Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey
Campus Monterrey
Escuela de Ingeniería y Ciencias
Design and characterization of a biosensor for the detection of aminoglycoside compounds with codon-readthrough activity.
Tesis presentada por
Luisa María Trejo Alarcón
sometida a la
Escuela de Ingeniería y Ciencias
como un requisito parcial para obtener el grado académico de
Maestro en Ciencias
con especialidad en Biotecnología
Monterrey Nuevo León, 02 de diciembre de 2020
III
Dedicatoria
Para todas aquellas personas que han tenido el valor de perseguir sus sueños a pesar de las dificultades, que no se han rendido y siguen adelante…
A veces decimos que la vida no es justa; pero quizá si lo es, porque todo lo que vivimos nos hace crecer y nos prepara para mostrarle al mundo una mejor versión
de nosotros mismos. Crean en ustedes, no desistan y confíen en que siempre habrá ángeles acompañándonos y guiándonos en el camino…
IV
Reconocimientos
A mi madre Carolina Alarcón, porque tu fuerza y amor me han dirigido por la vida.
Porque me regalaste unas alas enormes y me enseñaste a volar muy alto, impulsándome a llegar al lugar donde se hacen realidad los sueños.
A mi abuela Rosario González, por ser mi mamá canguro. Tus palabras guían mis pasos y tu amor ilumina mi camino.
A mi abuelo Sergio Alarcón, por inculcarme esa pasión por cuestionarme todo lo que me rodea.
A mi hermano Ulises Trejo, por los momentos de diversión y relajación que me regalaste.
A Axel Alejandro, mi amigo, compañero de aventuras y mi gran amor. Infinitas gracias por ser mi mano derecha y por tu apoyo incondicional, por ser mi guía cada día al despertar. Sin ti, el desarrollo de este trabajo definitivamente no habría sido posible.
A mis amigas y amigos; Sara, July, Luz, Erika, Ulises y Gustavo por siempre estar ahí para mí, por escucharme y aconsejarme, por acompañarme cuando más lo necesité.
Por ser mi segunda familia.
A mi ángel que me acompaña desde el cielo, por enseñarme a no rendirme a pesar de las dificultades. Gracias Chiqui por regalarme el amor más puro que puede existir y por seguir caminando y desvelándote conmigo, aunque no te pueda ver.
A Magno, perrito hermoso, por tu cariño incondicional. Eres de mis fuentes más grandes de inspiración.
A Héctor Castañeda, por su amistad sincera, el apoyo brindado y los conocimientos aportados para la realización de este proyecto.
A los miembros de Industrial Genomics Lab dirigido por el Dr. Cuauhtémoc Licona:
Luz, July, Héctor, Paulina, Lorena, David, Raúl, Constantino, Monserrat, Viridiana, Daniela, Mauricio y Caleb por todos los momentos de aprendizaje que hemos compartido juntos.
V
Al Dr. Pablo Cruz por confiar en mí, compartirme su conocimiento y guiarme en uno de los puntos claves de mi desarrollo profesional y personal. Por las aportaciones valiosas a este proyecto.
A los miembros de mi comité: Dr José Utrilla y Dr. José Manuel Aguilar, por tomarse el tiempo de leer este trabajo y mejorarlo con sus acertados comentarios.
Con especial reconocimiento al Dr. Cuauhtémoc Licona, director de esta tesis, por todo el apoyo brindado, los consejos, la paciencia y, sobre todo, por permitirme ser parte de su grupo de investigación y mostrarme lo maravilloso que es el camino de la investigación. Porque gracias a él, el desarrollo de este proyecto y mi crecimiento profesional fueron posibles.
Al Tecnológico de Monterrey y al Centro de Biotecnología FEMSA por abrirme las puertas del plantel, confiar en mí y brindarme una beca de colegiatura del 100%, lo que me permitió llevar a cabo este proyecto de maestría.
Al Joint BioEnergy Institute por recibirme en sus instalaciones, permitiéndome descubrir que la Ciencia no tiene fronteras.
A StrainBiotech por el financiamiento parcial brindado para la realización de mi estancia en el Joint BioEnergy Institute de la Universidad de California, Berkeley.
Al CONACyT y a UCMEXUS por el apoyo económico brindado para mi manutención y estancia internacional.
VI
Design and characterization of a biosensor for the detection of aminoglycoside compounds with codon-readthrough activity.
por
Luisa María Trejo Alarcón
Resumen
Las enfermedades raras o huérfanas se presentan en 5 de cada 10,000 individuos y son atribuidas en su gran mayoría a desordenes genéticos (80%); mientras que el resto son cánceres poco frecuentes, malformaciones congénitas e infecciosas, enfermedades autoinmunitarias y metabólicas; las cuales representan un problema de salud mundial ya que, al ser tan diversas entre sí, el desarrollo de fármacos para su tratamiento es escaso (solo el 5% tienen tratamiento) y aproximadamente 350 millones de la población mundial presenta afecciones de este tipo. La Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) entra dentro de esta clasificación, al ser una enfermedad genética hereditaria, que produce un codón prematuro de terminación (PTC) en el gen que codifica para la producción de la proteína distrofina; en los años 1990s se descubrió que los aminoglucósidos (AGs) tienen potencial terapéutico para este tipo de enfermedades, ya que propician el fenómeno conocido como codon-readthrough (CR), provocando la restauración del gen afectado; sin embargo, su uso durante largos periodos de tiempo provoca ototoxicidad y nefrotoxicidad. Debido a lo anterior surgió la necesidad de descubrir nuevos productos naturales con actividad de aminoglucósido, provenientes principalmente de Actinomicetos. Actualmente las estrategias de detección de nuevos metabolitos comprenden el aislamiento, cultivo y extracción utilizando diferentes medios de cultivo; métodos de screening para detectar su bioactividad y el uso de herramientas bioinformáticas para la identificación de clusters de genes de biosíntesis (BGCs); sin embargo son procesos muy largos, costosos y carecen de especificidad al no estar encaminados a la detección de procesos celulares especializados; por lo que la industria farmacéutica ha dejado de invertir en su investigación y desarrollo. El presente trabajo describe a detalle el desarrollo un sistema de screening eficiente y mejorado con respecto a los a existentes, para la detección de moléculas con actividad de aminoglucósidos basado en CR; mediante la generación de un biosensor dentro de la levadura Saccharomyces cerevisiae utilizando un arreglo de biología sintética compuesto por los genes reporteros de crecimiento URA3 y luminiscencia Nluc.
