Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. Beca de Formación de Profesorado Universitario (Orden EDU/3083/2009, de 6 de noviembre, BOE nº 277, de 17/11/09) (desde 03/12/2010 hasta 31/11/2013).
I. SUMMARY 1
II. INTRODUCCIÓN 5
1. Importancia del aceite de oliva y su composición 7
2. Compuestos fenólicos y aceite de oliva virgen 10
3. Antecedentes bibliográficos para el análisis de compuestos fenólicos en aceite de oliva
virgen 26
4. Estado actual de las técnicas empleadas en esta memoria 41
III. OBJETIVOS 91
IV. INSTRUMENTACIÓN, SOFTWARE Y MATERIALES 95
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 107
1. Desarrollo de un método de electroforesis capilar en medio no acuoso con detección UV-visible y fluorescente para la determinación de compuestos fenólicos en aceite de
oliva virgen 109
2. Combinación de la técnica de electroforesis capilar en medio no acuoso con el algoritmo quimiométrico MCR-ALS para la determinación de ácidos fenólicos en aceite de oliva
virgen 147 3. Determinación de compuestos fenólicos en aceite de oliva virgen mediante el uso de
microchips de electroforesis con detección amperométrica 173
4. Cromatografía líquida con detección UV-visible y fluorescente en serie para la cuantificación sencilla de compuestos fenólicos en aceite de oliva virgen 193 5. Desarrollo de un método de microextracción líquido-líquido dispersiva en fase inversa
para la determinación de compuestos fenólicos en aceite de oliva virgen mediante
RRLC-DAD-MS 215 6. Fractionation, characterization and isolation of phenolic compounds of both virgin olive
oil and alperujo 239
Anexo I. Acrónimos y abreviaturas 285
I.
SUMMARY
The present thesis is focused on the development of new analytical methodologies for the determination of the phenolic compounds present in the minor fraction of virgin olive oil (VOO). Currently, these compounds are receiving considerable attention, especially due to their antioxidant activity, strongly related to their benefits for the human health. The main goals of the present work have been to improve the already published methodologies, mainly in relation to the simplicity and speed, as well as to develop faster and simpler extraction procedures which, in addition, are environmentally friendly.
First of all the identification and quantification of some of these compounds was carried out by non-aqueous capillary electrophoresis coupled to UV-visible diode array detection and fluorescence detection (NACE-DAD-FLD). The determination of the phenolic compounds in greater concentrations was performed in a fast and simple way by direct injection of the VOO in the capillary without any previous treatment, in accordance to the hydrophobic character of the VOO sample. Regarding the phenolic compounds in smaller concentrations, a simple and fast liquid-liquid extraction (LLE) procedure with ethanol was proposed for cleaning and preconcentration, thus allowing the determination of the phenolic compounds in lower concentrations merely by the direct injection of the ethanolic extract in the capillary. However, and despite the good results obtained with this method, it was not possible to obtain a good electrophoretic separation between some phenolic acids. To solve this problem, the NACE proposed methodology was combined with the chemometric algorithm multivariate curve resolution-alternating least-squares (MCR-ALS). MCR-ALS was used to cope with the coeluting interferences, on accounting the second order advantage inherent to this algorithm and, in addition, because it is able to handle data sets deviating from trilinearity, like the data herein analysed. Afterwards, one of the most important current trends in the evolution of CE, the miniaturised chemical analysis systems, was also investigated. In this line, a new methodology for the determination of three important phenolic compounds (hydroxytyrosol, tyrosol and oleuropein) by microchips electrophoresis coupled to electrochemical detection (ME-ECD) was developed.
rapid resolution column and DAD and mass spectrometry detection (RRLC-DAD-MS). The use of a Hypersil MOS column allows employing a shorter elution time and, consequently to spend less time in the analysis even when a relatively high number of phenolic compounds are analyzed. However, it has also been tested that the use of a rapid resolution column allows obtaining not only shorter separation times, but also improved resolution, higher sensitivity and better performance. In addition, coupling RRLC with MS detection offers a powerful analytical alternative to characterize food products. The higher sensitivity and reduced analysis time of the MS detector have been shown, although, since the availability of a MS detector is not always possible, it has been also showed that the DAD and FLD are useful detection modes, which in addition show larger linearity ranges.
With respect to the extraction of phenolic compounds from the olive oil, it was firstly carried out by employing the most commonly used extraction procedures: LLE with a hydromethanolic mixture as extracting solvent and solid phase extraction (SPE) with Diol cartridges. However, and in spite of the good results provided by these extraction procedures, they are generally expensive, time and organic toxic solvents consuming and also an intensive labor is required. With the goal of diminishing these disadvantages and also getting a good extraction recovery, a new reversed phase dispersive liquid-liquid microextraction procedure (RP-DLLME) was developed. It allowed us to carry out the extraction and determination of phenolic compounds from VOO samples in a simpler and faster way, with reproducible and satisfactory results and without consuming high amount of toxic solvents.
II.
INTRODUCCIÓN
1. Importancia del aceite de oliva y su composición
El aceite de oliva es un aceite vegetal que se extrae del fruto del olivo (Olea Europaea L.) denominado oliva o aceituna. Es un alimento altamente energético puesto que aporta unas 9 kcal·g-1, provenientes de sus ácidos grasos, siendo el ácido oleico el que se encuentra en mayor
proporción, entre el 68 y 81.5 %. Existen distintas categorías de aceites de oliva. Así, tal y como se recoge en el artículo 118 del Reglamento (CE) nº 1234/2007 [1], se tienen las siguientes definiciones:
ACEITES DE OLIVA VÍRGENES: “Aceites obtenidos del fruto del olivo exclusivamente por medios mecánicos u otros procedimientos físicos aplicados en condiciones que excluyan toda alteración del producto, y que no se han sometido a ningún otro tratamiento que no sea su lavado, decantación, centrifugado o filtración, excluidos los aceites obtenidos con el uso de disolventes o de coadyuvantes de acción química o bioquímica, por un procedimiento de reesterificación o como resultado de cualquier mezcla con aceites de otros tipos.”
Los aceites de oliva vírgenes se clasifican y designan de la siguiente forma: a) Aceite de oliva virgen extra (AOVE, en inglés EVOO):
“Aceite de oliva virgen que tiene una acidez libre máxima, expresada en ácido oleico, de 0.8 g por 100 g y cuyas otras características se ajustan a las establecidas para esta categoría.”
b) Aceite de oliva virgen (AOV, en inglés VOO):
“Aceite de oliva virgen que tiene una acidez libre máxima, expresada en ácido oleico, de 2 g por 100 g y cuyas otras características se ajustan a las establecidas para esta categoría.”
c) Aceite de oliva lampante:
“Aceite de oliva virgen que tiene una acidez libre, expresada en ácido oleico, de más de 2 g por 100 g y/o cuyas otras características se ajustan a las establecidas para esta categoría.”
ACEITE DE OLIVA - CONTIENE EXCLUSIVAMENTE ACEITES DE OLIVA REFINADOS Y ACEITES DE OLIVA VÍRGENES: “Aceite de oliva obtenido mezclando aceite de oliva refinado y aceite de oliva virgen distinto del lampante, que tiene una acidez libre, expresada en ácido oleico, de no más de 1 g por 100 g y cuyas otras características se ajustan a las establecidas para esta categoría.”
ACEITE DE ORUJO DE OLIVA CRUDO: “Aceite que se obtiene del orujo de oliva mediante un tratamiento con disolventes o empleando medios físicos, o que corresponde, salvo en determinadas características, al aceite de oliva lampante, y cuyas otras características se ajustan a las establecidas para esta categoría, excluido el aceite obtenido por un procedimiento de reesterificación o como resultado de una mezcla con aceites de otros tipos.”
ACEITE DE ORUJO DE OLIVA REFINADO: “Aceite obtenido del refino de aceite de orujo de oliva crudo, que tiene una acidez libre, expresada en ácido oleico, de no más de 0.3 g por 100 g y cuyas otras características se ajustan a las establecidas para esta categoría.”
ACEITE DE ORUJO DE OLIVA: “Aceite obtenido mezclando aceite de orujo de oliva refinado y aceite de oliva virgen distinto del lampante, que tiene una acidez libre, expresada en ácido oleico, de no más de 1 g por 100 g y cuyas otras características se ajustan a las establecidas para esta categoría.”
El aceite de oliva se considera una grasa monoinsaturada (dado su alto contenido en ácido oleico), con efectos positivos sobre la salud de los consumidores que lo convierten en un alimento funcional [2]. Aunque la composición química del aceite de oliva depende de diferentes factores como las condiciones agronómicas y características tecnológicas de producción, la variedad de aceituna de la que proceda o el grado de maduración de esta, entre otros, de manera general consta de una fracción mayoritaria y otra minoritaria.
