Palabras clave: Plasma rico en plaquetas Factor de crecimiento transformante beta 1 Perros.

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Comparación de la concentración de factores de crecimiento transformante beta I, mediante 2 métodos de obtención de sangre en perros clínicamente sanos

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REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504

Comparación de la concentración de factores de crecimiento transformante beta I, mediante 2 métodos de obtención de sangre en perros clínicamente sanos – Comparison of the concentration of transforming growth factors beta I by 2 methods of obtaining blood in clinically healthy dogs

Fischer Wiethuchter, Christof: Universidad Santo Tomás. Escuela de Medicina Veterinaria. Sede Concepción. Chile. | Toro Troncoso Ignacio:

Universidad Santo Tomás. Escuela de Medicina Veterinaria. Sede Concepción. Chile. Luzio, Álvaro: Universidad Santo Tomás. Escuela de Medicina Veterinaria. Sede Concepción. Chile. | Opazo, Álvaro:

Universidad Santo Tomás. Escuela de Medicina Veterinaria. Sede Concepción. Chile. | Carolina, Rios: Universidad Santo Tomás. Sede Los Ángeles. Chile. | Partarrieu Parra, Juan: Centro Veterinario Alemán Kleintierklinik, Concepción. Chile. | Cherres Villarroel, Mitzi: Centro Veterinario Alemán Kleintierklinik, Concepción. Chile.

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Resumen

El presente estudio tuvo como objetivo comparar la concentración de factores de crecimiento beta I (TGF-β1), mediante 2 métodos de obtención de sangre en perros clínicamente sanos, para determinar con cual se obtiene una mayor cantidad de este factor. Los caninos se seleccionaron acorde a los parámetros fisiológicos normales para la especie. Se extrajo sangre a través de la vena cefálica, en 60 perros (n obtenido según teorema del límite central). Éstos fueron divididos en 2 grupos (Grupo 1: tubos al vacío y grupo 2: sin vacío), posterior a eso las muestras fueron centrifugadas en dos ocasiones a 1500 rpm por 5 minutos cada una, para luego determinar las concentraciones de TGF-β1 a través de ELISA. Para determinar las diferencias estadísticas se utilizó la prueba de U de Mann-Whitney. Los resultados arrojaron que el grupo 1 tuvo una concentración media de 28,76 pg/ml, con un error estándar de 3,568, siendo mayor que la del grupo 2 que fue de 16,92 pg/ml, con un error estándar de 1,200, por lo tanto, los resultados del primer grupo fueron estadísticamente significativos (P = 0,0163). En conclusión, se pudo comprobar que el método de obtención de sangre influye en la concentración de TGF-β1, siendo el método con tubos al vacío, el que permite obtener una mayor concentración de éste factor.

Palabras clave: Plasma rico en plaquetas | Factor de crecimiento transformante beta 1 | Perros.

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2 Abstract

The aim of the present study was to compare the concentration of transforming growth factors beta I (TGF-β1), with two diferent blood collection methods in clinically healthy dogs. All dogs included in the study (n

= 60) had normal physiological and hematological values. Blood collection was obtanined from the cephalic vein and were divided into 2 groups (1: vacuum tubes and 2: without vacuum). The samples were centrifuged 2 times at 1500 rpm for 5 minutes. Plasma were obtained and the concentration of TGF-β1 were measured by ELISA.

Statistical analysis was performed using SPSS and differences between groups were calculated using Mann-Whitney's test. The concentration of TGF-β1 in group 1 (28.76 pg / ml) was significantly higher (p = 0.0163) than in of group 2 (16.92 pg / ml). The results of the present study demostrate that the blood collection method influence the concentration of TGF-β1 in plasma and must be considered in future investigations and treatments.

Key Words: Platelet-Rich Plasma | Growth factor beta 1 | Canines.

