los irrigantes endodonticos contra cepas
del Enterococcus Faecalis (ATCC29212)
Item Type info:eu-repo/semantics/bachelorThesisAuthors Díaz Quispe, Yoselyn
Citation 1. Quispe D. Evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodonticos contra cepas del Enterococcus Faecalis (ATCC29212) [Internet]. Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas (UPC); 2017. Available from: http:// hdl.handle.net/10757/621311
Publisher Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas (UPC) Rights info:eu-repo/semantics/openAccess
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EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIBACTERIANO DE LOS
IRRIGANTES ENDODONTICOS CONTRA CEPAS DEL
Enterococcus faecalis (ATCC29212)
TESIS
Para optar el título profesional de:
CIRUJANO DENTISTA
AUTOR
Yoselyn Díaz Quispe
ASESORES DE TESIS
Dr. Néstor Enrique Gonzales
Co-asesora: Juana del Valle
Lima - Perú
2017
DEDICATORIA
A Yrma y Benjamin, mis amados padres, por ser mi ejemplo de perseverancia y paciencia, gracias por su amor constante y apoyo en todas mis metas, porque aprendí que el éxito siempre está para todo aquel que deseé encontrarla, esto es para ustedes…
A Joseph y Aarón, mis grandes amores, porque jamás dudaron de mi potencial y siempre me acompañaron en cada etapa de mi vida…
AGRADECIMIENTOS
A Dios por la oportunidad de cumplir mis sueños, ayudarme a vencer las pruebas y bendecirme siempre
A la PhD. Juana del Valle Mendoza, docente e investigadora de la facultad de Ciencias de salud de la Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas, mi asesora, por acompañarme en cada paso, su tiempo, su conocimiento, su amistad y apoyo total en este presente estudio
Al CD. Esp. Néstor Gonzales por confiar en mí y su apoyo desde el comienzo de la investigación
A la CD. Esp. Stefany Caballero por su paciencia y ayuda a lo largo de este camino
A todo el equipo de IIN, Carmen Tinco Valdez y Miguel Ángel Aguilar, por su apoyo y paciencia al elaborar el presente trabajo
RESUMEN
Objetivo: Comparar in vitro el efecto antibacteriano de tres irrrigantes endodónticos (Hipoclorito de sodio al 5%, Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%) sobre cepas del
Enterococcus faecalis (ATCC29212).
Materiales y Métodos: Se trabajó con una muestra de 10 pocillos por grupo para comparar el efecto antibacteriano en 24, 48 y 72 horas. Se realizaron cuatro pruebas: la actividad antibacteriana se evaluó mediante el método de difusión en agar utilizando medio Brain Heart infusión Broth (BHI). Por otro lado, para la concentración mínima inhibitoria (CMI), y el efecto bactericida y bacteriostático (CMB) se empleó el método de dilución en medio BHI. Para evaluar la prueba de citotoxicidad se utilizó la línea celular MDCK mediante la prueba colorimétrica del MTT.
Resultados: Se observó a las 72 horas que la Clorhexidina al 2% tuvo efecto antibacteriano sobre cepas del Enterococcus faecalis (ATCC29212) con una media de 30.45 + 8.54 mm, mientras que el NaOCl al 5% y el EDTA al 17% tuvieron una media de 19.3+ 1.82 mm y 30.40 + 8.77 mm respectivamente. La CMI de la clorhexidina fue de 1:25 μg/ml, el CMB de la Clorhexidina fue de 1:125 μg/ml y la citotoxicidad de la Clorhexidina fue de 65.6%.
Conclusiones: Al comparar los tres irrigantes endodónticos se demostró que la CHX al 2% es el irrigante con mayor efecto antibacteriano y el que posee menos efecto citotóxico. Palabras Claves: Antibacterianos, Irrigantes del Conducto Radicular, Enterococcus
ABSTRACT
Objective: To compare, in vitro, the antibacterial effect of three endodontic irrrigants (5% Sodium Hypochlorite, 2% chlorhexidine and 17% EDTA) on strains of Enterococcus
faecalis (ATCC29212).
Materials and Methods: It was worked with a sample of 10 wells per group to compare the antibacterial effect in 24, 48 and 72 hours. Four tests were conducted: the antibacterial activity was evaluated with the agar diffusion method in Brain Heart Infusion Broth (BHI). On the other hand, for the minimum inhibitory concentration (MIC) and bactericidal and bacteriostatic effect (MBC), dilution in BHI method was used. To evaluate the cytotoxicity test MDCK cell line was used by the MTT colorimetric assay. Results: It was observed at 72 hours the 2% chlorhexidine had antibacterial effect on strains of Enterococcus faecalis (ATCC29212) with an average of 30.45 + 8.54 mm, while the 5% NaOCl and 17% EDTA had an average of 19.3 + 1.82 mm and 30.40 + 8.77 mm respectively. The MIC of chlorhexidine was 1:25 ug/ml, the MBC Chlorhexidine was 1: 125 ug/ml and the cytotoxicity of Chlorhexidine was 65.6%.
Conclusion: When comparing the three endodontic irrigants it was demonstrated that the 2% CHX is the irrigant with more antibacterial effect and has less cytotoxic effect. Keywords: Anti-Bacterial Agents, Root Canal Irrigants, Enterococcus faecalis
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Pág.
I.INTRODUCCIÓN 1
II.PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIÒN 3
II.1 Planteamiento del problema II.2 Justificación III.MARCO REFERENCIAL 6 IV.HIPÓTESIS 21 V.OBJETIVOS 22 V.1 Objetivo general V.2 Objetivos específicos VI.MATERIALES Y MÉTODO 23
VI.1 Diseño del estudio VI.2 Grupo experimental
VI.3 Operacionalización de Variable VI.4 Técnica y/o procedimiento VI.5 Plan de análisis
VI.6 Consideraciones éticas
VII.RESULTADOS 32 VIII.DISCUSIÓN 44 XI.CONCLUSIONES 52 X.REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS 53 ANEXOS
ÍNDICE DE TABLAS
Pág. TABLA 1 Evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos
(NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre cepas del Enterococcus
Faecalis (ATCC29212)
35
TABLA 2 Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
37
TABLA 3 Evaluación del efecto bacteriostático y bactericida de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
39
TABLA 4 Evaluación de la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre la línea celular MDCK
40
TABLA 5 Comparación del efecto antibacteriano de tres irrigantes endodónticos según el tiempo de evaluación contra cepas del Enterococcus
Faecalis (ATCC29212)
42
TABLA 6 Comparación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos a las 24, 48 y 72 horas contra cepas del Enterococcus
Faecalis (ATCC29212)
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Pág.