En cuanto a la fracción minoritaria o no saponificable, representa el 2 % del peso total e incluye más de 230 compuestos químicos. Es muy difícil determinar de una manera precisa la totalidad de los componentes de esta fracción, debido a su naturaleza compleja y a la baja concentración en la que se encuentran. Dentro de esta fracción se distinguen dos grupos de compuestos:
a) Los derivados de los ácidos grasos, como los fosfolípidos, las ceras y los ésteres de esteroles.
b) Los compuestos químicamente no relacionados con los ácidos grasos: hidrocarburos, alcoholes grasos, alcoholes libres, esteroles libres, tocoferoles, pigmentos (clorofilas, feofitinas y carotenoides) y compuestos fenólicos.
Los compuestos fenólicos, junto con los tocoferoles y carotenos, constituyen los antioxidantes más importantes del aceite de oliva. Mientras que algunos fenoles lipofílicos, como los tocoferoles, se pueden encontrar en otros aceites vegetales, los fenoles hidrofílicos del AOV no se encuentran presentes en otros aceites vegetales y sólo están presentes en aceite de oliva en crudo, puesto que el procesado tecnológico, como el refinado, los elimina [2-4].
La fracción polar del aceite de oliva, en adelante compuestos fenólicos, constituye una mezcla heterogénea de compuestos con diferentes estructuras, presentes en el mesocarpio de la aceituna, que tradicionalmente se han extraído del aceite mediante el uso de mezclas hidrometanólicas. El número de publicaciones relacionadas con estos compuestos se ha incrementado mucho en los últimos años por varias razones. Los compuestos fenólicos están relacionados con la estabilidad del aceite de oliva, pero también con sus propiedades biológicas. En relación a estas últimas, muchos compuestos fenólicos del AOV como el hidroxitirosol y sus derivados se están investigando exhaustivamente en la actualidad con el fin de establecer relaciones entre el consumo de aceite de oliva en la dieta y el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares o cáncer.
Mientras que los compuestos fenólicos contribuyen al amargor del aceite, los compuestos volátiles son los principales responsables del atributo del verdor del AOV. El rango de concentraciones de los componentes de la mezcla es muy amplio, y podría ser usado para la identificación de la variedad y origen geográfico, puesto que se producen variaciones en función de estos factores, así como en función del estado de maduración del fruto. Se han identificado más de cien compuestos como hidrocarburos, alcoholes, aldehídos, ésteres, fenoles, terpenos y derivados del furano [2].
2. Compuestos fenólicos y aceite de oliva virgen
La diferencia en el contenido de compuestos fenólicos en el AOV con relación a otros aceites fue observada y confirmada hace ya más de cuarenta años por Cantarelli [5], que llevó a cabo la extracción y evaluación colorimétrica del contenido total de estos en AOVs procedentes de Italia y extraídos únicamente mediante presión a partir de las aceitunas. Se obtuvo una gran diferencia en los resultados al comparar el contenido en compuestos fenólicos en AOVs con el existente en aceites de oliva refinados [5,6]. Desde entonces hasta el momento, los estudios sistemáticos en relación a la presencia de compuestos fenólicos polares en el AOV se han incrementado. Los resultados obtenidos en una amplia variedad de trabajos muestran que la peculiar composición del AOV en relación al contenido en compuestos fenólicos no se ha encontrado en ningún otro aceite vegetal [3]. El AOV contiene diferentes clases de compuestos fenólicos:
1) Ácidos fenólicos y derivados: ácido gálico (GAL), ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido gentísico (GEN), ácido 4-hidroxibenzoico (4HB), ácido 4-hidroxifenilacético (4HF), ácido vaníllico (VAN), ácido cafeico (CAF), ácido siríngico (SY), ácido p-cumárico (p-CUM), ácido o-cumárico (o-CUM), ácido ferúlico (FER), ácido cinámico (CIN), ácido protocatecuico, 4-(acetoxietil)-1,2-dihidroxibeceno, ácido benzoico e hidroxi-isocromas, entre otros.
3) Secoiridoides:
forma dialdehídica del ácido elenólico decarboximetil unida a HYTY o también designado forma dialdehídica de la aglicona de la oleuropeína decarboximetil (3,4-DHPEA-EDA),
forma dialdehídica del ácido elenólico decarboximetil unida a TY o también nombrado forma dialdehídica de la aglicona del ligustrósido decarboximetil u oleocantal (p-HPEA-EDA),
forma aldehídica del ácido elenólico unido a HYTY o también denominado forma aldehídica de la aglicona de la oleuropeína (3,4-DHPEA-EA),
forma aldehídica del ácido elenólico unido a TY o también llamado forma aldehídica de la aglicona del ligustrósido (p-HPEA-EA),
otros derivados secoiridoides del TY, la oleuropeína (OI), la forma dialdehídica de la aglicona de la oleuropeína y la forma dialdehídica de la aglicona del ligustrósido que son isómeros del 3,4-DHPEA-EA y el p-HPEA-EA, respectivamente.
4) Lignanos: (+)-1-acetoxipinoresinol y (+)-pinoresinol. 5) Flavonoides: luteolina (LUT) y apigenina (APIG).
Las estructuras químicas de algunos de estos compuestos se muestran en la Figura 1. Los ácidos fenólicos fueron el primer grupo de compuestos fenólicos del AOV encontrados y descritos. Estos compuestos, junto con los alcoholes fenólicos, los hidroxi-isocromas y los flavonoides se encuentran presentes en el AOV en pequeñas cantidades [7-9] mientras que los secoiridoides y los lignanos son los compuestos fenólicos más abundantes en él.
Figura 1. Clases de compuestos fenólicos en el AOV. A modo de ejemplo se muestran las
estructuras químicas de algunos de los compuestos de cada familia.
flavonoides se incluyen glucósidos como la luteolina-7-glucósido y la rutina [13], así como antocianinas y cianidina principalmente [14-16]. Mientras que los ácidos y alcoholes fenólicos se encuentran presentes en frutas y verduras de distintas familias, los secoiridoides por el contrario se encuentran únicamente presentes en la familia Oleaceae que incluye Olea Europeae L. Las aceitunas y el AOV son los únicos productos que se usan en la alimentación humana y que contienen secoiridoides.
Aunque los ácidos fenólicos fueron los primeros compuestos descubiertos en el AOV y han sido encontrados en la aceituna por diversos autores [17-19], de manera general se encuentran presentes en el AOV en concentraciones inferiores a 1 mg·kg-1, mientras que los secoiridoides son
los compuestos fenólicos más abundantes en el AOV, estando presentes en concentraciones de 27 a 32 mg·kg-1.
Los secoiridoides más abundantes en AOV son fundamentalmente los derivados de la oleuropeína, la demetiloleuropeína y el ligustrósido, que existen en altas concentraciones en las aceitunas (Figura 2). Estos son las formas dialdehídicas del ácido elenólico decarboximetil unidas tanto a HYTY como a TY (3,4 DHPEA-EDA y p-HPEA-EDA, respectivamente) y un isómero de la aglicona de la oleuropeína (3,4-DHPEA-EA). Estos compuestos fueron encontrados por primera vez por Montedoro et al. [18, 20 ] que también asignaron sus estructuras [ 21 ], siendo posteriormente éstas confirmadas por otros autores [22-24]. Se caracterizan por la presencia en su estructura del ácido elenólico o sus derivados y proceden del metabolismo secundario de los terpenos. Están formados por un fenil etil alcohol (HYTY o TY), ácido elenólico y en ocasiones por un residuo glucosídico (generalmente aparecen glucosilados en las plantas).
Las agliconas de la oleuropeína y del ligustrósido, así como sus formas dialdehídicas han sido detectadas, en muy bajas concentraciones, también en el AOV [24- 26 ]. Se trata de compuestos intermedios de la transformación bioquímica de los glucósidos de los secoiridoides presentes en las aceitunas, como la oleuropeína, la demetiloleuropeína y el ligustrósido, en sus derivados agliconas correspondientes como el 3,4-DHPEA-EDA procedente de la oleuropeína y la demetiloleuropeína y el p-HPEA-EDA procedentes del ligustrósido [26].
aceite debido a la hidrólisis de los secoiridoides 3,4-DHPEA-EDA, p-HPEA-EDA, 3,4-DHPEA-EA y p-HPEA-EA, que contienen HYTY y TY en su estructura [27]. Por este motivo, existen variaciones en las concentraciones de HYTY y TY encontradas en el AOV por distintos autores [2].
Figura 2. Estructuras químicas de algunos de los glucósidos secoiridoides encontrados en las
aceitunas.