Introducción

El plasma rico en plaquetas (PRP) se define como un sustrato que contiene una mayor concentración de plaquetas por encima de lo que normalmente tiene la sangre, éstas a su vez poseen factores de crecimiento (FC); como el FC transformante beta I (TGF-β 1), el FC insulínico tipo I (IGF-I), el FC derivado de plaquetas (PDGF) y otras moléculas que modulan la respuesta inflamatoria (Alsousou y col, 2009). El TGF-β 1 se encuentra de manera más abundante en plaquetas (Laurencin, 2003), este factor regula la expresión de colágenos y fibronectina, restringe la degradación de la matriz extracelular, disminuye la expresión de las metaloproteinasas de matriz, promueve la síntesis de su inhibidor tisular del factor de crecimiento de fibroblastos y la producción de angiogénesis (Huang y Huang, 2005). El efecto de estimular la síntesis proteica en condrocitos y osteoblastos in vitro, más su elevada concentración en la matriz ósea extracelular y su liberación por parte de plaquetas en el hematoma las primeras 24 horas de la fractura, hace pensar que el TGF-β 1 es un factor de crecimiento importante implicado en la regulación de la formación ósea y cartilaginosa tras una lesión (Laurencin, 2003).

En medicina humana, hay evidencia sobre el número de plaquetas necesario para realizar potencialmente la cicatrización (Marx, 2001), y existen estudios comprueban que los síntomas clínicos asociados a osteoartritis (OA) disminuyen tras aplicaciones intraarticulares de PRP (Huang y Huang, 2005;

Kon y col, 2010; Lee y col, 2013). En medicina veterinaria, falta evidencia

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3 para el tratamiento de OA en caninos, pero se ha demostrado que el TGF-β1 estimula el crecimiento óseo en perros (Lind y col, 1996) y se han obtenido resultados favorables en equinos (Frisbie y col, 2007; Carmona y col, 2009).

El enriquecimiento de plaquetas en medicina humana está establecido y es el resultado de dos centrifugaciones. Una primera, que separa las células rojas del plasma, que contiene las plaquetas y una segunda que separa las plaquetas en conjunto con las células blancas del plasma (Marx, 2001). En el caso de los equinos, se ha demostrado, que distintas centrifugaciones tienen un efecto en la concentración de las plaquetas (Kissich y col, 2012). Según el conocimiento de los autores, en el caso de los caninos, aún no existe un método estándar para la obtención de mayor concentración de plaquetas y de TGF-β1.

Como objetivo se plantea comparar la concentración de factores de crecimiento transformante beta I, mediante 2 métodos de obtención de sangre en perros clínicamente sanos, con el fin de determinar con que método se puede obtener mayor cantidad de TGF-β1.

Materiales y métodos

Se utilizaron 60 caninos, sin distinción de raza, sexo o edad, siendo el único criterio de inclusión, el estar clínicamente sano al momento de la toma de la muestra. Para esto se tomó en consideración que las constantes fisiológicas estuvieran dentro de sus parámetros de normalidad.

El n muestral se obtuvo por teorema del límite central, el cual dice que la distribución de las proporciones o de las medidas de las muestras sigue una distribución aproximadamente normal, cuando las muestras son de tamaño grande (≥30) (Marrugat y col, 1998).

La toma de muestras se realizó por punción de la vena cefálica, en el grupo 1 el método de obtención sanguínea fue con tubos al vacío, para lo cual se utilizó la aguja acoplada al adaptador (holder) y en los pacientes del grupo 2 con tubos sin vacío, para lo cual se utilizaron jeringas de 10ml, en ambos casos la sangre fue obtenida en tubos con aditivo EDTA, recolectando aproximadamente 6 ml de sangre.

Posteriormente se procedió a realizar el hemograma en el analizador de hematología automático (Abaxis VetScan HM2, Union City, California, USA).

