Efecto de la proteína GST-NS3 del virus dengue sobre la respuesta inmune de mastocitos de ratón

(1)

I

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MAESTRÍA EN CIENCIAS EN PROCESOS BIOLÓGICOS

TESIS:

“EFECTO DE LA PROTEÍNA GST-NS3 DEL VIRUS

DENGUE SOBRE LA RESPUESTA INMUNE DE

MASTOCITOS DE RATÓN”

PRESENTA:

Q.F.B. Anahí Rojas Estrada

DIRECTOR:

Dra. Aracely López Monteon

ORIZABA, VER. JULIO, 2019

(2)

(3)

III

El presente trabajo de investigación fue realizado en el LADISER

Inmunología y Biología Molecular, adscrito a la Facultad de Ciencias

Químicas de la Universidad Veracruzana en la ciudad de Orizaba, Ver.,

bajo la dirección de la Dra. Aracely López Monteon. Durante la

realización de este proyecto recibí apoyo del programa de becas para

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IV

Agradecimientos

A Dios

Primeramente, a Dios por permitirme terminar este proyecto, y añadir una experiencia más a mi archivo de vida, que sin Él no hubiese sido posible llamarlo un logro más.

A mi papá Saúl

Gracias por tus consejos, por compartir conmigo de tu paciencia y de tu experiencia, por tu soporte de día a día que siempre has estado ahí para mí, gracias porque eres uno de los pilares más fuertes de mi vida, ¡muchas gracias papá!

A mis abuelitos

Gracias a mi abuelito que me cuida desde el cielo y mi abuelita que con cariño siempre se ha preocupado de mi bienestar, y que a veces no hace falta decir palabras para saber que cuento con ella y que siempre me ha apoyado. A ambos gracias por todo.

A Jairito

Gracias amor por apoyarme en todas mis metas día a día, cuando mi estrés me ha puesto en las peores situaciones, y que todos los días grises que tuve, gracias por siempre hacerme ver que soy capaz de hacer lo que me propongo, sin duda tu sufriste tanto este proyecto como yo y por eso te doy gracias por tu comprensión y cariño. Este logro es tuyo tanto como mío, Te amo.

A la Dra. Aracely

Gracias por todo el apoyo dado en este proyecto, en la enseñanza, y así como la infraestructura para poder llevarlo a cabo. Tiene toda mi admiración y respecto.

Al equipo de LADISER IBM

A la Dra. Soledad por su apoyo en todo el proyecto, al Dr. Jesús por sus enseñanzas y paciencia dadas. También a todos los chicos que en su momento apoyaron en la purificación de la proteína.

A mis amigos cercanos y familia

A los profes, Jacinto, Rossy, a la maestra Lulis, gracias por su apoyo moral, por sus consejos y palabras cuando el experimento no salía. A mis amigos Lucy, Mariana, Jairo, Lizzy, Mayam, Steffy gracias por estar ahí siempre, con sus buenos deseos para los experimentos y por su preocupación.

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V ÍNDICE

Página

LISTA DE FIGURAS v

LISTA DE ABREVIATURAS ix

RESUMEN xi

ABSTRACT xii

1. INTRODUCCIÓN 1

2. MARCO TEÓRICO 2 2.1 Generalidades del dengue 2

2.2 Epidemiología 2

2.3 Clasificación del DENV 4

2.3.1 Manifestaciones clínicas 4

2.3.2 Dengue grave 5

2.3.3 Dengue sin signos de alarma 5 2.3.4 Dengue con signos de alarma 5 2.4 Estructura y organización del genoma del virus 6

2.5 Proteínas estructurales 7

2.6 Proteínas no estructurales 7

2.7 Replicación del virus del dengue y ciclo infeccioso 9 2.8 Patogénesis del DENV 10

2.9 Respuesta inmune contra el DENV 11

2.10 Mastocitos 12

2.11 Relación del dengue y mastocitos 13

3. JUSTIFICACIÓN 15

4. HIPÓTESIS 16

5. OBJETIVOS 16

5.1 Objetivo general 16

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VI

6. MATERIALES Y MÉTODOS 17

6.1 Ensayos de transformación bacteriana 17

6.1.1 Preparación de células competentes (DH5-α) 17 6.1.2 Transformación de células DH5-α 17

6.2 Expresión y purificación de la proteína recombinante fusionada a GST

18

6.2.1 Preparación de la resina Glutatión 18 6.2.2 Expresión de la proteína recombinante GST-NS3 18 6.2.3 Purificación de la proteína recombinante GST-NS3 de los

cuatro serotipos 19

6.3 Geles de poliacrilamida-SDS 19 6.4 Cuantificación de la proteína recombinante GST-NS3 19 6.4.1 Micro ensayo de proteína 19 6.5 Aislamiento de mastocitos tisulares de ratón 20