La existencia de flavonoides como la LUT y la APIG en AOV también ha sido descrita [28]. Los flavonoides presentan anillos aromáticos en su estructura, uno de ellos y la cadena lateral de tres átomos de carbono provienen de la L-fenilalanina, mientras que el resto proviene del acetil-Co-A, por la ruta poliacética. Se subdividen en flavonas, flavonoles, flavanonas y flavanoles. La LUT y la APIG pertenecen a las flavonas.
El último grupo de compuestos fenólicos encontrados en AOV son los lignanos. La presencia de (+)-1-acetoxipinoresinol y de (+)-pinoresinol en AOV de origen español fue confirmada por Brenes y colaboradores [29]. Estos autores también propusieron que la presencia de estos compuestos se puede emplear para distinguir aceites procedentes de la variedad de aceituna Picual de los procedentes de otras variedades como Hojiblanca, Cornicabra y Arbequina [30].
Dado que tanto las condiciones agronómicas como las características tecnológicas de producción del aceite de oliva influyen en el tipo y concentración de los compuestos fenólicos presentes en él, es extremadamente difícil dar un dato de concentración media de estos compuestos en AOV [3]. Su concentración puede variar entre unos 40 y 900 mg·kg-1, aunque se
sí, lo que puede estar también relacionado con los aspectos agronómicos y tecnológicos de la producción. En este contexto, las relaciones entre los perfiles fenólicos de los aceites y su origen genético o geográfico son un importante aspecto a investigar.
Propiedades de los compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos son considerados una parte muy importante del sistema químico de defensa del fruto [2]. Se les atribuyen diversas funciones, como su actividad antimicrobiana y protección frente al daño oxidativo, al limitar los efectos de la luz UV. Además de esto, afectan a la estabilidad del aceite frente a la oxidación y a sus características sensoriales como el sabor y aroma y han sido identificados como los principales responsables de las propiedades antioxidantes del AOV.
Además de la actividad antioxidante y de las propiedades sensoriales, se les atribuyen importantes propiedades biológicas, responsables en gran medida del gran interés que estos compuestos están despertando en la actualidad [32,33].
Los ácidos fenólicos, por ejemplo, se han asociado con las cualidades sensoriales y organolépticas (sabor, astringencia y dureza), así como con las propiedades antioxidantes. Además, de estos compuestos se deriva una función protectora, a través de la ingestión de frutas y hortalizas, frente a enfermedades que pueden estar relacionadas con el daño oxidativo (enfermedad coronaria, accidentes cerebrovasculares y cáncer) [34-36].
Propiedades sensoriales
Generalmente, se ha asumido que los principales responsables de estas propiedades sensoriales son HYTY, TY y sus derivados [39]. Algunos autores señalan que el 3,4-DHPEA-EDA y el 3,4-DHPEA-EA son los principales contribuyentes al amargor [43,44]. En cambio, para otros existe una importante correlación entre las propiedades sensoriales de amargor y astringencia y el contenido en derivados del ligustrósido, como el p-HPEA-EDA [45]. También se ha relacionado el atributo picante presente en aceites obtenidos al principio de la campaña con el contenido en derivados del ligustrósido [ 46 ] y el contenido de la forma aldehídica de la aglicona de la oleuropeína [43].
García et al. [43] indican que el amargor del AOV, sensorialmente medido y químicamente estimado mediante la suma del contenido en las aceitunas de dos derivados secoiridoides del HYTY, decrece considerablemente con el aumento de la temperatura usada en el calentamiento de las mismas. Así, la intensidad de amargor del AOV fue objetivamente estimada mediante el contenido en el aceite de los derivados secoiridoides del HYTY. Para cada variedad, se encontró una relación adecuada entre el contenido en derivados secoiridoides del HYTY y su amargor.
En los últimos años, muchos investigadores han encontrado correlaciones entre las propiedades sensoriales del AOV y su contenido en compuestos fenólicos mientras que pocos han encontrado relación con la fracción de lignanos. Por otra parte, la mayor parte de los estudios muestran correlaciones estadísticas entre algunas propiedades organolépticas y la concentración total de secoiridoides, como ya se ha indicado, sin embargo son pocos los que se atreven a incluir datos de la relación entre estas propiedades y las estructuras químicas de los secoiridoides.
Gutiérrez-Rosales et al. [47] aislaron por primera vez cada derivado secoiridoide mediante cromatografía líquida preparativa para evaluar la intensidad de amargor en 20 muestras de AOV diferentes y observaron una correlación bastante fuerte entre el contenido de 3,4-DHPEA-EDA, p-HPEA-EDA y 3,4-DHPEA-EA y el amargor. Finalmente concluyeron que estos tres compuestos son los principales responsables del sabor amargo del AOV.
eficacia (HPLC del inglés high performance liquid chromatography, en adelante LC), en fase inversa, con recogida de las fracciones. Tras diversas pruebas con un panel de catadores, concluyeron que el p-HPEA-EDA es fundamentalmente el responsable de esta sensación de ardor/picor en el AOV, puesto que ninguna otra fracción fenólica de los AOV analizados dio lugar a tal intensa sensación.
Estos hallazgos fueron posteriormente remarcados por Beauchamp et al. [ 49 ] que, después de la síntesis del p-HPEA-EDA, estudiaron las propiedades sensoriales de este compuesto disuelto en aceite de maíz (que no poseía tales propiedades). El resultado, que es probablemente debido a la presencia de dos grupos dialdehídicos en la estructura química del p-HPEA-EDA, fue una sensación de ardor/picor comparable al del AOV.
Actividad antioxidante
La oxidación es un proceso inevitable que comienza después de la extracción del AOV y conduce a un deterioro que puede llegar a ser más pronunciado durante el almacenamiento del mismo. Los compuestos fenólicos pueden inhibir la oxidación a través de diferentes mecanismos [50-53], siendo el más común el conocido como radical scavenging o captación de radicales libres. De acuerdo con este mecanismo, su actividad antioxidante puede ser explicada teniendo en cuenta que poseen la habilidad de captar radicales libres e inhibir el proceso de oxidación mediante la deslocalización de un electrón y la estabilización mediante resonancia en los núcleos aromáticos, lo que evita la continuación de la cadena de reacciones de los radicales libres.
el HYTY y otros secoiridoides que contienen HYTY en su molécula son los antioxidantes naturales del AOV con mayor poder antioxidante.
Además, los resultados han demostrado que la actividad antioxidante depende de la concentración de estos fenoles en AOV. Posteriormente, otros autores han confirmado que, en general, los efectos antioxidantes más elevados se observan en presencia de compuestos con estructuras dihidroxi y 3,4,5-trihidroxi unidas a un anillo aromático, como la oleuropeína, el 3,4-DHPEA-EDA y el 3,4-DHPEA-EA [60].
En un trabajo relativamente reciente, Carrasco-Pancorbo et al. [61] han estudiado la actividad antioxidante de diferentes compuestos fenólicos simples del AOV mediante métodos químicos, oxidación acelerada en un modelo lipídico y mediante un método electroquímico. Así, han demostrado la habilidad de estos compuestos para actuar como donadores de hidrógeno e inhibir la oxidación gracias al elevado número de grupos hidroxilo en sus moléculas. En particular, aquellos compuestos con grupos hidroxilo en posición orto mostraron mayor capacidad antioxidante debido a la formación de enlaces de hidrógeno intramoleculares durante la reacción con radicales libres. Además, los sustituyentes en posición orto, que actúan como donadores de electrones, tienden a debilitar el enlace O-H del fenol facilitando la mayor estabilidad del radical fenoxil. Los resultados obtenidos mostraron de nuevo que el HYTY, el DHPEA-EDA y el 3,4-DHPEA-EA son los antioxidantes más fuertes, confirmando además que la presencia de un grupo hidroxilo simple confiere una actividad antioxidante más limitada. Además, se ha demostrado que la presencia de –COOCH3 en la molécula tiende a causar un decrecimiento en el poder
antioxidante puesto que no se trata de un grupo donador de electrones.
También se han llevado a cabo varias simulaciones en relación al comportamiento del AOV durante la fritura y otros procesos de cocinado. Los resultados relacionados con la estabilidad de los fenoles durante la fritura y el cocinado en el microondas confirman el fuerte efecto que algunos derivados de la oleuropeína como el 3,4-DHPEA-EDA y el 3,4-DHPEA-EA tienen en la estabilidad del aceite: la concentración de estos compuestos decrece bruscamente en el proceso de calentamiento del aceite para preservarlo de las reacciones de oxidación [62,63].
compuestos fenólicos presentes en el aceite de oliva como el acetato de HYTY y el p-HPEA-EA, mientras que los lignanos se confirmaron como los compuestos fenólicos más resistentes a los tratamientos térmicos y, por tanto, con menor capacidad antioxidante [64].