De esta manera se corroboró que el paciente estuviera clínicamente sano y así poder procesar las muestras. Cumpliendo con lo anterior, se procedió a centrifugar las muestras en una centrifuga BOECO C-28 a 1500 rpm por 5 minutos (RCF 1292). Luego de haber centrifugado las muestras, se procedió a recolectar aproximadamente 400 µl de plasma por encima de la interfaz eritrocitos-plasma con la ayuda de la micropipeta de volumen fijo de 1000µl, esto fue depositado en tubos sin aditivos y fueron sometidos a una segunda

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4 centrifugación a 1500 rpm por 5 minutos. Con la ayuda de una micropipeta de volumen fijo de 1000µl se recolectaron 400 µl y esto fue depositado en tubos de eppendorf, los cuales fueron congelados a -20°C hasta que se realizó el test de ensayo inmunoenzimatico ELISA (Mouse/Rat/Porcine/Canine TGF-β1 MB100B, del laboratorio R&D System), con el objetivo de determinar la concentración de TGF-β1.

Resultados y discusión

La concentración de los TGF-β1 obtenidos con el test de ensayo inmunoenzimatico ELISA mediante los 2 métodos de obtención de sangre (Grupo 1: Tubos al vacío y Grupo 2: Tubos sin vacío) se reportan en el gráfico N°1. En el grupo 1 se pudo obtener una concentración media de 28,76 pg/ml, siendo mayor al compararla con el grupo 2, en la cual se obtuvo una concentración media de 16,92 pg/ml, siendo los resultados estadísticamente significativos (p = 0,0163).

Grafico N° 1: Concentración de TGF-β1 con los dos métodos de extracción de sangre.

Dichos resultados son similares a los estudios de Silva y col (2013) en caninos, al de López y col (2012) en bovinos y al de Stief y col (2011). Si bien es cierto ambos estudios se basan en la concentración de TGF-β1, pero se diferencia de éste en el tipo de tubos de obtención de la muestra. Si bien estudios anteriores (Stief y col, 2011; Silva y col, 2013) describen la versión inicial de TGF-ß 1, no existen estudios previos que comparen 2 métodos de extracción de sangre, para la concentración de éste factor, por lo que es el primer estudio que evalúa esta variable. Si bien la concentración de PRP depende de factores intrínsecos y extrínsecos. Entre los primeros encontramos: especie, sexo, raza, edad, índice de condición corporal.

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5 Mientras que en los segundos se mencionan: el tipo de anticoagulante usado, método, tiempo y velocidad de centrifugación (Carmona y col, 2011).

Considerando que existen diferencias en la sedimentación de plaquetas humanas y caninas se podrían considerar resultados disímiles utilizando los mismo protocolos para la obtención de plasma rico en plaquetas (Clemmons y col 1983, Van Wie y Hustvedt, 1988). Así, Stief en el año 2011, demuestra que la obtención de PRP en humanos es distinta a la de caninos utilizando las recomendaciones para el proceso en personas por lo que no se debería extrapolar los protocolos.

El EDTA se utilizó en este estudio, ya que es el apto para el kit de ELISA Además, esta sustancia se considera el anticoagulante de elección para el recuento de células sanguíneas (Wayne, 2003), así como para la conservación de la morfología celular y evitar el efecto de diluir la muestra (Meinkoth y col, 2007). En un trabajo comparativo entre anticoagulantes; Heparina, EDTA y Citrato, se estableció que el número de plaquetas se mantuvo constante durante el periodo de conservación de la sangre anticoagulada con EDTA y citrato, no así con heparina que produce marcadas modificaciones en los índices plaquetarios (Sujeros y col., 2000).

Vieweg y col (1999) informaron de la concentración de TGF-ß1 en dos perros (16,5 y 19,9 ng / ml) usando un kit de ELISA humano. A pesar de que no eran representativos, los valores medios de plasma y sobrenadantes obtenidos de gel de plaquetas estaban más cerca de los datos obtenidos en nuestro estudio (Silva y col 2013). Por otra parte, otro estudio (Neumann y col 2008) describe concentraciones TGF-ß1 en plasma entre 0,193 y 0,598 ng / mL en 29 muestras de sangre canina recogidas con EDTA que se obtuvieron por doble centrifugación a 1000 gx 15 minutos seguido de 10 000 gx 10 minutos en una temperatura de 4 ° C. Estos valores fueron sustancialmente inferiores a los obtenidos en el estudio de Silva y col (2013). Sin embargo, estos valores siguen siendo inferiores a los obtenidos en nuestro estudio en el plasma mediante el uso del mismo anticoagulante de los estudios anteriormente mencionados.