VII
Lista de Figuras
Figura 1.1 Fármacos en desarrollo para enfermedades raras ... 2
Figura 1.2 Estructura química de la gentamicina ... 6
Figura 1.3 Clasificación de AGs con base en las sustituciones en el residuo aminociclitol 6 Figura 1.4 CR inducido por AGs ... 8
Figura 1.5 Estructura secundaria de la hélice h44 de los ribosomas en organismos procariotas y eucariotas. ... 10
Figura 1.6 Interacción de los AGs con el ribosoma. ... 10
Figura 1.7 Cronología de descubrimiento y desarrollo de fármacos ... 15
Figura 1.8 Estrategias recientes aplicadas al descubrimiento de Productos Naturales NPs ... 18
Figura 4.1 Mapa del vector de episomal de levaduras pESC-His ... 27
Figura 4.2 Mapa del vector pCEV-SUPs ... 35
Figura 5.1 Casete de expresión URA3*-Nluc ... 47
Figura 5.2 Mapa del sistema de detección pSUN-TGAU* ... 48
Figura 5.3 Amplificación de los genes SUP45 y SUP35 ... 49
Figura 5.4 Comprobación de la construcción pCEV-SUPs por enzimas de restricción ... 50
Figura 5.5 Comprobación de las secuencias Kozak, SUP45, ERBV-1 y SUP35 por PCR. ... 52
Figura 5.6 Ligación del fragmento SUPs al vector pSUN-TGAU* ... 53
Figura 5.7 Mapa del sistema de detección pSUN-SUPs-TGAU* ... 53
Figura 5.8 PCR de colonia para comprobar la inserción de los genes SUPs en el vector pSUN-TGAU* en E.coli ... 54
Figura 5.9 Comprobación de la construcción pSUN-SUPs-TGAU* por enzimas de restricción ... 55
Figura 5.10 Cinética de crecimiento del biosensor pSUN-SUPs-TGAU* en S.cerevisiae . 58 Figura 5.11 Cinética de crecimiento y de luminiscencia del biosensor pSUN-SUPs-TGAU* en S.cerevisiae. ... 60
Figura 5.12 Luminiscencia generada por el biosensor pSUN-SUPs-TGAU* contra la concentración celular S.cerevisiae, en presencia de G418 ... 60
Figura 5.13 Luminiscencia generada por el biosensor pSUN-SUPs-TGAU* contra la concentración celular de S.cerevisiae, atribuida a CR basal. ... 61
VIII
Lista de Tablas
Tabla 1.1 Principales AGs producidos por Actinobacterias ... 13
Tabla 2.1 Sistemas de screening para codones prematuros de terminación mediadores de enfermedades genéticas ... 22
Tabla 4.1 Características del vector episomal de levaduras pESC-His ... 27
Tabla 4.2 Secuencia y función de los oligos utilizados para la amplificación y comprobación de las secuencias utilizadas para la generación de los vectores de expresión ... 30
Tabla 4.3 Condiciones de termociclado para la amplificación de SUP45 mediante PCR touchdown ... 31
Tabla 4.4Condiciones de termociclado para la amplificación de SUP35 mediante PCR touchdown ... 32
Tabla 4.5 Condiciones de termociclado para la amplificación de SUP45 y SUP35 modificados ... 33
Tabla 4.6 Condiciones de la reacción de ligación para obtener el plásmido pCEV-SUPs 34 Tabla 4.7 Condiciones de termociclado para la comprobación del correcto armado del plásmido pCEV-SUPs ... 36
Tabla 4.8 Condiciones de la reacción de ligación para obtener el sistema de expresión pSUN-SUPs-TGAU* ... 38
Tabla 4.9 Condiciones de termociclado para la PCR de colonia para verificar el correcto armado del plásmido pSUN-SUPs-TGAU* ... 39
Tabla 4.10 Secuencia y función de los oligos utilizados para la mutagénesis dirigida que permitió la generación de los diferentes sistemas de expresión ... 40
Tabla 4.11 Condiciones de termociclado para llevar a cabo mutagénesis dirigida ... 41
Tabla 4.12 Oligos utilizados para secuenciar los diferentes sistemas de expresión ... 43
Tabla 5.1 Características del casete de expresión URA3*-nluc ... 47
Tabla 5.2 Vectores pSUN… ... 56
Tabla 5.3 Vectores pSUN-SUPs. ... 57
Tabla A.1 Lista de abreviaturas ... 71
IX
Contenido
Resumen ... VI Lista de Figuras ... VII Lista de Tablas ... VIII
1. Introduction ... 1
1.1 Enfermedades raras o huérfanas ... 1
1.1.1. Enfermedades raras cuyo origen es un desorden genético ... 3
1.2 ¿Qué son los aminoglucósidos? ... 5
1.2.1 Uso e importancia ... 7
1.2.2 Mecanismo de acción en eucariotas: Codon-readthrough (CR)... 7
1.2.3 Efectos tóxicos y alternativas ... 11
1.3 Proceso de generación de nuevos productos naturales (NPs) ... 13
1.3.1 Estrategias aplicadas al descubrimiento de NPs ... 15
2. Marco teórico ... 19
2.1 Sistemas de detección duales para CR en enfermedades genéticas ... 19
2.2 Sistemas de detección para monitorear CR ... 19
2.2.1 Basal ... 19
2.2.2 CR Inducido químicamente ... 21
3. Objetivos e hipótesis ... 24
3.1. Objetivo General ... 24
3.1.1 Objetivos Específicos ... 24
3.2 Hipótesis ... 25
4. Metodología ... 26
4.1 Organismo y cepa ... 26
4.2 Esqueleto del casete de expresión: pESC-His ... 26
X
4.3 Diseño y síntesis del biosensor pSUN-TGAU* ... 28
4.4 Verificación de la síntesis del biosensor pSUN-TGAU* ... 29
4.5 Clonación de los genes SUP45 y SUP35 en pCEV ... 29
4.5.1 Obtención de DNA genómico ... 29
4.5.2 Amplificación ... 30
4.5.3 Adición de secuencias complementarias: Kozak, sitios de restricción y secuencia 2A ... 32
4.5.4 Armado del vector pCEV-SUPs y su transformación en E.coli ... 33
4.5.5 Comprobación por enzimas de restricción ... 36
4.5.6 Comprobación por PCR ... 36
4.6 Clonación de los genes SUP45 y SUP35 en pSUN-TGAU* ... 37
4.6.1 Armado del biosensor pSUN-SUPs-TGAU* y su transformación en E.coli .. 37
4.6.2 Comprobación por PCR ... 38
4.6.3 Comprobación por enzimas de restricción ... 39
4.7 Generación de sistemas de expresión con diferentes codones de paro en diferentes posiciones del casete ... 39
4.7.1 Mutagénesis ... 39
4.7.2 Transformación de E.coli ... 42
4.7.3 Secuenciación ... 42
4.8 Transformación de S. cerevisiae CEN.PK2-1C ... 43
4.9 Ensayo para identificar actividad CR ... 44
4.9.1 Crecimiento ... 44
4.9.2 Luminiscencia ... 45
4.10 Métodos analíticos ... 46
5. Resultados ... 47
5.1 Síntesis del casete de expresión URA3*-Nluc ... 47
5.2 Sistema de biosensado pSUN-TGAU* ... 48
XI
5.3.1 Amplificación de los genes SUP45 y SUP35 ... 49
5.4 Sistema de biosensado pSUN-SUPs-TGAU* ... 52
5.4.1 Comprobación de la construcción por PCR ... 54
5.5 Generación de los sistemas de detección pSUN y pSUN-SUPs ... 55
5.6.1 Cinética de crecimiento ... 58
5.6.2 Luminiscencia ... 59
6. Discusión de resultados ... 62
7. Conclusiones ... 69
Apéndice A ... 71
Bibliografía ... 72
Curriculum Vitae ... 83
Capítulo 1
1. Introduction
1.1 Enfermedades raras o huérfanas
Las enfermedades huérfanas o raras, consideradas de esta manera ya que las padece un pequeño porcentaje de la población, son padecimientos relacionados en un 80% con anomalías genéticas que pueden llegar a ser hereditarias. El otro 20%, son cánceres poco frecuentes, malformaciones congénitas o infecciosas, enfermedades autoinmunitarias y metabólicas (WHO, 2019). Debido a su baja frecuencia, el público en general desconoce su existencia e incidencia;
sin embargo, son un problema de salud mundial ya que presentan altas tasas de mortalidad provocando deficiencias motoras, cognitivas y sensoriales (Field & Boat, 2010).
El concepto de enfermedades raras o huérfanas surgió a mediados de los 80s en Estados Unidos de América (EUA) por la necesidad de clasificar a las enfermedades de baja prevalencia e incidencia, aunado al término “drogas huérfanas” que se les acuñó a todos aquellos medicamentos utilizados para tratar o curar este tipo de enfermedades, ya que, debido a su poca demanda para las industrias farmacéuticas es poco rentable su producción sin apoyos gubernamentales (FDA, 2020a). De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (WHO, 2019), para ser considerada una enfermedad rara, debe presentarse en 5 de cada 10,000 individuos; no obstante, esto puede variar de población a población dependiendo del área geográfica. En EUA, se consideran enfermedades raras a aquellas que afectan a menos de 200,000 americanos (FDA, 2020b) lo que equivale a un total de aproximadamente 30 millones de casos; en la Unión Europea (UE) cuando afectan a 1 de cada 50,000 habitantes (Public Health - European Commission, 2020), lo que se traduce igualmente a 30 millones de personas afectadas. Se estima que al menos 7% de la población mexicana padece alguna de estas enfermedades, lo que significa 8 millones de habitantes. Mientras que, a nivel global, 350 millones de personas aproximadamente sufren una enfermedad rara (WHO, 2019).
