Niuñoz C a r r i l l o Ma. del

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kU'?OZ CURILL0 & A R I A

SEL ROC10 K:iñCkRITA/

TELEPONO:

91

595 4 11

33

TEZCOCO

MATRICULA : 3324563

I NGENI EBI A BIOQUSIiiIC A INDUSTRIAL

/

TRILESTFIE:

88

-

O

HORAS DE TRABAJO: 24 horas semanales

LUGAR: L a b o r a t o r i o de Bioqudmica, Centro de Botánica, C o l e g i o de Postgraduados, Chapingo, X€xico.

/ ' FRCHA DE I N I C I O : 22 de mareo de 1988.

FECHA

DE TERMINACION:

XI

de enero de

1989.

TU!LüR: Dra. María L u i s a Ortega Delgado

D i r e c t o r a de I n v e s t i g a c i ó n d e l l a b o r a t o r i o de bioquími

-

ca, Centro de B o t h i c a , C o l e g i o de Postgraduados.

T I T U L O ~ R O Y E C T O :

"ANALISIS DE AZUCARES SOLUBLES Y ALMIDON

EN

LOS

DIFEREN

-

TES COMPONENTES i)E LA SEMILLA DE FRIJOL (Negro Arribe-

/

//

iio)

1'.

Niuñoz C a r r i l l o

Ma.

d e l Dra. Maria L u i s a Ortega

D.

Rocio Marg.

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I.

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AN-GISIS DE AZUCARES SOLUBLES Y ALMIDON EN L O S

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Los ciirboi5iUr'?ktor son los nut.rimentos n2:s abund:i!ite'i y

-

L a r c t o s cue ::e e n c u e n t r a n en l a n a t u r a l e z a y ?or. L-tnto l o s n:5s convumiuos

>or

l o s nun;.Lnos: en DIU'~:-~OS paises ;Iilieiiccios c o n s t i

tuyen 53-3@ de l a d i e t a d e l pueblo.

-

Los c a r b o h i u r a t o s ue 18.9 e s u e c i e s Uel r e i n o v e g e t a l se

--

s i n t e t i z a n por e l pr'oceso de i s i o t o s f n t e s i s y s o n l o s a r i n c i -

mies com->uestos q u f s i c o s almacenodores de l a e n e r g í a r a d i a n t e d e l s o l . Fn l a f o t o s í n t e s i s , e l bióxido de carbono r e a c c i o n a

con a;ua para foriimr Clucosi., con e l consecuente desprenuimien

-

t o ue oxígeno:

6C02

+

12H20

---+

C,h O

+

602

+

6H20. (Badui,

1982).

o 1 2 6

Los azúcsr.es coffio tilucosa y s a c a r o s a , a l i g u i . 1 cue l o s

-

p o l i s a c d r i d o s , a l n i d ó n y c e l u l o s a , son c a r b o n i d r a t o s proauci- dos a t r a v é s a e é s t e mcznisoo y se L o c a l i z a n en f r u t a s y vege

-

t a l e s . L a mayoría ae l o s comnuestos o r g á n i c o s cue s e encuen--

tran e n las n1ants.s y e n los m í m a l e s son derivados a e c a r o o h i

-

d r a t o s , ya aue aún l a mism s f n t e s i s ue p z o t e i n a s a e i l e v 2 a

-

cabo a través de amiy,&2idoS nue s e generan de l a r e a c c i ó n en--

t r e c a r b o h i d r a t o s y compuestos nitrogene.dos.

En

utuchos c a s o s , los a z ú c a r e s s i m 3 l e s n o se encuentran l i b r e s en l a n a t u r a l e z a

como t a l e s , s i n o f o r n i a n a o uolisac8.ridos cuy8.s propiedades fun-

c i o n a l e s v a r f a n en C ~ U B aliinento; e s d e c i r , pueaen formar par- t e a e l a e s t r u c t u r a firme u e l prcducto e n cuyo caso nomslmen- t e no son cii[Teriblea, o b i e n aueucn s e r cnrbohidra.tos de r e s e r

va e n e r g é t i c a . En g e n e r - a l , l o s cai-borAdi.atoS mRs conociaoc

--

s o n 1 2 s a c a r o s a o :^zúcar ue cañri, l a g l u c o s a , c,ue e s u t i l i z a a a ü i i e c t a m n t e e n e l o e t i b o l i s i i . o , e l a i n i a ó n ~011.0 f u e n t e ue _:.e-- s e r v a e n e r e é t i c a y f i n o i i w r i t e , l a ct l u l o s a , que s i r v e ue es---

-

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r,a estr,uctuL..i ;iuiudcu ue los c a r h . , i a r a t o s L;etexu.ina su i'uncionalidau y sus progiedaaes, l o cutil repercute, r? @ U v e z , de d i í ' e r e n t e s foi-m?s e n l o s a i i u e n t o s , principalniente en ins c s r a c t e r f s t i c a s ue swbor, vF:;cosidm, estructura y c o l o r

----

(Santos, 1 9 3 9 ) .

La reserva. enegCtica de c2rboniaratos e n los anlmáles y e n l a s plantas s3n e i FlucSFeno y e l aimiaón, res3ectivsniente que son polímeI.os de mo1écuic:s ae lucosa, cuyo conteniao

-

c a l S r i c o e s ae 4 hca.i/g. La i i i d r 6 i i s i s enzimAtica úe é s t o s

-

p o i i s a c á r i a o s genera uniaaaes de lucosa oue son u t i i i z s a a s en e l metabolismo de todss 1a.s e s p e c i e s animales y v e g e t a l e s (Bauui, 1982). Por otr:? p a r t e , en l a mayoría. ae l o s alinen-- t o s de o r i g e n v e g e t a l sien.pre e x i s t e una f r a c c i d n de p o l i s a c á

-

r i a o s no d i g e r i b l e s , aenomin-aa f i b r a cruaa. Esta f r a c c i d n

-

e s t á formada. por- c e l u l o s a , pentosantis, pectinbs y heniiceluio-

s ; i s , que s J no s e r metebolizadas p o r e l organismo humano, s e

eliminan e n 1:is heces.