El primer método manual de centrifugación única en tubo para concentrar plaquetas en seres humanos fue descrito por Anitua (1999). Posteriormente, se describió un método manual de doble centrifugación en tubo para obtener concentrados de plaquetas en caballos (Argüelles y col, 2006; Carmona y col, 2008) y recientemente se han descrito dos métodos de centrifugación simple en tubo con el mismo objetivo en caninos (Silva y col, 2011^c) y felinos (Silva y col, 2011ª). El análisis de estas investigaciones permite apreciar que el tamaño y peso tanto de las plaquetas como de los leucocitos determinan el protocolo a utilizar para poder concentrar plaquetas de manera efectiva en cada especie (López y col, 2012). Por lo que se puede decir que los parámetros para la obtención de PRP en humanos se encuentra definido, a diferencia de lo que sucede en medicina veterinaria, en donde existen pocos estudios relacionados a la obtención de PRP (Sutter y col, 2004; Silva y col,

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6 2011 ; Stief y col, 2011, Kissich y col, 2012; López y col, 2012). El enriquecimiento de plaquetas observado en medicina humana a través de un paso de centrifugación a bajas revoluciones, permitiendo la remoción de eritrocitos y células nucleadas para concentrar gran parte de plaquetas se encuentra comprobado y existen centrífugas especiales y recomendaciones estandarizadas (Buhr y Siekmann 2007, Buhr y Siekmann 2009). Si bien existen 2 métodos descritos para la obtención de concentrados plaquetarios en caninos, el método del tubo (Jensen y col, 2004; Choi y col, 2005) y el método semiautomatizado SmartPReP 2 system (Thoesen y col, 2006).

Mientras que el primero, no encontró reproducibilidad; el segundo semiautomatizado es demasiado costoso (Silva y col, 2011c). De ésta forma diversos investigadores (Silva y col, 2011c; Fischer y col, 2014) han ido entregando resultados que apuntan a la estandarización de un método para concentrar plaquetas caninas de manera eficiente y reproducible.

Referente a la centrifugación, es importante considerar la velocidad de centrifugación que va en relación directa con la fuerza de gravedad, ya que se ha visto que una fuerza excesiva, reduce drásticamente la concentración de PRP. La fuerza de la centrifugación puede tener una influencia importante sobre las plaquetas, debido a que dichas fuerzas centrífugas pueden destruir las plaquetas y favorecer su activación temprana liberándose así los factores de crecimiento prematuramente, conllevando esto a una pérdida de plaquetas (Reyes y col, 2002, Sutter y col, 2004, Dohan y col, 2009).

Por otro lado, las diferencias encontradas para la concentración de TGF-ß1 medido en nuestro estudio, en comparación con otros estudios (Vercelli y col, 2003; Neumann y col, 2008; Stief y col, 2011), podría deberse a la metodología utilizada para la obtención y procesamiento de las muestras, y, potencialmente, debido al hecho de que el estudio usó un kit ELISA (Mouse/Rat/Porcine/Canine TGF-β1 MB100B, del laboratorio R&D System).

Esta última situación no fue considerada en los estudios antes mencionados, donde se utilizaron kits humanos específicos de ELISA (Vercelli y col, 2003; Neumannet y col, 2008, Stief y col, 2011).

Conclusiones

Con los resultados obtenidos se pudo comprobar, que el método de obtención de sangre de perros tiene influencia sobre la concentración de factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1). Mientras que el método de obtención con tubos al vacío permite obtener una mayor concentración de factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) en perros.

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REDVET: 2017, Vol. 18 Nº 11

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