GRÁFICO 1 Evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) contra cepas del Enterococcus
Faecalis (ATCC29212)
36
GRÁFICO 2 Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
38
GRÁFICO 3 Evaluación de la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre la línea celular MDCK
I. INTRODUCCIÓN
Los conductos radiculares presentan múltiples microorganismos que afectan la salud de los tejidos periapicales, estudios previos demuestran que la bacteria que se ha encontrado con mayor frecuencia (80-90%) es el Enterococcus faecalis.(1-3) Esta
bacteria anaerobia facultativa es persistente en el sistema del conducto radicular, y se encuentra asociada a los fracasos en los tratamientos endodónticos; debido a que puede sobrevivir y contaminar al conducto tratado endodónticamente.(2) Diferentes causas
acompañan al fracaso endodóntico, una de ellas es la dificultad que existe al eliminar estos microorganismos debido a la cantidad de túbulos dentinarios que tiene las paredes de la dentina, otra causa es la presencia de conductos accesorios o bifurcaciones por la variable anatomía de los conductos radiculares. Esta bacteria persiste y se adhiere a la dentina, impidiendo su remoción completa del conducto radicular. (3)
Por ello, existen diferentes procedimientos que permiten reducir o eliminar la cantidad de bacterias, ayudando a mejorar el pronóstico de la pieza tratada. La preparación química para eliminar los microorganismos del canal radicular son los irrigantes endodónticos, (40) los cuales tienen capacidad antimicrobiana que permiten destruir el
Enterococcus faecalis en los tratamientos odontológicos. En la actualidad existe una
variedad de irrigantes tradicionales como, el hipoclorito de sodio (NaOCl), e irrigantes relativamente nuevos como e l gluconato de clorhexidina (CHX) y el ácido etil diamino tetracético (EDTA), entre otros. (3)
El hipoclorito de sodio (NaOCl) se emplea en concentraciones de 1% al 5%, en la práctica odontológica, es eficaz e ideal para eliminar los microorganismos de los conductos radiculares; pero su uso en altas concentraciones y en contacto con los tejidos adyacentes pueden causar reacciones inflamatorias severas. (4) El ácido etil diamino tetracetico (EDTA) al 17% elimina la materia inorgánica a diferencia del hipoclorito de sodio que solo elimina materia orgánica. También, se utiliza como lubricante, ayuda a permeabilizar los conductos con difícil acceso, y remueve capas de desechos de los túbulos dentinarios y canales laterales. (5)
Por otro lado, el gluconato de clorhexidina (CHX) al 2%, es un desinfectante alternativo que tiene amplia actividad antimicrobiana, carece de capacidad de disolver tejidos orgánicos, posee bajo grado de toxicidad, y es muy usado como irrigante para alterar la permeabilidad de la membrana y ocasionar muerte celular. (6)
Por este motivo; el propósito de este estudio es evaluarin vitro el efecto antibacteriano
de tres irrigantes endodónticos (hipoclorito de sodio al 5%, gluconato de clorhexidina al 2% y EDTA al 17%) sobre cepas de Enterococcus faecalis.
II. PLANTEAMIENTO DE INVESTIGACIÓN
II.1 Planteamiento del problema
Se sabe que una de las causas de los fracasos endodónticos es la recidiva de las bacterias en el conducto radicular producido por su inadecuada eliminación al momento de la preparación químico - mecánica. (7) Los fracasos endodónticos se deben principalmente por la presencia del Enterococcus faecalis, la cual es persistente en los conductos radiculares. (3,5,10,14,15,16,17,18,20,36) Este microorganismo es uno de los factores etiológicos identificados de las patologías periapicales que conllevan al fracaso del tratamiento, por lo cual se debe realizar retratamientos con el fin de eliminar la causa y garantizar salud a los tejidos periapicales. (8-10,16)
Una gran variedad de irrigantes endodónticos se usan en la actualidad, y cada odontólogo escoge a su preferencia de acuerdo a las características que poseen cada irrigante. Se afirma que el NaOCl es el irrigante preferido, y con mayor efecto antibacteriano en los tratamientos endodónticos.(4,35,36,39) También se afirma que el EDTA y la clorhexidina son usados actualmente para mejorar la penetración y desinfección del conducto radicular.(3,5,6,35,36,38-40,48) Existen numerosas investigaciones que comparan el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos sobre cepas del Enterococcus faecalis. (3,4,17,19,20) Conocer cada característica del irrigante e incluso la citotoxicidad de una sustancia química es importante para evitar daños en la mucosa oral. Existen reportes que muestran la actividad bacteriana de los irrigantes endodónticos, sin embargo, en la mayoría de los casos es citotóxico para las células. (,21,23,35,49) Se debe obtener un estudio completo del efecto antibacteriano, la concentración mínima el inhibitoria, el efecto bactericida y bacteriostático, y también
de la citotoxicidad que es otra variable que se debe conocer para tener la seguridad que el irrigante es biocompatible con los tejidos. El mayor efecto antibacteriano, el menor porcentaje de concentración, e l efecto bactericida y una baja c itotoxicidad de los irrigantes son características que hacen a un irrigante ideal para lograr el éxito en la salud de los tejidos periapicales. (16)
Por eso, a través de esta investigación se busca responder la pregunta, ¿Cuál de los tres tipos de irrigantes endodónticos tuvo mayor efecto antibacteriano sobre cepas de
Enterococcus faecalis?
II.2 Justificación
El presente estudio es importante porque permite generar nuevos conceptos para conocer el efecto antibacteriano, la concentración mínima inhibitoria, el efecto bactericida y bacteriostático, la citotoxicidad de los irrigantes endodónticos (NaOCl al 5%, CHX al 2% y EDTA al 17%) en una sola investigación; y así generar conocimiento válido y confiable en el área de endodoncia.
Además, tiene importancia en el área clínica, ya que permite conocer los beneficios y las desventajas de usar uno u otro irrigante. La elección correcta de irrigantes puede lograr retratamientos efectivos y también conservar la salud a los tejidos adyacentes; logrando así el éxito en los tratamientos de conductos. Si se logra identificar el irrigante ideal con todas las características mencionadas, se deberá promover su uso como primera opción y mayor frecuencia en las prácticas clínicas diarias.
Por este motivo, esta investigación tuvo como propósito la evaluación in vitro del efecto antibacteriano de tres tipos de irrigantes (hipoclorito de sodio al 5%, gluconato de clorhexidina al 2% y EDTA al 17%) sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212).
III. MARCO REFERENCIAL
Enterococcus faecalis
Es un microorganismo que tiene la capacidad de formar biopelículas a las que se le agregan y co-agregan otros microorganismos, los cuales están incrustados en la matriz extracelular. (4) El biofilm forma una película acondicionada en el cual se adhieren las bacterias planctónicas o bacterias aisladas a la superficie para luego desprenderse, este mecanismo a nivel celular es la causa de infecciones a nivel de los tejidos apicales. Las células bacterianas dentro del biofilm desarrollan resistencia 1000 veces más que la forma planctónica. (8) Por ello, el Enterococcus faecalis es un o r g a n i s m o predominante y se ha demostrado que un 70% s e pueden encontrar en conductos tratados endodónticamente. (9)
El Enterococcus faecalis es una bacteria anaerobia facultativa Grampositiva, que se caracteriza por tener la capacidad de sobrevivir, debido a que utiliza como fuente nutricional el suero, que se origina del ligamento periodontal y del hueso alveolar. (4) Estos microorganismos son suficientemente pequeños para invadir y vivir dentro de los túbulos de la dentina. Crecen en ambientes ásperos y pueden sobrevivir en los ambientes extremos, por ejemplo, pueden crecer entre 10°C – 45°C a un pH de 9,6.(15) Poseen la capacidad de crecer en presencia o ausencia de oxígeno. También, otra característica importante de este organismo es que puede colonizar y sobrevivir como un organismo solo sin el apoyo de otras bacterias. (8-10)
Este microorganismo es menos dependiente de los factores de virulencia, porque posee una gran capacidad para sobrevivir y persistir como un patógeno. Cuando ingresa a los conductos radiculares produce enzimas proteolíticas, sustancias de agregación y de adherencia que favorecen a la persistencia de la bacteria. (8) Además, el Enterococcus
faecalis posee serina proteasa, gelatinasa, y la proteína de unión a colágeno, que ayudan
a que se una a los túbulos dentinarios. Cada uno de estas características de la bacteria favorece a infecciones muy diversas a nivel de los tejidos periapicales. (8,10)