Efectos biológicos sobre la salud
La actividad antioxidante de los compuestos del AOV ha despertado un gran interés en los últimos años puesto que se relaciona con la protección frente a importantes desórdenes crónicos y degenerativos como enfermedades coronarias del corazón, desórdenes neurodegenerativos y tumores en diferentes zonas [3,32,33,35,39,65,66].
Las especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés reactive oxygen species) son las responsables, se forman como consecuencia del estrés oxidativo y están involucradas en muchas de las enfermedades crónicas y degenerativas [67-69] a través de una serie de mecanismos parcialmente conocidos. El estrés oxidativo también está relacionado con el envejecimiento [70] y, además, también parece estarlo con la progresión de las enfermedades neurodegenerativas, como el Parkinson [71].
Los antioxidantes naturales tienen una gran importancia en la prevención de estos tipos de enfermedades. Por esta razón, los alimentos ricos en éstos han recibido una atención cada vez mayor en los últimos años y, en particular, el aceite de oliva ha sido reconocido como un importante protector frente al cáncer. Los estudios llevados a cabo por Martin-Moreno et al. [72], Trichopoulou et al. [73] y La Vecchia et al. [74] demuestran que el consumo de aceite de oliva de forma frecuente en la dieta reduce el riesgo de padecer cáncer. Estos resultados fueron posteriormente confirmados por otros autores [75] y resultados similares se obtuvieron también en lo que respecta a tumores en diferentes zonas: páncreas [76], cavidad oral [77], esófago [78], colon-recto [79], próstata [80,81] y pulmón [82]. En animales, también se ha demostrado el efecto protector del aceite de oliva frente a los rayos UV sobre la piel [83].
diferentes investigadores [84-86]. Resulta interesante indicar que mientras que el HYTY se comporta de forma muy activa en la inducción de apoptosis, el TY en cambio es inactivo a similar concentración (100 µM) mientras que el p-HPEA-EDA es más activo que 3,4-DHPEA-EDA. Estos resultados sugieren que las diferentes partes de la estructura molecular de un compuesto pueden tener distintas actividades biológicas. Por lo tanto, es muy difícil definir las relaciones entre la estructura de los compuestos fenólicos del AOV y sus posibles efectos beneficiosos para la salud.
Uno de los aspectos más importantes en relación a la interacción entre la estructura y las propiedades beneficiosas es la actividad antioxidante que, como previamente se ha indicado, está directamente relacionada con la habilidad de estos compuestos para transferir el hidrógeno del grupo hidroxilo a los radicales libres. De esta manera, se confirman las consideraciones en relación a la elevada capacidad antioxidante mostrada por aquellos compuestos fenólicos con grupos hidroxilo en posición orto en su estructura. De hecho, un estudio reciente, llevado a cabo por Fabiani et al. [87], pone de manifiesto que la habilidad del HYTY y del 3,4-DHPEA-EDA en la protección del ADN de los daños oxidativos es superior que la del TY y el p-HPEA-EDA.
Por otro lado, existen bastantes evidencias de que el efecto protector frente a enfermedades crónicas y degenerativas está relacionado con el contenido en compuestos fenólicos y, en particular, con el contenido en HYTY más que con el contenido en ácidos grasos insaturados del aceite de oliva [88,89]. En relación a estos efectos protectores, se pueden resaltar la reducción de la peroxidación de los fosfolípidos en liposomas [90], la protección frente a la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad [91,92], la reducción del daño oxidativo de los eritrocitos por HYTY [93], la inhibición de la agregación plaquetaria por HYTY y su participación en la síntesis de tromboxanos en las células humanas [94] y la inhibición en el cambio en las bases del ADN producidas por peroxinitritos [95]. Además de todo esto, también se ha demostrado su efecto protector frente a la inflamación en animales [96,97].
plasma y en la orina en sus formas conjugadas glucurónicas (en torno al 98 %), lo que sugiere un metabolismo intestinal/hepático de las formas iniciales ingeridas [100,101].
Es importante indicar también que muchos de los aspectos beneficiosos de la ingesta de aceitunas frente a los desórdenes cardiovasculares son debidos a las propiedades vasodilatadoras, antiinflamatorias, antioxidantes, antimicrobianas y de anti-agregación plaquetaria asociadas a su contenido en oleuropeína [102,103]. La oleuropeína y los ácidos vaníllico y p-cumárico pueden también inhibir el crecimiento de algunas bacterias in vitro, como la Escherichia coli, la Klebsiella peneumoniae y la Bacilluscereus [104].
En cualquier caso, son aún necesarios más estudios para aclarar la influencia que los compuestos fenólicos del AOV tienen sobre la salud y todos estos se llevarán a cabo más fácilmente cuando muchos de estos compuestos se encuentren disponibles como patrones comerciales.
Aspectos agronómicos y tecnológicos de la producción del aceite de oliva
La composición en compuestos fenólicos del aceite de oliva, tanto desde el punto de vista cuantitativo como cualitativo, depende de las condiciones agronómicas y tecnológicas de producción.
Los aspectos agronómicos que más influencia tienen y que han sido más estudiados son la variedad de cultivo, la maduración del fruto, las condiciones climáticas y algunas técnicas agronómicas como la irrigación [45,105-107]. Como han indicado algunos autores, la composición de las aceitunas está cualitativamente muy influenciada por la variedad de cultivo [30,108-111], aunque la madurez del fruto también afecta a su composición: el contenido en oleuropeína decrece con la maduración mientras que el de demetiloleuropeína se incrementa. En cualquier caso, la concentración de ambos disminuye en frutos altamente maduros [112]. La variedad de cultivo también afecta a la concentración de compuestos fenólicos específicos del AOV mientras que el perfil fenólico es prácticamente el mismo.
compuestos fenólicos en aceite de oliva se ve afectada por la disponibilidad y distribución de agua en el ciclo vegetativo del olivo [113,114], aunque existen opiniones contrarias en torno a esta influencia [45,115].
En relación a los aspectos tecnológicos de producción, la aparición de compuestos fenólicos en el aceite de oliva está estrictamente relacionada con la actividad de varias enzimas endógenas que están presentes en las aceitunas, lo que indica que las condiciones de extracción van a tener una gran influencia en la concentración de estos compuestos en aceite de oliva. La molienda y la malaxación son los puntos más críticos del proceso de obtención del aceite de oliva en lo que respecta al contenido en compuestos fenólicos [116].
Algunos derivados secoiridoides como el 3,4-DHPEA-EDA, el p-HPEA-EDA, el p-HPEA-EA y el 3,4-DHPEA-EA se originan durante la molienda por la hidrólisis de la oleuropeína, de la demetiloleuropeína y del ligustrósido debido a la acción de enzimas endógenas β-glucosidasas (Figura 3). Varios autores han estudiado esta hidrólisis enzimática empleando oleuropeína y demetiloleuropeína como sustratos [117,118], así como la relación entre la hidrólisis enzimática de los glucósidos secoiridoides y la presencia de algunos de estos derivados secoiridoides agliconas (3,4-DHPEA-EDA, p-HPEA-EDA y 3,4-DHPEA-EA) en AOV [119]. Aunque el mecanismo de obtención del 3,4-DHPEA-EDA como producto final de la hidrólisis enzimática de la demetiloleuropeína presente en las aceitunas es conocido [118], el mecanismo de formación de este mismo compuesto y del p-HPEA-EDA procedentes de la oleuropeína y del ligustrósido, respectivamente, se encuentra en estudio.
Figura 3. Mecanismo propuesto para la formación de los derivados secoiridoides. (I) R= H: ligustrósido; R=
Se ha comprobado que durante el proceso de malaxación la concentración de derivados secoiridoides agliconas así como de alcoholes fenólicos decrece, tanto en la pasta de las aceitunas como en los aceites, con el incremento del tiempo y la temperatura de procesado [10,122-124]. La mayor solubilidad de los compuestos fenólicos en la fase acuosa que en el aceite no es el único mecanismo que hace disminuir la concentración final de estos en el aceite, sino que las reacciones de oxidación catalizadas por oxidorreductasas endógenas promueven la oxidación de los compuestos fenólicos durante este proceso [10,125,126]. El uso de nuevas tecnologías que permiten, por ejemplo, llevar a cabo la extracción de pastas de aceitunas deshuesadas y que incrementan la concentración de compuestos fenólicos, confirman la existencia de relaciones entre las reacciones de oxidación durante el procesado y la concentración de compuestos fenólicos en el aceite [3].
Por otro lado, las interacciones entre los polisacáridos y los compuestos fenólicos presentes en la pasta de las aceitunas también influyen en la pérdida de estos compuestos durante el procesado. Durante la molienda y la malaxación, los polisacáridos pueden unirse a compuestos fenólicos reduciendo así su concentración total en el aceite de oliva [127].
