitro inhibitory activity with IC50 value between 0.1355 and 0.9765 mg/ml. The sensorial evaluation applied to the enriched juices revealed that the juice added with the Flavourzyme® < 1 kDa obtained fraction from P. lunatus at 90 min of reaction time, had better acceptance of the sensory evaluation panel.
The in vivo biological evaluation of P. lunatus and P. vulgaris protein hydrolysates as well as the peptidic fractions < 1 kDa showed antihypertensive effect on systolic and diastolic arterial pressure in strain female Wistar rats. The P. lunatus protein hydrolysates, obtained with Alcalase® at 90 min at 5 and 10 mg/Kg concentrations of corporal weight performed better in decreasing both arterial pressures in rats, while the P. vulgaris peptidic fractions < 1 kDa obtained with Alcalase® at 60 min presented the better antihypertensive activity at 5 mg/Kg concentration of corporal weight.
RESUMEN
En el presente trabajo se evaluó el efecto fisiológico in vitro e in vivo de los hidrolizados proteínicos y fracciones peptídicas bioactivas obtenidos de la hidrólisis enzimática de las proteínas de los granos de frijol lima (Phaseolus lunatus) y frijol jamapa (Phaseolus vulgaris) sobre la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina (ECA-I) (efecto antihipertensivo). El contenido de proteína en el concentrado proteínico de P. lunatus y P. vulgaris presentó valores de 71.8 y 63.8% respectivamente. El mayor grado de hidrólisis (GH) en el concentrado proteínico de P. lunatus con Alcalasa® fue de 37.94% a los 45 min de reacción y con Flavourzima® fue de 22.03% a los 90 min de reacción, mientras que, en el P. vulgaris con Alcalasa® presentó un GH de 49.48% a los 30 min de reacción y con Flavourzima® alcanzó un 26.05% a los 90 min de hidrólisis. La actividad inhibitoria in vitro de los hidrolizados de P. lunatus con Alcalasa® fue de un IC50 = 0.056 mg/ml a los 90 min de reacción y con la enzima Flavourzima® fue de 0.0069 mg/ml al mismo tiempo de reacción. Por otro lado, el hidrolizado de P.
vulgaris con Alcalasa® exhibió un IC50 = 0.061 mg/ml a los 60 min de reacción y con Flavourzima® fue con una IC50 0.127 mg/ml a los 45 min. Ambas leguminosas mostraron bandas de proteínas de bajo peso molecular en sus patrones electroforéticos (SDS-PAGE) en un intervalo de 31 a 6.5 kDa con Alcalasa® y con Flavourzima® fue de 97.5 a < 6.5 kDa. Con el fraccionamiento por ultrafiltración se obtuvieron cinco fracciones peptídicas: A (> 10 kDa), B (5-10 kDa), C (3-5 kDa), D (1-3 kDa) y E (< 1 kDa). La fracción con mayor actividad inhibitoria de la ECA-I (in vitro) en el P. lunatus con Alcalasa® fue la fracción E (< 1 kDa) con una IC50 = 30.3 µg/ml, y con Flavourzima® fue la fracción A (> 10 kDa) con un IC50 = 17.5 µg/ml, mientras que en el P. vulgaris con Alcalasa® y Flavourzima® mostraron mejor actividad en la fracción E (< 1 kDa) con ambas enzimas con valores de IC50 de 63.8 y 65.8 µg/ml respectivamente. La composición de aminoácidos de los hidrolizados proteínicos y de las fracciones peptídicas mostraron alto contenido de aminoácidos esenciales e hidrofóbicos comoTrp (W), Thr (T), Val (V), Phe (F), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Cys (C), Tyr (Y) e His (H). Se logró el
enriquecimiento de un jugo de naranja de marca comercial con las fracciones peptídicas con mayor actividad inhibitoria de la ECA-I y estos tratamientos presentaron dicha actividad in vitro con valores de IC50 entre 0.1355 y 0.9765 mg/ml. La evaluación sensorial aplicada a los jugos enriquecidos, revelaron que el jugo adicionado con la fracción < 1 kDa de P. lunatus con Flavourizma® 90 min tuvo mejor aceptación por el panel evaluador. La evaluación biológica in vivo de los hidrolizados proteínicos así como de las fracciones peptídicas < 1 kDa de las leguminosas P. lunatus y P. vulgaris mostraron efecto antihipertensivo sobre la presión arterial sistólica y diastólica en ratas hembras de la raza Wistar. De los hidrolizados proteínicos, el P. lunatus con Alcalasa® 90 min a concentraciones de 5 y 10 mg/Kg de peso corporal, fue el mejor al disminuir ambas presiones arteriales en las ratas, mientras que, de las fracciones peptídicas < 1 kDa, el P.
vulgaris con Alcalasa® 60 min presentó la mejor actividad antihipertensiva a una concentración de 5 mg/Kg peso corporal.
