11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 6 : C12P 13/08

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PATENTES Y MARCAS ESPA ˜NA N. de publicaci´on:

ES 2 092 078

k 51_{Int. Cl.}6_:

_{C12P 13/08}

A23K 1/14

C05F 7/00

k

12

_{TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA}

_T3

k

86 _N´_{umero de solicitud europea:} _92420249.2 k

86 _{Fecha de presentaci´}_{on :} _22.07.92 k

87 _N´_{umero de publicaci´}_{on de la solicitud:} _{0 534 865} k

87 _{Fecha de publicaci´}_{on de la solicitud:} _31.03.93

k

54 _T´ıtulo: _{Procedimiento de separaci´}_{on de la lisina bajo la forma de una disoluci´}_{on acuosa y utilizaci´}_on

de esta disoluci´on para la alimentaci´on animal.

k 30 _Prioridad: _{26.07.91 FR 91 09778} k 73 _Titular/es: _EUROLYSINE 16, rue Ballu F-75009 Paris, FR k

45 _{Fecha de la publicaci´}_{on de la menci´}_{on BOPI:}

16.11.96

k

72 _Inventor/es: _{Lucq, Pierre y}

Domont, Christian

k

45 _{Fecha de la publicaci´}_{on del folleto de patente:}

16.11.96

k

74 _Agente: _{Aguilar Forment, Domenec}

Aviso:

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Bolet´ın europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).

ES

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092

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DESCRIPCION

La presente invención se refiere a un procedi-miento de separación de la lisina bajo la forma de una disolución acuosa a partir de un caldo de fer-mentación. La invención se refiere igualmente a las disoluciones de lisina base susceptibles de ser obtenidas de esta forma y a su utilización para la preparación de composiciones destinadas a la alimentación animal.

En los procedimientos de preparación de li-sina por fermentación, se conocen esencialmente dos familias de procedimientos de recuperación de la lisina que han sido objeto de un desarrollo industrial.

Una primera familia de procedimientos pro-pone la recuperación de lisina bajo la forma de monoclorhidrato de lisina deshidratado en estado cristalizado. En este caso, es de práctica corriente recuperar la lisina a partir del caldo de fermen-tación utilizando una resina de intercambio de ca-tiones.

Para hacerlo, se procede seg´un las etapas prin-cipales siguientes:

1. Ajuste del pH del caldo de fermentación del que se han eliminado eventualmente las bac-terias, en un intervalo de valores óptimos para la adsorción de la lisina sobre la re-sina por adición de un ácido, generalmente el ácido clorh´ıdrico o el ácido sulfúrico. 2. Paso del caldo de fermentación acidulado

sobre una resina de intercambio de catio-nes que adsorbe la lisina as´ı como una parte de los cationes presentes tales como: amo-nio, potasio, calcio y aminoácidos derivados de las substancias que se hallan en el caldo de fermentación o que se forman durante la fermentación. Estos iones disminuyen la capacidad de adsorción de lisina de las resi-nas puesto que son adsorbidos sobre éstas al mismo tiempo que la lisina. Por esta razón, para mejorar la recuperación de la lisina, se recurre a tecnolog´ıas complejas y caras que utilizan varias columnas rellenas con una re-sina de intercambio de cationes y dispues-tas en serie. Igualmente, para favorecer esta adsorción, se ajusta el pH del caldo de fer-mentación a pH fuertemente ácidos, en ge-neral inferiores a 4 (consúltese, por ejemplo, la patente francesa n◦2567413). Puesto que la fermentación se conduce de manera gene-ral a valores próximos a la neutralidad, es necesaria una importante cantidad de ácido para llevar su pH a estos valores.

3. Elución de la lisina adsorbida sobre la re-sina por medio de una disolución alcalina, generalmente de amon´ıaco, y regeneración de la resina.

4. Recuperación de la lisina del eluato bajo forma de cristales de monoclorhidrato de li-sina deshidratado por concentración de la disolución eluida cuyo pH se ha ajustado previamente a un valor inferior a 6, seguida por la cristalización y, finalmente, la sepa-ración y el secado de los cristales obtenidos.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Un inconveniente importante de este m´etodo reside en el hecho de que es de cara realizaci´on. En efecto:

- es relativamente complejo y necesita nume-rosas instalaciones, por ejemplo columnas de resinas,

- la eluci´on de la lisina necesita importantes cantidades de agua,

- son igualmente necesarias importantes can-tidades de agua para regenerar la resina, - las aguas residuales as´ı producidas,

esen-cialmente durante la elución de la lisina y la regeneración de la resina que están car-gadas con materias minerales y/o con di-versas materias orgánicas, deben sufrir un tratamiento en estación de depuración an-tes de ser reutilizadas o devueltas al medio natural.

