UNIVERSIDAD VERACRUZANA
INSTITUTO DE CIENCIAS BÁSICAS
“
Identificación de péptidos bioactivos generados durante la
digestión gastrointestinal in vitro de proteínas de jalea real”
Tesis que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias Alimentarias
Presenta:
L.N. Jesús Osvaldo Conde Rivas
Directores:
Dra. Elvia Cruz Huerta, CIDEA-UV
Dr. Daniel Guajardo Flores, ITESM-Monterrey
II
DEDICATORIAS
A mis padres por todas sus enseñanzas, las cuales me han permitido ser una mejor persona cada día, sin ustedes no estaría en el lugar donde me encuentro ahora, los amo.
A mis hermanos, que a pesar de no convivir mucho, los amo y los llevo en el corazón
A mis compañeros de maestría Frineth, Selene y Felipe por siempre darme ánimos y siempre sacarme una sonrisa, gracias por todo su apoyo incondicional, aunque me cueste trabajo admitirlo, las quiero mucho y agradezco el haber compartido tiempo con ustedes estos últimos meses, los cuáles estuvieron llenos de diversión y también de estrés pero siempre optimistas.
A Gloricel, porque juntos atravesamos por momentos complicados que, aunque fueron estresantes, a la vez fueron muy satisfactorios.
A Orlando, Brenda y Marco por apoyarme en las últimas semanas de la realización de este trabajo.
III
AGRADECIMIENTOS
A las instituciones que me brindaron el apoyo para realizar mis estudios de maestría:
Instituto de ciencias básicas de la universidad veracruzana (ICB-UV)
Instituto Tecnológico de Estudios Superiores de Monterrey, Campus Monterrey (ITESM-Monterrey)
Instituto de Ecología (INECOL)
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)
A mis directores de tesis: la Doctora Elvia Cruz Huerta y el Doctor Daniel Guajardo Flores por todo el aprendizaje, por todo su apoyo incondicional, tiempo, dedicación y paciencia.
A mis sinodales: Dr. César Ignacio Beristain Guevara, Dr. Armando Jesús Martínez Chacón y Dr. Eliel Ruiz May por el tiempo brindado en la elaboración y revisión de este trabajo.
Al personal administrativo y docente del Instituto de Ciencias Básicas de la Universidad Veracruzana por el apoyo brindado a lo largo de la maestría.
Al personal del Instituto Tecnológico de Monterrey: A Javi por toda la paciencia que tuvo conmigo en los experimentos con células, a Felipe por siempre sacarme de apuros y apoyarme en todo lo necesario, a mis compañeros de laboratorio Sayra, Diana, Moni, Kathia, Fabi y Dani por contribuir de una u otra forma para mi crecimiento profesional y personal. A las doctoras Aurea, Marilena, Daniela, Lily por la ayuda que me brindaron en la realización de mi trabajo experimental.
Agradezco a Mirna y a Jiovany, personal del INECOL por apoyarme en mi trabajo experimental con proteínas.
A mis compañeros de generación Luis, Iván, Anaïs, Karina y especialmente a Gloricel por acompañarme en este último trayecto.
IV
ÍNDICE GENERAL
1. INTRODUCCIÓN ... 1
2. MARCO TEÓRICO ... 3
2.1 Jalea real ... 3
2.1.1 Composición de la jalea real ... 5
2.1.2 Proteínas de la jalea real ... 6
2.1.3 Contenido de aminoácidos en MRJPs de jalea real... 8
2.2 Digestión de proteínas y péptidos alimentarios ... 8
2.2.1 Simulación de la digestión ... 10
2.2.2 Identificación de péptidos durante la digestión gastrointestinal ... 11
2.2.3 Péptidos glicosilados ... 11
2.3 Mecanismos fisiológicos de defensa: actividad antioxidante ... 13
2.4 Actividad antiproliferativa de proteínas y péptidos alimentarios sobre células intestinales de cáncer de colon ... 17
2.5 Métodos de evaluación de la capacidad antioxidante de un compuesto ... 19
2.6 Ensayos celulares ... 20
2.6.1 Actividad antioxidante celular (CAA) ... 21
2.6.2 Actividad antiproliferativa ... 21
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 23
4. OBJETIVOS ... 24 4.1 Objetivo general ... 24 4.2 Objetivos específicos ... 24 5. HIPÓTESIS ... 24 6. MATERIAL Y MÉTODOS ... 26 6.1 Material biológico ... 26
6.2 Extracción de proteínas de jalea real ... 27
6.3 Propiedades fisicoquímicas ... 27
6.3.1 Humedad ... 27
V
6.3.3 Proteína ... 28
6.3.4 Lípidos ... 28
6.3.5 pH ... 28
6.3.6 Determinación de cenizas ... 29
6.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS- PAGE) ... 29
6.5 Simulación de la digestión gastrointestinal in vitro de las proteínas de jalea real ... 30
6.5.1 Fase oral ... 30
6.5.2 Fase gástrica ... 30
6.5.3 Fase duodenal ... 30
6.6 Identificación de péptidos obtenidos durante la digestion gastrointestinal in vitro de proteínas de jalea real mediante nanoLC -MS/MS ... 31
6.7 Determinación de la actividad antioxidante ... 33
6.7.1 Capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC) ... 33
6.7.2 DPPH ... 34
6.8 Ensayo de citotoxicidad y viabilidad celular de células Caco-2 ... 34
6.9 Análisis estadístico ... 35
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 36
7.1 Composición fisicoquímica de jalea real ... 36
7.2 Caracterización de proteínas de jalea real ... 36
7.3 Efecto de la digestión in vitro sobre las proteínas de jalea real ... 38
7.4 Identificación de péptidos obtenidos durante la digestión gastrointestinal in vitro de proteínas de jalea real ... 39
7.5 Péptidos glicosilados obtenidos durante la digestión gastrointestinal in vitro de proteínas de jalea real ... 46
7.6 Determinación de la actividad antioxidante de las proteínas de jalea real ... 51
7.6.1 ORAC ... 51
7.6.2 DPPH ... 52
7.7 Efecto de las proteínas de jalea real sobre la viabilidad de células de cáncer de colon ... 53
VI
9. BIBLIOGRAFÍA ... 58 10. APÉNDICE ... 72
VII
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Composición fisicoquímica de la jalea real ... 5
Cuadro 2. Clasificación y bioactividad de las proteínas mayoritarias de la jalea real. ... 6
Cuadro 3. Ejemplos de péptidos bioactivos en distintas fuentes proteicas ... 17
Cuadro 4. Viabilidad celular... 22
Cuadro 5. Composición fisicoquímica de jalea real ... 36
Cuadro 6. Contenido de proteína de jalea real antes y después de la digestión gastrointestinal. ... 38
Cuadro 7. Péptidos glicosilados identificados de proteínas de jalea real después de 60 minutos de digestión intestinal ... 49
Cuadro 8. Péptidos glicosilados identificados de proteínas de jalea real después de 120 minutos de digestión intestinal ... 50
Cuadro 9. Capacidad de absorción de radicales libres (ORAC)... 52
VIII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Abeja obrera y abeja reina (Apis mellifera L.) ... 4
Figura 2. Aparato digestivo ... 9
Figura 3 . Estructura de los glicopéptidos ... 12
Figura 4. Estrés oxidativo ... 14
Figura 5. Mecanismo antioxidante ... 15
Figura 6. Mecanismos de péptidos antioxidantes. Transferencia de átomos de hidrógeno: HAT, transferencia de electrones: SET, pérdida de protones asistida por solvente: SAPL ... 16
Figura 7. Incidencia de cáncer colorrectal en México ... 18
Figura 8. Diagrama general de trabajo ... 26
Figura 9. SDS-PAGE. 1) Marcador de peso molecular; 2) Fase oral; 3) Fase gástrica 60 min; 4) Fase gástrica 120 min; 5) Fase intestinal 60 min; 6) Fase intestinal 120 min. ... 37
Figura 10. Péptidos identificados tras la digestión in vitro de proteínas de jalea real MRJP1 después de 60 minutos de digestión. ... 40
Figura 11. Péptidos identificados tras la digestión in vitro de proteínas de jalea real MRJP2 después de 60 minutos de digestión ... 41
Figura 12. Péptidos identificados tras la digestión in vitro de proteínas de jalea real MRJP3 después de 60 minutos de digestión ... 42
Figura 13. Péptidos identificados tras la digestión in vitro de proteínas de jalea real MRJP1 después de 120 minutos de digestión ... 43
Figura 14. Péptidos identificados tras la digestión in vitro de proteínas de jalea real MRJP2 después de 120 minutos de digestión ... 44
Figura 15. Péptidos identificados tras la digestión in vitro de proteínas de jalea real MRJP3 después de 120 minutos de digestión. ... 45
Figura 16. Espectro de masas en tándem del ión con carga (+3) y m/z 1864.4 El glicopéptido fue identificado como ... 48
Figura 17. Viabilidad de los digeridos de proteínas de jalea real a distintas concentraciones (0.375 – 24 μg/mL) en línea celular Caco-2. ... 56
IX RESUMEN
Las proteínas mayoritarias (MRJPs 1-9) son la fracción proteica más abundante dentro de la jalea real, muchas de las actividades biológicas y de promoción de la salud de la jalea real se atribuyen al contenido de estas proteínas. Durante la digestión gastrointestinal, se producen una gran cantidad de péptidos por hidrólisis de las proteínas alimentarias, los cuáles pueden desempeñar distintos efectos benéficos para la salud. El objetivo de este trabajo fue identificar los péptidos bioactivos liberados durante la digestión in vitro de las proteínas de la jalea real y evaluar su actividad antiproliferativa en células de cáncer de colon, así como su actividad antioxidante. Las proteínas de jalea real fueron sometidas a una digestión
in vitro durante las distintas fases oral, gástrica, intestinal. En las proteínas
MRJP-1, 2 y 3 se pudieron identificar 249, 87 y 58 péptidos respectivamente tras 60 minutos de digestión intestinal y después de 120 minutos de digestión se pudieron identificar 106, 32 y 23 péptidos respectivamente. Se evaluó la actividad antioxidante en las diferentes fases de la digestión, la fracción intestinal presentó valor promedio mayor (1377 ± 0.97 μMET/g-1 bs) que la fase gástrica y oral; así mismo, en la viabilidad celular de células de cáncer la fracción intestinal fue la que mayor acción antiproliferativa mostró.