1
1. INTRODUCCIÓN
La hipertensión arterial es un padecimiento multifactorial que puede dañar órganos vitales como el corazón, riñón, así como a las arterias, entre otros, por lo que está considerada como un problema importante de salud pública. Sin embargo, esta enfermedad ha sido tratada mediante diversos tipos de medicamentos sintéticos que inhiben a la enzima convertidora de la angiotensina-I (ECA-I), misma que es la responsable de que se altere la presión normal de la sangre, cuando esta circula a través de las venas y arterias del cuerpo humano. Siendo los medicamentos más comunes en el mercado el captopril, benazipril, lisinopril, enalipril, ramipril, entre otros los cuales han sido eficaces y bien tolerados en el tratamiento de la hipertensión. Sin embargo, una de las desventajas de estos medicamentos de origen sintético, es que son caros y además pueden producir ciertas alteraciones secundarias a corto y largo plazo en su uso, como la tos, perturbación en el sabor y salpullidos en la piel (Atkinson y Robertson, 1979) e incluso no deben administrase durante el embarazo debido al riesgo de lesiones ó muerte del feto (Lip y col., 1997; Baltar y col., 2004).
Actualmente la ciencia de los alimentos ha ido promoviendo un nuevo concepto de nutrición alimentaria que incluye a aquellos alimentos que presentan una potencialidad en el mejoramiento de la salud y disminuyen los riesgos de enfermedades en el cuerpo humano. Por lo que muchas industrias alimentarias como Danone®, Nestlé®, Poleva®, Valio LTD®, Vita Corporación Alimentaria, etc., han incluido en sus productos alimenticios ciertos nutrientes y componentes bioactivos extraídos de fuentes animales y vegetales, capaces de ofrecer garantías de salud a los consumidores. Por lo tanto, el interés de la industria de los alimentos está orientado en encontrar materias primas naturales, principalmente las de origen vegetal tales como las leguminosas, ya que estas poseen un alto contenido de proteínas, del cual se pueden extraer ciertos componentes bioactivos como son fracciones peptídicas o péptidos bioactivos con efectos benéficos en el organismo.
Los péptidos bioactivos son cadenas peptídicas de pequeña longitud compuesta
2 por aminoácidos, los cuales pueden contener entre 2 a 15 residuos de aminoácidos (Vioque y col., 2000) y estos se encuentran inactivos dentro de la proteína intacta pero que pueden ser liberados durante la digestión del alimento o por un proceso previo del mismo, por ejemplo mediante hidrólisis enzimática. Cabe mencionar que se han realizado estudios sobre péptidos bioactivos obtenidos de fuentes animales como: leche, huevo, plasma de sangre, músculo de pescado, así también se han extraído de fuentes vegetales como la soya, garbanzo, girasol, colza, lupino, entre otros, en todos los casos se ha demostrado que tienen actividad antihipertensiva debido a la presencia de los biopéptidos Val-Pro-Pro (VPP) e Ile-Pro-Pro (IPP) los cuales purificados o como componentes de los productos hidrolizados han demostrado disminuir la presión arterial en ratas y en algunos estudios clínicos en humanos después de consumir un producto enriquecido con dichos componentes.
Por todo lo anterior en el presente trabajo de investigación se evaluó el efecto fisiológico de las fracciones peptídicas bioactivas obtenidas de las proteínas del grano de frijol lima (Phaseolus lunatus) y frijol jamapa (Phaseolus vulgaris) sobre la inhibición de la ECA-I así como su efecto sobre la regulación de la presión arterial en animales de experimentación (ratas de laboratorio).
3
2. ANTECEDENTES
2.1 Problemas de salud a nivel mundial y nacional
Según las estimaciones hechas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (WHO/World Health Organization, por sus siglas en inglés), en el año 2002, informaron que cerca de 16.7 millones de personas mueren cada año en el mundo por enfermedades cardiovasculares y esta cifra equivale a la tercera parte de las muertes a nivel mundial (WHO, 2004). De acuerdo con la información de los últimos 20 años, las enfermedades crónicas incluidas las relacionadas con el corazón y los vasos sanguíneos, son las que se encuentran entre las causas de discapacidad y muerte más comunes en casi todos los países del mundo y las cardiopatías y los accidentes cerebrovasculares representan el 35 a 55% de las 800,000 defunciones anuales que se registran en América Latina y el Caribe (Hassell, 2005).
El informe sobre la salud en el mundo 2002, expuso el concepto de varias cadenas causales que conducen a enfermedades cardiovasculares, como las apoplejías y las cardiopatías coronarias, y estas producen discapacidad o muerte.
Estas causas son debidas a diversos factores como los fisiológicos y fisiopatológicos, las cuales son causantes de las enfermedades cardiovasculares como: la hipertensión arterial, las concentraciones anormales de lípidos o grasas en la sangre y la intolerancia a la glucosa o diabetes. Los factores proximales, estos están relacionados con el estilo de vida, siendo los más importantes la obesidad, la inactividad física, la nutrición y el tabaquismo y los factores socioeconómicos dístales como son: la pobreza, la baja escolaridad y la ocupación. Por lo que, la disminución o eliminación de uno o varios factores causales reducirían la discapacidad y las muertes provocadas por estos grupos de enfermedades (WHO, 2002).