Esta bacteria es un habitante normal en la cavidad oral. Se encuentra entre el 4 al 40% de las infecciones endodónticas primarias, y la persistencia es mayor en lesiones periapicales. En algunos casos, se ha encontrado al Enterococcus faecalis como el único organismo presente en los dientes con lesiones periapicales. Este microorganismo se asocia con diferentes enfermedades perirradiculares incluyendo infecciones endodónticas, como abscesos periapicales agudos e infecciones persistentes. (11)
Efecto Antibacteriano
Es la cualidad de un fármaco o agente químico de inhibir o eliminar el crecimiento de bacterias patógenas al actuar sobre ellas indirectamente impidiendo el desarrollo bacteriano, o directamente causando muerte celular. (25) Existen dos métodos para evaluar el efecto antibacteriano: El método de contacto directo y de difusión de agar. En el método de contacto directo, el volumen del agente químico se mezcla en un medio de cultivo; donde se puede observar la presencia o ausencia del crecimiento bacteriano. (36) Por otro lado, en el método de difusión de agar es la prueba más común descrito por Kirby-Bauer. (47) Este método está actualmente estandarizado por el Subcomité Nacional de Normas de Laboratorios Clínicos (NCCLS) de los Estados Unidos. (28,41) Se pueden efectuar este método con la ayuda de discos o solamente con
pocillos dentro de las placas de cultivo. (28) Dicho método, se logra saturando el disco de papel con el agente químico o colocándolo directamente en los pocillos sobre la superficie de placas de agar. Después de cierto periodo de tiempo se forman zonas de inhibición alrededor de los discos o pocillos, estas zonas significan la presencia de actividad antimicrobiana. (36)
Para poder evaluar in vitro el efecto antibacteriano, se puede distinguir efectos al agregar un agente químico, como el efecto bacteriostático y bactericida. En el caso del efecto bacteriostático se refiere a la inhibición del desarrollo de colonias bacterianas y se mide mediante la Concentración Mínima inhibitoria (CMI). La técnica más frecuente para determinar la eficacia bacteriostática in vitro es la técnica de dilución en caldo, y radica en efectuar un cultivo en medio líquido con diferentes concentraciones de los agentes químicos y observar la aparición de turbidez (indicador de desarrollo bacteriano) al cabo de un tiempo determinado. También se puede efectuar en la técnica de dilución de agar, la principal desventaja de este método es la cantidad de muestras para evaluar. (25,26,28)
Mientras que el efecto bactericida es la muerte bacteriana producida por un fármaco o agente químico y esto se mide por la disminución de bacterias viables. (26) Para ello se toman muestras de los tubos en los que se determinó la CMI y se realizan diluciones seriadas en escala logarítmica (1:2, 1:4, 1:8, etc.) que se siembran en placas de cultivo sin microorganismo y se espera un tiempo para el desarrollo de colonias. En el recuento de colonias se calcula el número de bacterias viables; utilizando como control un cultivo de bacterias no expuesta al fármaco en estudio. El efecto bactericida se mide mediante la Concentración Mínima Bactericida (CMB), la cual se define como la concentración más baja del agente químico que elimina el 99,9% del microorganismo, al cabo de 24
horas de incubación. Este método es útil en casos especiales para un conocimiento exacto de la capacidad de un antibacteriano para destruir una bacteria específica. (28)
Efecto Citotóxico
Se define como “una alteración de las funciones celulares básicas que conlleva a que se produzca un daño que puede ser detectado”. (31) El propósito de determinar la
citotoxicidad de diferentes sustancias y/o agentes químicos es para decidir su uso en el área clínica. (24) Existen diferentes pruebas in vitro para hallar el potencial citotóxico de una sustancia química, las más comunes son: la prueba de citotoxicidad del rojo neutro, láctico deshidrogenasa (LDH) y la prueba de MTT (bromuro de 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio). (41,43,44) Las ventajas de estas pruebas radican en que son sencillas, baratas, cuantificables y s e p u e d e n reproducir. (24)
En el ensayo rojo neutro se fundamenta en el protocolo descrito por Borenfreund y Puerner (1984). En este método se realiza con placas de cultivo con 96 pocillos, cada uno de 6,4 mm de diámetro, donde se pueda conservar las células, y utilizar múltiples concentraciones de sustancias químicas, controles positivos y negativos. (30) Se realiza
el tratamiento a las células y se le adiciona el rojo neutro, con el fin de ser absorbido y retenido por cada célula viva y observar los efectos inmediatos. La intensidad del color corresponde a la acumulación del neutro rojo en los lisosomas no lesionados que corresponde a las células vivas en cada pocillo. (44) Los resultados se obtienen midiendo con un espectrofotómetro, donde se programa para realizar mediciones individuales por cada pocillo. Esta metodología ayuda al investigador a tener resultados rápidos y útiles. (27,31,32)
También se utiliza la prueba de LDH para hallar el efecto citotóxico. La LDH es una enzima que se encuentra en el citoplasma de las células vivas y se libera cuando ocurre lisis celular por una sustancia toxica. Después de realizar la prueba, se mide inmediatamente la cantidad de LDH liberada, que es un indicador de la muerte celular irreversible. Este ensayo se caracteriza por ser de evaluación simple y rápida. (24, 27, 44)
Otra de las pruebas más comunes es el MTT (bromuro de 3[4,5- dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio), que fue descrito por primera vez por Mossmann en 1983. Asimismo, Denizot y Lang, en 1986 y Hansen en 1989 realizaron modificaciones en el protocolo con el fin de mejorar la sensibilidad del ensayo. (44,45) El MTT es una sal de tetrazolio que es soluble en agua, el cual se convierte en un formazan de color purpura por la unión del anillo tetrazolio a la deshidrogenasa de la mitocondria activa. Este producto formazan es impermeable a las membranas celulares, por lo tanto, se acumula en las células sanas. (41,44) La cantidad de formazan se puede observar por la intensidad del
color que está directamente relacionada con el grado de integridad de las mitocondrias y se mide mediante un registro de cambios de absorbancia en un espectrofotómetro de lectura de placas. Esta prueba es útil para descubrir compuestos citotóxicos en general, y es un método simple, rápido y preciso. (45,46)
Irrigantes endodónticos
Son agentes químicos capaces de actuar sobre la flora microbiana, eliminan el tejido necrótico y conservan lubricado el conducto. (40) Son complementos esenciales de
limpieza y conformación de los conductos radiculares para alcanzar la desinfección antes de terminar los tratamientos endodónticos. Tres de estos irrigantes son los más destacados: Hipoclorito de Sodio, Ácido Etilendiamino Tetracético y Clorhexidina. (50)
El Hipoclorito de sodio (NaOCl) es un líquido claro, pálido, verde-amarillento, extremadamente alcalino (pH 11) y con fuerte olor clorino. Es el irrigante más utilizado en el área de endodoncia por su capacidad de limpieza, efecto antibacteriano, neutralizante de productos tóxicos, disolvente de tejido orgánico, acción emulsificante, desodorizante y blanqueante. La falta de biocompatibilidad que posee puede originar lesiones severas en la mucosa o en el hueso alveolar, ya que puede ocasionar quemaduras y/o necrosis por ser un agente citotóxico. (12) Se le ha atribuido varias características beneficiosas durante la terapia endodóntica, como, por ejemplo: expulsa los detritos que se liberan en la preparación biomecánica de los conductos radiculares, humedece los conductos favoreciendo el trabajo de los instrumentos, destruye y elimina todos los microorganismos de los conductos, tiene el poder de disolver rápidamente los restos de tejidos y posee baja tensión superficial que ayuda a penetrar en todas las concavidades del conducto radicular. Por ello, estas propiedades hacen al NaOCl la opción más común para la irrigación de los conductos radiculares. (15)
El ácido etilendiamino tetracético (EDTA) es “un ácido orgánico tetracaboxilico derivado del etano por aminación de sus dos grupos metilo y posterior diacetilación de cada uno de los grupos aminos”. Las propiedades principales son la capacidad de
actuar como agente quelante de iones metálicos, fijarse al ión metálico y separarse de la molécula en la que se encuentra. El término “quelar” deriva del griego “khele” que significa garra o pinza. El mecanismo de acción de los agentes quelantes es “robar” iones metálicos del complejo molecular. Gracias a esta propiedad el EDTA es muy eficaz para eliminar Ca, Mg, Mo, Fe, Cu y Zn, que son iones metálicos que se encuentran en la dentina del diente. (15,40)
