BLOQUE I
TEMA 3. TÉCNICAS DE TINCIÓN BACTERIANA
Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente con un microscopio óptico, es recomendable someterlos a procesos que permiten su mejor observación, razón por la cual es recomendable al hacer la preparación fijarlos y teñirlos para aumentar la visibilidad, acentuar las características morfológicas y conservarlos para su estudio en un futuro.
FIJACIÓN: Cuando se observan las células teñidas al microscopio deben parecerse lo más posible a las células vivas. La fijación es el proceso mediante el cual se conservan y se fijan en su posición las estructuras externas e internas de las células de los microorganismos. Inactiva enzimas que podrían alterar la morfología celular y endurece las estructuras celulares, de manera que conserven su estado original y que no se alteren durante el proceso de tinción y de observación. Normalmente, durante la fijación se destruye al microorganismo y se adhiere firmemente al portaobjeto.
Existen dos clases de fijación fundamentalmente diferentes:
1. Los bacteriólogos fijan con calor frotis bacterianos calentando suavemente con una llama una película de bacterias secada previamente al aire. Este método conserva adecuadamente la morfología general, pero no las estructuras internas de la célula.
2. Hay que utilizar la fijación química para proteger la subestructura fina y la morfología de microorganismos delicados de mayor tamaño. Los fijadores químicos penetran las células y reaccionan con componentes celulares, normalmente proteínas y lípidos, para inactivarlos y convertirlos en insolubles e inmóviles. Las mezclas comunes de fijación contienen sustancias como etanol, ácido acético, cloruro mercúrico, formaldehido y glutaraldehído.
COLORANTES Y TINCION SIMPLE: Los numerosos tipos de colorantes empleados para teñir microorganismos poseen dos características en común:
1) Todos poseen grupos cromóforos, grupos con enlaces dobles conjugados que dan el color al colorante;
2) Pueden unirse a las células mediante enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos. Por ejemplo, un colorante cargado positivamente se une a estructuras de la célula cargadas negativamente.
Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases generales, tomando como base la naturaleza de su grupo cargado.
superficies de las células bacterianas están cargadas negativamente, estos colorantes se emplean a menudo en la bacteriología.
2. Los colorantes ácidos, como la eosina, rosa de bengala y fucsina ácida, son aniónicos o poseen grupos cargados negativamente, como carboxilos (-COOH) e hidroxilos fenólicos (-OH). Los colorantes ácidos, debido a su carga negativa, se unen a estructuras celulares cargadas positivamente.
El pH puede modificar eficazmente la tinción, pues la naturaleza y el grado de la carga de los componentes celulares cambian con el mismo. Por ello, los colorantes aniónicos tiñen mejor en condiciones ácidas, en que las proteínas y muchas otras moléculas poseen una carga positiva; los colorantes básicos son más eficaces a valores de pH más elevado. Aunque las interacciones iónicas constituyen la forma más común de fijación de los colorantes, éstos se unen también por medio de enlaces covalentes o debido a sus características de solubilidad. Por ejemplo, el DNA se puede teñir con el método de Feulgen, en el que el reactivo de Schiff se une covalentemente a los azúcares de desoxirribosa después del tratamiento con ácido clorhídrico. El Sudán III (negro Sudán) tiñe selectivamente los lípidos porque es liposoluble, y no se disuelve en las partes acuosas de las células.
Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente con tinción simple, esto es, utilizando sólo un colorante. El valor de ésta clase de tinción radica en su simplicidad y facilidad de empleo. Se cubre el frotis fijado con un colorante durante el tiempo adecuado, se lava el exceso de colorante con agua y se seca el portaobjetos. Los colorantes básicos como el cristal violeta, azul de metileno y carbolfucsina se emplean con frecuencia para determinar el tamaño, la forma y la organización de las bacterias.
LA TINCION DIFERENCIAL: Los métodos de tinción diferencial permiten clasificar a las bacterias en grupos diferentes según sus propiedades de tinción. La Tinción de Gram, desarrollada por el médico danés Christian Gram en 1884, es el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de un método de tinción diferencial porque divide a las bacterias en dos clases – grampositivas y gramnegativas.
TINCION DE ESTRUCTURAS ESPECÍFICAS: Se han desarrollado numerosos métodos de tinción a lo largo de los años para estudiar las estructuras bacterianas específicas con el microscopio óptico. Uno de los más sencillos es la tinción negativa, técnica que revela la presencia de cápsulas difusas alrededor de muchas bacterias. Se mezclan las bacterias con tinta china (India ink) o colorante de nigrosina y se extiende en una capa fina sobre un portaobjeto. Después de secarlo al aire, las bacterias aparecen como cuerpos más claros en medio de un fondo azul oscuro, porque la tinta y las partículas de colorante no pueden penetrar ni la célula bacteriana ni su cápsula. La extensión de la zona luminosa está determinada por el tamaño de la cápsula y por su propia célula. Apenas se produce modificación de la forma bacteriana y la célula se puede teñir con un colorante de contraste para conseguir incluso una mejor visibilidad (Investigar cápsulas y capas mucosas).
Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium forman una estructura de supervivencia en condiciones ambientales desfavorables excepcionalmente resistente durante periodos largos de tiempo. Esta estructura inactiva se denomina endospora a que se desarrolla dentro de la célula. La morfología y la localización de las endosporas varían con la especie y son a menudo de un gran valor para la identificación bacteriana; pueden ser esféricas o elípticas, con un diámetro menor o superior al de la bacteria madre. Se pueden observar con el microscopio de contraste de fases o mediante tinción negativa. Las endosporas no se tiñen bien con la mayoría de los colorantes, pero una vez teñidas, resisten intensamente la decoloración. Esta propiedad es la base de la mayoría de los métodos de tinción de esporas. Con el método de Schaeffer-Fulton las endosporas se tiñen primero calentando las bacterias con verde malaquita, luego se lava la preparación con agua para eliminar el resto del colorante y, por último, se emplea la safranina como colorante de contraste. Esta técnica produce endosporas verdes en células de color rosa a rojo (Investigar estructura de las endosporas bacterianas).
TAREA A REALIZAR
1. Defina los conceptos de fijación, colorante, cromófero, colorante básico, colorante ácido, tinción simple, tinción diferencial, mordiente, tinción negativa y tinción ácido-alcohol resistente.