Otro de los aspectos tecnológicos que también influye en la composición fenólica del aceite de oliva es el sistema de extracción. Existen dos tipos de decantadores empleados para separar el aceite de oliva del resto de la fase acuosa mediante centrifugación: el tradicional sistema de tres fases y el más reciente sistema de dos fases.
En el sistema de tres fases se añade agua en grandes cantidades (10-100 L/100 kg de pasta de oliva), antes de la centrifugación, con el fin de disminuir la viscosidad de la pasta y mejorar la separación del aceite de oliva. Sin embargo, la adición de agua modifica la distribución de los compuestos fenólicos entre el aceite y la fase acuosa favoreciéndola hacia esta última. El nombre de tres fases se debe a que se obtiene por un lado el aceite de oliva, por otro una fase líquida (alpechín) y por otro una fase sólida (orujo). En estos sistemas la separación se realiza en dos pasos, el primero consiste en alejar las fases líquidas de la sólida (orujo) y el segundo en separar el aceite del alpechín.
alpechín), se obtienen aceites de oliva con mayores concentraciones de compuestos fenólicos que con el tradicional sistema de tres fases [128-130 ]. Así mismo, se ha obtenido una mayor concentración de compuestos fenólicos en aceites obtenidos en decantadores de tres fases con menor adición de agua en comparación con los que usan agua en grandes cantidades [131].
Compuestos fenólicos estudiados
Finalmente, en la Figura 4 se muestran las estructuras químicas de los compuestos fenólicos objeto del presente trabajo de investigación.
3. Antecedentes bibliográficos sobre la determinación de compuestos fenólicos en aceite de oliva virgen
Hasta 1990, la mayoría de los artículos publicados que evaluaban los compuestos fenólicos del AOV estaban relacionados con la utilización de métodos colorimétricos que empleaban el reactivo de Folin-Ciocalteau [5,6,8,9]. Sin embargo, actualmente, estos métodos clásicos han sido reemplazados por técnicas de separación, tales como la cromatografía de gases (GC, del inglés gas chromatography) [3,132,133], la electroforesis capilar (CE, del inglés capillary electrophoresis) y la cromatografía líquida (LC, del inglés liquid chromatography) con distintos tipos de detección, destacando la detección UV-visible con detector de diodos en serie (DAD, del inglés diode array detector) y la espectrometría de masas (MS, del inglés mass spectrometry) en distintas modalidades.
Las principales diferencias entre los distintos métodos se pueden resumir en el procedimiento empleado para la extracción de los compuestos fenólicos de la matriz del aceite y el detector elegido para la evaluación mediante la técnica separativa de la que se trate. A continuación se detallan los antecedentes de la determinación de compuestos fenólicos en AOV, desde los procedimientos de extracción empleados hasta la detección, pasando por la etapa de separación cromatográfica y haciendo hincapié en aquellas técnicas y procedimientos que se han empleado en esta memoria.
Extracción de la fracción fenólica del aceite de oliva virgen
Tabla 1. Procedimientos más comúnmente empleados para llevar a cabo la extracción de compuestos fenólicos de muestras de AOV
Procedimiento de
extracción Características Referencias
LLE Aceite previamente disuelto en hexano. Disolvente extractante formado por diferentes proporciones de metanol/agua.
[18,135]
SPE
Cartuchos C18.
Metanol como disolvente de elución.
Compuestos fenólicos separados del AOV por primera vez mediante este procedimiento.
[136]
LLE vs SPE
LLE de acuerdo con Montedoro et al. [18].
SPE, cartuchos Alltech C18 de alta capacidad, metanol como disolvente de elución.
SPE más eficiente para extraer fenoles simples.
La recuperación de los derivados secoiridoides es mayor empleando LLE.
[137]
LLE con metanol/agua 60:40 (v/v) y AOV disuelto en hexano. SPE con cartuchos C8 y acetonitrilo como disolvente de elución.
No se encontraron diferencias significativas en la recuperación de los compuestos fenólicos.
[138] SPE con cartuchos C8 y con cartuchos modificados C8, C18 y Diol.
LLE con metanol/agua 60:40 (v/v) y AOV disuelto en hexano.
Diol-SPE y LLE mostraron recuperaciones más altas de los compuestos fenólicos .
[139] Comparación entre LLE con metanol/agua 60:40 (v/v) y AOV disuelto en
hexano y SPE empleando cartuchos C18, Diol y SAX.
Los procedimientos más efectivos para la extracción de TY, HYTY, secoiridoides y lignanos fueron Diol-SPE y LLE.
[140]
LLE y Diol-SPE Son los procedimientos más empleados para llevar a cabo la extracción de este tipo de compuestos en muestras de AOV. [141-147]
[149] propusieron el uso de N,N-dimetilformamida (DMF) consiguiendo interesantes resultados en términos de eficiente recuperación y manipulación de la muestra.
La SPE fue aplicada por primera vez en AOV para separar los compuestos fenólicos por Mannino et al. [136] empleando cartuchos C18 y metanol como disolvente de elución. Posteriormente, Servili et al. [137] llevaron a cabo una comparación entre el procedimiento de LLE propuesto por Montedoro et al. [18] y la SPE empleando cartuchos Alltech C18 de elevada capacidad y metanol como disolvente de elución. Tal y como se recoge en la Tabla 1, los resultados mostraron que la SPE es más eficiente para extraer fenoles simples, mientras que por el contrario, el rendimiento de recuperación de los derivados secoiridoides es mayor al emplear la LLE.
En contraste a estos resultados, Pirisi et al. [138] compararon la SPE, empleando cartuchos C8 y acetonitrilo como disolvente de elución, y la LLE, empleando una mezcla metanol/agua 60:40 (v/v) sobre AOV previamente disuelto en hexano, y no encontraron diferencias significativas en las recuperaciones de los compuestos fenólicos.
Sin embargo, a pesar de los buenos resultados obtenidos tanto con LLE como con SPE, ambos procedimientos son complejos, tediosos y consumen gran cantidad de tiempo y de aceite, además de disolventes tóxicos como el hexano [150]. En este sentido, destaca el interés en desarrollar nuevos métodos de extracción de compuestos fenólicos que traten de eliminar estos inconvenientes como los métodos de microextracción, que serán tratados más adelante.
Técnicas de separación y detección
Cromatografía líquida
Mayoritariamente, se ha utilizado la elución en fase inversa (RP, del inglés reversed phase), en gradiente, con columnas C18 de longitudes entre 150 y 250 mm, diámetros internos de 4.6 mm y tamaño de partícula de 5 µm. Se han empleado una gran cantidad de fases móviles. Sin embargo, las más comunes han sido sistemas binarios formados por un componente acuoso y un disolvente orgánico menos polar como acetonitrilo o metanol. Normalmente, se añade un ácido (acético, fórmico o fosfórico) a uno de los dos componentes de la fase móvil, ya que la disminución del pH evita la disociación de los compuestos fenólicos, mejorando así la simetría de los picos y reduciendo la cola [151].
En la Tabla 2 se muestra un resumen de los métodos propuestos para el análisis de compuestos fenólicos en AOV mediante LC. Esta información se encuentra recogida, de forma extensa, en las revisiones publicadas por Servili et al. [3] y Carrasco-Pancorbo et al. [134] en 2004 y 2005, respectivamente, así como en otras publicadas más recientemente [57,152].