Palabras clave: Apis mellifera, proteínas de jalea real, digestion in vitro, péptidos bioactivos, actividad antioxidante, actividad antiproliferativa.
X ABSTRACT
Majority proteins (MRJPs 1-9) are the most abundant protein fraction in royal jelly, many of the biological and health promotion activities of royal jelly are attributed to the content of these proteins. During gastrointestinal digestion, a large number of peptides are produced by hydrolysis of food proteins, which can have different beneficial health effects. The objective of this work was to identify the bioactive peptides released during in vitro digestion of royal jelly proteins and evaluate their antiproliferative activity in colon cancer cells, as well as their antioxidant activity. Royal jelly proteins were subjected to in vitro digestion during the various oral, gastric, intestinal phases. In the MRJP-1, 2 and 3 proteins, 249, 87 and 58 peptides could be identified respectively after 60 minutes of intestinal digestion and after 120 minutes of digestion, 106, 32 and 23 peptides could be identified respectively. The antioxidant activity in the different phases of digestion was evaluated, the intestinal fraction presented a higher average value (1377 ± 0.97 μMET / g-1 bs) than the gastric and oral phase; Likewise, in the cell viability of cancer cells, the intestinal fraction showed the greatest antiproliferative action.
Keywords: Apis mellifera, royal jelly, proteins, In vitro digestion, bioactive peptides,
1
1. INTRODUCCIÓN
La jalea real es una secreción de las glándulas hipofaríngeas de las abejas (Apis
mellifera L.), que sirve de alimento para la abeja reina y para las larvas. Diversos estudios
tanto in vitro como in vivo han demostrado que la jalea real posee actividad anticancerígena, antimicrobiana, antiinflamatoria, hipocolesterolémica, hipotensora, desinfectante, vasodilatadora, e inmunomoduladora (Melliou y Chinou, 2014). Además, se compone principalmente de agua (50-70%), proteínas (12-18%), carbohidratos en su mayoría glucosa, fructosa y sacarosa (10-12%), lípidos y ácidos grasos (3-8%) y en menor cantidad vitaminas hidrosolubles, nucleótidos, polifenoles, hormonas y esteroles (Pina et al., 2018).
Las proteínas son el principal componente estructural y funcional de las células y tienen numerosas e importantes funciones dentro del organismo. En la jalea real, el grupo de proteínas mayoritarias (MRJPs 1-9) pertenecen a la familia de las apalbúminas, representan aproximadamente el 90% del contenido total de las proteínas y se consideran el principal componente activo de la jalea real (Ramadam y Al-Gamdhi, 2012).
Durante la digestión gastrointestinal, las proteínas sufren modificaciones que dan lugar a la liberación de secuencias peptídicas capaces de ejercer un determinado efecto o actividad biológica en el organismo. Estos péptidos pueden ejercer su efecto a nivel sistémico tras su absorción, o localmente en contacto con las células y los receptores digestivos (Foltz et al., 2010).
El tracto gastrointestinal se encuentra continuamente sometido al ataque oxidativo de altas concentraciones de ROS en el contenido luminal como consecuencia de ciertos compuestos pro-oxidantes de la dieta, fármacos o toxinas, así como aquellas especies reactivas generadas de forma endógena en el metabolismo del propio organismo (Zhu y Li, 2012). Por todo ello, en numerosos estudios se han vinculado los desequilibrios del sistema redox con el inicio y la progresión de varias patologías digestivas, como las enfermedades inflamatorias intestinales, disfunciones hepáticas y el cáncer colorrectal (Zhu y Li, 2012;Alzoghaibi, 2013).
2
En este sentido, diversos estudios han demostrado el efecto quimiopreventivo de los péptidos bioactivos como agentes moduladores del proceso tumoral mediante, la inducción de la apoptosis, el bloqueo de vías de señalización celular, la inhibición de la angiogénesis, así como mediante efectos anti-inflamatorios, antioxidantes e inmunomodulantes (Melliou y Chinou, 2014; Waleed et al., 2015;Teixeira et al., 2017).También, se ha descrito que los péptidos bioactivos pueden regular la expresión de proteínas y genes implicados en los distintos estadios del inicio y progreso del desarrollo tumoral (Blanco-Míguez et al., 2016). Además, la interacción directa entre los digeridos de proteínas alimentarias y el tracto digestivo, ha mostrado potenciales efectos quimiopreventivos a este nivel (Khoogar et al., 2016).
Para el caso de la jalea real, se considera que las proteínas son las responsables de la mayor parte de su bioactividad (Lin et al., 2018). Sin embargo, aún no se han identificado las secuencias peptídicas que se forman tras la digestion de sus proteínas y su efecto sobre la salud intestinal. En este estudio, se planteó la identificar los péptidos bioactivos generados durante la digestión gastrointestinal de las principales proteínas de jalea real y se evaluó su actividad antioxidante y antiproliferativa.
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2. MARCO TEÓRICO 2.1 Jalea real
En la última década, la sociedad ha sido más consciente del binomio dieta y salud. Debido a esto han tomado importancia en el sector alimentario los alimentos funcionales, los cuales proporcionan beneficios más allá de los valores nutricionales, ya sea mejorando una función determinada del organismo o bien reduciendo el riesgo de enfermedades (Aleixandre et al., 2008).
Los elementos que definen el marco en el cual se han desarrollado estos alimentos funcionales son: 1) los cambios en los patrones alimentarios en los países desarrollados, con tendencias hacia el consumo de dietas altas en grasas, así como el aumento del consumo de alimentos precocinados y congelados. 2) patrones epidemiológicos de las enfermedades que afectan a la población en los cuales resaltan las enfermedades crónico-degenerativas como la diabetes, hipertensión arterial o incluso el cáncer.