Los carbohiaratos pueaen s e r monosacáridos, o l i g o s a c á r i - dos, y polisacfiridos. P o r a e f i n i c i ó n , l o s carbohiaratos son a o l i h i d r o x i a l d e h f a o s o polinidroxicetonas y sus aerivaaos.

c i ó n ae grupos -C:IOH 'i l o c n w n a b5sica ue átomos ae c:.rbono. E l $-t3mo ue carbono UDS u 0 1 ; l i c e r z l o e n í U o e s ktim&trico, y

-

por i o t:~into pueue e x i s t i r e n forma i r 3 n é r i c a

D

o

L.

Touos los monosacáriaos (glucosa, fructosa, galactosa,

-

arabinosa, r i b o s a y r:-ininosa) son s o l u b l e s en agua, y sus

solu

-

cienes t i e n e n , en g e n e r a l , un sabor dulce. La mayoría ae és- t o s azúcares s e tian obtenido en forma c r i s t a l i n a . (Solomons,

1979).

La glucosa es ffiuy abunaante e n diferentes f r u t a s y vege- t a l e s como uvas, manzanas, f r e s a s , c e b o l l a s , papas y o t r a s , y

su

concentrncibn depende básicamente a e l krado de madurez d e l producto.

L a f r u c t o s a se encrentra junto con l a glucosa en l o s ju- gos de v a r i a s frutas y s e obtienen en cantidades equimolaxes

con _{l a} glucosa a l i i i d r o l i z a r l a sacarosa, l a fructosa e s un

-

azúcar reauctor y íorma p a r t e ue alLunos polisacdridos, prin- cipalmente de l a i n u l i n a .

La g a l a c t o s a se encuentra r e l a t i v a n e n t e en DOC? cantidad en formr l i b r e como monosacárido, pero e s abundante en forma combinaaa.

La mayoría ue las p e n i o s i s se ericuentrzn en forme ui?oli- meros y muy poco e n e s c a a o l i b r e con!o ni,Jr!o:;i-ic::!riaos. L,a arabi

-

nasa e s c o n z t i t u y e n t e ue v a r i o s j o l i s a c L r i u o s i i a u x o s ar.i!o;l-- nos que abunu:in en rriuchss plantas.

L,os o l i ~ : o s : c + r i u o s son nam-tlniente suluisles en aFua y

-

t i e n e n un 61scio tie polimeiizacibii i;ue yuer;e ser ue u09 i s e i s

unidalies ue rnonómeios. Ueritro de dr.te 6riui.o UP coinruestos

--

l o s m.<s importsntes s,sn l o s uisscáxduos y zicunos t r i y t e t r a

-

sscilridos. Un iiiszcrkido SE p ro uuce

- o r

l a couuensacir5n de

-

dos nimosacIriuos a través ue un eiilace auíniico cov3lente,

--

con l a consecuente p h z i u i d a . de un* molécula ue a{,ua, ctunaue

-

también se nuede obtener por una i i i u r S l i s i s de l o s Folsacári- dos.

ijentro ae l o s dísacdridos ~ 6 s comunes se encuentra l a s a

carosa, lactosn, maitosa, e t c . La sacarosa es e l azúcar

for-

mzuo ? o r l a unión de una molécula ue glucosa y una ue f r u e t a z

sa

en l a c&a ue azúcar p r i n c i p a i m n t e ; l a sacarosa es

un

i^zúc.a-

no reductor y a que no t i e n e nin& c a r b o n i l o l i b r e reacti.vo; e s un ezÚcar reductor que e s hidrolLzado p o r l a enzima malta- sa y n o r ácidos que se encirentrm e n jarabes e hidrslizados

-

&e almidón y en l a cebada. La l a c t o s n e s un Uisac&rido y s e encuentra exclusivaniente en la iect?e cie los memíferos y e s t á c o n s t i t u i a o u o r una ffioiécu1.a ue g e l i i c t o c a y una de elucosa

--

uniaas p o r enlaces Elucosíuicos p(1-4). Otros o l i g o s a c á r i d o s importantes en alimentos son l o s csrbo!:iuratos de l a f i ! e i l i a Ue l a r a f i n o s a : r a f i n o s a , estaquiosa y verbascosa. Normalnien

-

t e , é s t o s o i i g o s a c á r i a o s a.bbnu:zn en l o s granos ae leeuniinosiis

coffio 1:a soyn

,

slubias, g a r b a n z o s , c-:c?Jiuate y t'ri j o l . (Badui

13521.

a t r a v é s de un e n i z c e g i u c o s í a i c o p ( 1 - 2 ) , y se encuentra

r i a 0 :;ue iü i n g e s t i ó n ue iet.umin>s . s a o u u c e g : . s e s cieuiuo P

-

una fercentacidn ae l o s o i i c 3s,ac:'l-iaD.A EII e l testir^ ir^^ in.rue--

so. (Snaui, 1 j 32).

L O S o o l i s a c ~ r i u o - son c:-:rboniuretos oue tienen muc:,os ni0

nos?cá.riuos uniuos a trnvCs ue en1ict.s Flucosfdicos; son c o l g i d e s , no forncm verdaderas so1uL:iones CONO Los wonosicS.r,iuos, no t i e n e n c o l o r n i sabor, y su Deso uioiécul~?.r mede l i e g , a r

--

hasta v a r i o s millones; gresentan e:ron capaciuad para r e t e n e r

agua y forman ?artículz.s c o l o i d a l e s altamente hiaritadas.

--

Los 2 o l i s a c á r i d o s son considerqdos productos de la -uoliconden

s a c i ó n ae morAosacáridos unidos giucosíciicamente con i a eiimi- nación de agua, formando cadenas l i n e a l e s o ramificadas que

-

pueden e s t a r c o n s t i t u i a a s p o r un s o l o t i p o ae monosacdridos

-

como e l almidón y l a c e l u l o s a , o b i e n e s t a r formaaos por d i f e

-

r e n t e s monosacáridos coni0 e s e l caso ue l a mayoría de l a s go- mas ( Solomons,

1979)

.

-

/

-

E l contenido t o t a l de carbohidratos de l a m y o r f a de l o s

t e j i d o s anímeles y v e g e t a l e s se encuentre.n en forma de p o l i s a

-

c á r i d a s , de l o s que Oerivan dos grupos p r i n c i p e l e s con dife-- rente función b i o l b g i c i : l o s p o l i s a c R r i d o s (que constituyen

-

e l t e j i d o e s t r u c t u r a l ( c e l u l o s a , carrspenina, 5cido murámico, pectinas, ngnr, galactanos, e t c . ) , y los que constituyen la

-

r e s e r v a e n e r g é t i c a (alniiJ6n, amilosa, aniilogectina, fructa---

nos, glucbgeno, etc.). Fstos dos grupos de pslímeros presen- tan c s r a c t e r i s t i c a c muy uii'erc,ntes e n sus urooiedsdec físic:is

;y químicas.