Tabla 2. Determinación de compuestos fenólicos en AOV mediante LC Analitos Modalidad Fase estacionaria Tiempo total de
separación (min) Referencia
Productos de oxidación del 3,4-DHPEA-EDA LC-DAD-ESI-MS y LC-ESI-MS/MS C18 Intersil ODS-3 (5 µm, 250 mm x 4.6 mm) 77 [153]
Alcoholes fenólicos, secoiridoides, lignanos y flavonoides
LC-DAD-ESI-TOF-MS
Zorbax Eclipse Plus RP-C18 (1.8 µm, 150 x 4.6
mm)
27 [154]
Diferentes compuestos fenólicos LC-ESI-MS
Zorbax Eclipse Plus (1.8 µm, 150 x 4.6
mm)
35 [155]
p-HPEA-EDA (oleocantal) LC-DAD-ESI-TOF-MS Apollo RP-C18 (5 μm, 250 × 4.6 mm) 65 [156,157]
Dos alcoholes fenólicos, cuatro ácidos fenólicos, oleuropeína y
pinoresinol
LC-ECD Kinetex C18 (2.6
µm,100 x 4.6 mm) 35 [158]
Derivados del ácido cinámico y benzoico, otros ácidos fenólicos, alcoholes fenólicos y flavonoides
UPLC-ESI-MS/MS
Acquity UPLC BEH C18 (1.7 µm, 100 x
2.1 mm)
7.5 [159]
Ácidos y alcoholes fenólicos, secoiridoides, lignanos y
flavonoides
LC-UV-visible Spherisorb ODS2
Tabla 2 (continuación). Determinación de compuestos fenólicos en AOV mediante LC Analitos Modalidad Fase estacionaria
Tiempo total de separación
(min)
Referencia
HYTY y TY LC-ESI-MS/MS Hypersyl Gold C18
(150 x 2.1 mm) 14 [161]
Veintitrés compuestos fenólicos (alcoholes y ácidos fenólicos,
secoiridoides y lignanos)
LC-ESI-TOF-MS Zorbax Eclipse Plus C18
(1.8 µm, 150 x 4.6 mm) 32 [162]
Ocho compuestos fenólicos (TY, HYTY, OI, CAF, FER, VAN,
p-CUM y pinoresinol) LC-ECD Kinetex C18 (2.6 μm, 100 × 4.6 mm) 35 [163] Alcoholes fenólicos, secoiridoides, flavonoides y lignanos LC-DAD-FLD LC-ESI-MS/MS Luna PFP (5 µm, 250 x 4.6 mm) 80 [164]
Ácidos y alcoholes fenólicos, secoiridoides, flavonoides y lignanos RRLC-ESI-TOF-MS Zorbax C18 (1.8 µm, 150 × 4.6 mm) 35 [142,143]
Ácidos y alcoholes fenólicos,
secoiridoides y flavonoides LC-DAD
Chrompack Chromspher C18 (5 µm, 250 x 4.6
mm)
75 [165]
HYTY y TY LC-UV-visible Shim Pack CLC-C18 (5
µm, 250 x 4.6 mm) 13 [166]
Ácidos y alcoholes fenólicos, secoiridoides, flavonoides y
lignanos
RRLC-ESI-TOF Zorbax Eclipse Plus C18
(1.8 µm, 150 x 4.6 mm) 35 [167]
Cuatro ácidos fenólicos (SY, VAN, 4HB, CAF)
LC-DAD y quimiometría
Inertsil-5 C18 (5 μm, 150
x 4.6 mm) 20 [168]
Alcoholes fenólicos, ácido elenólico, secoiridoides, flavonoides y lignanos nanoLC-ESI-TOF-MS BioSphere C18 (3 µm, 100 mm x 75 µm) 45 [169] Compuestos fenólicos, α-tocoferoles, pigmentos y ácidos
grasos
LC-DAD Spherisorb S3 ODS-2 (5
µm, 250 x 4.6 mm) 65 [170]
Fenoles simples (HYTY y TY), ácidos fenólicos (VAN, p-CUM y CIN) y flavonoides (LUT y APIG)
LC-DAD Meta Therm C18 (5µm,
250 x 4.6 mm) 85 [171] Alcoholes fenólicos, secoiridoides, flavonoides y lignanos RRLC-ESI-TOF-MS y ESI-IT-RRLC-ESI-TOF-MSn Zorbax C18 (1.8 μm, 150 x 4.6 mm) 33 [172]
Compuestos fenólicos diversos 2-D-LC-CZE-ESI-TOF-MS Gemini C18 (5 µm, 250 x 3.0 mm) 80 [173]
Triacilgliceroles y ácidos grasos. Scualeno, tocoferoles, clorofilas,
carotenoides y fenoles
Tabla 2 (continuación). Determinación de compuestos fenólicos en AOV mediante LC Analitos Modalidad Fase estacionaria
Tiempo total de separación
(min)
Referencia
Alcoholes y ácidos fenólicos,
secoiridoides, lignanos y flavonoides LC-FLD
Inertsil ODS-3 (5
µm, 15 x 4.6 mm) 55 [175]
Alcoholes y ácidos fenólicos, secoiridoides, lignanos y flavonoides
UPLC-DAD-ESI-MS/MS UPLCTM BEH C18 (1.7 µm, 100 × 2.1 mm) 29 [175]
Lignanos, secoiridoides, fenoles simples y flavonoides LC-DAD-ESI-MS Luna RP18 (5 µm, 250 x 4.6 mm) 70 [176]
Alcoholes y ácidos fenólicos, secoiridoides y lignanos DAD Y LC-ESI/APCI-MS Luna C18 (5 µm, 250 x 3.0 mm) 80 [64]
Ácidos y alcoholes fenólicos, lignanos, flavonoides y secoiridoides
LC-ESI-TOF-MS RP C18 (3.5 µm, 100 x 2.1 mm) 45 [145]
Compuestos fenólicos (TY, CAF, p-CUM, OI) y fosfolípidos (fosfatidiletanolamina y
fosfatidilcolina)
MLC-DAD Nucleosil 120 C18 (5
µm, 200 x 4.6 mm) 57 [177]
Metabolitos de los compuestos fenólicos LC-ESI-MS/MS Luna C18 (5 µm, 150 x 2.0 mm) 50 [178,179]
Alcoholes y ácidos fenólicos,
secoiridoides, flavonoides y lignanos LC-DAD-FLD
ChromSep Inertsil ODS-3 (5 µm, 250 x 4.6 mm) y Spherisorb ODS-1 (5 µm, 250 x 4.6 mm) 73 [180]
Alcoholes y ácidos fenólicos, secoiridoides, vainillina, flavonoides y
ácido elenólico LC-DAD LC-ESI-MS/MS Luna C18 (5 µm, 150 x 2.0 mm) 45 [181]
Alcoholes y ácidos fenólicos,
secoiridoides, flavonoides y lignanos LC-DAD-FLD
Spherisorb ODS-2 (5
µm, 250 x 4.6 mm) 80 [182]
Alcoholes y ácidos fenólicos, secoiridoides, flavonoides, lignanos y
vainillina LC-DAD Spherisorb S3 ODS-2 (5 µm, 250 x 4.6 mm) 65 [183]
Alcoholes y ácidos fenólicos, secoiridoides, flavonoides y lignanos
Como se observa en la tabla, se han empleado fundamentalmente columnas C18, a pesar de que el uso de este tipo de columnas da lugar a tiempos de análisis elevados como consecuencia de su inherente apolaridad. En este sentido, para reducir el tiempo total de análisis se han utilizado diferentes alternativas, como la cromatografía líquida de ultra alta eficacia (UPLC, del inglés ultra performance liquid chromatography) [159,175], la cromatografía líquida de resolución rápida (RRLC, del inglés rapid resolution liquid chromatography) [142,143,167,172] o LC acoplada a técnicas quimiométricas [168]. Una alternativa también interesante para reducir el tiempo total de análisis es el empleo de columnas de diferente naturaleza, como por ejemplo la C18 de núcleo fusionado empleada por Bayram et al. [158]. Este es un importante campo de estudio que permite reducir el tiempo de análisis, sin necesidad de emplear sofisticados y costosos sistemas de separación y detección y será tratado posteriormente.
En relación a la detección, se han empleado, fundamentalmente, espectrofotometría UV-visible [149,168,170,171,174-177,180-183] y espectrometría de masas (MS) [142,143,145,159,172,174-176,178,179,181] y más escasamente, aunque también con buenos resultados, detección electroquímica (ECD, del inglés electrochemical detection) y fluorescente (FLD, del inglés fluorescence detection) [19,30,136,149,158,175,180,182].
Para la detección UV-visible, el DAD ha sido el detector más utilizado en análisis de rutina, puesto que permite obtener el espectro de los compuestos facilitando así su identificación [3,134]. Este aspecto es particularmente importante en la evaluación analítica de los compuestos fenólicos del AOV, debido a la inexistencia de patrones comerciales de muchos de ellos.
El uso de la detección por MS, acoplada a diferentes formas de separación se ha incrementado considerablemente en los últimos años debido a su universalidad, su habilidad para elucidar o confirmar estructuras y su alta sensibilidad en muchos casos. Así, el acoplamiento de RRLC y detección por MS constituye una herramienta muy potente que se ha empleado recientemente para caracterizar alimentos [143], aunque no siempre es posible disponer de un detector de masas, debido fundamentalmente a su elevado coste.
La mayor parte de los artículos publicados que hacen uso de detección por MS para la determinación de compuestos fenólicos en AOV se centran en la caracterización de la fracción fenólica. Por ejemplo, Fu et al. [172] usan RRLC acoplada a espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización por electrospray (ESI-TOF-MS) y también a espectrometría de masas en tándem múltiple con analizador de trampa de iones y fuente de ionización por electrospray (ESI-IT-MSn) para caracterizar compuestos fenólicos en AOVE. Igualmente, merece la pena destacar el
interesante trabajo publicado por Carrasco-Pancorbo et al. [145] en el que desarrollan métodos de CE-TOF-MS y LC-TOF-MS para caracterizar compuestos fenólicos también en AOVE.