Por consiguiente, la extracción de la lisina según este primer método ocasiona un gasto im-portante de energ´ıa.

Adem´as, este procedimiento es igualmente caro debido al consumo importante de reactivos que implica.

Una segunda familia de procedimientos pro-pone la recuperación de lisina bajo la forma de una composición deshidratada que puede com-prender igualmente la biomasa y/o los diferentes constituyentes presentes en el medio de fermen-tación.

As´ı, es conocido, por la patente SU-183581, un procedimiento de preparaci´on de L-lisinapura

seg´un el cual:

a) la fermentaci´on se realiza con ´acidos gra-sos de bajo peso molecular, como fuentes de carbono;

b) el caldo de fermentaci´on es hervido y luego liberado de los microorganismos;

c) el filtrado es acidulado con HCl a pH 5 y luego tratado con 4-5% de carbón activo a 50-55 ◦C durante treinta minutos con una agitación constante: esta etapa tiene el ob-jetivo de provocar la decoloración del fil-trado;

d) después de filtración para eliminar el carbón activo, se añade hidróxido de calcio, a fin de eliminar el sulfato de amonio bajo la forma de sulfato de calcio y de hidróxido de amo-nio, y la sacarosa que queda bajo la forma de sacarosa y calcio;

e) la disolución se filtra y se concentra por eva-poración: esto tiene por efecto descomponer el hidróxido de amonio en agua y amon´ıaco, siendo destilado entonces este último; f) debido a la evaporación, se obtienen

disolu-ciones muy concentradas en L-lisina, que se cristaliza durante el enfriamiento;

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g) los cristales se disuelven en una peque˜na cantidad de agua y luego se precipitan por adici´on de etanol;

h) despu´es de filtraci´on y de secado, se recogen cristales de L-lisina pura.

Tal procedimiento es incontestablemente com-plejo.

Además, estas composiciones deshidratadas conducen a sólidos pastosos, que se pegan y que son muy higroscópicos, por lo que son dif´ıcilmente manipulables. Finalmente, la estabilidad al alma-cenaje de estas composiciones deshidratadas es mediocre.

Para resolver estos problemas, se ha propuesto el empleo de aditivos en los mostos de fermen-tación productora de lisina, lo que permitir´ıa li-mitar su carácter higroscópico. Esta solución no es totalmente satisfactoria puesto que exige ele-vadas cantidades de aditivo y, en consecuencia, conduce a la producción de composiciones deshi-dratadas con un contenido de lisina relativamente pequeño.

Igualmente se ha propuesto efectuar la fer-mentación productora de lisina en condiciones bien definidas. En particular, en la patente fran-cesa n◦ 2541867, se preconiza la utilización de fuente de carbono con elevado contenido de ma-terias fermentables con respecto a la materia seca total, es decir una fuente de carbono que contenga una materia carbonada oxigenada asimilable con una tasa de pureza suficientemente elevada, tal como la glucosa, la sacarosa, los hidrolizados de almidón. Un procedimiento de este tipo es rela-tivamente caro de realización, puesto que excluye el empleo mayoritariamente de fuente de carbono económica, tales como las melazas de remolacha o de caña de azúcar. Además, necesita un gasto importante de energ´ıa durante la deshidratación. Por lo demás, la deshidratación debe condu-cirse en condiciones particulares para que el pro-ducto final no sea degradado. Este procedimiento es pues relativamente complejo.

Un objetivo de la presente invención es propo-ner un procedimiento de separación de la lisina a partir de un caldo de fermentación que sea a la vez simple, económico y que conduzca a la obtención directa de disoluciones acuosas y concentradas de lisina.