Capítulo 1. Introducción
2
Se ha reportado que un 50% de estos padecimientos son detectadas en la edad pediátrica, siendo la causa de muerte de los niños que las padecen en un 65% (30% antes de los 5 años y 35% antes del año de edad). Debido a lo anterior, la mayor prevalencia se da en adultos.
En México se conocen 20 enfermedades raras, entre las que se encuentran la Fibrosis Quística (CF, por sus siglas en inglés), la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD, por sus siglas en inglés), Hemofilia, Hipotiroidismo Congénito, Síndrome de Turner, Espina Bífida, Enfermedad de Pompe, Histiocitosis, Galactosemia, Fenilcetonuria, Enfermedad de Gaucher Tipo 1, 2 y 3, Hiperplasia Suprarrenal Congénita, Enfermedad de Fabry, Homocistinuria, entre otras; siendo las primeras dos las más conocidas (Rivera-Silva et al., 2018). Sin embargo, de acuerdo con la Oficina de Investigación de Enfermedades Raras de los Institutos Nacionales de Salud en EUA, se estima que existen más de 7,000 enfermedades genéticas distintas que afectan del 6 al 8% de la población humana (National Institutes of Health (NIH), 2020).
Debido a lo anterior, la industria Biofarmacéutica ha realizado trabajos de investigación en vista de realizar adelantos en el desarrollo de medicamentos que permitan combatir enfermedades huérfanas. Dichos esfuerzos han dado como resultado el contar al día de hoy con más de 770 moléculas aprobadas por la Administración de Medicamentos y Alimentos (FDA) y 560 más en proceso (Genetic and Rare Diseases Information Center (GARD), 2020; FDA, 2020a). Sin embargo, el trayecto aún es largo, ya que todas estas medicinas están enfocadas solamente en un 5% del total de enfermedades raras, la mayoría se encuentran dirigidas a Cáncer y desordenes genéticos (PhRMA, 2020) , como se muestra en la Figura 1.1.
Figura 1.1 Fármacos en desarrollo para enfermedades raras. Adaptado de (PhRMA, 2020).
Capítulo 1. Introducción
3
Sin embargo, el avance en el desarrollo de fármacos dirigidos a estos padecimientos, se encuentra con ciertas barreras tanto operacionales como científicas, dentro de las que podemos mencionar la complejidad biológica que existe en cada una de estas enfermedades, dando origen a diversos subtipos. Otro obstáculo es la densidad demográfica de individuos que padecen esta enfermedad, lo que ocasiona dificultades específicamente en la etapa de pruebas clínicas (PhRMA, 2020).
A pesar de estas situaciones desfavorables, la industria biofarmacéutica ha logrado proveer avances en la tecnología y el entendimiento científico de estas enfermedades, dentro de estos logros podemos resaltar los siguientes (FDA, 2020b):
• Desarrollo del primer tratamiento para combatir la fibrosis quística.
• Terapias dirigidas al tratamiento de cáncer en sangre (Leucemia linfocítica crónica, Leucemia mielógena crónica y mieloma múltiple).
• Medicamentos preventivos o retardantes dirigidos a hipertensión arterial pulmonar, angioedema y la enfermedad de Gaucher.
• Terapías pioneras en el tratamiento de enfermedades pediátricas como: Hipofosfatemia, deficiencia de la enzima lisosomal lipasa ácida, y neuroblastoma.
Más allá, nos topamos con el reto principal que se enfrenta el desarrollo de estos medicamentos, y es el económico. Si bien estos medicamentos tienen la capacidad de dar un giro total a la vida de los pacientes que padecen enfermedades huérfanas, el desarrollo de estos requiere de una fuerte inversión financiera (PhRMA, 2020); a pesar de esto, los gobiernos han hecho esfuerzos para dar la atención que estas enfermedades requieren.
1.1.1. Enfermedades raras cuyo origen es un desorden genético
Como se mencionó anteriormente, el 80% de las enfermedades raras tienen un origen genético.
El uso de nuevas tecnologías como la secuenciación de próxima generación (NGS, por sus siglas en inglés), han permitido la detección de las mutaciones causantes en los genes afectados por este tipo de enfermedades. De acuerdo con reportes realizados por la OMS (WHO, 2019), se han detectado 3 tipos:
Capítulo 1. Introducción
4
• Afectaciones en un solo gen, causadas principalmente por mutaciones puntales que provocan la aparición de codones prematuros de terminación (PTCs, por sus siglas en inglés) o inserciones de pares de bases que alteran el marco de lectura ribosómico, produciendo proteínas totalmente diferentes a las esperadas.
• Trastornos cromosómicos, en su mayoría relacionados con duplicaciones, deleciones y translocaciones.
• Mutaciones en 2 o más genes, causados principalmente por el ambiente en el que se desarrollan las personas y el estilo de vida que llevan.
Un estudio metagenómico realizado recientemente demostró que las mutaciones sin sentido; es decir, el cambio de un solo par de bases que provoca la aparición de un codón prematuro de terminación (PTC), son las responsables del 11% de las enfermedades raras existentes (Mort et al., 2008), de entre las que destacan la Fibrosis Quística (CF) y la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).
•
Fibrosis quística (CF)
La Fibrosis Quística (CF) es una enfermedad genética causada por mutaciones en el gen que codifica para el regulador de conductancia transmembrana de la CF (CFTR) que afecta la actividad del canal de cloruro activado por el cAMP, lo que provoca deficiencias en la secreción exocrina, que desencadenan en la producción de moco espeso y viscoso que bloquea las funciones de los pulmones, el hígado y el páncreas (Manfredi et al., 2019).
La supresión del gen CFTR es provocada por la deleción de un solo nucleótido del aminoácido fenilalanina (70% de los casos), mientras que el 5% de la población afectada presenta mutaciones puntuales en los cromosomas que desencadenan en un PTC, concretamente en el residuo glicina 542 (G542X) o en el residuo de arginina 553 (R553X), cuya principal característica es que aparecen cerca del sitio de unión a la proteína.
En 1996, se descubrió, mediante un ensayo in vitro, que el antibiótico G418 o geneticina (clasificado como aminoglucósido o AG) era capaz de restaurar un gen implicado en la CF. En este estudio se demostró que G418 pudo reestablecer la función del gen CFTR en un 35 y 25%
con respecto a los niveles expresados normalmente sin PTCs, para los residuos G542X y el
Capítulo 1. Introducción
5
R553X, respectivamente; después de 8-12 horas de incubación utilizando una concentración de 0,2 mg/mL (M. Howard et al., 1996).
•
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)
La DMD es una enfermedad ligada al cromosoma X que afecta principalmente a 1 de cada 3500 a 6000 hombres en el mundo. Es inducida por la falta de función de la proteína Distrofina, la cuál es causada por mutaciones puntuales (en el 60% de los casos); errores de splicing o PTCs que desencadenan una proteína trunca y por consiguiente la ausencia del gen DMD, produciendo el debilitamiento de las fibras musculares y daño por contracción muscular, terminando en falta de movilidad y en el peor de los casos la muerte por insuficiencia cardíaca (Emery et al., 2015).
Gracias al descubrimiento realizado en 1996 en el que fu posible la restauración del gen CFTR mediante el uso de antibióticos-aminoglucósidos; en 1999 se realizó otro estudio, en el que se demostró que la gentamicina (otro tipo de AG) puede suprimir codones de parada tanto in vitro como in vivo a partir de su aplicación en células de ratón para restablecer la función del gen de distrofina (DMD), implicado en la DMD. Los resultados de inmunoquímica e inmunotransferencia demostraron que la gentamicina puede restaurar la presencia y función del gen DMD en un 20%
cuando se administra por inyección a una concentración de 17mg/kg en dosis aplicadas cada 14 días (Barton-Davis et al., 1999).