Se afirma que el pH ideal para la descalcificación dentinaria del EDTA debe estar próximo al pH neutro 7,5. Por ellos, en 1975 Ostby agrega sal disódica al hidróxido de sodio para obtener sal trisódica a un pH de 7.3, logrando así la fórmula original del EDTA al 17%.(40) Por ello, se recomienda su uso porque localiza las entradas de los conductos, ayuda al ensanchamiento químico e inocuo de los conductos estrechos y/o calcificados, elimina el barrido dentinario, mejora la limpieza mecánica de las paredes del conducto radicular, posee una acción antibacteriana, aumenta la permeabilidad dentinaria a los medicamentos y facilita la extracción de instrumentos rotos. (48)
En la década de los 40, científicos, desarrollaron la Clorhexidina (CHX) en la Industria Imperial de Química en Inglaterra. En 1954 emergió al mercado como el antiséptico para heridas en la piel, posteriormente comenzó a usarse en medicina y cirugía (para el paciente). El mismo equipo de investigación desarrolló un grupo de compuestos denominados polibisguanidas, los cuales poseen efecto antibacteriano contra microorganismos de la cavidad bucal, siendo utilizados principalmente en el área de endodoncia. (38)
La clorhexidina es un antiséptico catiónico que posee la capacidad de unirse fuertemente a la membrana celular bacteriana, en bajas concentraciones produce un aumento de la permeabilidad con filtración de los componentes intracelulares como el potasio (efecto bacteriostático), y en concentraciones altas produce la precipitación del citoplasma bacteriano y ocurre lisis celular (efecto bactericida). (6,35) En boca y los dientes se absorbe inmediatamente a las superficies con película adquirida, proteínas salivales y a la hidroxiapatita. Esta absorción se libera paulatinamente entre 8-12 horas y después de 24 horas se puede encontrar la clorhexidina en concentraciones bajas. Esta propiedad impide la colonización de bacterias durante ese tiempo. El pH de la clorhexidina es entre 5,5 y 7,0 pero con un pH entre 5,0 y 8,0 posee efecto frente a las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, y también puede reducir los microorganismos aerobios y anaerobios. (36,38,39)
A diferencia del hipoclorito de sodio, la CHX tiene un potencial citotóxico moderado y en el uso clínico se sugiere usar concentraciones bajas de 0.12%, 0.2 % y 2% (13) Por ellos, cada propiedad de la clorhexidina hace de ella una opción más entre los irrigantes endodónticos y se recomienda como una solución de irrigación final, debido a su propiedad de inhibir la adherencia de ciertas bacterias a la dentina. (15)
En el 2003, Torabinejad y col. evaluaron la capacidad del MTAD (mezcla de un isómero de tetraciclina, un ácido y un detergente) para eliminar al Enterococcus faecalis, y comparar su eficacia a la del h i p o c l o r i t o de sodio (NaOCl) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Se realizaron dos pruebas: difusión de agar y la concentración mínima inhibitoria para estas soluciones. La medición de zonas de
inhibición mostró que el MTAD es tan eficaz como el NaOCl al 5,25% y significativamente más eficaz que el EDTA (p <0,0001). La medición de las concentraciones mínimas inhibitorias demostró que el MTAD sigue siendo eficaz a una dilución 200x, el NaOCl deja de ejercer su actividad antibacteriana más allá de dilución 32x y el EDTA no presentó ninguna actividad antibacteriana. Por ello, el MTAD es una solución eficaz en la erradicación del Enterococcus faecalis. (15)
En el 2006, Bulacio y col. evaluaron la concentración mínima inhibitoria y el efecto antibacteriano del NaOCl al 2,5%, gluconato de clorhexidina (CHX) al 0,2% y de EDTA al 17% en Enterococcus faecalis. Se utilizó: agar y dentina radicular contaminada. Se empleó porciones medias y apicales de raíces humanas, esterilizadas y contaminadas con Enterococcus faecalis. Cada muestra se sumergió en soluciones de irrigación, se incubaron a 37 ° C y se realizó un conteo de células viables a las 0, 4, 8 y 24 horas. Se encontró que la Concentración mínima inhibitoria del NaOCl y la CHX fue de 0.2% y la del EDTA fue menor al 5%, mientras que en la prueba de difusión de agar el NaOCl tuvo 21 mm de halos de inhibición, y la CHX y EDTA tuvieron 14 y 17 mm respectivamente. Por lo cual se concluyó que el NaOCl al 2,5% inhibió totalmente durante 24 horas en la zona apical y durante 8 horas en la zona media; la CHX al 0,2% provocó una reducción de más de 5 log CFU (unidades formadoras de colonias) y el EDTA al 17% indujo una reducción de más de 3 log CFU en todas las porciones medias y apicales de la raíz. (16)
En el 2007, Ferraz y col. evaluaron in vitro la eficacia antimicrobiana de la CHX (0,2%, 1% y 2%), CHX en gel (0,2%, 1% y 2%), y NaOCl (0.5% ,1%, 2.5%, 4% y 5.25%) contra 5 bacterias anaerobias facultativas y 4 bacterias anaerobios Gram-negativos. Se realizó la
prueba de difusión de agar y se midió cada pocillo para observar el efecto antibacteriano de cada irrigante. Las zonas de inhibición de crecimiento se producen cuando las bacterias de prueba estaban en contacto con 2% gel de gluconato de clorhexidina (11,79 mm), siendo significativamente diferente (p <0,05) de las zonas de inhibición de crecimiento producidos por todas las concentraciones del NaOCl, incluyendo 5.25% (9.54 mm). Sin embargo, no hubo diferencia estadísticamente significativa (p> 0,05) entre el crecimiento zonas de inhibición obtenidos con concentraciones iguales de solución de clorhexidina y gel. Los resultados de este estudio indican que, en cuanto a sus propiedades antimicrobianas se refiere, la clorhexidina tiene un gran potencial para ser utilizado como una sustancia química auxiliar endodóntica. (35)
En el 2009, Giardino y col. evaluaron la acción antimicrobiana de Biopure MTAD, Tetraclean, Clorhexidina y NaOCl al 5,25% contra el Enterococcus faecalis,
Porphyromonas gingivalis y Prevotella intermedia. Se utilizó el método de difusión de
agar para observar la actividad antimicrobiana. Se encontró que el NaOCl al 5,25% indujo una zona más grande de inhibición en Prevotella intermedia y Porphyromonas
gingivalis (P <0,0001). Asimismo, el MTAD y el Tetraclean fueron más eficaces para
inhibir el crecimiento del Enterococcus faecalis bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas, en comparación con la CHX al 2% y NaOCl (P <0,0001). Se concluyó que el NaOCl al 5,25% mostró una alta actividad antimicrobiana frente a bacterias anaerobias, el MTAD y el Tetraclean mostraron una alta acción frente a anaerobias estrictas y facultativas, y la Clorhexidina mostró la más baja actividad antibacteriana contra las bacterias anaerobias estrictas y facultativas. (20)
En el 2009, Espindel y col. compararon la efectividad en la remoción del Enterococcus
faecalis con hipoclorito de sodio al 5%, gluconato de clorhexidina al 2% y ácido
etilendiamino tetracético (EDTA) al 1,7%. Se prepararon treinta premolares extraídas que fueron sembrados en agar BHI con las cuatro combinaciones y un grupo control (solución salina). Se midió el crecimiento de Enterococcus faecalis por conteo de unidades formadoras de colonias (UFC). Se observaron i nc o nt ab le s UFC en todas las muestras del grupo control. Finalmente, se encontró mayor cantidad de UFC en los grupos de (hipoclorito de sodio al 5% + EDTA al 1,7%) y (gluconato de clorhexidina al 2% + EDTA al 1,7%). El uso de EDTA al 1,7% disminuyó la efectividad de las sustancias irrigadoras en la remoción del microorganismo. Se concluyó, que el hipoclorito de sodio y gluconato de clorhexidina fueron relativamente efectivos en la eliminación de Enterococcus faecalis. (3)
En el 2011, Dagna y col, compararon in vitro mediante el ensayo de MTT, la eficacia antimicrobiana del NaOCl al 5%, CHX al 0.2%, peróxido de hidrógeno al 3% y EDTA al 17% contra Enterococcus faecalis y Streptococcus mutans. Se utilizó el método de contacto directo con dientes humanos uniradiculares recién extraídos, los cuales se trataron endodónticamente y se inocularon con las cepas bacterianas. Luego se dividieron los grupos para enjuagarlos con las cuatro soluciones y un control positivo. Finalmente, la viabilidad bacteria se evalúo por medio del ensayo de MTT. Se encontró mayor reducción bacteriana para ambas cepas con los grupos de NaOCl al 5% y EDTA al 17%, mostrando una reducción significativamente mayor en comparación con los otros grupos (p<0.001). Mientras que para la CHX al 0.2% y el peróxido de hidrógeno al 3% no se mostró diferencias significativas, pero estos dos grupos mostraron significativamente mayores porcentajes de reducción comparado con el grupo de solución salina (p<0.001).