Los alimentos funcionales provienen de distintas matrices alimentarias, las cuales pueden ser tanto de origen animal como de origen vegetal. En el caso de la jalea real se considera un complemento dietético que presenta características funcionales interesantes, es secretada por las glándulas hipofaríngeas de las abejas obreras jóvenes del género Apis mellifera L. Todas las larvas de abeja en sus primeros tres días de vida se alimentan con jalea real; posteriormente, las larvas destinadas a ser obreras se alimentan con una mezcla de jalea real, miel y polen, a diferencia de la abeja reina que se alimenta de jalea real durante toda su vida.
Por lo tanto, las abejas obreras tienen una esperanza de vida de aproximadamente 6 a 8 semanas, mientras que la abeja reina vive alrededor de 4 - 5 años (Ramanathan et
al., 2018). A pesar de que la abeja reina y la abeja obrera son genéticamente idénticas,
tienen diferencias fenotípicas, fisiológicas y funcionales (Figura 1). Estas diferencias se atribuyen principalmente a la extraordinaria composición de la jalea real y su poderosa influencia epigenética en la diferenciación de las larvas cuando son alimentadas exclusivamente con jalea real.
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Figura 1. Abeja obrera y abeja reina (Apis mellifera L.)
La jalea real ha atraído especial atención debido a sus efectos sobre la salud humana. Desde la antigüedad se ha usado como un suplemento alimenticio o cosmético y se considera que tiene una gran variedad de efectos benéficos para la salud. Diversos estudios han puesto de manifiesto que la jalea real posee distintas propiedades funcionales incluyendo actividad antihipertensiva (Matsui et al., 2002), hipocolesterolémica (El-MorsyI, 2014), antimicrobiana (Fratiniab et al., 2016), inmunomoduladora (Melliou y Chinou, 2014), antiinflamatoria (Waleed et al., 2015), antioxidante (Teixeira et al., 2017) y antiproliferativa (Tsuruma et al., 2011).
La medicina tradicional y muchos investigadores en el campo de la apiterapia consideran a la jalea real un producto de la colmena muy útil como compuesto saludable cuando se consume como suplemento alimenticio, sin embargo estudios controlados o efectos en humanos son escasos, y algunos estudios se han realizado solo a nivel de cultivo celular; en los pocos estudios en donde se trabaja con organismos vivos (animales), sustancias potencialmente activas han sido inyectadas o aplicadas en lugar de ser administradas oralmente y la ingesta oral de jalea real es la forma más común de consumirla (Mureᶊan et al., 2018).
5
2.1.1 Composición de la jalea real
La composición de la jalea real es compleja, contiene agua (60-70%), proteínas (12-15%), carbohidratos (10-16%), lípidos, vitaminas y aminoácidos libres (Cuadro 1). Además, contiene numerosos compuestos bioactivos, incluyendo el ácido 10-hidroxi-2-decenoico (HDA), ácidos grasos y polifenoles. El extracto crudo de las proteínas de JR consta de proteínas solubles y proteínas insolubles. Más del 80% de las proteínas solubles de la jalea real son proteínas mayoritarias (MRJPs 1-9). Se piensa que las MRJPs son el factor responsable del papel fisiológico de la jalea real en el desarrollo de la abeja reina (Hadi et al. 2018).
La jalea real tiene un pH ácido entre 3.6 y 4.2 y su composición varía con las estaciones del año y condiciones ambientales en las cuales las abejas se desarrollan, también varía de acuerdo a la raza y el metabolismo de las abejas obreras y el tiempo de recolección de la jalea real. De las proteínas registradas dentro de la jalea real la más ampliamente estudiada y la que es considerada responsable del papel fisiológico y del desarrollo de la abeja reina es la MRJP-1 (Ramanathan et al., 2018).
Cuadro 1. Composición fisicoquímica de la jalea real
Parámetro Referencia
Humedad (%) 50-70 Kokot et al., 2018
Proteína (%) 9-18 Ramanathan et al., 2018
Lípidos (%) 3-8 Furusawa et al., 2016
Carbohidratos (%) 7-18 Buttsted et al., 2014
pH 3.5-4.5 Broto, 1989
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2.1.2 Proteínas de la jalea real
Mediante estudios proteómicos, se han logrado identificar hasta 100 proteínas diferentes en la jalea real, incluidas el grupo de proteínas mayoritarias de la jalea real (MRJPs 1-9) que pertenecen a la familia de las apalbúminas y representan aproximadamente el 90% del total de las proteínas (Hykollari et al., 2018). Estas proteínas son codificadas por nueve genes diferentes, con masas moleculares que varían de 49 a 87 KDa y se considera que son el principal factor responsable de la bioactividad de la jalea real (Moriyama et al., 2015; Ramanathan et al., 2018). El cuadro 2 muestra brevemente la clasificación y bioactividad de las proteínas mayoritarias de la jalea real.
Cuadro 2. Clasificación y bioactividad de las proteínas mayoritarias de la jalea real.
Proteínas Bioactividad de las proteínas
Proteínas en mayor abundancia MRJP-1 MRJP-2 MRJP-3 MRJP-4 MRJP-5
Incremento en la longevidad, mejoran la actividad inmunomoduladora, aceleran la
respuesta inmune, contienen
propiedades antialergénicas, entre otras.
Proteínas en menor abundancia MRJP-6 MRJP-7 MRJP-8 MRJP-9
No existe suficiente evidencia científica para determinar alguna actividad biológica.
Fuente: Ramanathan et al., (2018)
MRJP-1
Es la proteína de la jalea real más abundante y la primera en ser identificada. También se conoce con diferentes nombres como apalbúmina o royalactina (Kamakura, 2011). Se considera la principal responsable de inducir los cambios fisiológicos que resultan en la diferenciación de las larvas en la abeja reina, acorta el tiempo de desarrollo y aumenta el
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tamaño del cuerpo. Se encuentra en diferentes formas, tales como monómeros, oligómeros y formas solubles en agua. Es una proteína de 420 kDa que generalmente se combina con un oligómero de apisimina (5.5 kDa) para formar el complejo estable de aproximadamente 450 kDa. Es la proteína más glicosilada de las 3 MRJPs. Los factores que influyen en la oligomerización de MRJP1 aún no están bien definidos. Una de las razones podría deberse a la glucosilación o la variabilidad genética entre las diferentes especies de abejas melíferas. Esta proteína también se ha detectado en miel y polen en pequeñas cantidades (Malecová et al., 2003).
MRJP-2
Es una glucoproteína monomérica que tiene ocho formas con una masa molecular de 50-59 kDa y un punto isoeléctrico entre 4.92 y 7.02. Esta proteína se encuentra glicosilada en dos sitios del extremo N terminal, composición única a la que se le atribuyen sus numerosas aplicaciones farmacológicas. La MRJP-2 o apalbúmina-β al igual que la MRJP-3 no tiene la habilidad para formar geles, aunque tiene una conformación muy similar a la MRJP-1 o apalbúmina. La MRJP-2 tiene efectos antibacteriales contra la enfermedad Loque americana, que es característica de las colonias de abejas; en el género Apis cerana, la MRJP-2 actúa como un péptido antimicrobiano que tiene un amplio espectro contra bacterias, hongos y levaduras así como también confiere protección a las células contra la oxidación actuando como un escudo de la membrana (Ramanathan
et al., 2018).
MRJP-3
Es una proteína polimórfica que representa aproximadamente el 15% del contenido total de proteína de la jalea real (Furusawa et al., 2008). Similar en su composición aminoacídica a las proteínas MRJP1 y MRJP2 en un 64 - 69%, y con glicosilaciones en sitios de la cadena aminoacídica similares. Contiene pocos aminoácidos aminoácidos esenciales totales en comparación con las proteínas MRJP 1 y 2, aunque tiene altas concentraciones de algunos de ellos como arginina (4.9%) y lisina (5.8%) (Schmitzová et
al., 1998). La proteína MRJP-3 contiene regiones similares dentro de la secuencia y está
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marcadores para diferentes estudios genéticos en colonias de abeja de miel y diferentes especies de Apis mellifera.
MRJPs 4-9
Las MRJPs 4 – 9 son proteínas en menor abundancia y aún no hay registros suficientes acerca de su actividad biológica; aparte de éstas, hay algunas proteínas que aún no han sido caracterizadas y algunos péptidos provenientes de estas proteínas que están presentes en la jalea real (Maghsoudlou et al., 2019).