Los cue cJnstituyen e l t e j i a o estructui.ai tienden a f o r -

nar mientes ue nicr6i.e:io in:; r m 3 i é c ~ i i r e a WJY e:;tuoies, son

-

poco saluble.3 en zt:.,>:> ;y snsorben una b-+j:i c a n t i a m ae é s t e li

quicio, siendo aden4s noco r.e;jctivos tiebids u l a a l t : ~ : imwrffiea

b i l i d a u que presentan 7 la w y o r í a ae l o s ii.c;entes químicos.

?or

o t r a p a r t e , los c a r b o h i a r o t o s que s i r v e n de r e s e r v a ener-

(.ética. pueden :3bsurber agua, fiincnándose i n m e d i a t a e n t e , con

l a f a c i l i d a d ae f3rrriar s o l u c i o n e s v i s c o s a s c o l o i u a l e s ; son

--

s u s c e n t i b l e s a a.taques químicos y presentan propieoades hidro f í l i c a s cieoido a l a g r s n cantidac? de grupos h i d r o x i l o l i b r e s .

que tienen.

-

-

-

Los

p o l s a c g r i d o s t i e n e n un gran número de puentes y e n l a

ces químicos que l e pertziten a SUS moléculas una c i e r t a r o t a -

c i ó n y f l e x i b i l i a a d de movimiento, con un cambio muy pequeño

e n s u e n e r g í a i n t e r n a . E s t w r o t a c i o n e s causan que los

poií-

meros tomen d i f e r e n t e s conformsciones sienao l a e s t r u c t u r a a l

azar.

Las e s t r u c t u r a s ae h é l i c e , como en e l almidón, son rn&

ordenadas, p o r l o t a n t o se reduce e l número ae p o s i b l e s con--

f'ornsciones que l o s p o l i s a c 8 r i d o s nueaen a d q u i r i r . ( Solomons,

1 3 7 9 ) .

Los p o i i s s c á . r i a o s se encüentran en ~ ' o r i i i a nativa. en mu---

chos a l i m e n t o s , peyo en alpnF:s ocasiones son aTadidos para

-

l a c o r r e c t a formuiaci6n lie o t r o s , comoen e l caso de1 almidón,

l a carrapenina y l a s p e c t i n a s .

Uesnuéc ae 11 c ~ ~ u l o c r ; , e l aimiaón e s e l o o i i s a c á r i a o

--

mas sibunoante e importrnte aesue e l m n t o de v i s t a coniercial.

dos muy s i m i l a r e s : aiuilose y omiapectina. L a si.iioUn, D ~ O U U C t o ae la c ~ n u e n s ~ c i b n ue '!.exosc:.s (D-gluconiiñnos.:s) foruian ca

-

uenas largas l i n e n l e s cue Dueden t e n e r 200-2500 unidacies, con

pesos moléculnres cue l l e e m hasti

un

rriilión ue daltones.

--

L O S

ni>nosac;ú.idos estdn unitios a través ae e n l a c e s giucDsiai-

COS d-D-(1-4), siendo l a 4-maltosa l a uniaau r e p e t i t i v e de

és

-

t z e s t r u c t u r a química.

Por

o t r a a a r t e , l a awilopectina e s

--

o t r o d-D-glucano, que s e u i f e r e n c i a de l a emilosa por la. pre- s e n c i a de r a m i f i c a c i o n e s unidad por e n l a c e s o(-D-(

1-6)

..

Los

-

almidones contienen api.oximaaamente

17-279s

de a l o s a y e l

--

r e s t o ue amilopectina. (Badui, 1932).

-

E l aimiaón s i r v e como r e s e r v a e n e r g é t i c a en I s g l a n t a , y

normalmente s e almacena e n p a r t í c u l a s

muy

pequeñas conocidas

como granulos. Debiao zi que los granulos de almiaón e j e r c e n

una p r e s i ó n o s m ó t i c i muy 'Da ja, las p l a n t a s pueden almacenar

-

grandes cantidades de D-glucosa en una forma muy a c c e s i b l e ,

-

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111. 0 3 J E T I V O S

O b j e t i v o General:

-

I d e n t i f i c a c i d n y determinación de azúcares solubles y almidón en d i f e r e n t e s componentes de l a s e m i l l a

-

de f r i j o l d e l grupo negro arribeño.

O b j e t í v o s Particulares:

-

I d e n t i f i c a r y c u a n t i f i c a r e l contenido de azdcares solubles en cuatro variedades de f r i j o l (Mex-407,- Pue-219, Pue-40, _Oax-36) d e l grupo negro arribefío; en t e s t a , c o t i l e d d n y e j e embrionario.

-

Determinar e l contenido de almidón en

los

mismos

-

componentes.

-

Aprendizaje de algunas t é c n i c a s más usuales en

bio

-

qufmica para evaluar azúcares solubles y almidón

-

en semillas de leguminosas.

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--

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111. B A T E R I G , FQUIPO,

KETODO,

REACTIVOS.

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NI A T E B I A L

Papel f i l t r o c o r r i e n t e

Hojas de papel f i l t r o para cromatografía Whatman Elo.

1

Tamiz de malla

No.

40

Vasos de precipitado

de 250, 100 y 50

ml.

NLatraces Erlen-Meyer de 250 m i

Probetas de 100, 250, 1000 m i

T u b a de ensaye

Pipetaa de 1, 5 y 10 mi

De ae cadore a

Aspersores Embudo BÜchner Matraz k i t a z a t o Bureta

E x t r a c t o r de Soxhlet F i l t r o s de v i d r i o molido Celdas

H i e l o

-

o e s a f i l t r o s

MATFRIAL VEGETAL: E l material v e g e t a l f u é proporcionado por l a Dra. Karla Luisa Ortega

D.,

que fueron semi-

l l a s de f r i j o l d e l grupo "Negro Arribeño*' 9

con sus cuatro genotipos Oax.

36;

Mex-407;

Aparato Goldfisch LJ.B/CON/CO. Balanza analítica k e t t l e r H51

Balanza granataria OH4üS, Hoffmann-Pinther & Basworth.