El presente estudio confirmo que el NaOCl al 5% y EDTA al 17% tuvieron mayores efectos antimicrobianos. (50)
En el 2011, Karale y col, evaluaron in vitro la eficacia antibacteriana del NaOCl al 3%, la alta frecuencia de corriente alterna (HFAC) (sistema endodontico endox), CHX al 2% en la eliminación de Enterococcus faecalis de conductos infectados. Se utilizaron ochenta dientes anteriores superiores extraídos, los cuales fueron instrumentados, esterilizados e inoculados con la bacteria para ser incubada. Después, se dividieron los grupos para ser sometidos a las soluciones e incubarlos durante 24 y 48 horas. Se obtuvo que el NaOCl al 3% expuso una reducción al 100% de crecimiento bacteriano a las 24 y 48 horas. Mientras que el HFAC mostró una reducción de 70% a las 24 horas y de 55% a las 48 horas, y para la CHX se mostró una reducción de 95% a las 24 y 48 horas. En el presente estudio todas las soluciones son eficaces eliminando Enterococcus faecalis, pero el NaOCl mostró una máxima actividad antibacteriana que la CHX y HFAC. (49)
En el 2012, Kamberi y col. evaluaron la eficacia antimicrobiana de Biopure MTAD, NaOCl y EDTA contra el Enterococcus faecalis en canales de raíces contaminadas. La muestra que se utilizó fue de cuarenta y dos dientes humanos unirradiculares extraídos, que fueron inoculados con Enterococcus faecalis y se incubaron durante cuatro semanas. Luego de ellos, las muestras se dividieron en dos grupos; un grupo control y cinco grupos experimentales irrigados con soluciones de NaOCl al 1,5%, NaOCl al 3%, Biopure MTAD; NaOCl al 1,5% / EDTA al 17% o NaOCl al 3% /EDTA al 17%. Después de la semana de incubación, se confirmó la inhibición de la bacteria por medio de la ausencia de turbidez del medio de incubación. Los resultados muestran diferencias significativas entre Biopure MTAD y 1,5% NaOCl, 1,5% NaOCl / 17% de EDTA y 3%
NaOCl / 17% de EDTA (P = 0,008 para cada comparación), pero no hubo diferencia significativa entre Biopure MTAD y 3% NaOCl (P = 0,242). Estos hallazgos sugieren que Biopure MTAD posee actividad bactericida superior en comparación con el NaOCl y E D T A contra el Enterococcus faecalis. (21)
En el 2012, Arias y col. evaluaron la actividad y la formación de biopelículas antimicrobianas de tres barnices de clorhexidina (EC40, Cervitec - CE y Cervitec Plus - CEP) en cinco cepas de Enterococcus faecalis: Enterococcus faecalis ATCC 29212,
Enterococcus faecalis EF-D1 (de un tratamiento endodóntico fallado), Enterococcus faecalis 072 (queso), Enterococcus faecalis T-1765 (infección nosocomial), y una cepa
de Enterococcus durans (de un tratamiento endodóntico fracasado). Se utilizó la prueba de contacto directo y se observaron los resultados a las 24 horas. Los resultados demostraron que la EC40 erradico todas las cepas de Enterococcus faecalis excepto el ATCC 29212, donde se logró una disminución de 98.78%, y la CE y CEP mostraron mayor actividad antimicrobiana contra Enterococcus durans y Enterococcus faecalis 072. Mientras, que el EC40 inhibió completamente la formación de biofilm de
Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus durans y Enterococcus faecalis 072,
y la CE y CEP llevaron a más del 92% de la reducción del biofilm, excepto en el caso de
Enterococcus faecalis T-1765 (76,42% en la CEP). Los tres barnices estudiados mataron
las cepas probadas de Enterococcus faecalis e inhibieron la formación del biofilm, pero los mejores resultados se observaron en el primer barniz de clorhexidina(EC40). (13)
En 2013, Manikandan y col. evaluaron la capacidad de tolerancia alcalina del
Enterococcus faecalis. El microorganismo se cultivó en BHI y se mantuvó a diferentes
digluconato de clorhexidina (CHX) y MTAD (mezcla de un isómero tetraciclina, un ácido, y un detergente) para evaluar la eliminación del Enterococcus faecalis. Los resultados no mostraron diferencias estadísticamente significativas en el crecimiento del E. faecalis debido al cambio de pH 7.3 a 12.3 y la densidad óptica media fue de (0.193 + 0.044 a 0.139 + 0.037). Se demostró la susceptibilidad de la bacteria con el NaOCl al 2% (0,128 + 0,03), la CHX al 1% (0,146 + 0,01), el MTAD (0.204+ 0,03) y con el control (0,254 + 0,02). Se concluyó que la NaOCl al 2% y C H X al 1% eran altamente eficaces en la eliminación del Enterococcus faecalis mientras MTAD tenía actividades limitadas. (23)
En el 2013, Afzal y col. estudiaron la actividad antibacteriana de CHX 2%, NaOCl 5,25%, MTAD y Vancomicina sobre la misma bacteria. Se seleccionaron ochenta premolares humanos y se seccionaron debajo de la unión cemento-esmalte a los 15 mm de longitud. El Enterococcus faecalis ATCC 29212 y las cepas clínicas se sub-cultivaron a partir de placas de agar de nutrientes en el laboratorio. Se inocularon colonias individuales de ambas cepas a partir de cultivos de agar nutriente de triptona caldo de soja (TSB) y se incubaron a 37 ° C durante 2 horas. Después de 2 horas, se añadieron las muestras de dientes preparados y se incubaron a 37 ° C durante 7 días. Se dividieron en dos grupos de 40 cada uno: el primer conjunto de 40 muestras para ATCC 29212 y el segundo conjunto de 40 muestras de aislados clínicos. Cada set fue más subdividido en cuatro grupos de 10 dientes de acuerdo con los irrigantes seleccionados. Los resultados mostraron que el MTAD presento 32 mm, la Clorhexidina de 24 mm, el Hipoclorito de Sodio de 8 mm y la vancomicina de 14 mm de halos de imbibición en el método de difusión de agar, mientras que en método de contacto directo se realizó conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) encontrando para el hipoclorito de sodio cero
UFC, la clorhexidina tuvo 0.004 x 106 UFC, el MTAD y agua destilada tuvo una media de 2,4 x 106 UFC y 4,7 x 106 UFC respectivamente. Se concluyó que, en el método de difusión en disco de agar, tanta clorhexidina y MTAD mostraban una mejor propiedad antibacteriana. Mientras, que en la prueba con dientes humanos el hipoclorito de sodio mostro mayor propiedad antimicrobiana entre los demás irrigantes contra el
IV. HIPÓTESIS
El hipoclorito de Sodio (NaOCl) al 5% es el irrigante con mayor efecto antibacteriano, bacteriostático y bactericida sobre cepas de Enterococcus faecalis, y de mayor efecto citotóxico comparado con los irrigantes de Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%.
V. OBJETIVOS DEL ESTUDIO
V.1 Objetivo general:
Comparar in vitro el efecto antibacteriano de los irrrigantes endodónticos (Hipoclorito de sodio al 5%, Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%) sobre cepas del Enterococcus
faecalis (ATCC29212).
V.2 Objetivos específicos:
1. Evaluar el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212).
2. Evaluar la concentración mínima inhibitoria de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212).
3. Evaluar el efecto bacteriostático y bactericida de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212).
4. Evaluar la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre la línea celular MDCK.
5. Comparar el efecto antibacteriano de tres irrigantes endodónticos según el tiempo de evaluación contra cepas del Enterococcus Faecalis (ATCC29212).
6. Comparar el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos a las 24, 48 y 72 horas contra cepas del Enterococcus Faecalis (ATCC29212).
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
VI1. Diseño de estudio
El diseño del estudio fue de tipo experimental in vitro.