Otro objetivo de la invención es la utilización de tales disoluciones acuosas y concentradas de li-sina como aditivo de los alimentos para animales. Según la invención, para alcanzar estos obje-tivos, se prevé un procedimiento de separación de la lisina a partir de un caldo de fermentación que la contiene bajo la forma de una disolución acuosa, caracterizado porque consiste en:

a) ajustar el pH del caldo de fermentaci´on a un valor comprendido entre 9 y 11;

b) cristalizar las sales minerales presentes en el caldo de fermentaci´on por concentraci´on y eventualmente enfriamiento de este caldo; c) separar estas sales minerales del caldo de

fermentaci´on; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

d) recoger la disoluci´on acuosa que contiene la lisina y que constituye las aguas madres de cristalizaci´on;

y porque comprende igualmente una etapa cuyo objetivo es eliminar del caldo de fermentación los microorganismos que han determinado la pro-ducción de lisina, pudiéndose ejecutar esta etapa o bien antes o bien después de la etapa a) o bien después de la etapa c).

El procedimiento presenta la ventaja princi-pal de realizar de forma simultánea y simple la eliminación de ciertos constituyentes del caldo de fermentación, a saber los microorganismos y una gran proporción de las materias minerales, as´ı como la concentración de lisina del medio tra-tado. Esto permite obtener disoluciones estables con una fuerte concentración de lisina (compren-dida entre el 25 y el 50% en peso).

Igualmente, se elimina del caldo de fermen-taci´on la biomasa, lo que permite llegar a una disoluci´on acuosa, concentrada en lisina, que pre-senta una estabilidad al almacenaje perfecta-mente satisfactoria.

Gracias al procedimiento según la invención, las disoluciones acuosas y concentradas en lisina que se producen del mismo son particularmente económicas. En efecto:

- como aditivo, s´olo es necesaria para su rea-lizaci´on una base tal como NaOH, NH4OH o KOH

- el consumo de agua es particularmente re-ducido, o incluso nulo

- no es necesaria ninguna instalación espec´ı-fica para la realización de la invención. En otras palabras, las instalaciones habitual-mente utilizadas en fermentación, que com-prenden un fermentador equipado con me-dios de separación de la biomasa y de las materias minerales, no necesitan ninguna adaptación compleja para la realización del procedimiento según la invención,

- finalmente, debido a su elevado contenido de lisina y a su estabilidad, la explotación y la conservación industriales de las disolucio-nes según la invención son a la vez simples y económicas.

Otra ventaja importante del procedimiento según la invención reside en el hecho de que no comprende ninguna operación susceptible de de-gradar la lisina, tal como la deshidratación que se emplea ampliamente en los procedimientos cono-cidos.

Las composiciones alimentarias que contienen las disoluciones seg´un la invenci´on presentan una eficacia, para el crecimiento de los animales, equi-valente a la de las composiciones que comprenden clorhidrato de lisina purificado.

Además de su estabilidad al almacenaje, la disolución acuosa y concentrada de lisina obte-nida del procedimiento según la invención posee las propiedades siguientes:

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· contenido elevado de lisina base que, a t´ıtulo de ejemplo, expresado como lisina base (li-sina bajo la forma libre) es por lo menos igual a 25% en peso cuando la fuente de carbohidrato utilizada para realizar la fer-mentación es la melaza de remolacha o de caña de azúcar,

· una elevada relaci´on en peso de lisina base respecto a materias secas, generalmente por lo menos igual al 35% en peso,

· las disoluciones acuosas y concentradas de lisina base según la invención son l´ıquidos cuya mezcla con alimentos para animales no presentan ninguna dificultad. Además, la adición de las disoluciones según la in-vención en alimentos compuestos para ani-males puede realizarse siempre de tal ma-nera que los contenidos de lisina correspon-dan a la respectiva necesidad de los anima-les.

La operación de separación de la lisina debe conducirse a un pH comprendido entre 9 y 11, puesto que de lo contrario se favorece la precipi-tación de la lisina.

Según un modo de realización preferido, la se-paración de la lisina se realiza a partir de un caldo de fermentación productora de lisina cuyo pH se ha ajustado a un valor comprendido entre 9,5 y 10. En efecto, a estos valores se han alcanzado las concentraciones más elevadas de lisina.