Por otro lado, se estima que cada 4 seg ocurre un síndrome coronario agudo y cada 5 seg un accidente vascular cerebral (Murray y López, 1997; WHO, 2002). Así,
4 las enfermedades cardiovasculares ocupan el primer lugar en causa de mortalidad del paciente adulto en todo el mundo y México no escapa a esta circunstancia (SSA, 2000). En México al igual que en otros países en vías de desarrollo y en la mayoría de los países desarrollados la prevalencia de las enfermedades crónicas no transmisibles, o también denominadas enfermedades crónicas esenciales del adulto (ECEA), tales como la hipertensión arterial sistémica (HTAS), diabetes mellitus tipo-2 (DM-2), dislipidemias, obesidad y aterosclerosis entre otras, han mostrado un crecimiento exponencial en las últimas décadas, llegando a superar las enfermedades transmisibles en el adulto, por lo que a esta transformación se ha aplicado el término “Transición Epidemiológica” (Zanchetti y col., 1993).
La prevalencia a nivel mundial de la hipertensión arterial fue de cerca de 1 billón de individuos con éste mal y casi 7.1 millones de muertes por año fue atribuido a la hipertensión arterial (U.S. Departament of Health and Human Services, 2004).
En México la enfermedad identificada como HTAS para el año 2000 fue del 30.05%, es decir, más de 16 millones de mexicanos entre los 20 y 69 años padecen esta enfermedad, siendo los estados del Norte de la República Mexicana, los que alcanzaron cifras mayores del 30%. La Encuesta Nacional de Salud 2000 (ENSA- 2000), mostró notablemente que el 61% de los hipertensos de este país desconocen ser portadores del mal, situación que es de extrema importancia ya que, en general, el paciente acude al médico cuando ya han transcurrido varios años desde su inicio y, probablemente, ya habrá en su mayoría daños a órganos importantes como el corazón, cerebro, retina y riñón, entre otros (Velásquez y col., 2002).
La existencia de HTAS guarda estrecha relación con la edad, género y factores co-mórbidos, tales como diabetes, obesidad, dislipidemias y tabaquismo. Así la forma, tipo y gravedad en que la HTAS interaccionan con estos factores, determina la magnitud y velocidad de progresión de daño a órganos vitales, situación que debe tomarse en cuenta para el establecimiento de un tratamiento médico óptimo inicial (Zanchetti y col., 1993; Chalmers y col., 1999). En México la ENSA-2000 informó que otras entidades de enfermedades, tales como la DM-2, esta siguiendo el mismo
5 comportamiento informándose una prevalencia nacional actual del 10.7%, para factores de riesgo cardiovascular como la obesidad con 24.4% y para el tabaquismo con 36.6%, los cuales favorecen la prevalencia de HTAS, incrementando así la morbimortalidad cardiovascular del adulto (Velásquez y col., 2003).
2.2 Hipertensión ó presión arterial alta
La hipertensión es el principal factor de riesgo de las enfermedades cardiovasculares y de las complicaciones relacionadas (FitzGerald y col., 2004). La hipertensión es la elevación patológica de la presión que ejerce la sangre bombeada por el corazón sobre los vasos sanguíneos (Hong y col., 2003) y ésta es asociada con daño en las arterias y en diversos parénquimas (conglomerados de células de igual diámetro formando meatos entre sí y que pueden elaborar y almacenar sustancias). Entre estos, son especialmente susceptibles el corazón, riñón, cerebro y retina, cuyo daño es proporcional tanto a la magnitud como a la duración de la hipertensión (Loscalzo y col., 1996). La presión arterial se mide mediante la presión sistólica la cual está dada por la sístole: que es la contracción del músculo cardíaco, representando el máximo esfuerzo y por la presión diastólica, está dada por la diástole: el cual es la relajación del corazón, permaneciendo las arterias con el mínimo flujo de sangre (Torresani y Somoza, 1999).
Los niveles normales de presión arterial de una persona sana debe de ser de 120/80 mmHg (presión sistólica/diastólica). Sin embargo, una presión arterial alta se considera cuando los niveles sobrepasan de 130/85 mmHg de presión y es cuando se le debe prestar atención a la misma para ser atendida y poder controlarla antes que ésta se vaya incrementando y pueda dañar órganos importantes en el organismo. A niveles mayores de 180/110 mmHg (denominada de grado 3 ó extremo) se pueden presentar en el individuo apoplejías (embolias) causando en el mismo parálisis e inclusive la muerte (Cuadro 1) (Rosas y col., 2005).
6 Cuadro 1. Clasificación de los niveles de presión sanguínea en adultos
Nivel de presión Sistólica (mmHg) Diastólica (mmHg)
Óptima < 120 < 80
Normal 120-129 80-84
Normal alta 130-139 85-89
Grado 1 (leve) 140-159 90-99
Grado 2 (moderada) 160-179 100-109
Grado 3 (extrema) 180 o más 110 o más
Fuente: Rosas y col. (2005)
Cabe mencionar que según las guías recientes del The Seventh Report of the Joint National Committee on Prvention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure (JNC-VII), simplifican la clasificación de la hipertensión arterial e identifican a una nueva población de pacientes “prehipertensos”, que son aquellos con una presión arterial sistólica entre 120 y 139 mmHg o una presión arterial diastólica entre 80 y 89 mmHg. Dichas guías también establecen la importancia de identificar a este grupo como una población de alto riesgo para desarrollar hipertensión arterial, y el valor de instituir cambios en el estilo de vida cuando se encuentran estos niveles de presión arterial. Además hacen recomendaciones para un tratamiento combinado más temprano y agresivo cuando la presión arterial es más de 20/10 mmHg por arriba de los valores recomendados (Rodríguez-Carranza y Aguilar-Salinas, 2006).
