RESIDUOS DE Eucalyptus grandis COMO FUENTE DE COMPUESTOS ANTIFUNGICOS
Christian SEQUÍN
1, Pablo ACEÑOLAZA
2, Diego SAMPIETRO
3, Adriana GIECO
4RESUMEN
Argentina cuenta con cerca de 1.120.000 hectáreas de bosques cultivados, entre los que se encuentran 255.000 ha de Eucalyptus sp. Tras la cosecha de una plantación forestal, permanece en el campo una cantidad importante de residuos compuestos por ramas, despuntes y hojas que representan una cantidad de sustancias extraíbles de potencial interés económico. Es conocido que especies forestales cultivadas han demostrado tener actividad antifúngica contra hongos fitopatógenos. El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antifúngica de Eucalyptus grandis sobre Cercospora kikuchii hongo fitopatógeno integrante del complejo de enfermedades de fin de ciclo del cultivo de soja. Para este estudio se recolectaron follaje, albura y duramen de E. grandis y se prepararon extractos diclorometánicos y metanólicos. Como material biológico se utilizó la cepa Cercospora kikuchii NRBC 6713 y la actividad antifúngica se determinó mediante la inhibición del crecimiento micelial. El extracto metanólico de hojas presentó actividad con una inhibición de 5 mm e inhibió el normal desarrollo del hongo en un halo de 20 mm aproximadamente. El extracto diclorometánico de hojas presentó moderada actividad antifúngica. Los compuestos químicos responsables de esta actividad podrían ser tres flavonoides con actividad antifúngica que han sido aislados en otras especies de Eucalyptus; la 2´,6´-dihydroxy-3´-methyl-4´-methoxy-dihydrochalcone, el eucalyptin y 8-desmethyl-eucalyptin.
Palabras clave: hongos fitopatógenos, actividad antifúngica, Cercospora kikuchii
1. INTRODUCCIÓN
Argentina cuenta con 1.120.000 hectáreas de bosques cultivados, predominando las forestaciones de pinos (Pinus spp.), eucaliptos (Eucalyptus spp.), sauces (Salix spp.) y álamos (Populus spp.), de las cuales el 80% se concentra en la Mesopotamia (DPF, 2014). Tras la cosecha de una plantación, permanece en el campo una cantidad importante de residuos, que son materiales que se desprenden del aprovechamiento maderero y no son utilizados industrialmente por no ser convertibles en subproductos. La mayor parte de estos remanentes están compuestos por ramas, despuntes y hojas (Velázquez, 2006). En las zonas de tala suelen quedar del 35 al 45% del follaje arbóreo (Vidal, 1995).
Asimismo, durante el procesamiento primario de los rollizos en aserradero, se desperdicia entre un 45 y un 50% del volumen entre costaneros, aserrín y corteza. Esta biomasa por lo general es subaprovechada, o directamente incinerada, y representa una fuente recuperable de materia prima para la obtención de aceites esenciales, ceras y extractos vegetales (Díaz, 1998). En este sentido, Ramírez (2012), indica que los residuos forestales presentan una gran cantidad de sustancias extraíbles de interés económico que pueden ser utilizadas en diferentes actividades humanas.
Las especies forestales cultivadas han demostrado tener actividad antifúngica contra hongos fitopatógenos como los que se mencionan en el Cuadro 1.
La bibliografía existente sustenta la posibilidad de que las especies forestales como E. grandis exhiban actividad antifúngica frente a Cercospora kikuchii. Esta especie fúngica forma parte del complejo de fitopatógenos que causan las enfermedades de fin de ciclo (EFC) de mayor prevalencia
1 Fac. Cs. Agropecuarias – UN Entre Ríos / CICyTTP-CONICET. Contacto: [email protected]
2 Fac. Cs. Agropecuarias – UN Entre Ríos / CICyTTP-CONICET
3 UN Tucuman - CONICET
4 Fac. Cs. Agropecuarias – UN Entre Ríos
en Argentina, Brasil y Uruguay en el cultivo de soja.
Cuadro 1. Antecedentes sobre actividad antifúngica de extractos arbóreos.
Especie evaluada Parte
utilizada Hongo Fitopatógeno Inhibido E. grandis Hojas
Fusarium oxysporum Pyricularia grisea Phytophthora capsici
Liu y col. (2008) Populus alba
Populus nigra Hojas Aspergillus niger A. fumigates
Al-Hussaini y col.
(2011) Salix subserrata Hojas y
corteza Microbotryum violaceum Hussain y col. (2011)
El objetivo de este trabajo fue estudiar la actividad antifungica de E. grandis sobre Cercospora kikuchii, hongo fitopatógeno integrante del complejo de enfermedades de fin de ciclo del cultivo de soja.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Selección y recolección del material vegetal: Se recolectaron follaje, albura y duramen de 5 ejemplares de Eucalyptus grandis provenientes de un monte sito en la localidad de Valle María (ER).
Un ejemplar de referencia fue depositado en el Herbarium Lorentz (DTE) bajo el número 5843. Las muestras fueron secadas a temperatura ambiente y separadas en: hojas, corteza, albura y duramen y trituradas en molino mecánico.