VI2. Grupo experimental
La unidad de análisis estuvo conformada por un pocillo en placas y microplacas con cultivos de cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212) frente a tres irrigantes endodónticos NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%. El efecto antibacteriano se evaluó mediante la técnica de difusión de agar. El tamaño muestral fue de 8 pocillos para cada grupo, se determinó mediante el software Stata® versión 12.0, utilizando la fórmula de comparación de dos medias, para lo cual se tomaron los datos encontrados en la prueba piloto. Por disponibilidad de insumos se trabajó con más de 8, o sea 10 pocillos (Anexo 1)
La distribución de los grupos quedo establecida de la siguiente manera:
Grupo 1: Un pocillo e n placas y microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis ( ATCC29212) frente a la solución de NaOCl al 5% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 2: Un pocillo e n placas y microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis ( ATCC29212) frente a la solución de Clorhexidina al 2% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 3: Un pocillo e n p lacas y microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis ( ATCC29212) frente a la solución de EDTA al 17% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 4: Un pocillo e n p lacas y microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis ( ATCC29212) frente a la solución de PBS (tampón fosfato salino) a las 24, 48 y 72 horas.
Criterios de Selección
1. Un pocillo en placas de 15 cm de diámetro con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) f re nte a la solución de NaOCl al 5%.
2. Un pocillo en placas de 15 cm de diámetro con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) f re nte a la solución de Clorhexidina al 2%.
3. Un pocillo en placas de 15 cm de diámetro con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) f re nte a la solución de EDTA al 17%.
4. Un pocillo en placas de 15 cm de diámetro con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) f re nte a la solución de PBS.
5. Microplacas de 96 pocillos con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) frente a la solución de NaOCl al 5%.
6. Microplacas de 96 pocillos con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) frente a la solución de Clorhexidina al 2%.
7. Microplacas de 96 pocillos con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) frente a la solución de EDTA al 17%.
8. Microplacas de 96 pocillos con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) frente a la solución de PBS.
VI3. Operacionalización de variables
Variable Definición Operacional Indicadores Tipo
Escala de
medición Valores
Efectividad
bacteriana
Inhibición del desarrollo o crecimiento de las bacterias debido a la presencia de los
irrigantes endodónticos Método de difusión en pocillos Cuantitativa De razón Continua Milímetros de inhibición Irrigantes endodónticos
Agentes líquidos con capacidad de eliminar microorganismos Tipos irrigantes Cualitativa Nominal politómica - NaOCl al 5% - CHX al 2% - EDTA al 17% Concentración mínima inhibitoria
Cantidad del extracto
en la cual es inhibido el crecimiento bacteriano Método de microdilución Cuantitativa De razón Continua Milímetros de mínima inhibitoria Efecto bactericida y bacteriostático Menor concentración de la
sustancia capaz de inhibir totalmente el crecimiento microbiano Método de difusión de agar Cualitativa Nominal Dicotómica CMB / Ausencia de CMB Citotoxicidad Concentración de una sustancia que disminuye la
viabilidad de las células a un 50% Prueba de MTT Cuantitativo Intervalo Continua Porcentaje de absorbancia Tiempo
Periodo determinado para evaluar los resultados de
cada prueba Ficha de recolección de datos Cualitativo Ordinal Politómica 24, 48 y 72 horas
VI4. Técnica y/ o procedimiento
Permisos
Se procedió a enviar una carta por medio de la co-asesora, encargada del laboratorio de microbiología y biología molecular del instituto de investigación nutricional (IIN) – Universidad Agraria para poder realizar los procedimientos microbiológicos y químicos.
Capacitación
Se realizó un entrenamiento para realizar la preparación de los especímenes, placas y microplacas de Enterococcus faecalis, y una capacitación previa para la identificación de las unidades formadoras de colonias bacterianas. Se elaboró bajo la supervisión y colaboración de la co-asesora, encargada del laboratorio de microbiología y biología molecular.
Recolección de irrigantes endodónticos y bacteria
Los irrigantes endodónticos (NaOCl al 5% “Ciatex®”, CHX 2% “FGM®” y EDTA al 17% “Eufar®”) que se utilizaron en el estudio se adquirieron en el Stand Mogollones (Cercado de Lima, Perú). Además, el Enterococcus faecalis (ATCC29212) se adquirió del laboratorio GenLab del Perú, representante del laboratorio MicroBiologics (USA). Las bacterias fueron cultivadas siguiendo las instrucciones del fabricante. (Anexo 6)
Cultivo bacteriano
Las muestras bacterianas se cultivaron en placas de agar BHI (Agar de infusión de cerebro corazón).
Para lo cual se comprimió la parte superior de la ampolla del tubo que contenía el microorganismo hasta que se liberó el líquido que hidrato a las bacterias liofilizadas. Luego, se apretó la parte inferior de la unidad y se trituro el sedimento con el líquido hasta que la suspensión del sedimento se volvió homogénea. Posteriormente el hisopo incluido se saturo con las bacterias hidratadas y se transfirió a una placa de agar BHI. Se inoculo la placa de cultivo haciendo rodar el hisopo con suavidad sobre un tercio de la placa y con ayuda de un asa de siembra estéril, se creó vetas para facilitar el cultivo y aislamiento de las colonias. Las placas que contenían las bacterias fueron incubadas en una cámara de anaerobiosis controladas con anaerocult y anaerotest a 37°C durante 72 horas. (Anexo 7)
División por grupos
Se procedió a dividir en cuatro grupos y se codifico de acuerdo a cada grupo. La distribución fue de la siguiente manera:
Grupo 1: Un pocillo e n Placas y Microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis ( ATCC29212) frente a la solución de NaOCl al 5% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 2: Un pocillo en Placas y Microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) a la solución de Clorhexidina al 2% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 3: Un pocillo en Placas y Microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) a la solución de EDTA al 17% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 4: Un pocillo en Placas y Microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212) a la solución de PBS (tampón fosfato salino) a las 24, 48 y 72 horas.
Actividad antibacteriana
La actividad antibacteriana se analizó mediante el método de difusión de agar en pocillos (perforación en gel de agar). (25) Se utilizó placas de Agar BHI inoculadas con 0.5 ml de la bacteria evaluada (la bacteria utilizada para la inoculación estuvo en una infusión de Agar BHI). Las placas fueron incubadas durante 3 horas a temperatura ambiente hasta que se solidifico el agar que contiene la bacteria. Posteriormente, con ayuda de un sacabocado, en cada una de las placas se realizó perforaciones de 9 mm de diámetro. A cada pocillo se le adicionará 0,2 ml de cada uno de los irrigantes endodónticos evaluados (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%), como control se utilizó PSB (tampón fosfato salino). Todo el procedimiento fue realizado dentro de una cabina de flujo laminar tipo II para mantener las condiciones de esterilidad. Todas las placas fueron incubadas en condiciones de aerobiosis controlada, a 37°C durante 24, 48 y 72 horas. Trascurrido el tiempo de incubación, se procedió a medir con una regla los diámetros de los halos de inhibición en milímetros (mm). Los datos fueron registrados mediante una ficha de recolección de datos. (Anexo 2 y Anexo 8)
Concentración mínima inhibitoria (método de microdilución)
Este método permite determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cada extracto siguiendo las recomendaciones del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012).
Para lo cual se realizó diluciones seriadas entre 100-0 μg/ml de los irrigantes endodónticos utilizados (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%). En las placas de Agar BHI inoculadas con la bacteria se realizaron 3 pocillos por cada placa Petri y se adiciono
200 µl de cada dilución, previamente se vibró en Vortex para lograr homogeneidad de la dilución.