6.5.1 Preparación del tejido intestinal 20

6.5.2 Recuperación de mastocitos 20

6.5.3 Propagación in vitro y mantenimiento de cultivos de MC/9 y

mastocitos de cultivo primario 21 6.6 Estimulación in vitro de la línea celular MC/9 las células MCs de

ratón con las proteínas recombinantes NS3DEN1,

GST-NS3DEN2, GST-NS3DEN3, GST-NS3DEN4 21

6.7 Caracterización de MCs por citometría de flujo 22 6.8 Determinación de citocinas intracelulares en mastocitos MC/9 y

cultivo primario por citometría de flujo 22

6.9 Tinción de Mastocitos con azul de toluidina 23 6.10 Determinación de la expresión de citocinas por ELISA 23 6.11 Análisis estadístico 24

7. RESULTADOS Y DISCUSION 25

7.1 Expresión y purificación de las proteínas recombinantes GST-NS3DEN1, GST-NS3DEN2, GST-NS3DEN3 y

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VII

7.2 Propagación in vitro y mantenimiento de cultivo MC/9 26 7.3 Caracterización de línea celular MC/9 28 7.4 Determinación de la expresión intracelular de IFN-γ en mastocitos

de la línea MC/9 por citometría de flujo 28

7.5 Determinación de la expresión intracelular de TNF-α en

mastocitos de la línea MC/9 por citometría de flujo 35

7.6 Propagación in vitro y mantenimiento de cultivo primario 40 7.7 Caracterización de mastocitos de cultivo primario de ratón por

citometría de flujo 41

7.8 Determinación de la expresión intracelular de IFN-γ a las 24, 48 y

72 de cultivo primario por citometría de flujo 43

7.9 Determinación de la expresión intracelular de TNF-α a las 24, 48

y 72 h de cultivo primario por citometría de flujo 50

7.10 Determinación de la expresión de citocinas y quimiocinas de

mastocitos de línea celular MC/9 por ELISA 55

7.11 Determinación de la expresión de citocinas y quimiocinas de

mastocitos de cultivo primario por ELISA 62

7.12 Tinción de Mastocitos con azul de toluidina 67

8 CONCLUSIONES 68

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VIII LISTA DE ABREVIATURAS

º C µg µL ADA BSA CD DENV EDTA ELISA FD FHD g GST HBSS IgE IgG IPTG IFN-γ IL LB LPS kb kDa M MCs MDA5 NK Grado Celsius Microgramo Microlitro

Amplificación dependiente de anticuerpos Albúmina sérica bovina

Cúmulo de Diferenciación (Cluster of differentiation) Virus dengue

Ácido etilendiaminotetraacético

Ensayo inmunoenzimático ligado a enzima Fiebre por dengue

Fiebre hemorrágica por dengue Gravedades

Glutatión-S-Transferasa Solución de Hank’s Inmunoglobulina E Inmunoglobulina G Isopropil-tio-α-galactósido Interferón gamma Interleucina Luria Bertani Lipopolisacárido Kilobase Kilodalton Molar Mastocitos

(9)

IX NKT mL mM NS OMS PBS PB PE PE-Cy 7 pH prM RANTES RIG-I RE RNA RNAv SE SDS SFB SCD TI TNF-α VEGF

Linfocito T asesino natural Mililitro

Milimolar No estructural

Organización Mundial de la Salud Amortiguador de fosfatos

Pacific Blue

Ficoeritrina“Del inglés Phycoerythrin”

Ficoeritrina-cianina7 “Del inglés Phycoerythrin-Cyanin 7”

Potencial Hidrógeno Precursor de membrana

Células T normales, expresadas y secretadas reguladas en la activación

Gen inducible por ácido retinoico Retículo Endoplásmico

Ácido ribonucleico Ácido ribonucleico viral Sin Estímulo

Dodecilsulfato de sodio Suero Fetal Bovino

Síndrome de choque por dengue Tasa de Incidencia

Factor de necrosis tumoral alfa

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I RESUMEN

El dengue es una enfermedad infecciosa causada por un virus que es transmitido a los humanos por la picadura del mosquito hembra del género Aedes aegypti que transmite el virus del dengue. La infección por el virus del dengue causa un amplio espectro de síntomas clínicos, que van desde fiebre, fiebre con cefalea, dolor articular, vómito y en general gran malestar. Por otro lado, el dolor abdominal, anafilaxia, hemorragia y extravasación de plasma son los síntomas de la enfermedad grave del dengue, donde a menudo se asocia a individuos que experimentan infecciones secundarias por un serotipo diferente del virus del dengue.