2.2.1 Mecanismo de la hipertensión arterial (sistema renina-angiotensina)
El sistema renina-angiotensina (SRA) es uno de los sistemas de regulación central de la presión arterial sanguínea y la patogénesis de la hipertensión arterial está estrechamente asociada con desórdenes del SRA (Matsui y col., 2003). Éste sistema estimula la activación simpática de secreción de renina por las células
7 yuxtaglomerulares (Brown y Vaughan, 1998), siendo el riñón, la principal fuente de renina activa en la circulación, aunque también se han encontrado en diversos tejidos de animales y humanos, tales como el cerebro, glándula adrenal, glándula submandibular, ovarios, testículos, próstata, cerebro, entre otros (Pan y Gross, 2005).
El angiotensinógeno (Ao) es una glicoproteína que se produce en el hígado y es el sustrato inicial del SRA aldosterona. La renina es la enzima que reacciona con el Ao circulante, dando lugar a un decapéptido, la angiotensina-I (Ang-I) (Scow y col., 2003). La enzima convertidora de angiotensina (ECA) ó kininasa II es una dipeptidil carboxipeptidasa I, (kininasa II, EC 3,4,15,1) zinc metalopeptidasa la cual es sintetizada en el pulmón. La ECA rompe el dipéptido del C-Terminal del decapéptido Ang-I (DRVYIHPFHL) que es inactivo para posteriormente convertirlo en un octapéptido angiotensina-II “Ang-II” (DRVYIHPF) potente vasoconstrictor y es el componente activo principal del SRA aldosterona. De igual forma la ECA juega un papel fisiológico clave en la regulación de los niveles locales de varios péptidos bioactivos endógenos tales como las encefalinas, la sustancia P y el nonapéptido vasodilatador bradikinina (RPPGFSPFR) (Figura 1) (Meisel y col., 2006) y también causa la expansión de volumen a través de la retención de sodio (vía aldosterona y vasoconstricción renal) y retención de fluidos (vía hormona antidiurética) (Ondetti y col., 1977; Chen y col., 2002a).
8 Figura 1. Modelo del sistema renina-angiotensina (SRA) (De la Serna, 2006)
La Ang-II por ser un potente vasoconstrictor actúa directamente sobre las células del músculo liso vascular y sobre el sistema nervioso simpático, tanto periféricamente como centralmente para incrementar el tono vascular. Las acciones de la Ang-II están mediadas por los receptores AT1 los cuales activan efectos perjudiciales (provoca vasoconstricción) y los receptores AT2 que son los que causan efectos benéficos (ayuda a la vasodilatación) en el organismo (Cuadro 2) (Scow y col., 2003). También han sido descritos los receptores AT3 y AT4 pero aun no han sido aceptados en la nomenclatura internacional de receptores (Risler y col., 1998;
Pathak y col., 2001). Los receptores AT1 se encuentran en las glándulas suprarrenales, en el cerebro, riñón, en el músculo liso vascular y en el corazón mientras que los receptores AT2 se les haya en grandes cantidades en los tejidos fetales para luego disminuir grandemente después del nacimiento (De la Serna, 2006). Se ha postulado que en el humano, en condiciones de salud normal se encuentran la misma cantidad de receptores AT1 y AT2 (Yan y col., 2003).
9 Cuadro 2. Efectos de la Ang-II sobre los receptores AT1 y AT2
Receptores
AT1 AT2
Vasoconstricción Vasodilatación
Liberación de aldosterona Producción de bradikinina Retención de Na+ y H2O Reparación de tejidos
Liberación de K+ Aumento de apoptosis
Inhibe la secreción de renina Inhibición del crecimiento celular Crecimiento celular Anti-proliferación celular Proliferación de células Diuresis y Natriuresis
Estrés oxidativo Aumento de la síntesis de NO
Relajación endotelial
Liberación de adrenalina
Respuesta inflamatoria
Fuente: Risler y col. (1998); De la Serna, (2006)
El mecanismo vasoconstrictor ocasionado por la Ang-II al activar los receptores AT1 genera la constricción del músculo vascular liso y de las proteínas contráctiles y en respuesta a estos estímulos se produce la liberación de calcio en forma de Ca2+. De igual forma este receptor AT1 estimula la hidrólisis del fosfatidilinositol 4,5-difosfato a partir de las fosfolipasas C-β y C-γ formándose los mensajeros intracelulares 1,4,5-trifosfato y diacilglicerol. El mensajero 1,4,5-trifosfato provoca liberación de más Ca2+ desde los almacenes intracelulares, en tanto que el mensajero diacilglicerol activa a la enzima proteinkinasa, misma que, promueve la expresión de factores de trascripción tales como c-fos, c-myo y c-jun, que han sido vinculados con la hipertrofia miocítica (Pathak y col., 2001; Yan y col., 2003).