Las placas contenidas con las diluciones se incubaron en condiciones de aerobiosis controladas a 37°C durante 24, 48 y 72 horas. Finalmente, se procedió a medir cada halo de inhibición y los datos fueron registrados mediante una ficha de recolección de datos. (Anexo 3 y Anexo 9)
Concentración mínima bactericida (CMB)
Para la determinación de la concentración mínima bactericida (CMB) se realizó en la campana de flujo laminar diluciones de los tres irrigantes endodónticos en placas de microtiter de 96 pocillos. Se adiciono 200 μl de cada dilución y 2 μl de suspensión bacteriana (0.5 McFarland). Después, se colocó cada dilución en las placas de Agar BHI y se dispersó la dilución con el asa de siembra. Finalmente, las muestras fueron incubadas en condiciones aeróbicas a 37ºC durante 24, 48 y 72 horas. Se observaron en estos tiempos y los datos fueron registrados mediante una ficha de recolección de datos (Anexo 4 y Anexo 10)
Actividad citotóxica o prueba de citotoxicidad (ensayo del MTT)
La citotoxicidad de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) fue evaluado utilizando una prueba colorimétrica basada en la reducción de 3-(4,5- Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) por las enzimas mitocondriales (1,2, 3). La prueba fue realizada en una microplaca para cultivo celular de 96 pocillos estéril. (8 mm de diámetro; Falcon Plastics, Oxnard, CA).
En cada pocillo se cultivó 1x104 células/pocillo MDCK (células de riñón de mono) en 200 µL de medio DMEN suplementado (500 ml Dulbeco suplementado con 50 ml de suero bovino fetal, 5.5 ml de penicilina/eritromicina). Las muestras fueron incubadas a 37 ºC en una atmosfera húmeda al 5% de CO2 durante 24 horas. Posteriormente, a la monocapa celular se le adiciono los irrigantes endodónticos a diferentes concentraciones (escala 1/1 a 1/1000). Para cada ensayo se utilizó un control positivo de viabilidad celular (medio de cultivo, pero sin ningún tipo de extracto). El cultivo fue incubado a 37ºC durante 3 días. La morfología de las células fue inspeccionada diariamente y observada al microscopio por si se detectase alguna alteración.
Posteriormente se le adiciono 20µL de solución de MTT (3mg/mL en PBS 1X) a cada pocillo. Las muestras fueron incubadas durante 3 horas a 37 ºC. El medio fue cuidadosamente removido y se obtuvo los cristales de formazán, los cuales fueron diluidos con 200µL DMSO (Dimetil Sulfóxido).
Finalmente, la viabilidad celular fue calculada como porcentaje de la absorbancia obtenida en cada pocillo vs. el control de células no tratadas. Los valores de absorbancia (570nm) fueron medidos en un lector de ELISA (Biorad). El CC50 fue determinado utilizando un programa de computadora Pharm/PCS. (27) Para confirmar los resultados obtenidos con la prueba de MTT, las monocapas serán evaluadas microscópicamente para evidenciar cambios morfológicos. Los datos fueron registrados mediante una ficha de recolección de datos. (Anexo 5 y Anexo 11)
VI5. Plan de análisis
Para el análisis univariado se procedió a obtener la media y desviación estándar para cada uno de los grupos de estudio conformado por los irrigantes de hipoclorito de sodio al 5%, Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%
Además, se determinó si la muestra tenía distribución normal mediante la prueba de Shapiro – Wilk.
Para el análisis bivariado se procedió realizar la prueba de ANOVA por no presentar distribución normal, de no presentar esta distribución se procedió a realizar la prueba de Kruskall Wallis para comparar el efecto antibacteriano de cada grupo de estudios anteriormente mencionado.
La base de datos se realizó en el programa Microsoft Excel y se analizaron los resultados mediante el paquete estadísticos Stata® versión 12.0.
VI6. Consideraciones éticas
Este estudio no presenta implicaciones éticas debido a que se procedió a realizar pruebas in vitro que consiste en comparar el efecto antibacteriano de los irrigantes en la bacteria del Enterococcus faecalis (ATCC29212).
Se procedió a realizar una solicitud dirigida al comité de ética de la Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas, para que autorizar la ejecución del proyecto de investigación. Posteriormente se procedió a enviar una solicitud a la Oficina de Grados y títulos para la aprobación del trabajo de tesis. (Anexo 12)
VII. RESULTADOS
El presente estudio tuvo como objetivo comparar in vitro el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos (Hipoclorito de sodio al 5%, y Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%) sobre cepas del Enterococcus faecalis (ATCC29212) en tres tiempos 24, 48 y 72 horas. Para ello, se realizaron 10 pocillos por cada grupo y como control positivo se utilizó PBS (solución fosfato salino). Los resultados mostraron promedios similares a las 24 horas, a las 48 horas el EDTA al 17% tuvo mayor efecto, mientras que a las 72 horas la Clorhexidina al 2% (30.45 mm) y el EDTA al 17% (30.4 mm) tuvieron mayor efecto antibacteriano que el NaOCl al 5%.
En la tabla 1, se evaluó el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, y CHX 2% y EDTA 17%) sobre cepas del Enterococcus Faecalis. Para el grupo de NaOCl a las 24 horas el promedio fue de 19.18 + 1.45 mm, para el grupo de CHX para este mismo tiempo se encontró el promedio de 18.7 + 3.94 mm; finalmente para el EDTA el efecto antibacteriano fue de 19.4 + 3.83 mm. También se evaluó a las 48 horas, encontrándose para el NaOCl, CHX y EDTA promedios de 19.3 + 1.82, 23.6 + 1.41 y 30.4 + 8.77 mm respectivamente. El último tiempo evaluado fue a las 72 horas encontrando para el NaOCl un promedio de 19.3 + 1.82 mm, para la CHX se observó un promedio de 30.45 + 8.54 mm y para el EDTA se encontró un promedio de 30.4 + 8.77 mm. Así mismo se realizó la prueba de Shapiro Wilk y se encontró que la distribución fue normal para los grupos de CHX24h (p=0.087), EDTA24h (p=0.984), NaOCl48h (p=0.999), CHX48h (p=0.198), EDTA48h (p=0.207), NaOCl72h (p=0.999) y EDTA72h (p=0.207); finalmente no se encontró normalidad en los grupos de NaOCl24h (p=0.031) y CHX72h (p=0.026). (Tabla y Gráfico 1)
Se realizó la evaluación de la concentración mínima inhibitoria ( C M I ) de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis. Observándose que para el caso del NaOCl y EDTA la CMI se obtuvo en la dilución 2 (1:5 µg/ml) con promedios de 9.92 mm y 12.56 mm respectivamente, mientras que para la CHX la CMI se obtuvo en la dilución 3 (1:25 µg/ml) con un promedio de 9 mm. Por otro lado, a partir de la dilución 4 (1:125 µg/ml) no se encontró efecto antibacteriano de dichos irrigantes endodónticos. (Tabla y Gráfico 2)
Al evaluar el efecto bactericida ( C M B) de los irrigantes endodónticos sobre cepas de
Enterococcus faecalis. Se observó que para el NaOCl y EDTA la CMB se obtuvo hasta
la dilución 3 (1:25 µg/ml), mientras que la CHX es bactericida hasta la dilución 4 (1:125 µg/ml). Por otro lado, a partir de la dilución 5 (1:725 µg/ml) no se encontró efecto bactericida de los irrigantes endodónticos. (Tabla 3)
Se evaluó la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre la línea celular inmortalizada MDCK. Los resultados indican que el NaOCl y EDTA son altamente tóxicos a bajas concentraciones, la CC50 se observa a una concentración del 5%, con una viabilidad celular de 28.78% y 28.09% respectivamente. También se pudo observar los resultados a una concentración de 50% del NaOCl con un promedio de 5.34%, CHX al 65.60% y EDTA al 13.07%. (Tabla 4 y Gráfico 3)
Se realizó la comparación del efecto antibacteriano de tres irrigantes endodónticos según el tiempo de evaluación (24, 48 y 72 horas) contra cepas del Enterococcus Faecalis. Se realizó la prueba de Kruskall Wallis encontrándose para el NaOCl que no existen diferencias significativas a las 24, 48 y 72 horas, mostrando un p valor de 0.804, en la