2.1.3 Contenido de aminoácidos en MRJPs de jalea real
Estas proteínas contienen altas cantidades de aminoácidos necesarios para nutrir tanto a la abeja reina como a las larvas. Dentro de su composición contienen los diez aminoácidos esenciales: Arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina. En las proteínas MRJP1, MRJP2 y MRJP4 los aminoácidos predominantes son leucina y valina, en MRJP5 arginina y metionina, en MRJP3 arginina y lisina, en MRJP6, 7 y 8 leucina y en MRJP9 el aminoácido predominante es isoleucina.
2.2 Digestión de proteínas y péptidos alimentarios
Cada tramo del tracto gastrointestinal tiene su propia función en el proceso digestivo (Figura 2). En la cavidad oral se produce la masticación de los alimentos y se mezcla con la saliva, que contiene una compleja mezcla de componentes incluyendo la enzima amilasa que cataliza la hidrólisis del almidón en azúcares. El bolo alimenticio es transportado a través del esófago al estómago donde entra en contacto con proteasas, principalmente pepsina y lipasas, que hidrolizan proteínas y lípidos, respectivamente. La digestión in vivo de las proteínas comienza en el estómago bajo la acción de la pepsina, además la secreción de ácido a nivel gástrico disminuye el pH, lo que contribuye a la digestión de las proteínas.
9
El quimo es gradualmente desplazado al intestino delgado donde el pH del estómago es neutralizado y se incorporan jugos digestivos pancreáticos (con enzimas digestivas como la tripsina y la quimotripsina) y de la vesícula biliar (ácidos biliares). Las enzimas digestivas secretadas catalizan la hidrólisis de las proteínas, los lípidos y el almidón, mientras que los ácidos biliares ayudan a emulsionar los productos resultantes de la digestión de los lípidos en micelas (Wickham et al., 2009).
Figura 2. Aparato digestivo
La proteína que se ingiere por la dieta es digerida y absorbida en el tracto gastrointestinal. Después de ser desnaturalizada por el ácido gástrico es hidrolizada en pequeños péptidos y aminoácidos por las proteasas gástricas y pancreáticas. Algunos aminoácidos presentes son utilizados en la célula por los propios enterocitos como fuente de energía y en el recambio celular, otros más sufren transformaciones metabólicas antes de pasar a la sangre (Martínez y Martínez, 2006). La etapa final en la digestión de las proteínas alimentarias ocurre en la superficie de los enterocitos por la acción de las proteasas de las células intestinales con borde en cepillo (Shimizu, 2004). Una vez que los aminoácidos y pequeños péptidos que lograron atravesar la barrera intestinal entran a la sangre y llegan al hígado a través de la circulación portal son captados y utilizados por este órgano, una parte entra en la circulación sistémica y se utilizan por los tejidos
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periféricos. El destino metabólico de los aminoácidos es complejo e inicia desde la utilización como sustrato energético o gluconeogénico hasta la síntesis de nuevas proteínas y péptidos (Martínez y Martínez, 2006).
Algunos de estos péptidos liberados durante la digestión pueden presentar homología estructural con péptidos endógenos y podrían interactuar con las mismas dianas. En otros casos, estos péptidos pueden actuar como inhibidores de enzimas endógenas o actuar sobre distintos receptores en el organismo, pudiendo, así ejercer una determinada actividad biológica. Estas secuencias peptídicas capaces de ejercer un determinado efecto o actividad biológica en el organismo se denominan péptidos bioactivos y pueden encontrarse en forma inactiva o menos activa dentro de la matriz proteica siendo necesaria su hidrólisis, por ejemplo, durante la digestión gastrointestinal, para su liberación y activación. Estas secuencias también pueden generarse mediante hidrólisis
in vitro, o una combinación de ambos (Hernández-Ledesma et al., 2013). Asimismo,
cuando se estudia el efecto que un compuesto activo podría tener en nuestro organismo, es importante asegurarse que la forma activa alcance el órgano diana. Con este fin, se debe evaluar la estabilidad a la digestión, su absorción, y también es importante evaluar su distribución, metabolismo y excreción, a fin de establecer las propiedades de biodisponibilidad del péptido de interés (Foltz et al., 2010).
2.2.1 Simulación de la digestión
Los modelos de digestión in vitro se han desarrollado como una alternativa adecuada y reproducible a los estudios in vivo para mimetizar los mecanismos complejos de la digestión. La simulación de lo que acontece en el tracto gastrointestinal supone establecer parámetros, lo más próximos posibles a las condiciones fisiológicas de pH y tiempos de tránsito para cada sistema, así como las condiciones químicas y enzimáticas para cada tiempo. Una regla básica en la simulación gastrointestinal es conseguir la relación adecuada de complejidad técnica frente a la relevancia fisiológica, ya que siempre existirán parámetros que quedarán fuera del modelo entre otros: mecanismos hormonales, sistema inmune, microbiota, etc.(Minekus et al., 2014).
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2.2.2 Identificación de péptidos durante la digestión gastrointestinal
Varios autores han empleado la peptidómica para caracterizar los productos formados durante la digestión de diferentes proteínas (Dupont et al., 2010; Picariello et al., 2010). La identificación por MS puede estar dirigida a algunos productos de interés a través de la digestión (epítopos potenciales, búsqueda de secuencias bioactivas, estabilidad de ciertas regiones). Algunos autores han utilizado esta identificación específica para evaluar la estabilidad de varios péptidos durante la digestión, por ejemplo, para supervisar la actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) (Miguel et al., 2004) o para dar seguimiento a péptidos antioxidantes y anticancerígenos (Hernández-Ledesma et al., 2013).
Dentro de la jalea real existen péptidos con actividad antibiótica, uno de ellos es la royalisina, el cual es un péptido de 51 aminoácidos, este péptido confiere protección contra las bacterias gram negativas que puedan atacar a la larva de la abeja. Además, se ha encontrado una familia de péptidos denominados jaleínas, los cuales son 4 y son efectivos contra bacterias gram positivas y gram negativas; 3 de estos péptidos de cadena corta presentan el aminoácido leucina en su estructura en la posición C-terminal, y presentan actividad antibacterial específica (Fontana et al., 2004).
2.2.3 Péptidos glicosilados
Las proteínas y péptidos glicosilados se encargan de llevar a cabo bioactividades que son necesarias para el desarrollo y el buen funcionamiento de todos los organismos. Las reacciones de glicosilación se llevan a cabo durante la traducción de proteínas en el lumen del retículo endoplasmático rugoso y continua en el aparato de Golgi. Las glicosilaciones se clasifican de acuerdo al sitio de unión entre el azúcar y la proteína (Jiménez-Martínez et al., 2002). En la actualidad las proteínas recombinantes que se prescriben como terapia son proteínas glicosiladas, la glicosilación hace que nuestro cuerpo pueda distinguir a proteínas que no pertenecen al organismo de las propias y de acuerdo al sitio de glicosilación y al tipo de azúcar, tienen distintas bioactividades (Palomares, 2008). Una de las principales funciones de los azucares unidos a las proteínas es la de brindar protección contra algunas enzimas que puedan hidrolizarlas,
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aunque también participan en la diferenciación, transducción de señales y estimular la respuesta inmune en contra de ciertas enfermedades contra el cáncer. (Gorocica-Rosete
et al., 2008).
Figura 3 . Estructura de los glicopéptidos
Las proteínas que se encuentran en la jalea real son glicoproteínas, que están unidas a través de un enlace covalente al residuo terminal-N, y se considera que estás modificaciones son las responsables del desarrollo y crecimiento de las abejas reinas. La glicosilación es una modificación compleja post-translacional, se estima que en la naturaleza más del 50% de las proteínas naturales son proteínas glicosiladas, y de éstas, el 70% son proteínas N-glicosiladas; En este tipo de glicosilación, el glicano está unido covalentemente a la asparagina. Las glicoproteínas tienen un papel muy importante en varios procesos biológicos regulándolos, entre ellos, la proliferación celular, desarrollo celular o incluso la respuesta inmune y esta actividad va a depender del tipo de glicano y el sitio de unión a la proteína. Doce N-glicanos han sido identificados en la jalea real, de los cuales se ha reportado que algunos son capaces de inhibir el crecimiento de bacterias (Lin et al., 2019).