Baño Narfa THELCO, GC.4/Presici6n S c i e n t i f i c . C e n t r i f u g a SORVALL, RC-5.

Bomba de v a c í o KOBLENZ, DGP 144.

E s t u f a p a r a s e c a r cromatogramas CHRON!ATOGRAPHIC

DRYING

OVEN.

Camaras de cromatografía CHROYATOCAB, SMI 4200 E s t u f a BLUE

Ni,

Power-O-N.atic 60.

Espectrofotdmetro S p e c t r o n i c 20, Bausch & Lomb.

k o l i n o e l é c t r i c o Wiiey.

Potencidmetro Beckman, Zeromatic

SS-3.

P a r r i l l a magnética.

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...

K E T O D O

JIACI(4L 4 GE.IEi3.a: Peso de l a s e m i l l a de f r i j o l

a s (muestra)

4

I

I

Medición de porcentaje de humedad

Desgrasamiento de l a haxina

Determinación de

AZUCARES y ALWLIDON

OBTENCION

DE

HARINAS:

Se pes6 en balanza granataria cantidades i g u a l e s de

las cua

-

t r o g e n o t i p o s de f r i j o l por eeparado y se puso

en vasos de

--

p r e c i p i t a d o con su r o t f i l a c i ó n correspondiente; se enjuagó

los

f r i j o l e s con agua de l a l l a v e y se agregó agua d e s t i l a d a has-

t a c a s i l l e n a r

e l

vaso. Se d e j ó reposar por algunas horas

los

f r i j o l e s para suavi.+ar l a t e s t a .

Una v e z que

los f r i j o l e s

es-

t u v i e r o n suaves se procedió a descascarar e l f r i j o l ; p a r t e s

-

d e l f r i j o l que se separaron: t e s t a , e j e embrionario, c o t i l e d ó n

Estos t r e s componentes se colocaron.en papel f i l t r o común pa-

r a que se secaran; s e pes6 l o s componentes por separado, y a

-

seco6 y pesados se procedió a l a obtención de harinas; molien

-

do l o s componentes en un molino e l é c t r i c o y se pas6 I n harina en un tamiz de malla número 40, se pesó e l producto y se cal-

culo e l rendimiento harinero, de l a manera siguiente:

Peso d e l componente seco 100 $

Harina d e l componente obtenido

x - ?

IVWICION 2)? PORCXXTAJF U!? 'XlhiDfii):

Se usaron p e s a f i i t r o s limpios y bien secos (secados en estu

-

f a a temperatura a l t a aproximadamente 6 horas) y pesados en

-

balanza a n a l f t i c a (pv = peso d e l desecador v a c í o ) . P o r separa

-

do se pes6 en balanza a n a l í t i c a l a muestra h h d a (harina)

-

(2mh = peso de muestra htbeda).Se colocó l a muestra dentro d e l

p e s a f i l t H ( n o t o c a r

-

directamente e l p e s a f i l t r o ) , se puso a se- car l a muestra en una e s t u f a a 70 C durante 24 horas. Y a pasa

do e s t e tiempo se procedió a pesar l a muestra (Pms = peso de muestra seca). y se calculó e l porcentaje de humedad de l a

--

muestra:

O

x

100. Pmh

-

Pms

Pmh

$ H =

DETERMINkCION DE EXTRACTO ETERFD:

Se pusieron l a s muestras de harina completamente secas y pe

-

sedas en un papel f i l t r o y después en un dedal de asbesto; se colocó e l dedal dentro de los tubos de v i d r i o con extremos

--

a b i e r t o s y se montaron en e l aparato Goldfisch. En l o s vasos d e l G o l d f i s c h previamente secos en horno (aproximadamente

6

hg

ras) y pesados en balanza a n a l f t i c a ( e v i t a r t o c a r l o s direct- mente) se adicionó 20 m l de é t e r anhidro y se colocaron en e l

sistema G o l d f i s c h ; se e x t r a j o durante 4 horas. Pasado este

--

tiempo, se r e t i r a r o n l o s vasos s i n t o c a r l o s directamente y se colocaron en una e s t u f a a _7OoC y se pesaron. Y a pesados se

--

procedió a l c á l c u l o d e l porcentaje de e x t r a c t o etéreo:

x

100 Peso d e l vaso más E.E

-

Peso i n i c i a l d e l vaso

$

E.F

=

Peso de l a muestra o r i g i n a l

E S O U N A ATTLITICO PAR4 4ZUCP.RT:C Y AIiPIDON

I

-r".

".."

-..

C"

. -

i

.

kuestra: Sarina de f r i j o l

1

Extraction con e t a n o l _{a l SO+}

1

Extract o Residuo

1

Extraer nuevamente con e t a n o l a l

-

8% en aparato de Soxhlet durante

dos horas y media.

I

F i l t r a r

I

Extract o Re&duo

1

Concentrar

I--+

a un volumen

-

Incubación con dias- conocido para cromatogrg

f i a en papel

1

1

Extraer l a s manchas con c l o r o f ormo-agua-metano1 (4:3:3

v/v).

Determinar e l c o l o r a 490

nm

con r e a c t i v o de fenol-sulfú- r i c o .

Azucares Solubles

tasa

-

H i d r 6 l i s i s ácida d e l f i l t r a d o

-

Neutralixaci6n con car bonato de sodio a

pH=7

-

Niedir hexosas por

el

-

-

método de NELSON

1

ALIIDON

....

c..

r-

.

..

,

* .. ,_..

.. , .

~ " . . ....

*-

..-

c

.

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--

.._

c

I .

* ..

' ..

r..

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F ,-

._I

....

C..

--

I

-.. -

.-.

..

1)TZTrnB IY .ICIOX

UT

9zuc

*os

SOLLaLYS:

Se pes6 l a muestra y se caloc6 en un vaso ue precinitados

-

con e t v i o l ai 3%

,

se puso a n e r v i r aurante 5 minutos. ~ j e fil

t r o a l v a c i o (Extracto-1); a l residuo se colocó en e l Soxiilet y se e x t r a j o con e t a n o l a l 8- durante 2:30 horas (Extracto-2) se juntaron los e x t r a c t o s y se concentraron a un volumen cono

-

-

c i d o y dnimo.