10 2.3 Características estructurales de la ECA
Actualmente se han identificado tres formas de la ECA. La forma somática de la ECA (sECA) la cual tiene un peso molecular entre 150 a 180 kDa y se encuentra distribuida en las células endotelial, epitelial y neuroepitelial, cabe mencionar que ésta consiste de dos dominios homólogos denominados dominio-N y dominio-C. Por otro lado, se encuentra la forma testicular de la ECA (tECA) y es más pequeña que la sECA con un peso entre 90 a 110 kDa y se presenta en células germinales masculinas y se ha relacionado con la maduración del esperma en los varones (Soubrier y col., 1993), está compuesta por el sitio activo del dominio-C, así como, por una porción del dominio-N, pero sin el sitio activo del dominio-N (Figura 2) (Tzakos y col., 2003). Quizás la diferencia más notable entre los dos sitios catalíticos es la diferencia por la especificidad de sustrato, ya que, ambos dominios son capaces de hidrolizar la Ang-I y la bradikinina, pero el sitio activo del dominio-N es capaz de hidrolizar otros sustratos, incluyendo la sustancia P, precursores de encefalina, la hormona luteinizina “liberación de hormona”, péptidos β-amiloides y el derivado activo 1-7 de la Ang-II, entre otros (Benishin, 2005). Por último, la tercera forma de la ECA denominada como un homólogo de la ECA (hECA) o ECA-2 (Turner y Hooper, 2002). La ECA-2 presenta también un sitio activo correspondiente al dominio N-terminal de la sECA. Cabe mencionar que la ECA-2 no es afectada por los inhibidores típicos de ECA tales como el Captopril® o Enalaprilat® (Tzakos y col., 2003) y su especificidad es distinta a la de la ECA, ya que la ECA-2 no hidroliza a la bradikinina. De igual forma la ECA-2 tiene la capacidad de convertir a la Ang-I en Ang 1-9 (nonapéptido) que no tiene acción vascular, pero puede ser convertida por la ECA en Ang 1-7 que es un vasodilatador bloqueando así la vasoconstricción inducida por la Ang-II en arterias del humano (Meisel y col., 2006; De la Serna, 2006). Existe además otra forma, denominada soluble, que se ha aislado mediante la acción de una secretasa y se ha encontrado en suero sanguíneo y otros fluidos corporales; sin embargo, aún no se esclarece su participación fisiológica en el ser humano (Parvathy y col., 1997; Turner y Hooper, 2002).
11 Figura 2. Estructura y conformación de la ECA encontrada en plasma, en células somáticas y testiculares mostrando los sitios activos catalíticos, dependencia del zinc y las regiones N y
C terminal (Johnston, 1992)
Es importante destacar que existen diversos mecanismos alternativos para la transformación de la Ang-I en Ang-II que no requieren la presencia de la ECA, a través de otras enzimas como la quinasa, la catepsina G y la CAGE por sus siglas en inglés (Chymostatin-sensitive Ang II Generating Enzyme). La Ang-I también puede ser convertida en el hexapéptido Ang 1-7 por ciertas endopeptidasas tisulares tales como la endopeptidasa neutral NEP 24.11, NEP 24.15 y NEP 24.26 (Figura 3) (De la Serna, 2006).
12 Figura 3. Mecanismos de formación de angiotensina-II (Ang-II) en el SRA (De la Serna,
2006)
2.4 Tratamiento de la hipertensión arterial
La importancia clínica del bloqueo del SRA aldosterona se ha vuelto cada vez más clara a lo largo de 20 años, ya que, muchos médicos utilizan los inhibidores de la ECA o los bloqueadores de los receptores de angiotensina (BRA) como la terapia de primera línea para la hipertensión, por lo que existe una tendencia en la combinación de estos dos agentes valiosos (Codario, 2005). La combinación de dos o más antihipertensivos, actúa en el control de la presión arterial y otras para minimizar los efectos secundarios de cada uno de ellos por separado (Martínez y col., 2005). Por otro lado, los fármacos antihipertensivos deben administrarse de forma crónica, por lo que, a menudo, se utilizan asociados con otro tipo de medicamentos prescritos para patología concomitantes. Por ello, es importante reconocer las principales interacciones farmacológicas, tanto beneficiosas como perjudiciales de los fármacos antihipertensivos (Martínez y col., 2001).
13 El primer fármaco que se descubrió con actividad inhibitoria de la ECA fue el Captopril®, el cual fue sintetizado por Ondetti y col. (1977), este fármaco demostró ser activo por vía oral impidiendo así, la conversión de la Ang-I en Ang-II. Tras una década de utilización del Captopril® han surgido una variedad de fármacos con capacidad de inhibición de la ECA que difieren de éste por la ausencia de un grupo sulfhídrilo en la formulación química y una vida media más prolongada, lo que permite utilizarlos en una sola dosis diaria (Vázquez y col., 1998).
Entre los medicamentos más comunes en el mercado se encuentran los inhibidores de la ECA, los β-bloqueadores, los diuréticos y los bloqueadores de los receptores de Ang-II, los cuales han sido eficaces y bien tolerados en el tratamiento de la hipertensión. Además, los inhibidores de la ECA han sido estudiados para el tratamiento de la deficiencia cardiaca crónica e infarto al miocardio (Pitt, 1997), asimismo, han sido propuestos para el tratamiento del cáncer (Lever y col., 1999).