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2.3 Mecanismos fisiológicos de defensa: actividad antioxidante
En condiciones fisiológicas, en las células del organismo existe un equilibrio entre la formación de especies reactivas de oxígeno (comúnmente denominadas ROS por sus siglas en inglés “reactive oxygen species”) y su neutralización por parte de los mecanismos de defensa antioxidantes. Las ROS se originan en la célula fundamentalmente durante el metabolismo endógeno del oxígeno para la obtención de energía. También pueden tener origen externo por diversos factores como la radiación, la quimioterapia, los agentes contaminantes, el tabaco, el alcohol y los xenobióticos, entre otros. En situación de homeostasis, las ROS cumplen funciones esenciales como eficientes moléculas de señalización celular y componentes del sistema inmunológico. Las células presentan un eficaz sistema antioxidante, tanto enzimático, en el que destaca la actividad de las enzimas glutatión peroxidasa (GPx), glutatión reductasa, CAT y SOD, como no-enzimático, cuyo principal agente es el tripéptido ECG, denominado glutatión (GSH).
Cuando se produce un desequilibrio debido a un aumento en la producción de ROS o a una reducción en los mecanismos de defensa antioxidante propio de situaciones patológicas (Ray et al., 2012), la célula entra en un estado anómalo conocido como estrés oxidativo. En este estado, las ROS pueden interaccionar con lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, enzimas y otras moléculas celulares, y debido a su alta reactividad y carácter de radicales libres, pueden oxidar y alterar sus estructuras químicas (Figura 4).
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Figura 4. Estrés oxidativo
El desequilibrio oxidativo celular tienen un papel importante como agente causal subyacente en el desarrollo de numerosos procesos patológicos crónicos, como la inflamación, las enfermedades cardiovasculares, digestivas, neurodegenerativas, la diabetes, el envejecimiento y el cáncer (Mittal et al., 2014).
El tracto gastrointestinal se encuentra continuamente sometido al ataque oxidativo de altas concentraciones de ROS en el contenido luminal como consecuencia de ciertos compuestos pro-oxidantes de la dieta, fármacos o toxinas, así como aquellas especies reactivas generadas de forma endógena en el metabolismo del propio organismo (Zhu y Li, 2012). Además, se considera que el hígado es particularmente sensible a los agentes tóxicos y oxidativos al estar directamente conectado con los órganos gastrointestinales y el bazo mediante la circulación portal hepática. Por todo ello, en numerosos estudios se han vinculado los desequilibrios del sistema redox con el inicio y la progresión de varias patologías digestivas, como las enfermedades inflamatorias intestinales, las disfunciones hepáticas y el cáncer colorrectal (Bhattacharyya et al., 2014).
Las células han desarrollado mecanismos de defensa frente a los radicales libres para mantener la homeostasis redox. Estos mecanismos protectores, que neutralizan los ROS
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bloquean su producción, incluyen defensas enzimáticas y no enzimáticas producidas por el cuerpo (endógenas) o aportadas por la dieta (exógenas) (Figura 5). Por lo tanto, numerosas investigaciones se han centrado en la búsqueda e identificación de nuevos agentes de origen natural con potencial efecto antioxidante (Moura et al., 2015).
Figura 5. Mecanismo antioxidante
En este sentido, muchos péptidos pueden ejercer capacidad antioxidante, contrarrestando situaciones de estrés oxidativo e inflamación (Chakrabarti et al., 2014), así como efectos preventivos frente a la proliferación de células tumorales (Hernández-Ledesma y Hsieh, 2015), fenómenos íntimamente implicados en el origen, desarrollo y agravamiento de múltiples alteraciones patológicas digestivas.
Existen dos mecanismos principales por los cuáles las moléculas pueden neutralizar radicales libres: por transferencia de átomos de hidrógeno (HAT) o por transferencia de electrones (SET). Péptidos que contengan tirosina actúan mediante el mecanismo HAT mientras que los aminoácidos cisteína, triptófano e histidina actúan a través del mecanismo SET. Los radicales libres resultantes de los péptidos antioxidantes son significativamente más estables que los hidroxilos y peroxilos producidos en los alimentos y durante el estrés oxidativo celular (Esfandi et al., 2018)(Figura 6).
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Figura 6. Mecanismos de péptidos antioxidantes. Transferencia de átomos de hidrógeno: HAT, transferencia de electrones: SET, pérdida de protones asistida por solvente: SAPL
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Cuadro 3. Ejemplos de péptidos bioactivos en distintas fuentes proteicas
Fuente proteica Secuencia peptídica Bioactividad
Rotífero brachionus DLGLGLPGAH Antioxidante
Trigo STTTGHLIYK Antioxidante
Garbanzo NRYHG Antioxidante
Alimentos varios AVL Inhibidor de la ECA
S. limacinum PYK Antioxidante
Avena GLVYIL Antioxidante
Alacha LHY Antioxidante
Fuente: Bougatef et al., 2009; Gallegos-Tintoré et al., 2013; Xu et al., 2019; Esfandi et
al., 2019; Intiquilla et al., 2018.
2.4 Actividad antiproliferativa de proteínas y péptidos alimentarios sobre células intestinales de cáncer de colon
El cáncer colorrectal (CCR), sigue siendo la neoplasia maligna más prevalente en humanos, reconocido como el tercer cáncer más común en todo el mundo, con un alto índice de morbilidad y mortalidad, de modo que más de 600 000 personas mueren cada año debido a este tipo de cáncer (Scheuders et al., 2017). También este tipo de cáncer es el tercero más frecuente en México (Figura 7). Generalmente comienza con el crecimiento de un pólipo en el revestimiento interno del colon o el recto hasta convertirse en cáncer. Entre los síntomas más comunes se incluyen cambios en los hábitos intestinales, presencia de sangre en las heces, anemia, vómito, pérdida de peso inexplicable, dolor pélvico e inflamación (Darbandi et al., 2019).
A pesar de los avances médicos que se han alcanzado en los últimos años relativos a los tratamientos de quimioterapia, radioterapia y cirugía, recientemente se ha estimado que para el año 2030, aproximadamente 27 millones de nuevos casos de cáncer serán diagnosticados y 17 millones de pacientes de cáncer morirán a causa de esta enfermedad (Ferlay et al., 2015).
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Figura 7. Incidencia de cáncer colorrectal en México
Estudios epidemiológicos indican que un 5-10% de los casos de cáncer se han relacionado con factores genéticos, mientras que entre el 90-95% se han atribuido a agentes medioambientales externos y al estilo de vida (Anand et al., 2008). Entre ellos, los hábitos dietéticos podrían relacionarse con aproximadamente un 35% de los casos de cáncer (Davis y Milner, 2007). Estudios recientes y evidencias epidemiológicas han puesto de manifiesto el papel preventivo que podrían tener los compuestos bioactivos presentes en los alimentos (Amin et al., 2009).
Durante los últimos años, las proteínas y péptidos alimentarios han atraído la atención por su potencial papel frente al cáncer. Estos compuestos de naturaleza proteica tienen ciertas ventajas con respecto a otros tipos de moléculas quimioterapéuticas, ya que poseen gran afinidad por ciertos tipos celulares, tienen facilidad de penetración en los tejidos, cuentan con una fuerte especificidad por dianas celulares y muestran bajos índices de toxicidad (Bhutia y Maiti, 2008). Esto les ha llevado a convertirse en un grupo de nutracéuticos con un papel prometedor en la prevención de los diferentes estadíos del cáncer como la iniciación, la promoción y la progresión, caracterizándose su papel quimiopreventivo frente al cáncer colorrectal.
Mama Próstata Colon Tiroides Cérvix Pulmón Estomago Útero Hígado Leucemia
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Adicionalmente, se ha demostrado, en diferentes estudios que la interacción directa y continua entre el tracto digestivo y los componentes alimentarios derivados de la digestión, como son los péptidos bioactivos, pueden representar una interesante estrategia preventiva para la protección del organismo a este nivel. Algunos estudios se han enfocado en la acción de la jalea real sobre células de cáncer en los que se reporta que la jalea puede tener efecto positivo en el crecimiento de tumores malignos en ratones, mostrando así un efecto antiproliferativo y en algunos casos la jalea real puede incrementar la esperanza de vida en un ligero porcentaje (Tamura T. et al., 2000). Se ha demostrado también que la administración simultánea de jalea real a determinadas concentraciones con algunos fármacos para tratar cáncer como la doxorrubicina tiene un efecto sinérgico lo que probablemente pueda ayudar a disminuir el tratamiento farmacológico para evitar los efectos secundarios en el organismo (Mohammadi-Abandansari et al., 2018).