TO

DE

EXTRACCION DE

SOXHLET

/

Se rayaron las h o j a s de cromatografia (Whatman

No.1

de

46x57

cm) de acuerdo a l a f i g u r a siguiente:

-

14

-

En cada seccidn se a p i i c d una muestra alícuotfl ae 150 m i c r o l f

t r o s y en l a seccidn c e n t r a l un volumen ae 200 m i c r o i f t r o s .

-

Se us6 e l método cromatográfico descendente; e l solvente de cl

d e s a r r o l l o u t i l i z a d o fue: BUTANOL- AGUA- ACID0 PROPIOIJICO.

Se colocd e l papel f i l t r o en l a cámara de cromatografia para que se saturara (12 horas aproximadamente) con l a mezcla de

-

solventes; ya saturados l o s papeles se agregd e l solvente en

-

l a s charolas, e l corrimiento se e f e c t u ó durante 13 horas aprg ximadamente. Se sacaron l o s cromatogramas y se pusieron a se-

car ai a i r e l i b r e ; ya secos se procedio a r e c o r t a r para rcve- l a r ; l o s r e a c t i v o s de reaccidn usados fueron: n i t r a t o de p l a t a

amoniacai, que d e t e c t a p o i i o i e s con gnipos reductores; e l f t a

-

l a t o de a n i l i n a , que determina azúcares y sus derivados, exceE t o cetosas, y e l o r c i n o l , que e s e s p e c i f i c o para cetosas.

I

Azdcares m4s n i t r a t o de plata amoniacal:

Gluconato amdnico

+

2AgL

+ "

+

D-Glucosa

+

2Ag(NH3J2 + H20

-

3

Azúcares más f t a l a t o de anilina.

L

COOH

A 4 . 0 0 ' +H3N-C6H5

UCOO-

+H

3N-C

6H zzúcar

+

hzdcares más o r c i n o l en medio ácido

( complejo ) ___+

+

f u r f u r a l

OH

6

h i droximet il f u r f u r

a i

HO

c QCH

o r c i n o l

Se a s p e r j a r o n los cromatogramas r e c o r t a d o s con l o s r e a c t i v o s y se secaron en e s t u f a a 80 C durante 5-10 minutos para n i t r a

t o de pl&a amoniacal; de

1 5

a 20 minutos p a r a o r c i n o l y de

-

20 a 30 minutos para f t a l a t o de a n i l i n a .

NOTA: No

se deben mezclar

los

cromatogramas, durante e l asper

jade, secado y tampoco durante

su

almacenamiento.

O

-

-

CAMARI\ DE CROKATOGRAFIA DRSCENDENTR

EN

PAPEL

L a s e c c i ó n c e n t r d que s i r v e para l a recuperación c u a n t i t a t i

_-

va s e d e j ó s i n r e v e l a r .

Para l a i d e n t i f i c a c i ó n de los azúcares desconocidos se hizo

D O r comparación con e l desplazamiento a e u n a muestra conocida

determinando los iif

6

R r correspondientes. (Ver apéndice 1)

Frente de soluto --I Frente de s o l v e n t e

R f

=

Donde, R f e s l a velocidad de migraci6n d e l soluto en l a d i r e c

-

c i ó n de desplazamiento d e l solvente 6 sea, l a r e l a c i ó n entre l a d i s t a n c i a que r e c o r r e e l soluto, con respecto a l a distan- c i a r e c o r r i d a

por

e l solvente en e l papel

f i l t r o .

En _algunos casos, para obtener un mayor desplazamiento de

-

azúcares, se dejan c o r r e r l o s cromatogramas más allá d e l iími

-

t e d e l papel; e l azúcar que más se desplaza e s l a ramnosa; se l e toma como punto de r e f e r e n c i a para determinar e l Rr.

PiIigraci6n d e l carbohidrato migración de l a ramnosa

R r =

Despuéa se integraron l a s partes separadas que no se asper- jaron y l a s secciones que t i e n e n

los azúcares t i p o que s i r v e n

de

_guia

para l a i o c a i i z a c i 6 n de l o s problemas. Una v e z i d e n t i

-

f i c a d o s l o s problemas,sB.trazaronl€neas

-

enmarcando l a regidn de l a parte c e n t r a l que no ha s i d o asperjad9,ia sección c o r r e s pondiente a cada azúcar se r e c o r t ó en t i r a s pequeñas y se ex- t r a j o con 1 0 m l de una mezcla de solventes: cloroformo-agua-- metano1

(4:

3s

3 v/v).

A l mismo tiempo se h i z o v a r i o s t e s t i g o s d e l papel f i l t r o para sustraer su v a l o r de los problemas; pa- r a e v i t a r que en e l e x t r a c t o se fueran p a r t í c u l a s de papel

6

de polvo, ya que e s t o induce e r r o r e s en l a s l e c t u r a s , se pasa

-

ron

los e x t r a c t o s

por f i l t r o s de v i d r i o molido.

Para l a determinación c u a n t i t a t i v a de l o s e x t r a c t o s se us6 e l método de f e n o l - s u l f ú r i c o (1:5

v/v),

se midi6 l a absorban- c i a en un espectrofotómetro a 480 nm para pentosas y a 490 nm Para he xo cas.

La cantidsd ae szúcar presente en l a muestra en solución fue calculada en _base a una curva estándar, expresada en microqra

-

mos; en donde e l comportamiento de cada azúcar e s d i f e r e n t e

-

con e i r e a c t i v o . (Ver apéndice-2).

DETERMINACION

DE

ALhtIDON:

El

residuo que quedd después de e x t r a e r los carbohidratos

-

solubles, se suspendid en 50 mlde agua d e s t i l a d a y se calen-

t ó

durante 30 minutos a e b u l l i c i ó n para g e i a t i n i z a c i ó n . Des-- pués se bajó l a temperatura a 55OC y se adicionó una a l í c u o t a de

io

mi de d i a s t a s a a i i $ y se mantuvo a e s t a misma tempera

-

t u r a durante 1 hora) e s t o se r e p i t i d hasta completar 30 mlde

d i a s t a s a a l 1%. Y a teniendo

los 30

m i ae diastasa a l 1%, l a in mezcla fue incubada toda una noche E 55 C en baño Maria; se

-

f i l t r d a l v a c i o , e l residuo se desechó y ai f i l t r a d o se l l e -

v6

a un volumen conocido (Para confirmar que l a h i d r d l i s i s

--

fiagfa mide aompleta se h i z o

en e l residuo

l a prueba de yodo

-

para almid6n). U n a a l f c u o t a de

5

d.

d e l f i l t r a d o se h i d r o l i z 6 con HC1, densidad 1.125 durante dos horas y media a 80 C.