Por otro lado, aquellos artículos que se centran en la cuantificación, lo hacen mayoritariamente en la de los compuestos más abundantes, como los derivados secoiridoides. Las importantes diferencias de concentración encontradas para los compuestos fenólicos del AOV, y recogidas en distintos artículos, pueden ser en parte explicadas por la diversidad de procedimientos de extracción y métodos de separación empleados, pero asimismo podrían explicarse debido al problema que existe, a la hora de dar un valor de concentración, con la falta de patrones comerciales para muchos de estos compuestos.
Así, para intentar cuantificarlos se han propuesto diferentes enfoques: hacer uso de las rectas de calibrado de patrón externo de otros compuestos con estructuras similares, o incluso con estructuras totalmente diferentes a la del compuesto en estudio, o mediante el empleo de patrones internos que se añaden directamente sobre el extracto a analizar. Uno de los principales inconvenientes de estos enfoques es que la respuesta relativa de cada analito en el detector de MS (y también en otros sistemas de detección) es muy sensible a la variación en la estructura química y, por tanto, el error cometido en la cuantificación puede llegar a ser bastante elevado [18,24,31,143].
En definitiva, para conocer la concentración real de cada uno de los compuestos fenólicos presentes en el AOV es necesario emplear patrones comerciales y en aquellos casos en los que no se disponga de éstos, deberían de extraerse de la matriz del aceite y purificarse, empleándolos ya puros para definir la respuesta del detector para cada compuesto específico.
La detección fluorescente para el análisis de estos compuestos en AOV fue propuesta por primera vez por Cartoni et al. [184]. Posteriormente, Selvaggini et al. [180] evaluaron los ácidos fenólicos, los derivados secoiridoides y los lignanos del AOV mediante la inyección directa del aceite en el cromatógrafo y llevaron a cabo una comparación de los resultados obtenidos mediante DAD y FLD previa LLE. Para aquellos compuestos presentes en mayores concentraciones, el tratamiento de la muestra propuesto consistía en diluir 2 g de AOV con acetona hasta 10 mL e inyectar directamente en el cromatógrafo esta disolución. De esta forma, obtuvieron buenos resultados para estos compuestos, mayoritarios dentro de la fracción fenólica. También, García et al. [182] investigaron la composición fenólica de AOVs procedentes de distintas variedades de aceituna (Picual, Hojiblanca, Cornicabra y Arbequina) mediante LC-DAD-FLD con el fin de obtener una base de datos. Así mismo, llevaron a cabo una clasificación química de los AOVs mediante procedimientos quimiométricos.
La detección electroquímica para la determinación de compuestos fenólicos en AOV, mediante cromatografía líquida, fue inicialmente propuesta por Mannino et al. [136]. Tisimidou et al. [19] compararon la detección UV-visible, a longitud de onda fija y con DAD, con ECD, y concluyeron que ésta última podría llegar a ser de gran utilidad en la determinación de compuestos fenólicos que se encuentran en pequeñas cantidades, debido a su alta sensibilidad en comparación con la detección UV visible con y sin DAD. A modo de ejemplo, Brenes et al. [149] han empleado ECD para la determinación de estos compuestos mediante LC previa LLE con DMF.
acoplados a LC. La reducción del tiempo de análisis la consiguen gracias al empleo de una columna C18 de núcleo fusionado de 2.6 µm de tamaño de partícula.
Electroforesis capilar
A pesar de que la LC ha sido la técnica mayoritariamente empleada y, además, con resultados satisfactorios para la determinación de compuestos fenólicos en AOV, presenta algunos inconvenientes, como que necesita una cuidadosa preparación de la muestra, por lo que suele requerir más tiempo en el análisis, además de un mayor consumo de disolventes.
La electroforesis capilar (CE) tanto en medio acuoso como no acuoso se ha convertido en una alternativa a la LC en muchos casos, ha sido satisfactoriamente utilizada para la determinación de compuestos fenólicos en una amplia variedad de alimentos (miel, extractos de diversas plantas, vino, cerveza, té, frutas, vegetales y zumos naturales) y está generando grandes expectativas, fundamentalmente debido a su alta resolución, volumen reducido de muestra, tiempo de duración del análisis, simplicidad y bajos costes de operación [134].
La CE se utilizó por primera vez para el análisis de extractos de AOVs en el año 2003 por Bendini et al. [139] y desde entonces la utilización de esta técnica en la determinación de compuestos fenólicos en AOV se ha incrementado cada vez más [35,134,185]. Se ha usado principalmente la modalidad de electroforesis capilar en zona (CZE, del inglés capillary zone electrophoresis) con detección UV-visible [140,141,144,147,186-188] o acoplada a espectrometría de masas [145,146].
Tabla 3. Determinación de compuestos fenólicos en AOV mediante CE Analitos Modo de CE empleado Características Tiempo de separación (min) Referencia
Trece ácidos fenólicos CZE-DAD
Tetraborato de sodio 25 mM (pH 9.15) y 5 % en metanol, 30 kV, 25 ºC. Inyección hidrodinámica, 4 s (50 mbar) 10 [190] Ácidos rosmarínico y cafeico CZE-DAD Tampón borato 40 mM (pH 10) con 1 mM de tiosulfato de sodio, 28 kV, 18 ºC. Inyección hidrodinámica, 5 s (0.5 p.s.i.) 8 [191] Trece compuestos fenólicos (alcoholes fenólicos, ácidos fenólicos, flavonoides y glucósido de
la oleuropeína)
CZE-DAD
Ácido bórico 50 mM (pH 10.2), -30 kV durante 5 min y luego 30
kV, 25 ºC. Inyección hidrodinámica,
25 s (50 mbar). Optimización de la separación
mediante un diseño de experimentos central compuesto
12 [192]
Ácidos fenólicos (GEN, 4HF, VAN, FER,
o-CUM, m-o-CUM, p-CUM)
CZE-ESI-MS Tampón acetato amónico/hidróxido amómico 10 mM (pH 10.0), 25 kV, 25 ºC. Inyección hidrodinámica, 15 s (1 p.s.i.) 15 [144,193] Compuestos fenólicos diversos 2D-LC-CZE-ESI-TOF-MS Acetato de amonio 40 mM (pH 9.5), 25 kV. Inyección hidrodinámica, 24 s (0.5 p.s.i.) 80 [173] Alcoholes fenólicos, ácidos fenólicos, flavonoides, secoiridoides CZE y NACE ESI-TOF-MS
Acetato de amonio 25 mM/ácido acético en metanol/ACN (1:1 v/v) (pH 5.0), 30 kV, 25 ºC. Inyección hidrodinámica, 10 s (50 mbar) 20 [194] Dieciocho compuestos fenólicos (alcoholes fenólicos, ácidos fenólicos,
secoiridoides, flavonoides y lignanos)
CZE-DAD
Condiciones de [141]. Comparación perfiles fenólicos de
AOVE españoles e italianos y relación con las propiedades sensoriales mediante análisis
estadístico
Tabla 3 (continuación). Determinación de compuestos fenólicos en AOV mediante CE Analitos Modo de CE
empleado Características
Tiempo de
separación (min) Referencia
Siete ácidos fenólicos, TY, HYTY y
glucósido de la oleuropeína
RP-CEC-DAD
Fase móvil: formiato amónico 100 mM (pH 3.0)/agua/ACN (5:65:30 v/v/v), 22 kV, 20 ºC. Inyección combinando presión y voltaje (10 bar x 10 kV x 0.5 min)
35 [196] Ácidos fenólicos, alcoholes fenólicos, lignanos, flavonoides y secoiridoides CZE-TOF-MS
Carbonato ácido de amonio 25 mM (pH 9.0), 30 kV. Inyección hidrodinámica, 10 s (50 mbar) 12 [145] Alcoholes y ácidos fenólicos, secoiridoides y lignanos CZE-DAD Tetraborato de sodio 45 mM (pH 9.3), 28 kV, 22 ºC. Inyección hidrodinámica, 3 s (0.5 p.s.i.) 7 [64] Fenoles simples, lignanos, derivados secoiridoides, ácidos fenólicos y flavonoides CZE-DAD Tetraborato de sodio 45 mM (pH 9.3), 28 kV, 22 ºC. Inyección hidrodinámica, 8 s (0.5 p.s.i.) 7 [187] Fenoles simples, lignanos, ácidos fenólicos y flavonoides CZE-DAD Tetraborato de sodio 45 mM (pH 9.3), 28 kV, 22 ºC. Inyección hidrodinámica, 8 s (0.5 p.s.i.) 10 [141,197] Alcoholes fenólicos, lignanos y derivados secoiridoides CZE-ESI-IT-MS Acetato amónico 60 mM (pH 9.5) con 5% 2-propanol, 25 kV, 25 ºC. Inyección hiddrodinámica, 10 s (0.5 p.s.i.) 30 [146] Catorce ácidos fenólicos CZE-DAD Borato de sodio 50 mM (pH 9.6) 20 % 1-propanol y 0.001 % de surfactante policatiónico, 25 ºC, -25 kV. Inyección hidrodinámica, 8 s (0.5 p.s.i.) 35 [188] Alcoholes fenólicos, derivados secoiridoides y lignanos CZE-DAD Tetraborato de sodio 30 mM (pH 9.3), 25 kV, 25 ºC. Inyección hidrodinámica, 8 s (0.5 p.s.i.) 30 y 60 [140] Ácidos fenólicos (CIN, SY, p-CUM, VAN, CAF, DOPAC y ácido protocatecuico)
CZE-DAD
Tabla 3 (continuación). Determinación de compuestos fenólicos en AOV mediante CE Analitos Modo de CE empleado Características Tiempo de separación (min) Referencia
Trece ácidos fenólicos y
taxifolín CZE-DAD Borato de sodio 25 mM (pH 9.6), 25 kV, 25 ºC. Inyección hidrodinámica, 8 s (0.5 p.s.i.) 16 [186] HYTY, TY, 2,3-dihidroxifeniletanol, derivados no identificados de la aglicona de la oleuropeína CZE-DAD Tetraborato de sodio 45 mM (pH 9.6), 27 kV, 30 ºC. Inyección hidrodinámica, 3 s (0.5 p.s.i.) 10 [147] HYTY, TY y derivados secoiridoides no identificados CZE-DAD Tetraborato de sodio 45 mM (pH 9.6), 27 kV, 30 ºC. Inyección hidrodinámica, 3 s (0.5 p.s.i.) 10 [139]
La mayoría de los métodos de CZE que no emplean detección por MS, hacen uso de tampones o buffers de separación, BGEs (del inglés background electrolyte), formados por borato en medio básico puesto que éste ha sido el medio que se ha encontrado más eficiente para separar los compuestos fenólicos.