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II ABSTRACT

Dengue is an infectious disease caused by a virus that is transmitted to humans by the bite of the female mosquito of the genus Aedes aegypti that transmits the dengue virus. Dengue virus infection causes a wide spectrum of clinical symptoms, ranging from fever, fever with headache, joint pain, vomiting and in general great discomfort. On the other hand, abdominal pain, anaphylaxis, hemorrhage and plasma extravasation are the symptoms of severe dengue disease, where it is often associated with individuals experiencing secondary infections from a serotype other than dengue virus

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1

1. INTRODUCCIÓN

El dengue es una enfermedad endémica de origen viral que afecta regiones tropicales y subtropicales. El virus dengue (DENV) pertenece a la familia Flaviviridae y comprende cuatro serotipos (DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4) que son transmitidos al humano a través de la picadura de dos especies de mosquitos: A aegypti y A.

albopictus. El genoma del DENV está constituido por una molécula de RNA

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2 2. MARCO TEÓRICO

2.1 Generalidades del Dengue

El dengue es una enfermedad infecciosa causada por un virus que es transmitido a los humanos por la picadura de un mosquito hembra del género Aedes aegypti es el transmisor o vector del DENV más importante en el hemisferio occidental (Acosta-Bas y Gómez-Cordero, 2005).

En el continente Americano, el dengue se considera la enfermedad reemergente más importante y sus formas hemorrágicas son cada vez de mayor relevancia, especialmente debido al aumento progresivo en el número de defunciones. La infección en humanos por el DENV causa un amplio espectro de síntomas clínicos, que van desde fiebre indiferenciada, fiebre por dengue, fiebre por dengue hemorrágico, síndrome de choque por dengue, según la clasificación de la OMS (Kouri, 2006).

El DENV está representado por 4 serotipos (o subespecies): DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4; los cuales exhiben características antigénicas y serología diferentes, y además pueden presentar variantes genéticas (genotipos y topotipos) dentro de un mismo serotipo relacionadas con la virulencia y la procedencia geográfica de la cepa (Kuhn et al., 2002).

2.2 Epidemiología

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3

Según la OMS, en el año 2016 se caracterizó por grandes brotes de dengue en todo el mundo. La región de las Américas notificó más de 2 380 000 casos ese año, y solo en Brasil hubo poco menos de 1 500 000 casos, es decir, cerca de tres veces más que en 2014. En la región se notificaron asimismo 1032 muertes por dengue.

En la región del Pacífico Occidental, en 2016 se notificaron más de 375 000 casos, 176 411 de ellos en Filipinas y 100 028 en Malasia, cifras que representan una carga similar a la de años anteriores en ambos países. Las Islas Salomón declararon un brote con más de 7000 casos sospechosos. En la región de África, Burkina Faso notificó un brote localizado con 1061 casos probables.

Hasta la semana epidemiológica 11 de 2017, la Región de las Américas había notificado 50 172 casos, cifra inferior a la registrada en el mismo periodo en años anteriores. En la Región del Pacífico Occidental se han notificado brotes de dengue en varios Estados Miembros, y la circulación de los serotipos DEN1 y DEN2 (OMS, 2017).

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4

Figura 1. Incidencia y Serotipos Aislados de Dengue, por Entidad Federativa. México, 2017.

Tomado de: https://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/285237/Pano_dengue_sem_52_2017.p

2.3 Clasificación del DENV

De acuerdo a la OMS, cuando una persona se recupera de la infección adquiere inmunidad de por vida contra el serotipo en particular. Sin embargo, la inmunidad cruzada a los otros serotipos es parcial y temporal. Las infecciones posteriores causadas por otros serotipos aumentan el riesgo de padecer el dengue grave. Actualmente, el dengue se clasifica como dengue sin síntomas de alarma, con síntomas de alarma y dengue grave (OMS, 2009).

2.3.1 Manifestaciones clínicas

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5

general, dolores osteomioarticulares, con o sin exantema, leucopenia y algún tipo de sangrado hasta formas graves que habiendo comenzado con lo anterior presentan choque hipovolémico por extravasación de plasma, con trombocitopenia moderada o intensa y con grandes hemorragias en aparato digestivo y otras localizaciones (Martínez-Torres, 2008).