Se n e u t r a l i z ó a pH 7.0 con carbonato de s o d i o y se v o i v i d a

-

l l e v a r a un volumen dado.

O

O

P a r a

la

determinación c u a n t i t a t i v a de l o s e x t r a c t o s se us6 e l método de Nelson, se midió l a absorbancia en un espectrofo

-

tómetro a 54.0 nm.

La

cantidad de glucosa presente en l a muesL t r a en solución fud calculada en base a una curva estándar

-

Los resultados en porcentaje de glucosa multiplicados por e l

f a c t o r 0.9 corresponden a l v a l o r d e l almid5n. (Ver ap6ndice-

3).

HETOM ilT FT?OL

-

SULPURICO:

Colocar 1

ml de muestra Droblema más

1 mi de agua c t i t i l a d a

agregar 1 mlde f e n o 1 a l

5%

y 5 m i de ácido s u l f ú r i c o xncen- trado ( a g r e g a r l o con mucho cuidado y con agitacibn)

.

l e e r ab- sorbancia en un espectrofotómetro a 490 nm. E l blanco ?e pre- para con 2 mlde agua más 1 m l de f e n o l a l

s

y 5 m l :5 H _{2 4}

SO

concentrado.

MIIEMW DE NFLSON:

Nelson A: D i s o l v e r 12.5 g de carbonato de sodio anhidrr, (Na2 CO )

m4s

12.5 g de t a r t r a t o de sodio y p o t w i o

más

10 g de bicarbonato de sodio (NaHC03) y 100 de

--

s u l f a t o de s o d i o

anhidro

(Na2S04) se l l e v a a 500

ml

con agua destilada.

3

Nelson B: D i s o l v e r 7.5 g de s u l f a t o de cobre (CuS04

.

5H20)

-

en 50 de agua d e s t i l a d a más una g o t a de

ácido

--

s u l f o S i c o concentrado (H2S04).

Nelson C: 12.5 m l de A m á s 0.5 m l de

B.

Arsenomolibdato de amonio: D i s o l v e r 25 g de (NH4)gM~7024

.

4-

H O e n 450 ml de agua d e s t i l a d a más 21 mlde H2S04. D i s o l v e r por separado 3 g de Na2HAe04

.

7H20 en 25 m l de ague d e s t i l a d a , mezclar l o s r e a c t i v o s (ColoPa

ci6n amarilla, cuando e s verde no s i r v e ) , _guardar

-

e l r e a c t i v o en un f r a s c o &bar, en una estufa a 37OC

durante 24 horas. 2

-

Ihétodo: C o l o c a r i u11 de muestra problema, más 1

m l

del react&

vo C de Nelsón, poner a baño 'aarfa a 30 O C durc.te 20 minutos, sacar y e n f r i a r en bafío de hielo por 10 a 1 3 zinutos

adicionar 1 m l d e l r e a c t i v o Re zrsenomolibaato, agitar y a a i

-

r-

cioriqr

7

ml de ap~¿+ d e s t i l a a a , l e e r a 7140 nrn.

$1

blanco se

--

preaara con 1 m i de

wua

más 1 a l de r e a c t i v o C.

._.

I.

R E A C T I V O S U T I L I _Z A D O S

.._

r-

-

Acido s u l f ú r i c o

-

Agua d e s t i l a d a

-

Acido c i o h f d r i c o

-

Acido propiónico

-

Butanol

-

Carbonato de sodio

-

Cloroformo

-

Diastasa

-

Etano1

-

E t e r anhidro

-

Fenol

-

F t a l a t o de

anilina

-

Ketanol

-

Orcinol

-

Yodo

Solvente u t i l i z a d o en cromatografia : Butanol: agua: &ido pro-

p i 6ni

co

.

Solución A: mezclar

1246 ml

de butanol con 84 mi de agua des-

tilada.

Solución

R:

mezclar 620 m l de ácido propiónico con 790 m l de agua destilada.

hlezclar 1:l soiucidn A y B en e l momento de u t i l i z a r s e . 1 ₁

* .

1..

... "

. ..

r.

.-

.._.

r

..

".<

--.

-

3 e a c t i v o s de aspersibn:

-

N i t r a t o de d a t a emoniacai:

a) Preparar una solución de n i t r a t o ue p l a t a 3.1 ti (16.7 g ae AgNO en un l i t r o de a g u s destilada).

3

b) Se prepara hidrdxicio de amonio 5N a p a r t i r de hidr6xido de amonio a l 304b F.M 35.043, densidad _0.9G2 g/ml, medir 526

m l

y l l e v a r a 1000 _ml.

Y e z c l a r 1:l l a s soluciones a y b, en e l momento de u t i l i z a r s e

-

F t a l a t o de anilina:

Se saturan 200 mide butanol con 40 m l de agua en un embudo de

separaci6n. Posteriormente se separa e l agua. Por o t r o lado se

pesan 3.2 g de anhidrido d e l ácido t a n o l , después s e añaden 0.9 mi de quedar completamente d i s u e l t o para

-

Orcinol:

f t b l i c o

y se agregan a i bu

-

a n i l i n a . E l r e a c t i v o debe

-

poderlo u t i l i z a r .

a) Pesar 1.2 g de o r c i n o l m á s 20 m i de agua destilada.

b) Medir 100 mide dcido c l o r h i d r i c o concentrado.

c) P e z c l a r 20 m l de

-

a agua d e s t i l a d a .

más 100 ml de

-

b y l l e v a r a

180

m i de

Y-

n

B

L*

c O

B . e

I iII

cr O in W

*

*

u) O .I .I N N d 4 cr O cr i + cr cr in c 4 VI L 5 C 3 r3 31 a n

-

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2

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O O m I O a L -

-

23

-

c ._L u O O 10

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I--

--

I I

I O

1 0

0' '1; P 3 O v) W

-

I O a N O m N

-

I O m m O a CL

-

I O o O 21 \o

-

I O m L +: -! -i Y 1

P

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21

W

K

L

I*

z j

j

P i

I

a _c

L N . m m O 2 C [r I

N

p

r

.