Sin embargo, una de las desventajas de estos medicamentos de origen sintético es que son caros y además pueden producir ciertas alteraciones secundarias a corto y largo plazo en su uso, como: la tos, perturbación en el sabor y salpullidos en la piel (Atkinson y Robertson, 1979). Baltar y col. (2004) indicaron que todos los fármacos usados para el tratamiento de la hipertensión arterial durante el embarazo pueden atravesar la placenta, por lo que pueden afectar al feto bien indirectamente disminuyendo el flujo útero-placentario ó bien directamente a través de la circulación umbilical. Por otro lado, Cooper y col. (2006) alertaron que el uso de inhibidores de la ECA como: Benazapril® (Lotensin), Captopril® (Capoten), Enalapril/Enalaprilat® (Vasotec oral e inyectable), Fosinopril® (Monopril), Lisinopril® (Zestril y Prinivil), Moexipril® (Univasc), Perindopril® (Aceon), Quinapril® (Accupril), Ramipril® (Altace) y Trandolapril® (Mavik) (Figura 4) durante el primer trimestre de embarazo, puede estar asociado con el incremento de riesgo de malformaciones congénitas del recién nacido e inclusive la muerte (datos soportados por la FDA 221-02-3003). Debido a lo anterior, surge el interés de la comunidad científica de los alimentos por identificar a los mismos como fuentes naturales o no convencionales para la obtención de péptidos inhibidores de la ECA (Torruco-Uco y col., 2008).
14 Figura 4. Principales medicamentos utilizados como inhibidores de la ECA
2.5 Las proteínas de la dieta: fuentes de biopéptidos
Las proteínas alimentarias, son una fuente de energía y además son materiales ricos para la obtención de péptidos bioactivos, así como también son componentes esenciales en la nutrición humana, ya que forman parte de los alimentos y cumplen con funciones básicas desde el punto de vista nutricional como funcional (Clemente y col., 1999). Nutricionalmente, proporcionan los aminoácidos necesarios para la síntesis de proteínas corporales y otras sustancias nitrogenadas esenciales para el crecimiento y mantenimiento del organismo. Funcionalmente, afectan las propiedades fisicoquímicas y sensoriales de los alimentos, proporcionando atributos únicos debido a sus propiedades intrínsecas y/o a su interacción con otros componentes, fundamentalmente lípidos e hidratos de carbono e inclusive algunas proteínas y péptidos pueden ejercer efectos fisiológicos benéficos en el cuerpo humano, ya que poseen propiedades biológicas que hacen a estos componentes ingredientes potenciales por su bioactividad o como alimentos promotores de la salud. De igual forma, estas proteínas pueden afectar la funcionalidad tecnológica de los productos finales proyectados, por lo que es un
15 factor esencial para aplicar o desarrollar tecnologías para conservar o regular el aumento de componentes bioactivos en sistemas alimenticios (Korhonen y col., 1998).
Las principales fuentes de proteínas alimentarias estudiadas como fuente de péptidos bioactivos son de origen animal, como: la caseína y el lactosuero son las fuentes proteínicas más utilizadas en la elaboración de hidrolizados proteínicos, tanto en preparaciones infantiles como en la elaboración de dietas especiales para adultos (Pahud y Schwarz, 1984). Sin embargo, desde los años ochenta ha existido una demanda de fuentes proteínicas vegetales para la elaboración de formulaciones alimentarias, sustituyendo a los hidrolizados de origen animal (Kilara y Shahani, 1985). Recientemente se ha encontrado que las proteínas de origen vegetal presentan un contenido elevado del mismo, el cual es importante para ser explotadas en la obtención de ciertos componentes bioactivos como son: péptidos, fracciones peptídicas y aminoácidos libres, que pueden tener cierta actividad benéfica al organismo (Clemente y col., 1999).
En las últimas décadas, diversas investigaciones han mostrado que los péptidos bioactivos pueden ser derivados de las proteínas de la dieta y estos pueden estar presentes como entidades independientes o codificadas en la proteína original y que durante la digestión gastrointestinal o por un procesamiento previo de los alimentos, por ejemplo mediante una hidrólisis enzimática o fermentación, estos péptidos son liberados de la proteína precursora (Vioque y col., 2000; Vioque y col., 2006). Los péptidos bioactivos son pequeñas cadenas peptídicas compuestas por 2 a 15 residuos de aminoácidos (Vioque y col., 2000). Sin embargo, Kitts y Weiler, (2003) mencionan que los péptidos bioactivos obtenidos de los alimentos pueden presentar entre 2 y 9 residuos de aminoácidos. Aunque puede haber excepciones ya que existen péptidos con más de 20 residuos de aminoácidos, tal como la lunasina, péptido extraído de la soya con actividad anticancerígena probada en ratas el cuál presenta 43 residuos de aminoácidos y un peso molecular de 5400 Da (Jeong y col., 2002).
16 2.5.1 Actividad biológica de los péptidos bioactivos
En los organismos vivos, a menudo los péptidos endógenos funcionan como hormonas y neurotransmisores y juegan un papel fisiológico importante, a través de interacciones hormona-receptor y cascadas de señalización, estos ejercen sus acciones sobre la regulación del metabolismo (agua, minerales y otros nutrientes), controlando las glándulas de excreción, ajustando la presión arterial e impactando en el crecimiento del individuo. Ellos también pueden ejercer efecto sobre el sueño, aprendizaje, memoria, dolor, comportamiento sexual, apetito y los efectos de las vías de estrés sobre el sistema nervioso central (Wang y González de Mejía, 2005). La literatura científica evidencia que estos péptidos bioactivos pueden atravesar el epitelio intestinal y llegar a tejidos periféricos vía circulación sistémica, pudiendo ejercer funciones específicas a nivel local, tracto gastrointestinal y a nivel sistémico.