CHX se encontró diferencias significativas al comparar el efecto antibacteriano en los tres tiempos, encontrándose un mayor promedio a las 72 horas (p=0.003). Finalmente, para el EDTA se realizó la prueba de ANOVA y se encontró diferencias significativas, observando promedios similares a las 48 y 72 horas con un p valor de 0.032. (Tabla 5)
En la tabla 6 se comparó el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos a las 24, 48 y 72 horas contra cepas del Enterococcus Faecalis. Se realizó la prueba de Kruskall Wallis a las 24 horas no encontrándose diferencias significativas para el NaOCl, CHX y EDTA con un p valor de 0.769, mientras que a las 48 horas se realizó la prueba de ANOVA y se encontró diferencias significativas con un p valor de 0.000. Finalmente, para las 72 horas se realizó la prueba de Kruskall Wallis encontrándose diferencias significativas con un p valor de 0.000. (Tabla 6)
TABLA 1
Evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre cepas del Enterococcus Faecalis
(ATCC29212)
Grupo Media
(mm) Mediana D.E Mínimo Máximo Normalidad*
NaOCl24h 19.18 19.75 1.45 17 21 0.031 CHX24h 18.7 19 3.94 14 23 0.087 EDTA24h 19.4 20 3.83 15 23 0.984 NaOCl48h 19.3 19.5 1.82 17 21 0.999 CHX48h 23.6 23.5 1.41 22 26 0.198 EDTA48h 30.4 29 8.77 22 40 0.207 NaOCl72h 19.3 19.5 1.82 17 21 0.999 CHX72h 30.45 30 8.54 22 40 0.026 EDTA72h 30.4 29 8.77 22 40 0.207
*Prueba de Shapiro Wilk
GRÁFICO 1
Evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre cepas del Enterococcus Faecalis
(ATCC29212) 0 10 20 30 40 NaOCl 5% CHX 2% EDTA 17% 19.18 18.7 19.4 19.3 23.6 30.4 19.3 30.45 30.4 H al os de i nhi bi ci on (m m ) Irrigantes Endodónticos
TABLA 2
Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
mm: Tamaño de los halos de inhibición
Stock (concentración inicial): NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%
Irrigantes Diluciones (ug/ml)
STOCK (1:5) (1:25) (1:125) (1:725) (1:3500) (1:15000) (1:745000)
NaOCl 18.98 9.92 0 0 0 0 0 0
CHX 30.45 20.11 9 0 0 0 0 0
GRÁFICO 2
Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
mm: Tamaño de los halos de inhibición
Stock (concentración inicial): NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%
0 5 10 15 20 25 30 35 H al o s d e in h ib ic ión (m m ) Diluciones de Irrigantes NaOCl CHX EDTA
TABLA 3
Evaluación del efecto bacteriostático y bactericida de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
Microorganismo Irrigantes Concentración (ug/ml)
STOCK 1:5 1:25 1:125 1:725 1:3500 1:15000 1:745000 Enterococcus faecalis NaOCl - - CMB - - - - - CHX - - - CMB - - - - EDTA - - CMB - - -
CMB: Concentración mínima bactericida
TABLA 4
Evaluación de la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre la línea celular MDCK
CN: Control negativo Irrigantes Concentraciones V/V (%) 0 5 10 20 30 40 50 CN NaOCl 5% 100 28.78 14.25 10.96 13.03 9.09 5.34 4.03 CHX 2% 100 99.76 99.73 99.43 96.80 71.93 65.60 2.95 EDTA17% 100 28.09 17.25 13.67 14.79 12.39 13.07 7.17
GRÁFICO 3
Evaluación de la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre la línea celular MDCK
TABLA 5
Comparación del efecto antibacteriano de tres irrigantes endodónticos según el tiempo de evaluación contra cepas del Enterococcus Faecalis (ATCC29212)
Irrigante Tiempo
(horas) Media D.E p
NaOCL 5% 24 19.18 1.45 0.804* 48 19.3 1.82 72 19.3 1.82 CHX 2% 24 18.7 3.94 0.003* 48 23.6 1.41 72 30.45 8.54 EDTA 17% 24 19.4 3.83 0.032** 48 30.4 8.77 72 30.4 8.77
* Prueba de Kruskall Wallis ** Prueba de ANOVA
TABLA 6
Comparación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos a las 24, 48 y 72 horas contra cepas del Enterococcus Faecalis (ATCC29212)
Tiempo Irrigante Media D.E p
24 horas NaOCL 5% 19.18 1.45 0.769* CHX 2% 18.7 3.94 EDTA 17% 19.4 3.83 48 horas NaOCL 5% 19.3 1.82 0.000** CHX 2% 23.6 1.41 EDTA 17% 30.4 8.77 72 horas NaOCL 5% 19.3 1.82 0.000* CHX 2% 30.45 8.54 EDTA 17% 30.4 8.77
* Prueba de Kruskall Wallis ** Prueba de ANOVA
V. DISCUSION
En los últimos años, se ha reportado que la bacteria Enterococcus faecalis se encuentra en un 80-90% en los conductos radiculares. (1,3) Por tal motivo, este estudio tuvo como
finalidad evaluar in vitro el efecto antibacteriano de tres tipos de irrigantes usados en el área de endodoncia (Hipoclorito de sodio al 5%, Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%) sobre cepas del Enterococcus faecalis (ATCC29212).
Existen diferentes métodos para evaluar el efecto antibacteriano, siendo las más utilizadas, la difusión de agar en discos y difusión agar en pocillos (28). En este estudio se eligió el método de difusión de pocillos, similar a lo realizado por Ferraz y col. en el año 2007. (35) La ventaja de este método es que el irrigante endodóntico está en contacto directo en los pocillos, lo cual favorece a una mayor sensibilidad del irrigante. Además, es una técnica simple, fácil de realizar e interpretar los resultados. (36) Mientras que, en
el método de discos, el grosor y el tamaño del poro del papel es muchas veces una limitante, además de su alto costo. (28) En el presente estudio se utilizó el método de difusión de agar de pocillos, por las ventajas antes mencionadas para determinar el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos.
Se evaluó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los irrigantes endodónticos, en esta investigación se utilizó la técnica de dilución de caldo BHI (Brain Heart Infussion), donde se puede obtener cultivos de microorganismos de difícil y rápido crecimiento entre los que se incluyen a bacterias anaerobias como el Enterococcus faecalis. En el estudio realizado por Stella y col. (28) realizaron la comparación de técnicas mostrando que la técnica de dilución en caldo es la más sensible y específica. La primordial ventaja de la
dilución en caldo radica en utilizar tubos o microplacas que aumentan la sensibilidad para el efecto antibacteriano debido a las diluciones pequeñas, lo cual favorece a inhibir a la bacteria y es de vital importancia al momento de encontrar la concentración mínima inhibitoria. (16,25,26,28,41)
Asimismo, en el presente estudio se evaluó como otra variable, el potencial citotóxico de los irrigantes endodónticos. El propósito de determinar esta característica de los irrigantes endodónticos, se debe porque ellos son usados clínicamente y la citotoxicidad es crucial para su acción. (24,27) Para el presente estudio se utilizó el ensayo de reducción del MTT
debido a que es un método sencillo, cuantitativo que permite determinar la viabilidad celular, la cual es determinada por la actividad mitocondrial de las células viables. Asimismo, Huertas en el año 2015, también realizó la prueba de citotoxicidad y demostró que el MTT tiene como ventaja que es un método cuantitativo a diferencia de los otros métodos que son cualitativos. (32,33, 41)
Existen diversos irrigantes para la desinfección de los conductos en los tratamientos de endodoncia, y los más usados y conocidos son el Hipoclorito de Sodio (NaOCl), Gluconato de Clorhexidina (CHX) y Ácido etilendiamino tetracético (EDTA). El NaOCl es el más utilizado en el área de endodoncia por su capacidad antibacteriana, disolvente de tejido orgánico, pero es un agente irritante y tóxico. (4,35,36,39) Mientras que la Clorhexidina tiene una amplia gama de actividad contra las bacterias Gram positivas y negativas, posee efecto bacteriostático y bactericida, y tiene poca o ninguna capacidad tóxica. (6,35,36,38,39) Finalmente, el EDTA se utiliza como lubricante, ayuda en la localización de los conductos con difícil acceso, remueve capas de desechos de los túbulos dentinarios y canales laterales.(3,5,40,48) Cada uno se usa en diferentes