2.5 Métodos de evaluación de la capacidad antioxidante de un compuesto
Actualmente, se han descrito numerosos métodos para evaluar la capacidad antioxidante de un compuesto. Inicialmente, la mayoría de las investigaciones se centran en distintos métodos químicos in vitro, basados en la complejidad de las reacciones de oxidación que ocurren en los sistemas biológicos. Métodos químicos que pueden clasificarse en ensayos que se basan en la transferencia de un átomo de hidrógeno, entre los que destacan el ensayo “oxygen radical absorbance capacity (ORAC)” y el ensayo “total radical trapping antioxidant parameter (TRAP)” y los que se basan en la transferencia de electrones, como el ensayo “Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC)”, el ensayo “ferric ion reducing antioxidant parameter (FRAP)” y el ensayo “diphenyl-1 picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity assay”, entre otros (Huang
et al., 2005). Sin embargo, estas metodologías presentan varias limitaciones ya que
solamente reflejan reactividad química, pero no demuestran evidencias de relevancia fisiológica (Sarmadi e Ismail, 2010). Durante los últimos años se han empleado los modelos in vitro en cultivos celulares ya que permiten evaluar la biodisponibilidad, el metabolismo y la bioactividad de los compuestos antioxidantes y son una herramienta
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alternativa y previa a los modelos animales y a los ensayos clínicos que suponen un mayor tiempo, costo e implicaciones éticas (Wan et al., 2015).
Los hidrolizados enzimáticos de jalea real han sido probados por su actividad antioxidante en diversos modelos experimentales y dicha actividad se atribuye a algunos compuestos fenólicos, proteínas y péptidos, los cuales son asociados potencialmente con la recuperación después de la fatiga. En algunos estudios se ha explorado el efecto biológico de la jalea real en modelos in vitro mediante técnicas como DPPH. Se ha demostrado también que las proteínas y péptidos derivados de la jalea real disminuyen la oxidación intracelular en un efecto dosis-dependiente mediante la captación de especies reactivas de hidrógeno (Maghsoudlou et al. 2019).
2.6 Ensayos celulares
El cultivo celular se ha perfeccionado a través del tiempo, permitiendo obtener tejidos, órganos e inclusive embriones en desarrollo, los sistemas de cultivo celular son usados comúnmente debido a que son fáciles de mantener relativamente, ocupan poco espacio físico, permiten aislar virus, permiten la producción de vacunas, incrementan complejidad de los estudios experimentales sobre la biología de respuestas celulares básicas. El uso de este tipo de técnicas es de grande interés tanto biológico como farmacológico y su importancia incrementa día con día. El uso de cultivos celulares es posible a la creación de bancos de células las cuales se mantienen congeladas a una temperatura de -190°C (Acevedo-Fernández et al., 2013).
Son varias las células que se han intentado cultivar in vitro, aunque no todas responden de la misma manera y hay una amplia diferencia en cuanto al rendimiento, curvas de calibración, vida, etc. Los principales objetivos de la realización de cultivos celulares son: la obtención de un modelo experimental con condiciones controladas para realizar diversos análisis biológicos, entender los procesos biológicos de la carcinogénesis así como las diferencias entre células normales y cancerígenas para así poder utilizar tratamientos terapéuticos adecuados y por último identificar los principales agentes causantes del cáncer (Gil et al., 1989).
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2.6.1 Actividad antioxidante celular (CAA)
El ensayo celular antioxidante es capaz de medir la oxidación celular mediante un reactivo fluorescente que absorbe la célula (2′,7′-dichlorofluorescein diacetato; DCFH), este compuesto es sensible a radicales libres de oxígeno y la reacción entre estos genera una fluorescencia que es medida a una longitud de onda determinada por un lector espectrofotométrico, la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de oxidación existente en la célula. En este ensayo, los extractos se añaden a concentraciones conocidas a la célula para que esta los absorba, los antioxidantes provenientes de los extractos que fueron absorbidos por la célula son capaces de reducir la oxidación producida por el 2,2′-Azobis(2-methylpropionamidina o AAPH (agente oxidante comúnmente utilizado). Dentro de las ventajas de este ensayo es que muestra una aproximación a cómo reaccionarán diversos extractos a nivel biológico sin embargo su repetibilidad está condicionada al comportamiento de las células por lo cual la comparación entre un ensayo y otro no siempre será del todo precisa (Shahidi y Zhong, 2015).
2.6.2 Actividad antiproliferativa
La determinación de la viabilidad de las células de un cultivo es un requisito muy importante porque de esto depende que el extracto o muestra a analizar pueda ser utilizado in vivo. Existen varias técnicas para evaluar dicha viabilidad y los métodos de laboratorio para estudiar la viabilidad o funcionalidad celular tenemos: los que evalúan la integridad de la membrana celular, los ensayos funcionales, ensayos de viabilidad a través de fluorescencia, estudios de morfología celular, microanálisis por rayos X y técnicas de determinación de expresión genética (Vico, 2009) (Cuadro 4).
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Cuadro 4. Viabilidad celular
Ensayo Fundamento
Evaluación de la
integridad de la membrana celular
1. Basados en colorantes o sustancias fluorescentes.
2. Basados en tinciones catiónicas.
3. Basados en la determinación de liberación de moléculas.
Ensayos funcionales 1. Medición del ATP 2. Tasa del ADN
3. Síntesis de proteínas Ensayos con pruebas de
fluorescencia
Utilización de biosensores de fluorescencia.
Ensayos morfológicos Basados en la observación microscópica. Microscopía electrónica
analítica
1. Microanálisis por energía dispersiva de rayos X.
2. Microarrays de oligonucleótidos Determinación de la
expresión genética global
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3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En las últimas décadas, ha crecido el interés por los compuestos funcionales que están presentes en los alimentos. Los péptidos bioactivos derivados de las proteínas de la dieta destacan como ingredientes funcionales debido a la diversidad de efectos benéficos que pueden presentar y por lo tanto favorecer el bienestar y la salud. La digestión gastrointestinal de los péptidos bioactivos es uno de los primeros aspectos a evaluar antes de considerar su incorporación como ingredientes de los alimentos funcionales. Durante su tránsito por el tracto gastrointestinal, los péptidos bioactivos sufren modificaciones que dan lugar a la liberación de nuevas secuencias activas o, por el contrario, a fragmentos con menor o nula actividad. El efecto proteolítico de la pepsina y pancreatina y de las enzimas del epitelio intestinal es determinante en la relevancia fisiológica de los péptidos bioactivos.
Estos péptidos pueden ejercer su efecto a nivel sistémico tras su absorción, o localmente en contacto con las células y los receptores digestivos. En este sentido, la fracción proteica de la jalea real producida por las abejas melíferas contiene numerosos componentes valiosos y substancias biológicamente activas, por lo que resulta de particular interés conocer las secuencias específicas de los péptidos que se generan durante la digestión gastrointestinal. Existe cierta evidencia de estudios previos tanto in
vitro como in vivo sobre el papel que las proteínas de la jalea real o sus péptidos ejercen
en la prevención de diversas enfermedades, sin embargo, es necesario ampliar el conocimiento e identificar secuencias concretas de las proteínas de jalea real que están implicadas en las diferentes actividades, incluidas la antioxidante y antiproliferativa.
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4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Identificar los péptidos generados durante la digestión gastrointestinal de proteínas de jalea real y evaluar su actividad antioxidante y antiproliferativa.
4.2 Objetivos específicos
Para llevar a cabo el objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos:
Caracterizar los principales compuestos de la jalea real
Identificar y cuantificar los péptidos generados durante la simulación de la digestión gastrointestinal de las proteínas de la jalea real mediante cromatografía líquida de nano flujo acoplada a espectrometría de masas en tandem (nanoLC-MS/MS). Evaluar la actividad antioxidante de las proteínas digeridas de jalea real con
métodos químicos y un método biológico in vitro.