De manera general, los caldos de fermentación conocidos para producir lisina son adecuados para la invención. Ventajosamente, se eligen los caldos producidos por la fermentación de una fuente de nitrógeno y de una fuente de carbono con la ayuda de un microorganismo que tenga una fuerte pro-ductividad en lisina, perteneciente por ejemplo al género Brevibacterium o Corynebacterium. Pre-ferentemente, como fuente de carbono, se eligen las melazas de remolacha o de caña de azúcar o las fuentes de carbono con elevado contenido de materias fermentables tales como la glucosa, la sacarosa, los hidrolizados de almidón o una mez-cla de dos o varias de las diferentes fuentes de carbono previamente citadas.

Cuando la concentración de fuente de carbono es suficientemente débil, se detiene la fermen-tación y puede emprenderse la separación de la lisina en disolución acuosa: puesto que la fermen-tación se realiza de manera general a valores de pH próximos a la neutralidad, la lisina se halla entonces esencialmente en estado de cation mo-novalente, bajo forma de una sal y de manera general bajo forma de sulfato o de clorhidrato.

Según el modo de realización preferido de la invención, en una primera etapa, se eliminan, por ejemplo por ultrafiltración, microfiltración, sepa-ración centr´ıfuga o filtración, las materias en sus-pensión y en particular los microorganismos.

Se ajusta luego el pH de la disoluci´on clari-ficada a un valor comprendido entre 9 y 11 y,

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

preferentemente entre 9,5 y 10, a˜nadi´endole una base tal como NaOH, KOH y NH4OH. Ventajosa-mente, a t´ıtulo de base, se utiliza KOH o NH4OH o la mezcla de estas dos bases, a fin de producir sales minerales que puedan emplearse en el campo de los piensos.

A continuación, se puede proceder, en una se-gunda etapa, a la cristalización de las sales mine-rales por concentración y eventualmente enfria-miento de la disolución clarificada.

De manera general, la concentración se rea-liza según técnicas bien conocidas para este tipo de operación. Las condiciones operatorias de esta concentración se eligen de modo que los compues-tos contenidos en la disolución acuosa final no se degraden.

Por ejemplo, la concentraci´on puede realizarse con la ayuda de aparatos de evaporaci´on bajo vac´ıo.

En el curso de esta etapa, se eliminan venta-josamente todas las sales cuya solubilidad es in-ferior a la de la lisina. Entre las sales que pueden eliminarse de esta forma, gracias a la invención, se pueden citar SO24−, Cl−, Na+, K+, NH+4. Los cristales de las sales minerales que se forman du-rante la operación de concentración se eliminan, por ejemplo, por centrifugación o filtración. Para-lelamente con la eliminación de las sales minera-les, se recoge la disolución madre de cristalización que contiene la lisina.

Ejemplo 1 :

Preparaci´on de una disoluci´on de lisina a partir

de un caldo de fermentaci´on realizado con un

hi-drolizado de almid´on (jarabe de alto contenido de

glucosa) que comprende 10% en peso de melaza de remolacha y 90% en peso de glucosa, como fuente de carbono.

El procedimiento de fermentación que utiliza un microorganismo productor de lisina y que uti-liza como fuente de carbono un hidrouti-lizado de almidón (disolución de glucosa) conduce a la ob-tención de un mosto de fermentación que tiene las caracter´ısticas siguientes:

lisina base/ materia seca total: 50%

Sulfatos: 3%

pH: 7

El mosto de fermentación se ha ajustado as´ı a pH 10 por adición de una disolución de potasa.

El mosto ajustado se ha tratado luego por cen-trifugaci´on para eliminar la biomasa.

El mosto as´ı tratado se ha concentrado luego por evaporaci´on bajo vac´ıo y se ha obtenido una suspensi´on de cristales de sulfato de potasio a 60 ◦_C.

La suspensi´on de cristales se ha enfriado a 10 ◦_{C en un cristalizador para asegurar un buen} ago-tamiento de las sales minerales.

Las sales minerales se han eliminado por cen-trifugaci´on y se ha obtenido una disoluci´on de li-sina base que tiene las caracter´ısticas siguientes:

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- l´ıquido pardo claro - densidad: 1,30 - pH : 10

- contenido de lisina base: 45% - composici´on centesimal:

- materia seca: 70% - prote´ınas: 6% - materias minerales: 5,8% iones sulfato de las mismas 1,5% La estabilidad de esta disolución se ha verifi-cado y la pérdida de t´ıtulo de lisina es inferior a 1% después de 6 meses de almacenaje en condi-ciones de temperatura ambiente (variando entre -5◦C y 20◦C).