..

..

.

OAX

-

36 EEX

-

407 PUE

-

40

Tipo de adú-

Grupo * % e g o Arribeñon

(P.

vulgaris L.)

Concentración üe aécares solubles en ex

-

tracto de TESTA.

CUADRO 2-A

&E K-407 I PUE -40 PUE-219 T i p o s _azúcares de _OAX-36

PUE

-

219 E s t aquiosa 0.32 O. 24

0.13

0.18

.-

h e l i b i o s a 0.09

o.

22 0.16

o.

21

-

H!altosa 0.12 0.09

0.19

0.17 Sacarosa 0.13 0.11 0.12 0.06

~~

~ ~

* -

Glucosa 0.11 0.11 O. 24 0.1

-

-

.

X i l o s a 0.07 0.06 0.09

0.13

Grupo "Negro Arribeñon

(P.

vulgaris L.)

concentración de adúcares solubles en e x

-

tracto

de EJE EMEIRIONAFUO.

E s t aquiosa 1.14 1.16 1.26 1.27

3

----

Rafinosa O. 82 0.88 0.8 0.84

Glucosa O. 36 0.41 O. 32 0.39 Fruct osa 0.45 0.48 O.

5

0.56

X i l o s a 0.44

0.37

O.

31

0.35

----

Grupo “liegro P.rribeño” (P. v u l g m i s L. )

Concentracidn de azúcares solubles en

Clave O 4X-36

MEX-407

PUE-40

e x t r a c t o de WTiiiSDON.

_-

1

1

5.6

8.7

25 e 1

I

I

Testa Eje Embrionario

c o t

i l e d6n

I

5.9 9.0 26.7

7.9 28.1

4.9

.- CUADIiC, _{_- -} 2-C

Tipos

_-

de

azúcares OAX-36 hEX-407

PUB-40

PUE-219

Tstaquiosa 0.73 1.11 O. 92 1.26

Rafinosa 0.62 0.81 0.79 1.24

-__

~~ ~. ... . .... , ... . . ~ . ..

Me1 i b i o s a 0.15 0.09 0.09

0.18

Sacarosa 0.04 0.05 0.04 O .14

Glucosa 0.08 0.12 0.05

o.

21

P n i c t o s a 0.09 0.12 0.05 0.12

- I _ _ _______I_..__--_-

_.--

-

_-

.--.I_ . . .

-%i1osa 0.06 0.11 0.08 0.12

? P E N D I C E

-

1

Constantes cromatográficas de l o s azúcares+

-

r

4zúcare s t i p o Rf 8

Estaquio sa Rafinosa Yielibiosa YLaltoea

Sacarosa Glucosa Fructosa Xilosa Ramnosa

0.203 0.293 0.375

0.422

0.484

O 610 0.692 0.735 0.823

O. 344

O. 390 0.414 O 507 0.621

O. 689 0.724 0.862

1 .o0

+

solvente de desarrollo: butanol: agua: ácido propiónico.

*

-I ,

A P E N D I C E - 2

Cueva e s t h d a r de glucosa

por

e l método. de

FENOL-SULFZmICO.

-

Tubos S o l u c . m d a r (mi) Absorbancia Concentracidn(*/,i.)

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

O

o

.1 0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8 0.9 1

o

.

O 0.07

0.17

O. 25

0.39 0.46

0.57

0.64

o.

IO 0.80 0.85 O 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ~~ -

Solucidn estándar = 5 mg de glucosa/ 1 mlde agua Ecuacidn de l a l i n e a recta

ajustada:

-3:

Y

=

8.a37x1o-~x

+

3.637~10 I , Donde:

Y-

absorbancia

X= concentracidn

-

27

-

~~

. ..

Y : '),

,.

A P E N D I C E

-

3

- .

,._..

.

..

Curva estándar de Glucosa por e l método de NELSON.

.

”,-.

re.

I ..

” ..”

I.. .

r-

-.-

~ ...

.

..

,.,_

~ ~~ ~~ ~

Tubo 8 soiuc. estándar ( m i ) Absorbancia Concentraci6n

(qgi).

1

O 0.0

O

2

o

.1 0.04 10

3 0.2

o

.1 20

4

0.3 0.15

30

5 0.4

0.23

40

6 0.5

0.32

50

7 0.6 0.37 60

8

0.7 0.46 70

9

0.8

0.5

00

10

0.9

O. 54

90

11 1

o

.

0.63 100

.__

r.-

.--

r .I

.

..

.

..

.,-

.

...

c

.-

.,e

-._.

c

._

.I

.~_

..s.

. .~

Solucidn estándar =

5

mg de glucosa/ 1 ml de agua.

Ecuación de l a l i n e a r e c t a

a j u s t ada:

Y = 6.469i0-3X

-

0.01954 Donde:

Y

= absorbancia

X = concentracion

Curva

estámiar de eiucosú Dor e l método de NEiSüN.

D I S C U S I O N

De acuerdo a

los r e s u l t a d o s mostrarlos en e l cuadro-1

e en cuanto a l rendimiento harinero, en e s t e grupo, e x i s t e una fluctuación e n t r e 74.24% y

76.w0

siendo é s t e i n t e r v a l o e l c c

rrespondiente a l a harina de c o t i l e d d n además de representar e l rendimiento máximo pues

los porcentajes de rendimiento pa

r a t e s t a 7.17 a 9.58$ y e j e embrionario 1.23 a

1.37%

no

son representativos.

Los porcentajes de humedad no presentan a l t a s diferen- c i a s entre l a s cuatro variedades siendo PUE-40 e l que c o n t i 2 ne e l menor porcentaje ( 2.n a 4.8% ) ;

sin embargo todas

-

presentan l a misma proporción de humedad en SUS t r e s compo--

nentes, e s t o es, e l v a l o r mayor que o s c i l a entre

4.8%

y

-

6.7%

para t e s t a , e l v a l o r medio entre 4.04% y

6.3%

para e j e embrionario y e l v a l o r más bajo e n t r e

5.¿$

y 2.71% para c o t i

-

ledón.

E l mayor contenido de grasa queda claramente represen- tado en e l e j e embrionario pues contiene de 7.2% a 1 l . l l P ; l o s o t r o s dos componentes presentan s610 de 0.7 a 2.1% de

--

grasa ( t e s t a y c o t i l e d d n )

.