Dentro de estas actividades, los péptidos podrían alterar el metabolismo celular y actuar como vaso-reguladores, como factores de crecimiento, como inductores hormonales y como neurotransmisores (Baró y col., 2001).
Los péptidos bioactivos han sido aislados de diferentes fuentes como el plasma de la sangre de humanos (Nakagomi y col., 2000) y plasma de sangre de bovino (Wanasundara y col., 2002), de la carne de pollo (Saiga y col., 2006), de la yema de huevo (Yoshii y col., 2001; Miguel y col., 2006), del músculo y esqueleto de pescado (Neves y col., 2004; Je y col., 2004) y de la proteína de la leche (caseínas) y suero de la leche (Warner y col., 2001; Sipola y col., 2002; Hosono y col., 2002;
Gobbetti y col., 2004), entre otros, los cuales han presentado diversas actividades biológicas como antihipertensivos, opioides, antioxidantes, anticolesterolémicos, antimicrobianos, anticariogénicos, antitrombóticos, anticancerígenos e inmunomoduladores. También, cabe mencionar que se han encontrado diversos péptidos extraídos de fuentes vegetales que han presentado diversas actividades biológicas como las mencionadas anteriormente. Entre estas fuentes se encuentran:
el girasol (Megías y col., 2004), garbanzo (Clemente y col., 1999), espinaca (Yang y col., 2003), chícharo (Taylor y col., 2004) sorgo (Kamath y col., 2007), frijol mungo
17 (Hong y col., 2005), soya (Jeong y col., 2003), piña (Antoniolli y col., 2004), por lo que, el estudio de más fuentes vegetales para extraer estos péptidos con diferentes actividades biológicas está tomando mayor importancia entre la comunidad científica en el área de la industria de los alimentos e industria farmacéutica.
2.5.1.1 Péptidos opioides
Se ha descrito la existencia de péptidos derivados de proteínas alimentarias con actividad opioide y el aislamiento por primera vez en 1975 de péptidos opioides endógenos denominados encefalinas, condujo a la detección en 1979 de esta actividad en péptidos derivados de hidrolizados proteínicos de las proteínas de la leche (Brantl y col., 1979; Henschen y col., 1979). Estos son péptidos pequeños, entre 5 y 10 aminoácidos de longitud, los más abundantes son las β-casamorfinas denominadas así por derivar de la hidrólisis de la β-caseína y por su parecido efecto fisiológico al de la morfina (Teschemacher y Koch, 1991). La característica común en la secuencia aminoacídica de estos péptidos es la presencia de un residuo de Tyr (Y) en el extremo N-terminal así como la presencia de otro residuo aromático Phe (F) en la tercera o cuarta posición del péptido (Fiat y col., 1993).
2.5.1.2 Péptidos antihipertensivos
Recientemente, varios estudios se han enfocado sobre los péptidos antihipertensivos (inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina “ECA”), por lo que, se han realizado diversos estudios tanto “in vitro” como “in vivo” para lograr la comprensión del mecanismo de acción de los péptidos que inhiben la ECA. Dicho mecanismo de acción es de forma similar a la de los fármacos, ya que los tres últimos residuos de aminoácidos adyacentes a la región del C-terminal de los péptidos que presentan ésta actividad se enlazan fuertemente al sitio activo de la ECA y se ha observado que estos tienen una mayor especificidad de inhibición hacia aquellos péptidos que contengan residuos de aminoácidos hidrofóbicos (aromáticos o ramificados) en las tres últimas posiciones de la región C-terminal. Lo anterior,
18 aplica para los péptidos de cadenas cortas altamente activos como son: la mayoría de los di y tripéptidos que poseen residuos de Tyr (Y), Phe (F), Trp (W), o Pro (P) en el C-terminal, siendo el W el que parece ser que le confiere mayor potencial de inhibición de la ECA. Con respecto, a los residuos de aminoácidos que más predominan en el grupo N-terminal de los di y tripéptidos son la Ile (I) y Val (V) (Mine and Shahidi, 2006). Cabe mencionar que los péptidos con residuos de aminoácidos como la Lys (K) y Arg (R) en el C-terminal con carga positiva en el grupo amino ε pueden también contribuir en la inhibición de la ECA. Sin embargo, se ha postulado que este mecanismo de acción puede darse mediante interacciones de un enlace aniónico en sitios distintos a la región catalítica del sitio activo produciéndose un tipo de inhibición alostérica (Fitzgerald and Meisel, 2000).
Cheung y col. (1980) reportaron que la actividad inhibitoria de la ECA es más fuerte cuando hay residuos de aminoácidos hidrofóbicos (aromáticos y ramificados) como His-Leu (HL), Phe-Arg (FR) y Ala-Pro (AP) en el C-terminal. Por todo lo anterior, puede resumirse su mecanismo de acción en dos puntos importantes: 1) tienen importancia fisiológica, porque en la administración oral, estos péptidos bioactivos tienen que alcanzar el torrente sanguíneo en una forma activa para ejercer su efecto antihipertensivo, ya que la digestión gastrointestinal y el transporte son las principales barreras de la biodisponibilidad de los péptidos que inhiben a la ECA y 2) la digestión por proteasas gastrointestinales puede ser usada como un proceso de producción de péptidos inhibitorios de la ECA, con la ventaja de que los péptidos que se formen sean resistentes a la digestión fisiológica después de su ingestión (Vermeirssen et al., 2003).