Estos descubrimientos, abrieron la posibilidad de utilizar las estrategias encaminadas a la supresión de mutaciones sin sentido como posibles terapias para tratar las enfermedades raras, tal es el caso del uso del grupo de antibióticos que actúan a nivel ribosomal: los aminoglucósidos.
1.2 ¿Qué son los aminoglucósidos?
Los aminoglucósidos (AGs) son oligosacáridos con actividad antimicrobiana. La estructura de los AGs se compone de un número variable de anillos de azúcar sustituidos con grupos amonio e hidroxilo y una columna vertebral o molécula core, que es un residuo aminociclitol que se divide en tres categorías; (1) el anillo de 2-desoxiestreptamina, que puede estar disustituido en las posiciones 4, 5 (donde se encuentran clasificadas la neomicina y paromomicina) o 4, 6 (por ejemplo, kanamicina, amikacina y gentamicina), ver Figura 1.2; (2) el anillo de
Capítulo 1. Introducción
6
desoxiestreptamina monosustituido (apramicina); y (3) el anillo de estreptamina, donde se clasifica la estreptomicina (Krause et al., 2016; Wright et al.,1998). En la Figura 1.3 se muestran algunos de los aminoglucósidos conocidos actualmente y sus sustituciones.
Figura 1.2 Estructura química de la gentamicina. Residuo aminociclitol: anillo de 2-desoxiestrepatima (RII) disustituido en las posiciones 4 y 6 (mostrado en naranja). Los grupos y átomos se representan como círculos de color (verde, grupos amonio; azul, grupos hidroxilo y rojo, átomos de oxígeno). R: anillo.
Figura 1.3 Clasificación de AGs con base en las sustituciones en el residuo aminociclitol. Adaptado de (Garneau-Tsodikova & Labby, 2016).
Capítulo 1. Introducción
7
1.2.1 Uso e importancia
Los AGs son moléculas catiónicas, esta característica les permite ser utilizados para tratar infecciones bacterianas Gram-negativas, ya que se unen mediante interacción electrostática a los aminoácidos cargados negativamente presentes en la membrana externa de las bacterias y la rompen (Houghton et al., 2010). Una vez dentro de la célula, se adhieren al RNAr 16S, específicamente en el sitio A que pertenece a la subunidad 30S del ribosoma (la mayoría de los AG), matando a las bacterias mediante la inhibición de la síntesis de proteínas (Shakil et al., 2008). En los organismos eucariotas sucede algo diferente, debido a pequeños cambios en la secuencia de nucleótidos del RNAr, su interacción con los AGs se ve debilitada, por lo que no hay inhibición de la síntesis de proteínas (Prokhorova et al., 2017) como se menciona en detalle más adelante en el texto. Los AGs inducen un proceso conocido como codon-readthrough (CR), en el que los ribosomas no leen los PTCs, lo que da como resultado posibles tratamientos para ciertas enfermedades genéticas, como las mencionadas anteriormente (Dabrowski et al., 2018). También se ha comprobado que los AGs inhiben la propagación de virus, como el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH-1), al bloquear la unión de sus proteínas reguladoras (Wang et al., 1997) e igualmente, han presentado actividad antiviral frente a el virus de la influenza A, el virus del herpes simple (HSV) y el virus del Zika cuando se aplican tópicamente (Gopinath et al., 2018).
1.2.2 Mecanismo de acción en eucariotas: Codon-readthrough (CR)
En eucariotas, la producción de proteínas se lleva a cabo en la traducción cuando el sitio A del ribosoma reconoce un codón de paro (UGA, UAG o UAA) en el RNAm mediante la acción de un factor de liberación conocido como eRF1; que interactúa con eRF3 (otro factor de liberación).
Estos cuatro elementos forman un complejo y colaboran con PABP (la proteína de unión a la cola de poli As), lo que permite la liberación del péptido resultante en un proceso mediado por GTP (Bulygin et al., 2017).
Cuando el ribosoma encuentra un PTC, puede recodificarse en otro aminoácido mediante un proceso conocido como CR basal, mismo que se lleva a cabo debido al a presencia de tRNAs cercanos, que son casi afines (nc-tRNA, por sus siglas en inglés) al anticodón al que se unen,
Capítulo 1. Introducción
8
complementándose con dos de las tres bases del PTC en las posiciones 1, 2 o 2, 3; compitiendo con los factores de liberación (eRF1 y eRF3), lo que permite que el proceso de traducción continúe (Dabrowski et al., 2015). La probabilidad de que esto suceda depende del tipo de codón de terminación, el orden de reconocimiento por los nc-tRNAs es UGA> UAG> UAA y puede ocurrir en un rango de 0.01% hasta 1% en el procesos de transcripción (Manuvakhova et al., 2000).
Por otro lado, una gran cantidad de estudios han demostrado que el proceso de CR puede inducirse mediante el uso de fármacos, siendo los AGs las moléculas más estudiadas, ya que tienen la capacidad de generar proteínas de longitud completa, como se mencionó anteriormente.
En la Figura 1.4, se muestra el fenómeno de CR en presencia y ausencia de AG, lo cual provoca la restauración de la expresión de proteínas que contienen PTCs.
Figura 1.4 CR inducido por AGs. A) En presencia de un AG. Si el ribosoma encuentra un PTC, lo codifica en otro aminoácido. Un nc-tRNA se complementa con dos de las tres bases del PTC en las posiciones 1, 2 o 2, 3; compitiendo de esta manera con los factores de liberación eRF1 y eRF3 a través del efecto de la unión AG-h44, que monitorea la adecuada interacción codón-anticodón permitiendo que continúe el proceso de traducción, cuya eficiencia depende del AG y su concentración. B) En ausencia de AG. El ribosoma lee el PTC causado por mutaciones sin sentido, lo que resulta en proteínas truncadas en la mayoría de los casos. AG: aminoglucósido, PTC: codón prematuro de terminación; CR: codon- readthrough; nc-tRNA: tRNA análogo cercano.
Capítulo 1. Introducción
9
•
Interacción con el ribosoma
Algunos estudios que utilizan cristalografía de rayos X y análisis FRET de molécula única han confirmado la interacción ribosoma-aminoglucósido en organismos procariotas y eucariotas, mismos que parecen ser muy similares; sin embargo, algunos cambios en sus respectivos residuos producen efectos diferentes, por lo que los organismos eucariotas presentan resistencia a este tipo de fármacos.
En la subunidad pequeña de ambos tipos de ribosomas, específicamente en el surco mayor de la subunidad pequeña del rRNA 16S y 18S respectivamente, hay un bucle conocido como hélice 44 (h44) que se encarga de verificar la interacción entre el codón anti- codón durante el proceso de traducción, siendo el lugar donde interactúan los anillos I y II de los AGs (Ogle et al., 2001;
Prokhorova et al., 2017)
En el caso de los microorganismos procariotas, el residuo A1408 forma enlaces de hidrógeno con los grupos NH2 u OH de la posición 6’en el anillo I y tiene lugar una pseudo-interacción con las pares de bases del codón de paro causada por un cambio conformacional que provoca el salto de h44. Luego, otro residuo, G1491, estabiliza esta pseudo-interacción, lo que hace que el ribosoma sea más propenso a errores de lectura, incluido un bloqueo total del proceso de traducción y, por lo tanto, la muerte del organismo (Ogle et al., 2001).