2.3.2 Dengue grave

Los criterios de dengue grave son: de acuerdo con la Secretaría de Salud es la extravasación grave de plasma (Figura 2), manifestada por choque hipovolémico, y/o por dificultad respiratoria causada por exceso de líquidos a nivel pulmonar. Hemorragias graves. Afectación de órganos: hepatitis grave por dengue (transaminasas superiores a 1,000 UI), encefalitis o afectación grave de otros órganos, como miocarditis.

Los casos sospechosos de dengue deben ser evaluados para identificar la presencia o no de signos de alarma ya mencionados, pues esto definirá una primera clasificación: dengue sin signos de alarma o dengue con signos de alarma.

2.3.3 Dengue sin signos de alarma

Estos casos pueden ser tratados de manera ambulatoria, excepto cuando presenten condiciones médicas coexistentes o riesgo social que modifiquen el tratamiento o el lugar de seguimiento.

2.3.4 Dengue con signos de alarma

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6

edades extremas de la vida, o embarazadas para evitar complicaciones asociadas (Frantchez et al., 2016).

Figura 2. Clasificación clínica del DENV. Tomado de Secretaria de Salud. http://www.cenetec.salud.gob.mx/descargas/gpc/CatalogoMaestro/151_GPC_DENGUE/SSA_151_

08_GRR_Dengue_170610.pdf

2.4 Estructura y organización del genoma del virus

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7 2.5. Proteínas estructurales

El virión maduro contiene 3 proteínas estructurales: C, proteína de la nucleocápside o núcleo; M, proteína asociada a la membrana y E, proteína de la envoltura (Acosta-Bas y Gómez Cordero, 2005).

La proteína E, es una glicoproteína con un peso molecular entre 51 y 60 kDa, es la proteína mayoritaria de la envoltura, glicosilada y la más conservada, la fusión con la célula huésped es inducida a pH bajo. Está estrechamente asociada a la envoltura lipídica. Es el componente principal de las proyecciones de la superficie del virión observadas por microscopía electrónica y contiene los determinantes antigénicos responsables de la neutralización del virus (Mellado et al., 2004).

Los virus inmaduros contienen una proteína conocida como prM; que es un precursor deM. La proteína C es componente básico de la nucleocápside, el primer polipéptido viral sintetizado durante la traducción tiene un peso molecular de 13.5 kDa. Es rica en residuos de lisina y arginina los que le confieren un carácter altamente básico que permite su interacción con el RNA viral, con el que forma la nucleocápside como componente estructural. La prM (22 kDa) es el precursor glicosilado de la proteína estructural M (8 kDa). La separación proteolítica de este precursor por una proteasa del aparato de Golgi, durante la maduración viral, es lo que da origen a la formación de la proteína M.

La proteína M madura, es una proteína de membrana, extracelular o de virus maduros, resultado de la proteólisis de prM y eliminación de la porción amino terminal, C-terminal no-glicosilado. Está estrechamente asociada a la envoltura lipídica (Acosta-Bas y Gómez-Cordero, 2005).

2.6 Proteínas no estructurales

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8

endoplasmático (RE) y los brotes del virus en el lumen del RE como viriones inmaduros.

Figura 3. Genoma del virus dengue. Señalando la ubicación de las proteínas que lo conforman, de acuerdo con su clasificación (estructural, no estructural) y sus grupos terminales carboxilo o amino

(Costa et al., 2011).

La proteína NS1 (46 kDa) forma dímeros o hexámeros asociados a balsas lipídicas (rafts) de la membrana plasmática. También, se puede hallar soluble en el citoplasma y en el espacio extracelular; por esta razón, la NS1 puede estimular al sistema inmunitario.

(20)

9

La proteína NS3 puede participar durante los procesos de ensamblaje y de transporte intracelular de los flavivirus (Patkar et al., 2008) donde se demostró que la mutación W349A en el dominio helicasa de la proteína NS3 del virus de la fiebre amarilla afecta el ensamblaje de las partículas virales sin disminuir la capacidad de replicación del RNA (Velandia y Castellanos, 2011).

La NS4 da lugar a dos proteínas, la NS4a y la NS4b, ambas son hidrofóbicas y tienen un peso molecular de 16 kDa respectivamente. En cuanto a su función con el DENV se desconoce (Clyde et al., 2006).