Evaluar la actividad antiproliferativa de las proteínas de jalea real digeridas sobre la viabilidad de células de cáncer de colon Caco-2.
5. HIPÓTESIS
Se puede identificar una amplia variedad de péptidos generados durante la digestión gastrointestinal de las proteínas de jalea real, los cuales cumplen diversas actividades a nivel sistémico como actividad antioxidante y antiproliferativa.
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6. MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 8. Diagrama general de trabajo
6.1 Material biológico
Las muestras de jalea real fresca se obtuvieron de colonias de abejas melíferas (Apis
mellifera L.), proporcionadas por un distribuidor local de productos apícolas (Coatepec,
27 6.2 Extracción de proteínas de jalea real
La extracción de proteínas de la jalea real se realizó siguiendo la metodología descrita por Nozaki et al., 2012, con ligeras modificaciones. Las muestras se disolvieron en agua Milli-Q a una proporción 1:1 y se centrifugaron a 113.400 g durante 1 hora a 4 °C. El sobrenadante obtenido tenía dos capas que contenían las proteínas de jalea real (MRJP1, MRJP2 y MRJP3). Este sobrenadante se liofilizó y se almacenó a - 80 ° C hasta su análisis.
Otro detalle es que no utilizaron inhibidores de proteasa. No tengo idea de la estabilidad de las proteinas de miel
6.3 Propiedades fisicoquímicas
6.3.1 Humedad
La humedad se determinó de acuerdo con el método de la AOAC (2007). Donde 5 g de la muestra se colocaron en crisoles de porcelana llevados previamente a peso constante en una estufa de secado por convección a 100-110 °C. Las muestras se secaron durante 48 h. La cuantificación se realizó mediante la siguiente ecuación:
% Humedad = Peso de muestra húmeda−Peso de muestra seca Peso de muestra húmeda x 100
6.3.2 Actividad de agua
La actividad de agua (Aw) se midió a través de un equipo AquaLab Serie 4. La medición se realizó por cuadriplicado.
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6.3.3 Proteína
El contenido de proteína en las muestras de jalea real se determinó por el método del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.), usando albúmina de suero bovino (BSA) como proteína estándar. Posteriormente, la muestra (25 μL) fue mezclada con 200 μL del reactivo BCA, se incubó a 37°C por 30 minutos y después se midió la absorbancia a 560 nm en un lector de microplaca (BioTek® Synergy HT KC4, Winooski, Vermont, EE.UU.). Para crear la curva de calibración (125-2000 μg/mL) se usó BSA (Sigma-Aldrich, EE.UU.). Los experimentos se realizaron por triplicado.
6.3.4 Lípidos
La determinación del contenido de lípidos se realizó mediante una extracción semicontinua con hexano por el método de Soxhlet (960.39. AOAC, 1990). Se pesaron 2 g de jalea real en papel filtro, se colocaron en cartuchos de celulosa y se introdujeron en el extractor. El disolvente se calentó, se volatilizó y se condensó goteando sobre la muestra, la cual quedó sumergida en el solvente que posteriormente fue sifoneado al matraz, este proceso se repitió durante 5 h. Finalmente en el matraz de calentamiento se acumularon los lípidos de la muestra junto con el hexano, el cual se recuperó por evaporación en un rota vapor (Heidolph, Laborata, 4001, Alemania) y el contenido de lípidos de la muestra se cuantificó por diferencia de peso del matraz de calentamiento.
6.3.5 pH
El pH de las muestras se determinó de acuerdo al método 943.02 de la AOAC (1990). Se pesó 1 g de muestra en un matraz Erlenmeyer y se añadieron 10 mL de agua Milli-Q, posteriormente se mezclaron con un agitador magnético hasta que las partículas quedaron uniformemente suspendidas, se medió el pH utilizando un potenciómetro (HANNA EDGE® HI2020-01, EE.UU.) estandarizado con soluciones buffer de pH 4.01 y 7.01, ambas a 25 °C.
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6.3.6 Determinación de cenizas
La determinación de cenizas se realizó utilizando el método 923.03 de la AOAC (1990). Se pesó 1 gramo de jalea real en un crisol que previamente fue llevado a peso constante. Las muestras se calcinaron lentamente en una parrilla hasta que ya no desprendieron humo y se tornaron de color negro. Posteriormente se colocaron en la mufla para terminar de calcinar a 550 °C hasta que las muestras se tornaron de color gris claro y alcanzaron un peso constante. Las muestras se enfriaron en un desecador y se pesaron cuando alcanzaron la temperatura ambiente.
Se calculó el porcentaje de cenizas con la siguiente fórmula:
% 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 = (𝑃 − 𝑝)𝑥 100 𝑀 Donde:
P= Masa del crisol con las cenizas en gramos p= Masa del crisol vacío en gramos
M= Masa de la muestra en gramos
6.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS- PAGE)
La electroforesis (PAGE-SDS) se llevó a cabo de acuerdo a la metodología descrita por López-Barrios et al. (2018), utilizando un Mini-PROTEAN® Tetra cell (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE.UU.). Se usaron geles al 10% de poliacrilamida (pH 8.8). Las muestras (1 mg de proteína/mL) se disolvieron en solución amortiguadora 2X (tampón de muestra de Laemmli) y se cargaron en los geles (10 μL por carril), incluyendo el marcador de peso molecular (Precision Plus Protein Standards All Blue, Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y la separación electroforética se llevó a cabo a 110 V. Los geles se tiñeron con azul Coomassie Bio-Safe G-250 (Bio-Rad). Las bandas de proteínas fueron identificadas con el software GelAnalyzer™ 2010a.
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6.5 Simulación de la digestión gastrointestinal in vitro de las proteínas de jalea real
6.5.1 Fase oral
El concentrado de proteína de jalea real (2.5 g en 2.5 mL de agua destilada) se diluyó en una proporción de 1:1 (p:v) en fluido salival simulado (SSF) se añadió CaCl2, y se agitó a 150 rpm a 37ºC durante 2 minutos (Cuadro A1). Al final del proceso se tomó una alícuota de 1 mL y se almacenó a -20 ºC para futuros análisis.
6.5.2 Fase gástrica
La muestra se diluyó en una proporción 1:1 (p:v) en fluido gástrico simulado (SGF) que contenía pepsina de mucosa gástrica porcina y CaCl2, se ajustó el pH a 3.0 con la adición de HCl 5 M, y se agitó a 150 rpm a 37ºC durante 2 horas. Durante el proceso se retiraron alícuotas a los 60 y 120 minutos, se ajustó a pH 7.5 adicionando NaHCO3 1M para inactivar la enzima y se almacenó a -20°C para su posterior análisis.
6.5.3 Fase duodenal
Los digeridos gástricos (pH 3.0) se ajustaron a pH 7 por la adición de NaHCO3, se mantuvo la temperatura a 37°C y se le agregaron 6 mL de fluido duodenal simulado (SDF) 1M, que contenía pancreatina porcina, sales biliares (mezcla equimolar de glicocolato de sodio y taurocolato de sodio) y 12 µL de CaCl2 (58.8 g/L). Se agitó a 150 rpm a 37ºC durante 2 horas. Durante el proceso se retiraron alícuotas a los 60 y 120 minutos. Posteriormente, la digestión se detuvo agregando 1.6 mL del inhibidor de proteasas Pefabloc® SC (5 mM, Sigma-Aldrich). Las muestras se almacenaron a -20°C hasta su análisis.
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Todos los fluidos simulados (Cuadro A1), previo a su uso se ajustaron a 37 °C. La digestión se realizó por duplicado incubando a 37 °C en un agitador orbital a 150 rpm. Se preparó un blanco de digestión con una mezcla de enzimas usadas en las digestiones a la misma concentración sin la proteína sustrato. Las enzimas y los reactivos usados en el proceso de la digestión gastrointestinal fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Las diferentes actividades enzimáticas, la proporción y la concentración del material que se usaron en la simulación de la digestión fueron de acuerdo con el protocolo descrito por (Minekus et al., 2014).