No se ha constatado ninguna alteración de la calidad bacteriológica ni la aparición de precipi-tado.

Esta disoluci´on se caracteriza pues por una buena estabilidad en el tiempo, desde todos los puntos de vista.

Ejemplo 2 :

Preparaci´on de una disoluci´on de lisina a partir

de un caldo de fermentaci´on realizado con 100%

en peso de melaza de remolacha, como fuente de carbono.

Se realiza el mismo tipo de procedimiento de fermentaci´on pero utilizando la melaza de remo-lacha como fuente de carbono por parte del mi-croorganismo productor de lisina.

El mosto de fermentaci´on obtenido posee la composici´on siguiente:

- Lisina base/materia seca total: 25%

- Sulfatos: 3,8% - Potasio: 1,3% - pH: 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

El mosto de fermentaci´on se ha ajustado luego a pH 9,50 por adici´on de amon´ıaco.

El mosto ajustado se ha tratado luego en una instalación de microfiltración tangencial a fin de eliminar las bacterias y las materias en sus-pensión.

El mosto as´ı obtenido se ha concentrado por evaporaci´on bajo vac´ıo y luego se ha enfriado a 10 ◦_{C a fin de obtener la cristalizaci´}_{on de una mezcla} de sulfato de potasio y de amonio.

La separación de los cristales de sales minera-les ha conducido a la obtención de una disolución de lisina base que tiene las caracter´ısticas siguien-tes:

- l´ıquido pardo fuerte - densidad: 1,35 - pH: 9,5

- contenido de lisina base: 25% - composici´on centesimal:

- materia seca: 70% - prote´ınas: 16% - materias minerales: 7% iones sulfatos de las mismas: 2,4% Se ha verificado la estabilidad de la disolución y la pérdida de t´ıtulo de lisina es inferior a 1% después de 6 meses de almacenaje en condiciones de temperatura ambiente (variando entre -5◦C y 20◦C).

No se ha constatado ninguna alteración de la calidad bacteriológica ni de aparición de precipi-tado.

Esta disoluci´on est´a pues caracterizada por una buena estabilidad en el tiempo desde todos los puntos de vista.

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REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de separación de lisina, a partir de un caldo de fermentación que la con-tiene, bajo la forma de una disolución acuosa,

caracterizadoporque consiste en:

a) ajustar el pH del caldo de fermentaci´on a un valor comprendido entre 9 y 11;

b) cristalizar las sales minerales presentes en el caldo de fermentaci´on por concentraci´on y eventualmente enfriamiento de este caldo; c) separar estas sales minerales del caldo de

fermentaci´on;

d) recoger la disoluci´on acuosa que contiene la lisina que constituye las aguas madres de cristalizaci´on;

y porque presenta igualmente una etapa que está destinada a eliminar del caldo de fermentación los microorganismo que han determinado la pro-ducción de lisina, pudiéndose realizar esta etapa ya sea antes ya sea después de la etapa a) ya sea después de la etapa c).

2. Procedimiento seg´un la reivindicaci´on 1,

caracterizadoporque el pH del caldo de

fermen-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

taci´on se ajusta a un valor comprendido entre 9,5 y 10.

3. Procedimiento seg´un la reivindicaci´on 1 o 2,caracterizado porque el pH se ajusta con la ayuda de KOH o NH4OH.

4. Disoluci´on de lisina susceptible de ser pre-parada seg´un el procedimiento descrito en cual-quiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Disolución de lisina según la reivindicación 4, caracterizada porque posee las propiedades siguientes:

- un contenido de lisina base por lo menos igual a 25% en peso,

- una relaci´on en peso de lisina base respecto a materias secas totales por lo menos igual a 35% en peso,

- un pH comprendido entre 9 y 11.

6. Disolución de lisina según la reivindicación 5, caracterizada porque su pH está compren-dido entre 9,5 y 10.

7. La utilización de una disolución de lisina según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para la preparación de una composición destinada a la alimentación animal.

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva

del art. 167.2 del Convenio de Patentes Euro-peas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes euro-peas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a produc-tos qu´ımicos y farmacéuticos como tales.

Esta informaci´on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.