La NS5 tiene un peso molecular de 106 kDA, esta es multifuncional, ya que el extremo N-terminal cuenta con actividad enzimática de metiltransferasa y guanidiltransferasa, responsables del capping y la metilación del extremo 5´ del RNA genómico, mientras que, en el extremo C-terminal, se ubica el dominio de RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRps). Por lo tanto, la proteína NS5 actúa como la única polimerasa durante la replicación y transcripción viral. Aunque estos procesos suceden exclusivamente en el citoplasma de la célula infectada, se ha identificado una señal de localización nuclear en la proteína NS5 que facilita su importación al núcleo (Velandia y Castellanos, 2011).

2.7 Replicación del virus del dengue y ciclo infeccioso

(21)

10

Figura 4. Replicación del DENV. El DENV se adhiere a la superficie de una célula huésped y entra a la célula mediante un proceso llamado endocitosis. Una vez dentro de la célula, el virus se fusiona

con la membrana endosomal y se libera en el citoplasma. La partícula del virus se separa, liberando

el genoma viral. El RNA viral (RNAv) se traduce en un único polipéptido que se corta en diez

proteínas, y el genoma viral se replica. El ensamblaje del virus ocurre en la superficie del retículo

endoplasmático (RE) cuando las proteínas estructurales y el ARN recién sintetizado brotan del ER.

Las partículas virales inmaduras se transportan a través de la red trans-Golgi (TGN), donde maduran

y se convierten a su forma infecciosa. Los virus maduros se liberan de la célula y pueden infectar a

otras células (Mukhopadhyay et al., 2005).

2.8 Patogénesis del DENV

La patogénesis de las formas de infección por el DENV no es completamente entendida. Los síntomas de la enfermedad grave ocurren a menudo en individuos que experimentan infecciones secundarias por el DENV (King et al., 2002).

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11

activación del complemento (C5a y C5b-9), los mediadores inflamatorios y la autoinmunidad, todos los cuales han sido identificados en el Dengue hemorrágico y síndrome de choque por dengue (Tsai et al., 2014).

Particularmente en lugares donde el DENV es endémico, el riesgo de la adquisición de una infección secundaria con otro serotipo de DENV es alto. Tres principales teorías sobre la patogénesis del Dengue que han encontrado apoyo experimental son relevantes en el contexto de la infección secundaria: el pecado antigénico original (Original Antigenic Sin) producido por una baja especificidad de las células T a un desafío heterólogo secundario, la replicación aumentada dependiente de anticuerpos (Antibody-Dependent Enhanced Replication-ADA-), donde la unión de complejos DENV/anticuerpos no neutralizantes por las células promueven la captación por las células existiendo una entrada masiva de virus y por ende una replicación del DENV y finalmente la patología vascular mediada por mastocitos que se encuentra ligada al proceso conocido como tormenta de citocinas (Cytokine Storm), la cual puede ocurrir tanto en una respuesta primaria como secundaria por una producción exacerbada de citocinas. Estas citocinas actúan directamente sobre la vasculatura y promueven la salida vascular del plasma, en este contexto los MCs pueden liberar citocinas y factores vasoactivos en respuesta al DENV (Figura 5) (St. John, 2013).

2.9 Respuesta inmune contra el DENV

La respuesta inmune innata, además de la respuesta de las células B y T, desempeña un papel importante en la protección contra la infección de DENV y el grado de severidad de la enfermedad (King et al., 2002).

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12

Figura 5. Teorías sobre la patogénesis inmune del virus Dengue. Actualmente existen tres teorías sobre la patogénesis observada durante la infección por el DENV, asociadas en su mayoría

a infecciones secundarias: Teoría del pecado antigénico original, teoría de la patología vascular

mediada por mastocitos asociada a la tormenta de citocinas (Cytokine storm) y la teoría del aumento

de la replicación mediada por anticuerpos o fenómeno ADA (St. John, 2013).

Los mastocitos son células efectoras clave en las respuestas inmunes dependientes de IgE, tales como las implicadas en la patogénesis de los trastornos alérgicos o en ciertos casos de la inmunidad a parásitos (King et al., 2002). Trabajos recientes han puesto de manifiesto otro aspecto de la función efectora de los mastocitos y estos juegan un papel importante en la inflamación y las defensas del huésped contra patógenos extraños (Marshall y Bienenstock, 1994).

2.10 Mastocitos (MCs)

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13

característicos que tiñen metacromático después de la exposición a colorantes básicos. Los MCs también expresan una clara composición de antígenos citoplasmáticos y de superficie celular (Hauswirth et al., 2006).