El sitio de decodificación en organismos eucariotas interactúa de manera similar con los AGs; sin embargo, hay un cambio en los residuos G1645 y A1754 (se muestran en rojo en la Figura 1.5);
esto contribuye a la resistencia de estos organismos a los AGs y, en consecuencia, a la inducción de CR por la selección de tRNA casi afínes (nc-tRNA) que mejor se ajustan, los cuales son insertados en la posición del PTC y finalmente se leen como un codón con sentido (es decir, no como un PTC). Como se ejemplifica en la Figura 1.6, el PTC UGA cuyo anti-codón es ACU, es transportado por su respectivo tRNA; sin embargo, este es reemplazado por su casi análogo tRNA ACC para hacer que el ribosoma traduzca el aminoácido (aa) triptófano (W) en lugar de un codón de paro y la traducción puede continuar (Garreau de Loubresse et al., 2014).
Capítulo 1. Introducción
10
Figura 1.6 Interacción de los AGs con el ribosoma. A) Organismos procariotas. El residuo A1408 forma enlaces de hidrógeno con los grupos NH2 u OH de la posición 6' en el anillo I, lo que da como resultado una interacción de pseudo pares de bases causada por un cambio conformacional que provoca el salto de h44; G1491 estabiliza esta interacción de pseudo pares de bases, lo que lleva a la detención de la traducción. B) Organismos eucariotas. La porción de h44 interactúa con el ribosoma de manera similar a los procariotas, pero el cambio en los residuos G1645 y A1754 contribuyen a la resistencia a AG y, en consecuencia, a la inducción de CR. h44: hélice 44; AG: aminoglucósido.
Estos estudios revelan que las diferencias en la composición de los AG afectan la eficiencia de acción dentro del ribosoma, lo que significa la eficiencia del CR. Aquellos AG que contienen un grupo hidroxilo (6'-OH) en el anillo I, como la geneticina (G418) y la paromomicina, tienen la capacidad de formar un enlace estable con el ribosoma, mientras que la clase que en su anillo I tiene el grupo NH2 en la posición 6 ', tal es el caso de la gentamicina, no forma una interacción con el residuo A1754; sin embargo, A1755 y A1756 experimentan un cambio conformacional, provocando que los átomos de N2 se sumerjan en el enlace de hidrógeno formado por el grupo 2'-NH2 en el anillo III (Prokhorova et al., 2017).
Figura 1.5 Estructura secundaria de la hélice h44 de los ribosomas en organismos procariotas y eucariotas. Los residuos que constituyen el principal sitio de unión de los AG en Escherichia coli están coloreados en azul, mientras que para los humanos y Saccharomyces cerevisiae en rojo. Las diferencias entre los residuos contribuyen a la resistencia de AG y las divergencias de selectividad y eficiencia entre moléculas.
AG: aminoglucósido.
Capítulo 1. Introducción
11
1.2.3 Efectos tóxicos y alternativas
•
Efectos tóxicos: Ototoxicidad, nefrotoxicidad y resistencia
Los AGs son antibióticos con una amplia gama de aplicaciones; sin embargo, cuando se utilizan a largo plazo, presentan efectos adversos como la ototoxicidad, nefrotoxicidad y daños en el hígado; principalmente en las personas que requieren su uso constante, tal es el caso de la población que los utiliza para el tratamiento de enfermedades raras como la DMD (Chittapragada et al., 2009; Houghton et al., 2010), además de que algunos organismos han desarrollado resistencia contra ellos (Ban et al., 2019) principalmente ligadas a la modificación de las enzimas modificadoras de AGs (AMEs, por sus siglas en inglés) (Perry et al., 2014); lo cual es un conocido como un problema de salud global; ya que debido a la resistencia antimicrobiana desarrollada por diversos microorganismos se ha registrado un promedio de 700,000 muertes por año (WHO, 2019).
Debido a la anterior, los AGs están siendo estudiados por la comunidad científica y ha surgido la necesidad de desarrollar más moléculas con igual o mejor bioactividad, tratando de reducir sus efectos negativos, encontrando y creando nuevas moléculas con actividad de AGs;
principalmente con el objetivo de encontrar mejores tratamientos para las enfermedades huérfanas que existen hoy en día.
•
Alternativas: congéneres de AGs
Por otra parte, se sabe que la biosíntesis de diferentes AGs sigue casi la misma ruta debido a la capacidad de la naturaleza para reaccionar a las condiciones de estrés utilizando un conjunto limitado de genes, lo que resulta en la producción de congéneres de AGs al mismo tiempo (Yu et al., 2017).
Uno de los grupos de AGs más estudiados es el que contiene el anillo 2-desoxiestrepatima, que es producido por un conjunto de enzimas, principalmente la 2-desoxi-scilo-inososa sintasa, la 2- desoxi-scilo-inosamina deshidrogenasa, y la L-glutamina: 2-DOI aminotransferasa (Kudo et al., 2005). Las sustituciones con grupos amino e hidroxilo en los carbonos 4, 5 o 6 siguen diferentes rutas que pueden ser paralelas; tal es el caso de la kanamicina que tiene los congéneres A, B y C que comparten el resto de kanosamina pero tienen diferentes amino-azúcares en diferentes
Capítulo 1. Introducción
12
posiciones de carbono. En el caso de la gentamicina, los principales productos de M. echinospora son los congéneres clase C entre los que se encuentran C1, C2, C1a, C2a, siendo C2b el principal precursor la gentamicina A2, que a partir de aquí sigue rutas paralelas y a través de una serie de metilaciones y deshidrogenaciones puede llegar a su destino final (Yu et al., 2017).
A partir de la elucidación de rutas paralelas, se han descubierto congéneres de AGs mediante el uso de biología sintética (Zou et al., 2018), como es el caso de la gentamicina B, una molécula valiosa que podría ser precursora de un nuevo AGs semisintético. En este estudio se bloquearon las producciones de congéneres clase C con el fin de producir mayores cantidades de gentamicina B en M. echinospora, obteniendo como resultado que los nuevos intermediarios presentan actividad similar a la gentamicina pero con menor toxicidad (Ban et al., 2019).
Igualmente, la plazomicina, un AG de nueva generación aprobado en 2018 por la FDA para el tratamiento de infecciones complicadas del tracto urinario; es un antibiótico semisintético derivado de la sisomicina (un AG comercial), al cual se le añadió un grupo hidroxilo-ácido aminobutírico en la posición 1 (del anillo de 2-deoxiestreptamina) y un grupo hidroxietilo en la posición 6´ del anillo I, dándole la capacidad de bloquear sitios atacados por las AMEs, lo que permite su uso como tratamiento contra bacterias que han desarrollado resistencia a los AGs (Shaeer et al., 2019).
•
Alternativas: Mayor diversidad química de dónde obtenerlos
Asimismo, se han aislado del medio ambiente potenciales productores de estas moléculas con actividad de AG, como es el caso del filo Actinobacteria, al cual pertenecen bacterias Gram positivas cuyo genoma es rico en contenido de GC. Son habitantes del suelo responsables de degradar la materia orgánica; estas bacterias presentan fisiología, morfología y metabolismo diferentes a otras, siendo esta una de sus características más importantes debido a que pueden desarrollarse en diferentes ambientes, algunos de ellos conocidos como extremos; como resultado de una respuesta al estrés, producen metabolitos secundarios activos conocidos como productos naturales (NPs, por sus siglas en inglés), con el objetivo de mantener su viabilidad, tal es el caso de los antifúngicos, antivirales y antibióticos, que se han utilizado para tratar enfermedades humanas (Brahmachari, 2011; Nett et al., 2009).
Capítulo 1. Introducción
13
El primer producto natural (NP) se descubrió en 1944, la estreptomicina, un metabolito secundario producido por Streptomyces griseus utilizado para tratar la tuberculosis (Waksman, 1953), lo que despertó el interés por descubrir más moléculas como ésta para su uso como quimioterapia, señalando al género Streptomyces que es responsable de la producción de casi el 80% de los antibióticos existentes (Genilloud, 2019). Algunos de los principales AGs producidos por Actinobacterias son la gentamicina, la geneticina (G418), la paromomicina, la kanamicina y la neomicina (de Lima Procópio et al., 2012; Drug Bank, 2019). En la tabla 1.1 se muestran con sus respectivos productores.