En el año 2006, Carrasco-Pancorbo et al. [146] desarrollaron el primer método de CE acoplado a MS con ionización por electrospray y analizador de trampa de iones (CE-ESI-IT-MS) para la determinación de compuestos fenólicos pertenecientes a distintas familias. Después, estos autores publicaron un interesante trabajo en el que comparaban los resultados obtenidos por LC-ESI-TOF-MS y CE-LC-ESI-TOF-MS [145], mostrando que pueden usarse ambas metodologías para determinar muchos de los compuestos fenólicos presentes en el aceite de oliva en altas concentraciones y proporcionar información en relación a la presencia y concentración relativa de los menos abundantes. Tanto por CE-MS como por LC-MS se determinaron más de 45 analitos en cada análisis.
que esta metodología se puede aplicar para el análisis de compuestos fenólicos en AOV con alta precisión, linealidad y sensibilidad.
Además de las ventajas ya mencionadas, y especialmente en el caso de muestras no acuosas como el aceite de oliva, el pretratamiento de la muestra puede reducirse bastante al emplear el modo de electroforesis capilar en medio no acuoso (NACE, del inglés non-aqueous capillary electrophoresis). Comparada con la CZE en medio acuoso, NACE presenta una serie de ventajas: permite el uso de capilares más anchos, a consecuencia de un menor calentamiento por efecto Joule; se consigue mayor rapidez en el análisis, puesto que es posible emplear un mayor voltaje de separación; se produce menor adsorción en la pared del capilar; y se puede obtener alta selectividad en la separación, al seleccionar un tampón de separación adecuado [200].
El menor calentamiento por efecto Joule en NACE se justifica por el uso de BGEs de menor conductividad, debido a la utilización de iones en menor concentración, lo que se debe tanto a una inferior concentración de electrolito como a que se produce una menor disociación del electrolito en un medio orgánico [201]. Además, este modo muestra ventajas en el análisis de especies hidrofóbicas, compuestos inestables en agua y compuestos quirales, así como en la separación de compuestos neutros, debido a los desplazamientos en el pKa y a la
heteroconjugación en disolventes no acuosos [202].
Además, la utilización de la técnica en medio no acuoso disminuye aún más las cantidades de residuos generados con respecto a la técnica en medio acuoso, puesto que se simplifican las etapas de pretratamiento de las muestras, ya que, en algunos casos, es posible incluso introducir la muestra directamente en el interior del capilar, contribuyendo así a la sostenibilidad de la química analítica.
Como información general y al igual que ocurre en CZE, uno de los principales inconvenientes de NACE es la sensibilidad en relación a la detección UV-visible, motivo por el que se han empleado sistemas de detección más sensibles, como detección por MS [200,202], fluorescencia inducida por láser (LIF, del inglés laser-induced fluorescence) [204], ECD [209] y FLD [208].
Entre los primeros ejemplos de utilización de NACE en el análisis de alimentos se encuentra el trabajo publicado por Demianová et al. [210] en el que se lleva a cabo la separación de un grupo de polifenoles en vino blanco y tinto. Se trata de un grupo de flavonoides (quercetina, miricetina, catequina y epicatequina) y resveratrol, que se separan empleando un BGE con malonato como electrolito en metanol (pH* 13.5, y 14.2 mmol·L-1 de fuerza iónica). Probaron la
utilización de capilares estándar y recubiertos, observando que, al emplear los segundos, el tiempo de análisis y la repetitividad resultaban mucho mejores. Finalmente, comprobaron que la determinación de las catequinas y del resveratrol es posible sin necesidad de un pretratamiento tedioso de la muestra. Sin embargo, para la determinación de la quercetina y la miricetina es necesaria una extracción en fase sólida.
En 2005, Mendonça et al. [ 211 ] llevaron a cabo la caracterización de compuestos hidroxiaromáticos (antioxidantes sintéticos, vitamina E y otros constituyentes naturales) en aceites vegetales, empleando un BGE que contenía 40 mM de KOH en una mezcla de metanol/1-propanol (15:85, v/v). La importancia de esta investigación se centraba en la reducción del procedimiento previo de preparación de las muestras, puesto que, en algunos casos, las muestras simplemente fueron diluidas con 1-propanol 1:1 (v/v) y directamente inyectadas en el capilar.
En esta misma línea, Gómez-Caravaca et al. [194] han determinado algunos compuestos fenólicos mediante NACE y CZE acopladas a ESI-TOF-MS haciendo una comparación entre ellas. Ambos métodos permiten inyectar los extractos metanólicos directamente en el capilar, para llevar a cabo el análisis de una forma eficiente y rápida. En el caso de NACE es posible además llevar a cabo la inyección directa del aceite de oliva en el capilar.
anteriormente citado [194], donde se compara NACE-ESI-TOF-MS frente a CZE-ESI-TOF-MS, se concluye que el primer método proporciona mayor sensibilidad y estabilidad como consecuencia de la alta volatilidad de los disolventes orgánicos empleados.
A modo de resumen, es interesante destacar la evolución y mejora de la técnica CE en los últimos años. Del uso mayoritario de CZE-UV-visible se pasó al empleo de CZE-ESI-TOF-MS y de ahí al de NACE, que permite la inyección directa del AOV en el capilar. A pesar de que actualmente existen muchos artículos relacionados con el uso de CE en medio acuoso, el hecho de simplificar el proceso al permitir la inyección directa del aceite de oliva proporciona a NACE una gran importancia e interés en futuras investigaciones.
4. Estado actual de las técnicas empleadas en esta memoria
Microextracción líquido-líquido dispersiva
Las técnicas de microextracción están despertando cada vez más interés, debido fundamentalmente a su sencillez, ahorro de tiempo y disolventes y beneficios para el medioambiente. La microextracción líquido-líquido dispersiva (en adelante DLLME, del inglés dispersive liquid-liquid microextraction) fue ideada en 2006 por Rezaee et al. [212] y se puede considerar como una versión miniaturizada de la LLE, basada en el equilibrio de distribución del analito de interés entre la disolución de la muestra y el disolvente extractante y que requiere solo volúmenes de disolventes orgánicos del orden de los µL.
La DLLME convencional se basa en la formación de un sistema ternario de disolventes constituido por la muestra acuosa que contiene los analitos, un disolvente extractante hidrofóbico (de mayor densidad que la muestra) y un disolvente dispersante hidrofílico, que actúa de “puente”, puesto que a su vez es miscible con el disolvente extractante. La DLLME convencional, de acuerdo a estos principios, se aplica sobre muestras acuosas, pero existen bastantes variantes del procedimiento, que se comentarán a continuación.