2.5.1.3 Péptidos antioxidantes
Además de los antioxidantes de las frutas y vegetales, las proteínas hidrolizadas han demostrado tener actividad antioxidante contra la peroxidación de lípidos y sobre la hidrólisis de ácidos grasos (Chen y col., 1998). Por lo que, los péptidos de fuente animal tales como los obtenidos por vía enzimática a partir de
19 proteínas miofibrilar de cerdo (Saiga y col., 2003), caseína (Rival y col., 2001), huevo (Jung y col., 2001), suero de la leche (Tong y col. 2000) y proteínas de pescado (Shahidi y Amarowicz, 1996) han exhibido actividad antioxidante in vitro.
Otra fuente vegetal rica en péptidos con actividad antioxidante es el gluten de trigo, ya que su composición de aminoácidos es única, debido a que, cuenta con la presencia de Glu (E), Gln (Q) y Pro (P) en más del 50% de los residuos de aminoácidos total y cerca del 30% de estos aminoácidos presentan características hidrofóbicas y estos contribuyen grandemente a su habilidad para formar agregados proteínicos por interacciones hidrofóbicas, enlazando sustancias no polares, y su afinidad por el aceite, pueden tener efecto sobre la degradación de ácidos grasos Suetsuna y Chen, (2002). Otra característica, de los péptidos antioxidantes es la presencia de His (H) dentro de la secuencia del péptido, ya que, la presencia de HH y la presencia en el grupo N-terminal de residuos de Leu (L) o Pro (P) incrementan la actividad antioxidante del péptido (LLPHH) (Chen y col., 1996). La relación de la estructura/actividad de los antioxidantes que contienen H puede ser atribuida a la habilidad de donación del hidrógeno, al atrapamiento del radical peroxil de lípidos, y/o a la habilidad de quelación metálica del grupo imidazol (Chan y Decker, 1994;
Chen y col., 1998).
2.5.1.4 Péptidos antimicrobianos
Los péptidos antimicrobianos son moléculas efectoras del sistema inmune innato que tienen funciones contra gérmenes y además cumplen otras funciones ya que estos presentan un amplio espectro (incluyendo hongos y virus) y juegan un papel importante aunque poco conocido hasta el momento, en los procesos inflamatorios, liberación de citoquininas, inducción inmune, cicatrización y seguramente por todas estas razones, en la patogénesis de muchas enfermedades (Escovar y Chalela, 2004; Anderson y col., 2004). Estos péptidos se caracterizan por tener residuos de aminoácidos predominantes como son Pro (P), Trp (W), Arg (R) e His (H), pueden presentar una estructura en forma de lámina β plegada estabilizadas
20 por puentes disulfuros o una estructura α-helicoidal, circulares o en asa (Escovar y Chalela, 2004; Kamysz y col., 2003). Sin embargo, las péptidos antimicrobianos se diferencian mediante familias como son las defensinas y estos se encuentran tanto en los insectos, mamíferos y plantas. Los primeros poseen de 34 a 43 residuos de aminoácidos y cuenta con tres puentes disulfuros. En los mamíferos poseen entre 29 y 34 aminoácidos, tres puentes disulfuros, y las defensinas de las plantas son ricos en (Cys) C y altamente básicos, cuentan con 45 a 54 residuos de aminoácidos y poseen una carga positiva neta (Hoffmann y Hétru, 1992; Ganz y Lehrer, 1994;
Broekaert y col., 1995). La actividad de los péptidos antimicrobianos se debe tanto a su carga como su estructura, así como también involucra a los componentes que constituyen la membrana celular de los microorganismos. Dos mecanismo de acción se han descrito, el modelo de barril sin fondo y modelo de carpeta, ambos tienen como finalidad perforar la membrana del microorganismo y producir la lisis completa del mismo (Zhao, 2003).
2.6 Obtención de péptidos mediante hidrólisis enzimática
Los hidrolizados enzimáticos han sido utilizados para muchos propósitos, tales como mejorar y/o modificar las propiedades funcionales de productos alimenticios, en la formulación de productos farmacéuticos y de aplicación clínica específica, así como para reducir la alergenicidad de la proteína y en la obtención de péptidos bioactivos (Tardioli y col., 2003). Durante la hidrólisis de las proteínas, la elección de la enzima y las condiciones del proceso influyen en la composición de péptidos en el hidrolizado y por lo tanto en sus propiedades funcionales (Van der Ven y col., 2002).
Atendiendo su grado de hidrólisis (GH), los productos proteínicos pueden ser clasificados en hidrolizados parciales (GH < 10%) y extensivos (GH > 10%), cada uno de ellos presenta propiedades específicas que afectan a su utilización (Vioque y col., 2006). Para lograr lo anterior, un gran número de enzimas exógenas han sido empleadas satisfactoriamente en la producción de hidrolizados proteínicos de diferentes fuentes, por lo que un factor importante a considerar es la naturaleza de la