Tabla 1.1 Principales AGs producidos por Actinobacterias
AG Producer
Gentamicin Geneticin (G418)
Paromomycin Kanamycin
Neomycin Streptomycin
Micromonospora purpurea Micromonospora rhodorangea Streptomyces rimosus var. paromomycinus
Streptomyces kanamyceticus Streptomyces fradiae Streptomyces griseus
Si bien estos antibióticos son valiosos para el área farmacéutica, los efectos adversos mencionados anteriormente, han llevado a la necesidad de buscar otros productores aislando nuevas cepas del suelo y charcos de ambientes extremos, con el objetivo de tener mayor diversidad química de dónde extraer nuevas moléculas con actividad de AG, contrarrestar los efectos tóxicos de los ya existentes y, abrir la posibilidad de generar nuevas terapias basadas en su mecanismo de acción.
1.3 Proceso de generación de nuevos productos naturales (NPs)
Es bien conocido que los microorganismos, principalmente los Actinomicetos, nos han provisto una basta fuente de NPs, que se han convertido en productos comerciales para tratar enfermedades humanas, salvaguardar la salud animal e incluso proteger cultivos agrícolas. A partir del descubrimiento de la penicilina en 1928 y la estreptomicina en 1943, surgió el interés por caracterizar moléculas con actividad antimicrobiana dando como resultado la aparición de la
Capítulo 1. Introducción
14
“Era de oro” (1950-1960) para el descubrimiento de nuevos antibióticos, época en la cual la identificación de nuevas moléculas era relativamente fácil, ya que se hacía a partir de fermentaciones de bajo rendimiento y de detección de células y fenotipos (Davies, 2006).
Posteriormente, se comenzaron a utilizar métodos más robustos al aplicar conocimientos de medicina y técnicas de genética molecular; para finalmente, llegar a los años 1990s donde la manera de identificar nuevos compuestos era mediante el uso de sistemas de detección de bibliotecas químicas probadas contra dianas terapéuticas potenciales. Hoy en día gracias a la existencia de herramientas como la secuenciación y el avance en bioinformática y las ciencias ómicas, ha sido posible la detección de nuevas moléculas potenciales al hacer posible la identificación de rutas parciales de biosíntesis (Katz & Baltz, 2016).
A pesar del potencial y los esfuerzos generados para descubrir nuevos fármacos provenientes de fuentes naturales; las compañías farmacéuticas han perdido el interés por realizar investigación y desarrollo (R&D, por sus siglas en inglés) de nuevas drogas; debido a los altos costos y largos periodos de tiempo que esto representa, desde que los compuestos son descubiertos hasta que un muy bajo porcentaje de estos son aprobados como posibles candidatos para ser aprobados por la FDA, proceso que dura aproximadamente 14 años, cuenta aproximadamente 1 billón de dolares y solamente se encuentra 1 nueva posible droga de los 5,000 a 10,000 compuestos encontrados, (Figura 1.7) (Matthews et al., 2016). Por otra parte, está la dificultad para encontrar realmente nuevas moléculas evitando la redundancia y efectos tóxicos; para lo cual son necesarios métodos de detección dirigidos a mecanismos de acción específicos y más eficientes (David et al., 2015); con el objetivo de lograr que el paso de descubrimiento de nuevas drogas se reduzca en tiempo y esfuerzo; así como, hacer que el proceso sea más eficiente.
Capítulo 1. Introducción
15
Figura 1.7 Cronología de descubrimiento y desarrollo de fármacos. Primera etapa: Descubrimiento de nuevas drogas; el organismo productor es aislado, el compuesto extraído, identificado por bioactividad y mejorado para mejor efectividad. Segunda etapa: Ensayos preclínicos en modelos in vivo para monitorear su seguridad y efectividad. Tercera etapa: Ensayos clínicos, comienzan por voluntarios hasta probar los posibles fármacos en hasta 3,000 pacientes. Cuarta etapa: Proceso de aprobación regulatoria por autoridades de la salud.
1.3.1 Estrategias aplicadas al descubrimiento de NPs
Entre los métodos tradicionales utilizados para el descubrimiento de nuevos NPs, se encuentran (ver Figura 1.8):
•
Diversidad de muestro y cultivos
Como se mencionó en párrafos anteriores, los NPs son metabolitos secundarios generados por microrganismos con el objetivo de sobrevivir a tensiones naturales. El muestreo de ambientes diversos con características no habituales, por ejemplo, ambientes oligotróficos (con niveles muy bajo de nutrientes), puede llevar al descubrimiento de nuevos compuestos interesantes (Hernandez et al., 2020; Luo et al., 2014). Sin embargo, una vez que la muestra entra al laboratorio su composición puede diferir dependiendo del lugar del que fue recolectada (ambiente terrestre o acuático, parámetros climáticos, variación estacional, entre otras) además de que hay que tener en consideración que estas muestras pueden estar contaminadas con otros organismos, por ejemplo, los endofíticos. Esto puede mermar la obtención de una clase
Capítulo 1. Introducción
16
específica de NPs nuevos, aun cuando se realicen medios específicos para su aislamiento, atribuidos a factores bióticos y abióticos; así como la posibilidad de cambiar su composición química (David et al., 2015).
•
Screening robusto y de alto rendimiento
Por décadas la detección de nuevas moléculas se ha hecho a partir de ensayos de bioactividad tradicionales realizados a partir de extractos; por ejemplo, la detección del potencial antimicrobiano haciendo ensayos de concentración mínima inhibitoria (MIC) (Wong et al., 2012).
Sin embargo, un factor limitante de estos métodos de selección empleados es que los compuestos potencialmente interesantes pueden pasar desapercibidos si están presentes a bajas concentraciones o no es posible detectar su actividad si está se ve comprometida por la actividad de compuestos más abundantemente presentes (Hernandez et al., 2020; Luo et al., 2014).
Por otra parte, está la detección de estructuras a partir de técnicas de análisis instrumental, como son la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), la cromatografía de gases (GC) y la espectrometría de masas (MS). Estos métodos son muy sensibles a la detección; sin embargo, son muy costos y no son prácticos; por lo que hoy en día se sigue en búsqueda de sistemas de detección de metabolitos de alto rendimiento, más costeables, capaces de identificar y cuantificar su actividad de manera certera (Hernandez et al., 2020).
Con los avances de las ciencias ómicas como la transcriptómica y a metabolómica; hoy en día, ha sido posible la creación de métodos de detección masivos especializados para la detección de compuestos específicos (Katz & Baltz, 2016). Por ejemplo, el desarrollo de métodos colorimétricos como indicadores de actividad metabólica para detectar moléculas con actividad antifúngica (Monteiro et al., 2012); o el uso de ingeniería genética mediante la cual se puede detectar actividad de cierto metabolito a través de la expresión de proteínas reporteras ancladas a respuestas específicas, tal es el caso de la identificación de moléculas anticancerígenas (Santagata et al., 2012).
Por otra parte, la facilidad para secuenciar genomas ha abierto la posibilidad de encontrar arreglos de genes de biosíntesis (BGCs, por sus siglas en inglés) de interés encargados de la
Capítulo 1. Introducción
17
producción de NPs, mediante el aprovechamiento de herramientas como la bioinformática y genómica funcional.
•
Herramientas bioinformáticas
Para la identificación de BGCs y su caracterización como posibles productores potenciales se han secuenciado genomas y metagenomas; mismos que han sido analizados mediante herramientas bioinformáticas tales como antibiotics & Secondary Metabolite Analysis Shell (antiSMASH) (Medema et al., 2011). Esto ha permitido la identificación y activación de BGCs presentes en organismos huéspedes nativos mediante a identificación de enzimas claves, o bien en organismos heterólogos a los que se les ha insertado un gen, casetes o bien, o un grupo de genes para la identificación de rutas de biosíntesis involucradas en la generación de NPs (David et al., 2015; Genilloud, 2019; Hernandez et al., 2020).