6.6 Identificación de péptidos obtenidos durante la digestion gastrointestinal in vitro de proteínas de jalea real mediante nanoLC -MS/MS
Las muestras fueron procesadas utilizando un sistema nano UltiMate 3000 RSLC (Dionex, Sunnyvale, CA) acoplado a un espectrómetro de masa Orbitrap FusionTM TribidTM (Thermo-Fisher Scientific, San José, CA) conteniendo una fuente de ionización EASY spray. Cada muestra fue reconstituida con 5 μl de una solución de 0.1% ácido fórmico e inyectada a una precolumna C18 trap (3 µm, 75 µm X 2 cm, Dionex) utilizando un flujo de 3 μl min-1 y posteriormente separada en una columna nano EASY spray RSLC (2 µm, 75 µm x 25 cm) utilizando un flujo de 300 μl min-1 durante 100 min. Se utilizaron 0.1 % ácido fórmico como solvente A y 0.1 % ácido fórmico en 90% acetonitrilo como solvente B. El gradiente de elución se estableció como es indicado a continuación: Solvente A por 10 min, solvente B 7-20% en 25 min, solvente B 20% por 15 min, solvente B 20-25% por 15 min, solvente B 25-95% por 20 min, y solventa A por 8 min. El espectrómetro de masa se operó en modo positivo y el nanospray se utilizó con un voltaje de 3.5 kV y la temperatura de la fuente de ionización se programó a 280°C. Los calibrantes externos utilizados fueron cafeína, Met-Arg-Phe-Ala (MRFA) y Ultramark 1621.
Análisis MS/MS dirigido mediante árbol de decisiones (CID y HCD)
El espectrómetro de masa se operó en modo de dato-dependiente y programado automáticamente para cambiar entre el análisis MS y MS/MS. El barrido completo de
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espectros de masa (MS) fue adquirido con el analizador Orbitrap, el rango de barrido de masa fue de 350-1500 m/z a una resolución de 120,000 (FWHM), utilizando un control automático de obtención de 4.0e5 iones, tiempo de inyección máximo de 50 ms, exclusión dinámica de 1 a 60 s y tolerancia de masa de 10 ppm. Posteriormente una velocidad de 3 s para la velocidad de barrido en el análisis dirigido por árbol de decisiones que consiste en la disociación inducida por colisión (por sus siglas en inglés “CID”) y disociación por colisión con alta energía (por sus siglas en inglés “HCD”), utilizando el analizador Orbitrap. El umbral de señal para inducir un evento MS/MS fue de 1.0e4 y la colisión de energía normalizada de 30 y 30 % para CID y HCD, respectivamente. Para las fragmentaciones se programó un control automático de obtención de 3.0e4 iones y una ventana de aislamiento de 1.6 m/z. Adicionalmente, los parámetros de CID comprendieron un Q de 0.25 ms y un tiempo de inyección de 50 ms, para HCD se estableció la primera masa como 100 m/z y un tiempo de inyección de 50 ms. La programación para en análisis dirigido por árbol de decisiones se llevó a cabo como es descrito a continuación: Para CID los estados de carga de fragmentación 2 o 3 con un rango de barrido de 620-1600 m/z, estado de carga de fragmentación 4 con un rango de barrido de 800-1600 m/z y estado de carga 5 con un rango de barrido de 900-1600 m/z y para HCD los estados de carga de fragmentación 2 o 3 con un rango de barrido de 600-1600 m/z. Todos los datos fueron adquiridos con el programa Xcalibur 4.0.27.10 (Thermo-Fisher Scientific).
Los datos espectrales de m/z se procesaron y se transformaron a valores de masa utilizando el programa Proteome DiscovererTM Para identificar las secuencias de los péptidos y llevar a cabo la secuenciación se emplearon los motores de búsqueda MASCOT, SEQUEST y AMANDA. Para el análisis de glicopeptidos se utilizó el programa ByonicTM (Protein Metrix). Se utilizo, el proteomea de referencia de Apis mellifera (https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005203) para la generarción de espectros teoricos.
33 6.7 Determinación de la actividad antioxidante
6.7.1 Capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC)
La capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC) se realizó de acuerdo a la metodología descrita por Ou et al., 2001 con pequeñas modificaciones. Este ensayo evalúa la oxidación de un compuesto fluorescente (fluoresceína) en presencia de un agente oxidante (AAPH). El método mide la disminución de fluorescencia debido a la acción de los radicales peroxilos, y se compara con una curva de Trolox a distintas concentraciones, la cinética de la reacción entre la fluoresceína y el AAPH es medida por un lector de microplaca (BioTek® Synergy HT KC4, Winooski, Vermont, EE.UU) cada dos minutos durante 1.5 h y se calcula el área bajo la curva (AUC); el resultado se expresa en micromoles equivalentes de Trolox por cada gramo de muestra seca. Se utilizó una microplaca negra de 96 pocillos, en la cual se colocaron 300 μL de agua en las columnas 1 y 12, así como en las filas A y H. En la fila B se colocó PBS por triplicado y en las filas C,D,E,F y G se colocó la curva de Trolox a distintas concentraciones también por triplicado, en el resto de los pocillos de colocaron las proteínas digeridas a distintas concentraciones.
De acuerdo a la ecuación de la recta obtenida (A, se calcularon los valores obtenidos y el resultado fue expresado en μMET/g en base seca.
34 Donde: A= Agua B= PBS T= Trolox M= Muestra 6.7.2 DPPH
La actividad antioxidante se determinó de acuerdo a la metodología descrita por Brand-Williams et al. 1995. Brevemente, se utilizaron 100 μL de la muestra y 2.9 mL del reactivo de 2,2-diefenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), se dejó reposar durante 30 min en la oscuridad y a temperatura ambiente. Posteriormente, se midió la absorbancia a 517 nm en un espectrofotómetro (Shimadzu UV-1800, Kyoto, Japan). La actividad antioxidante se expresó en mmol ETrolox por gramo de muestra en peso seco (mmol ETrolox/g-1 bs).
6.8 Ensayo de citotoxicidad y viabilidad celular de células Caco-2
La línea celular Caco-2 procedente de adenocarcinoma colorrectal humano se obtuvo de la colección de cultivos tipo americano (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). Las células se sembraron en medio Dulbecco’s modified Eagle (DMEM, Sigma Chemical), suplementadas con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS, BioWest, Nuaillé, Francia), 1% de solución (v/v) de penicilina/estreptomicina/anfotericina B (BioWest), y suplementado
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con 1% (v/v) de aminoácidos no esenciales (Lonza Group Ltd.). La línea celular se cultivó a 37oC en una atmósfera con un 5% de CO2 y 95% de humedad relativa. Para evaluar el efecto de los digeridos de proteínas de jalea real, sobre la viabilidad celular se empleó un ensayo colorimétrico CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay que es un método colorimétrico para determinar la cantidad de células viables en los ensayos de proliferación, citotoxicidad o quimiosensibilidad.
El reactivo CellTiter 96® AQueous One Solution contiene un compuesto de tetrazolio [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio, sal interna; MTS] y un reactivo de acoplamiento de electrones (fenazina etosulfato; PES). Las células Caco-2 se sembraron en placas de 96 pocillos (VWR International, Radnor, PA, EE.UU.) a una densidad de 7 × 104 células/cm2, y se incubaron durante 24 horas. Tras este tiempo, se añadieron los digeridos obtenidos al final de la digestión gastrointestinal a diferentes concentraciones y las células fueron incubadas durante 24 horas más. El ensayo se realizó agregando 20 µL del reactivo CellTiter 96® AQueous One Solution directamente a los pocillos de cultivo, incubando durante 1 hora y luego registrando la absorbancia a 490 nm con un lector de microplacas (BioTek® Synergy HT KC4, Winooski, Vermont, EE.UU.). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los resultados se expresaron como porcentaje de células viables en comparación con el control, considerado como 100%.
6.9 Análisis estadístico
Las variables de respuesta fueron analizadas utilizando estadística descriptiva y Modelos Lineales Generalizados (MLG), para diseños bifactoriales, además se verificaron los supuestos de las pruebas (Zar, 1996). Los resultados se expresan como promedios ± su desviación estándar, considerando un valor de α=0.05 y el paquete estadístico que se utilizó fue Statistica 11 Stat, Inc 1984.