S i consideramos e l a l t o contenido de grasa en e l e j e embrionario y muy a l t o contenido de p r o t e f n a

42-4s

e s t o permite a p r e c i a r l a importancia d e l e j e em-- b r i o n a r i o encargado de n u t r i r y preservar l a especie ( E l co- t i l e d ó n contiene 22.95-25.7s de p r o t e i n a y l a t e s t a s o l o

un

616.

E1 uso de d i f e r e n t e s r e v e l a d o r e s permite l a mejor iaen

-

t i f i c a c i d n de los azúcares estánaar y problemas en l a crom- t o g r a f i a en papel.

En l a determinacidn c u a n t i t a t i v z de

los ozúcares solubles de

l o s e x t r a c t o s de f r i j o l , se ha aplicaao e l método a e l fenol- s u l f ú r i c o porque e s un procedimiento para cantidades en micro

-

escala. E l c o l o r producido en l a reaccidn e s proporcional a

-

l a cantidad de azúcar presente en l o s cromatogrbmas, a una con

-

centración constante de f e n o l . E l método (18 rápido, simple,

-

sensible y da resultados reproducibles. C i e r t o s f a c t o r e s com-

p l i c a n e l a n a i s i s , como l a presencia de impurezas que acompa

-

ñan aJ. papel y p a r t f c u l a s mismas de c e l u l o s a , e s t o se e v i t a de

-

sarrollando t e s t i g o s adecuados y extremando l a s condiciones de limpieza d e l m a t e r i a l de v i d r i o y f i l t r a d o de

los

extractos.

Los azúcares s o l u b l e s encontrados en l a s e m i l l a de fri-

j o l son: Estaquiosa, Bafinosa,

N e l i b i o s a , Kaltosa, Sacarosa,

-

Glucosa, Fructosa y Xilosa.

L o s r e s u l t a d o s para azúcares expresados en gramos de a- zúcares s o l u b l e s en 100 gramos de harina, se pueden v e r en e l cuadro- 2.

L a estaquiosa y l a x i l o s a se encuentran presente en to-

dos l o s componentes de l a s e m i l l a de f r i j o l de l a s cuatro

va-

riedades siendo l a

mayor proporción para e l e j e embrionario.

No se encuentra Rafinosa y Fructosa en t e s t a en ninguna variedad; a s f mismo no se encontró U e l i b i o s a y Sacarosa en

--

e j e ambrionario y finalmente no 6e detectó Idaltosa en c o t i

-

ledón y

en

e j e embrionario.

Los a d c a r e s Sstaquiosa y Rafinosa se encuentran en ma- yor proporción en e j e embrionario y cotiledón. E1 r e s t o de

--

los azúcares (liielibiosa, Ealtosa, Sacaros%, Glucosa, Iiructosa y X i l o s a ) se encuentran presentes en menor cantidad.

P o r último se Duede observar en e l cuadro-3 e l contenido de almid6n en los t r e s componentes d e l f r i j o l el cual nos mues

-

. .

. .

t r a claramente cue

e l c o t i l e o d n contiene l a pronorción

más

--

a l t a de almidbn en un promeaio ae

26.7%

mientras que en t e s t s

y P j e embrionario ~ 6 1 0 un

5.w

y 3.6~ respectivamente conside

-

rdndo se v a l o r e s ba j o

s.

. “

. ”

L ”

* _

..-

I_

”..

.F1

r-

c..

C O N C L U S I O N E S

1.

E l rendimiento harinero de e s t e grupo e s t á básicamen t e representado por l a h a r i n a obtenida de cotiledbn.

2. E l porcentaje de humedad no presenta d i f e r e n c i a s s i & n i f i c a t i v a s de variedad a variedad.

3.

E l e j e embrionario contiene un a l t o contenido de gra sas.

4. E l método de f e n o l - s u l f d r i c o r e s u l t a s e r e l más ade

-

cuado para l a c u a n t i f i c a c i 6 n de azúcares solubles.

5.

Los azúcares estaquiosa

y x i l o s a se encuentran pre-

sentes en l o s t r e s componentes ( i a mayor proporción en e l

--

e j e embrionario) de l a s cuatro variedades.

6. En l a t e s t a no se encontró r a f i n o s a y fructosa.

7.

En e j e embrionario no se c u a n t i f i c 6 melibiosa, saca

-

rosa y

maltosa.

8.

En c o l t i l e d ó n e l único azúcar que no s e encontró e s

9.

Los azúcslres solubles están representaáos p r i n c i p a l

-

mente Dor estaquiosa y r a f i n o s a que se encuentran en

mayor

-

proporción en e j e embrionario y c o t i l e d ó n .

10. E l porcentaje más a l t o de almidón est& contenido en

el cotiledón.

R E S U M E N

Se analizarón cuatro variedades d e l grupo "Negro Arribe

-

ño" ( Oax-36, Mex-407, Pue-40, Pue-219 )

,

en sus t r e s compo- nentes:

TESTA,

EJE ENB;;(IONtiRIO,

COTILEDON.

Se h i c i e r o n d e t e r

-

minaciones de azúcares s o l u b l e s y almidón.

Para azúcares solubles se es6 e l método de cromatogra- f i a descendente en p-ei y para su determinación c u a n t i t a t i v a

l o s azúcares fueron e l u i d o s de l o s cromatogramas con c l o r o f o r

-

mo-agua-metano1 (4:3:3 v/v) y se us6 e l método c o l o r i m e t r i c o de f e n o l - s u l f d r i c o (1:5 v/v), donde fueron identificados: e s

-

taquiosa, r a f i n o s a , melibiosa, maltosa, sacarosa, glucosa,

-

f r d c t o s a y x i l o s a . La d i s t r i b u c i 6 n de cada uno de los azdca- r e s e s varitible en sus t r e s comuonentes; l a estaquiosa y xi-

l O S 6 se encuentran m-esentes en todos l o s componentes de l a s

cuatro variedades; l o s azúcares no encontrados en t e s t a son- f r u c t o s a y rafinosa; en c o t i l e d d n maltosz y en e j e embriona- r i o meliSiusa, maltosa y Tacarosa.

?tira IC, Seterniinacibn c u a n t i t a t i v a d e almiddn se us6

-

e l rnktod:, c o l o r l m é t r i c o de Felson: donde se oncontr6 16 faz.-

yor cantidad en c o t i l e d h .

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