Sin embargo, aún son muchos los esfuerzos a realizarse para encontrar más y mejores sistemas de detección y/o filtración de nuevos NPs con potencial para cubrir las necesidades que presenta la sociedad hoy en día, como son la resistencia antimicrobiana; así como la existencia, prevalencia e incidencia de enfermedades raras que afectan a 350 millones de personas en el mundo.
Capítulo 1. Introducción
18
Figura 1.8 Estrategias recientes aplicadas al descubrimiento de Productos Naturales NPs. Adaptado de (Luo et al., 2014)
Debido a lo anterior, el presente trabajo describe a detalle el desarrollo un sistema de screening eficiente y mejorado con respecto a los a existentes, para la detección de moléculas con actividad de aminoglucósidos, basado en el mecanismo de acción que estas moléculas tienen a nivel ribosomal en organismos eucariotas (CR); mediante la generación de un biosensor dentro de la levadura Saccharomyces cerevisiae utilizando un arreglo de biología sintética compuesto por genes reporteros de crecimiento y luminiscencia.
Capítulo 2
2. Marco teórico
2.1 Sistemas de detección duales para CR en enfermedades genéticas
El desarrollo de sistemas de detección duales para CR es una forma eficiente que ha sido implementada por diversos grupos de investigación para testear la actividad de moléculas con actividad de AGs, ya que se cuantifica el porcentaje de CR de una primera proteína que contiene un PTC y posteriormente, la eficiencia viene dada por la expresión de una segunda proteína, que se expresa por la acción del mismo promotor en el mismo marco de lectura. El más conocido y utilizado es el formado por dos proteínas reporteras fluorescentes Renilla y Firefly, en donde están separadas por un codón de paro, lo que hace que la expresión de la segunda dependa del fenómeno CR, haciendo posible su cuantificación. En la Tabla 2.1, se muestran algunos de ellos expresados en células de mamífero tanto in vitro como in vivo, utilizados para monitorear la actividad de AGs que han tenido éxito (principalmente G418, la gentamicina y la paromomicina) en el tratamiento de algunas enfermedades genéticas como CF, DMD, Cáncer colorrectal (CCR), Reninitis pigmentosa (RP), síndrome de Usher tipo 1 (USH1) y mucopolisacaridosis tipo 1 (MPS- 1); mismos que han evolucionado desde los primeros descubrimientos, haciendo que los estudios sean menos costosos pero con igual o mejor eficiencia.
2.2 Sistemas de detección para monitorear CR
Como una forma más rápida y menos costosa de detectar CR, algunos organismos modelo como Escherichia coli y principalmente la levadura Saccharomyces cerevisiae se han utilizado para expresar sistemas de detección dual, para comprender mejor el proceso a nivel de mRNA y rRNA, encontrando los factores que aumentan su eficacia para ofrecer mejores opciones de tratamiento.
2.2.1 Basal
En primer lugar, para comprender mejor el mecanismo de acción del CR, los estudios se llevaron a cabo sin el uso de AG.
Capítulo 2. Marco Teórico
20
•
En bacterias
En el primer sistema dual creado en un organismo procariota, los autores utilizaron Firefly y Rrenilla, dos proteínas luciferasas clonadas en Escherichia coli. Entre estos dos insertaron una secuencia del virus de la leucemia murina de Moloney (MuLV) para hacer posible la expresión de ambas proteínas. Para controlar la actividad de CR, mutaron el MuLV para introducir el codón de terminación de TGA. Para conocer los resultados se realizó un gel de electroforesis para proteínas, en el que se observó que el control generaba una proteína fusionada de 100kDa, mientras que con la mutación se obtuvieron dos franjas, una de 40kDa y otra de 100kDa;
comprobando que la finalización de la traducción de ambas proteínas se llevó a cabo, como se esperaba, con menor eficacia (Grentzmann et al., 1998). La desventaja de este sistema es que no es posible cuantificar la eficiencia de CR; además, dado que es una bacteria, la inducción de CR no puede verificarse utilizando AGs.
•
En levaduras
Con base en el anterior, se construyó el primer sistema en la levadura S. cerevisiae utilizando los genes que codifican para la producción de la enzima β-galactosidasa (LacZ) y luciferasa (luc) para cuantificar el porcentaje de CR obtenido y probar los efectos causados por la variación de los factores de liberación (RF) al introducir un PTC entre los dos genes. Informaron que la sobreexpresión de los genes SUP45 (eRF1) y SUP35 (eRF3), reducen el CR basal (Laure Bidou et al., 2000).
Años más tarde se desarrolló un sistema utilizando las enzimas Renilla y Firefly, testeando los tres codones de paro existentes, donde se concluyó que UGA es el que tiene mayor porcentaje de CR, y se verificó que los nucleótidos aguas abajo y aguas arriba del codón de parada influyen la terminación de la traducción, obteniendo que la mayor eficiencia se obtiene al flanquear el PTC por dos glutaminas (Keeling et al., 2004).
Capítulo 2. Marco Teórico
21
2.2.2 CR Inducido químicamente
El primer sistema de fluorescencia dual diseñado para contrarrestar los PTC mediante la inducción de CR por AGs en S. cerevisiae se construyó utilizando varios plásmidos, que contenían las proteínas yEmRFP (roja fluorescente) y yEGFP (verde fluoescente) fusionadas, entre los que se encontraban los codones de paro UGA, UAG y UAA; mientras que los controles tenían codones con sentido CGA, CAG y CAA respectivamente. Los autores agregaron diferentes concentraciones de gentamicina y G-418 a los cultivos que portaban los correspondientes plásmidos, cuantificaron la producción tanto de proteínas fluorescentes en plásmidos con sentido como sin sentido, obteniendo así el porcentaje de CR. Probaron la funcionalidad de los AGs obteniendo la expresión de ambas proteínas, siendo el codón de terminación UGA el más eficiente. Este sistema es menos costoso; sin embargo, también presenta falsos positivos al no tomar en cuenta el efecto del CR basal, además de que la forma en que cuantifican el porcentaje de eficiencia se basa solo entre el plásmido mutado y sin la mutación, por lo que los resultados son inexactos y no son meramente cuantificables (Altamura et al., 2016).
En general, las desventajas de estos tres sistemas es que las enzimas utilizadas para la cuantificación son caras, las células necesitan ser lisadas para su obtención y requieren purificación. La última estrategia mencionada, presenta falsos positivos, a pesar de las modificaciones realizadas para mejorar la eficiencia, se sigue realizando el CR basal, lo que disminuye la precisión de la cuantificación.
Como se puede notar, la creación de sistemas de detección de actividad CR duales ha ido en aumento debido a la necesidad que se tienen hoy en día por encontrar moléculas capaces de suprimir los codones prematuros de terminación (PTCs) causantes de enfermedades genéticas raras. Los estudios realizados in vitro e in vivo en células de mamífero mostrados en la Tabla 2.1 abrieron la posibilidad de generar sistemas de screening de alta eficiencia capaces de detectar este fenómeno y así contribuir al descubrimiento de nuevas moléculas con potencial terapéutico.
Sin embargo, aún es necesario mejorar los sistemas existentes, reduciendo los costos que su uso y aplicación representan sin dejar de lado la robustez que estos requieren para una mejor eficiencia de detección.