2.2 Obtención de extractos: los extractos se prepararon a partir del material recolectado seco y molido, mediante extracción secuencial con volúmenes conocidos de solventes orgánicos de polaridad creciente (diclorometano y metanol) a temperatura ambiente y filtrando a las 24 h (Vivot y col., 2006).
Las fracciones obtenidas se evaporaron bajo presión reducida, conservándose los residuos secos a 2ºC hasta su utilización en los bioensayos.
2.3 Material Biológico: se utilizó la cepa Cercospora kikuchii NRBC 6713 obtenida del cepario perteneciente a la Fac. de Bioquímica y Cs. Biológicas - UN Litoral.
2.4 Bioensayo: Se procedió según la técnica descripta por Quiroga y col. (2009). En las placas de Petri con APG se colocaron discos de papel (Whatman No 4) estéril, de 6 mm de diámetro impregnados con 10μl de los diferentes extractos esterilizados por filtración. Los mismos se colocaron en la superficie del medio contenido en las placas, espaciados regularmente en forma excéntrica. Se trabajó con 6 repeticiones y se incluyeron controles negativos (de solventes orgánicos) y positivos (ciproconazole). Las placas fueron invertidas e incubadas en estufa por 20 días a temperatura óptima de 25ºC con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Luego se medió el diámetro del halo de inhibición del crecimiento micelial alrededor de cada disco. Con el objeto de adaptar la metodología a las características particulares de la especie de C. kikuchii, se llevaron a cabo las siguientes modificaciones. Inóculo: Para su preparación se utilizaron estrías del hongo, desarrolladas en APG, de 5 días de incubación. Las estructuras fúngicas se obtuvieron desprendiéndolas suavemente con un ansa y cuidando de no arrastrar medio agarizado. La concentración del inóculo se ajustó mediante el recuento en Cámara de Neubauer para lograr una concentración final de 4x103 - 5x104 UFC/mL.
Además se efectuó el control del inóculo mediante un recuento microbiológico en superficie. Sobre cada placa se sembraron 100μl de solución de propágulos.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el Cuadro 2 se muestra el rendimiento de extracción de los solventes utilizados indicando mg de extracto obtenido por cada gramo de material molido y seco. El extracto metanólico de la albura y el extracto diclorometánico de hojas presentan las mayores extracciones con valores de entre 30 y 50mg respectivamente.
Cuadro 2. Rendimiento de extracción de los solventes sobre diferentes partes de E. grandis.
Partes
utilizadas Solvente Extracción (mg/g)* Material molido y seco
Hojas
DClM 30,9
MeOH 1,2
Albura
DClM 0,7
MeOH 50,0
Duramen
DClM 1,9
MeOH 3,0
*mg de extracto obtenido por cada g de material molido y seco DClM: Diclorometano
MeOH: Metanol
En el Cuadro 3 se presenta la actividad antifúngica ensayada sobre C. kikuchii. Los extractos de hojas tuvieron diferencias significativas respecto de los extractos de albura y duramen. El extracto metanólico de hojas presentó actividad con una inhibición de 5mm e inhibió el normal desarrollo del hongo en un halo de 20 mm aproximadamente como puede observarse en la Figura 1. El extracto diclorometánico de hojas presento moderada actividad antifungica debido a que el micelio avanzo sobre el disco.
Cuadro 3. Actividad antifúngica del extracto obtenido de diferentes partes de Eucalyptus grandis.
Partes utilizadas Extracto* Inhibición Tukey**
Hojas DClM 5,1 mm a
MeOH 5,0 mm a
Albura DClM 0 mm b
MeOH 0 mm b
Duramen DClM 0 mm b
MeOH 0 mm b
*DClM: Diclorometano; MeOH: Metanol
**Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes
En la Figura 1 se muestra la placa de Petri invertida a los 6 días de incubación con el desarrollo micelial sobre el disco testigo y la inhibición del micelio sobre el extracto vegetal. Pudo observarse también la falta de formación de cercosporina de las colonias cercanas al disco. Esto es de gran relevancia debido a que la cercosporina es un pigmento que juega un papel preponderante en la toxicidad del hongo para sus hospederos (Daub y Ehrenshaft, 2000).
Figura 1. Actividad antifúngica del extracto metanólico de hojas de E. grandis
En este trabajo se comprobó que los extractos metanólicos y diclorometánicos de hojas de E. grandis poseen actividad antifúngica frente a C. kikuchii. Respecto de los compuestos químicos responsables de esta actividad Takahashi y col. (2004) encontraron tres flavonoides con actividad antifungica; 2´,6´- dihydroxy-3´-methyl-4´-methoxy-dihydrochalcone, eucalyptin, 8-desmethyl-eucalyptin que se muestran a continuación:
A) 2´,6´-dihydroxy-3´-methyl-4´-methoxy- dihydrochalcone
B) eucalyptin
C) 8-desmethyl-eucalyptin
Estos flavonoides fueron aislados de Eucalyptus maculata y también se encuentran presentes en otras especies del género Eucalyptus como E. botryoides, E. crebra y E. globulus. Es importante destacar que estos compuestos se encuentran presentes en el extracto metanol: diclorometano de hojas de E.
maculata y podrían ser los responsables de la actividad antifúngica observada en este estudio.
5. LITERATURA CITADA
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