Tabla 2.1 Sistemas de screening para codones prematuros de terminación mediadores de enfermedades genéticas
Disease Screening system Model Mutation Stop
codon AG Incubation
time (h) TCR activity Reference CF pAC99 dual reporter vector
(nonsense mutation between LacZ and nluc genes) in NH3T3 cells
In vitro cell
culture Y122X
W1282X R1162X G542X
UAA UGA UGA UGA
Gentamicin (600 µg/mL) 72 Β-galactosidase activity showed:
Y122X > W1282X >
R1162X > G542X
(Sermet-Gaudelus et al., 2010)
Dual luciferase p2luc (renilla and
firefly luciferases) constructs In vivo
transcription G542X
W1282X UGA
UGA Gentamicin &
Paromomycin (0-50 µM) 1.5 Gentamacin >
paromomycin (Nudelman et al., 2009)
Overexpression of dual luciferase
reporter vector in HEK293 cells In vitro cell
culture Not
specified UGA G418 (0-0.7 µM)
Gentamicin (0-1.5 µM) 16 G418 > gentamacin (Nudelman et al., 2010)
DMD Overexpression of dual luciferase reporter system p2luc (15 nucleotides upstream and downstream of the mutation) in
HEK293 and C2C12 cells
In vitro cell
cultures mdx UAA
UGA G418 (0.4 mg/mL) Gentamicin (1mg/mL) Paromomycin (2mg/mL)
24 UGA > UAA G418 > gentamicin >
paromomycin
(M. T. Howard et al., 2000)
Overexpression of dual luciferase
p2luc vector In vitro cell
cultures 96→A 4240C→T 4250T→A 4693C→T 6868A→T 7220C→T 8608C→T 9337C→T
UGA UAA UAG UAG UAA UAG UGA UGA
Gentamicin (1 mg/mL) Amikacin (5 mg/mL) Paromomycin (4 mg/mL)
48 UGA > UAG > UAA Paromomycin ≥ gentamicin >
paromomycin
Howard et al., 2004
Overexpression of a dual reporter vector (lac Z and luc) containing a stop codon flanked by four codons upstream and downstream in NH3T3 cells
In vitro cell
cultures E1593X Q60X Mdx Q1143X E2726X Q2125X Q3149X W651X L1417X Q2522X
UAA UAA UAA UAA UAA UAG UAG UAG UAG UAG
Gentamicin (600 µg/mL) 48 UGA > UAG > UAA Very low levels to discriminate between basal or induced TCR
(L. Bidou et al., 2004)
E931X Q2264X Q673X R3190X R1967X R3381X R2098X R145X S319X
UAG UAG UAG UGA UGA UGA UGA UGA UGA Dual luciferase reporter vector
pLRFL319d, stop codon between Renilla and Firefly luc genes in 6 weeks old male C67BL16 mouse skeletal muscle
In vivo X319X UGA 34 mg/kg
60*
Increased 3.9%
compared to basal (Zilberberg et al., 2010)
Dual luciferase p2luc construct In vitro R3381X UGA Gentamicin (0-50 µM)
Paromomycin (0-50 µM) 1.5 Gentamicin >
paromomycin
(Nudelman et al., 2010)
CRC Dual luciferase rluc-flu vector in
HCT116 cells In vitro R1450X UGA G418 (0.5, 0.75, 1.0
mg/mL)
Paromomycin (0.75, 1.0, 1.5 mg/mL)
24
G418 > paromomycin Zillberberg 2010
Dual luciferase rluc-flu vector in
HEK293 cells In vitro R1450X UGA G418 (0.5 mg/mL)
Gentamicin (1 mg/ mL) 24 Gentamicin > G418
USH1 Dual luciferase (p2luc) constructs In vitro R3X
R245X UGA Gentamicin (0-15 µM) 1.5 Increased compared
to basal (Nudelman et al., 2006)
MPS-1 Overexpression in HS dual reporter
vector in HEK293 cell line In vitro Q70X UAG Gentamicin (0-15 µM) 1.5 Increased compared to basal
*
Daily intramuscular injection per 5 days Adaptado de (Lee & Dougherty, 2012)Capítulo 3
3. Objetivos e hipótesis
3.1. Objetivo General
Desarrollar y caracterizar un biosensor que detecte la actividad codon-readthrough en Saccharomyces cerevisiae utilizando un arreglo de biología sintética.
3.1.1 Objetivos Específicos
• Diseñar conceptualmente un arreglo de biología sintética que sea capaz de detectar la actividad de codon-readthrough en Saccharomyces cerevisiae utilizando genes reporteros metabólicos y luminiscentes.
• Amplificar los genes SUP45 y SU35 del genoma de S. cerevisiae y clonarlos en un casete de sobreexpresión.
• Generar una cepa de S. cerevisiae que contenga los genes URA3*, Nluc, SUP45 y SUP35 contenidos en un vector de expresión bajo el control de un promotor bidireccional inducible.
• Generar cepas de S. cerevisiae que contengan genes URA y Nluc con los codones de paro UGA, UAG y UAA en distintas posiciones.
• Caracterizar el sistema biosensor previamente generado utilizando distintos aminoglicósidos comerciales en cuanto a concentraciones mínimas de detección de actividad codon readthrough, sensibilidad y eficiencia.
Capítulo 3. Objetivos e hipótesis
25
3.2 Hipótesis
La sobreexpresión de los genes SUP45 y SUP35 disminuirá el CR basal generado en S.
cerevisiae portando el casete de expresión conformado por el gen URA3 mutado con el codón prematuro de terminación UGA seguido del gen reportero Nluc, de esta manera se podrá generar un sistema de detección optimizado para moléculas con actividad CR.
Capítulo 4
4. Metodología
4.1 Organismo y cepa
La levadura S. cerevisiae CEN.PK1-1C (MATa ura3-52 his3-Δ1 leu2-3,112 trp1-289, MAL2-8c SUC2), una cepa auxótrofa a uracilo, histidina, leucina y triptófano fue elegida como huésped para portar el sistema de biosensado presentado en este trabajo.
4.2 Esqueleto del casete de expresión: pESC-His
Se seleccionó pESC-His (Agilent Technologies., Santa Clara, CA), un plásmido diseñado para la expresión y análisis funcional de genes eucariotas clonados en S. cerevisiae con la ventaja de tener un promotor bidireccional GAL1 / GAL10 que permite insertar al menos dos genes en orientación opuesta, bajo el control de un promotor inducible que se activa por la presencia de galactosa y la ausencia de glucosa, seguido de los promotores CYC1 y ADH1, respectivamente.
El vector de 6.7 kb contiene el marcador auxotrófico HIS3 para seleccionar y mantener los clones transformados en células de levadura mediante la producción de la enzima imidazolglicerol- fosfato deshidratasa, necesaria para la biosíntesis de histidina. El vector pESC-His es un plásmido episomal de levadura (YEp) que puede replicarse de manera autónoma por su origen de replicación 2μ. Para su producción en E. coli cuenta con el origen de replicación del plásmido pUC y su selección está mediada por el gen de resistencia AmpR que codifica la enzima b- lactamasa y confiere resistencia a ampicilina, carbenicilina y antibióticos relacionados (Agilent Technologies, 2020). En la Figura 4.1 y la Tabla 4.1 se muestran y enumeran las principales características del plásmido pESC-His.
Capítulo 4. Metodología
27
Figura 4.1 Mapadel vector de episomal de levaduras pESC-His
Tabla 4.1 Características del vector episomal de levaduras pESC-His
Característica Posición de nucleótidos
Marcador de selección para levaduras HIS3 504-1163
Terminador para levaduras ADH1 1960-2124
Sitio de clonación múltiple 1 (MCS 1) 2255-2338
Etiqueta FLAG (reconocida por anticuerpos monoclonales) 2273-2299 Promotor bidireccional para levaduras GAL1/GAL10
2343-3009
Sitio de clonación múltiple 2 (MCS 2) 3011-3086
Etiqueta c-myc (reconocida por anticuerpos monoclonales) 3051-3086
Terminador para levaduras CYC1 3113-3302
Origen de replicación del plásmido pUC (ori) 3939-4156
Gen de resistencia a ampicilina (AmpR) 4307-5164
Origen de replicación 2μ para levaduras 5298-6453
*Adaptado de “Yeast epitope-tagging Expression Vectors | Agilent”. La secuencia completa y la lista de enzimas de restricción están disponibles en www.genomics.agilent.com.