2.11 Relación del dengue y los mastocitos

Durante muchos años se ha especulado en cuanto a la participación de los MCs en la patogénesis del dengue. Pacientes con dengue exhiben mayores niveles de histamina urinaria, un gránulo de mayor producto de los MCs que se correlaciona con la gravedad de la enfermedad. Sin embargo, el papel potencial de los MCs no se ha explorado con respecto a la patogénesis del dengue. Los MCs juegan un papel importante en una amplia variedad de reacciones inflamatorias y en la defensa del huésped contra patógenos bacterianos (King et al., 2002).

Un estudio completo histológico de pacientes con FHD (ahora clasificado como dengue grave) mostró que los MCs en el tejido conectivo alrededor del timo mostraron hinchazón, vacuolación del citoplasma y pérdida de la integridad del gránulo, lo que sugiere activación de los MCs. Los MCs también están involucrados en las erupciones cutáneas (rash), una característica común del dengue (Brown et al., 2011).

(25)

14

de forma que se someten a la degranulación, la liberación de proteasas como la quimasa y triptasa, y la síntesis de mediadores inflamatorios leucotrienos y factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF), los cuales aumentan la permeabilidad de los capilares, lo que lleva a una fuga vascular. Los MCs en estos órganos también pueden ser activados por mediadores inflamatorios endógenos (tales como C3a y C5a) que ayudan al organismo a eliminar patógenos. El bloqueo de los MCs (o sus mediadores) con fármacos como el cromoglicato, ketotifeno y montelukast no solo reduce la fuga vascular del patógeno, sino que también podría obstaculizar la eliminación del virus. Por tanto, la terapia de células anti-MCs podría ser un arma de doble filo (Figura 6) (Avirutnan y Matangkasombut, 2013).

Figura 6. Respuesta de los mastocitos al virus dengue. La respuesta de los mastocitos ante el DENV puede ser benéfica a través del aclaramiento viral o puede ser perjudicial a través del aumento

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15 3. JUSTIFICACIÓN

La enfermedad del dengue es un foco importante para los centros de atención de salud, ya que afecta a muchos países de Latinoamérica con clima tropical, pero no sólo en esas regiones sino en muchas partes más del mundo se han registrado brotes de diferentes serotipos, siendo cada vez más cortos los plazos de latencia entre un brote de un serotipo y otro.

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16 4. HIPÓTESIS

La interacción de la proteína recombinante GST-NS3 del virus dengue con los MCs de ratón induce la producción de citocinas y quimiocinas, asociadas con las formas graves de la infección.

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

Evaluar el efecto de la proteína recombinante GST-NS3 del virus dengue sobre la respuesta inmune de mastocitos de ratón.

5.2. Objetivos particulares

➢ Expresar y purificar la proteína recombinante GST-NS3 de los cuatro serotipos en un vector procarionte.

➢ Aislar y purificar mastocitos a partir de la mucosa intestinal de ratón mediante tratamiento enzimático.

➢ Caracterizar los mastocitos de ratón y de la línea celular MC/9 mediante la identificación de los marcadores de superficie CD117 y CD45 por citometría de flujo.

➢ Determinar mediante citometría de flujo la expresión de moléculas de activación de los MCs de cultivo primario y de la línea celular MC/9 estimulados con la proteína recombinante GST-NS3 de los cuatro serotipos del virus dengue.

➢ Determinar el estado de degranulación de los MCs estimulados in vitro con la proteína recombinante GST-NS3 del virus dengue mediante tinción con colorantes básicos.

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17 6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Ensayos de transformación bacteriana

6.1.1. Preparación de células competentes (DH5-α)

Las células E. coli DH5-α se cultivaron en 5 mL de medio Luria-Bertani (LB, Triptosa 1%, Extracto de levadura 0.5%, NaCl 0.5% y glucosa 0.2%) sin ampicilina durante toda la noche a 37º C. Al día siguiente las células se inocularon en 50 mL de medio LB fresco y se incubaron a 37º C con aireación constante hasta alcanzar una densidad óptica de 0.5 (600 nm), aproximadamente 3 h. El cultivo se enfrió en hielo durante 3 min (0-5º C) y las bacterias se recuperaron por centrifugación a 3,046 g durante 20 min a 4º C. La pastilla se resuspendió suavemente en 12.5 mL de MgCl₂ 0.1 M en frío por un periodo de 5-10 min. Las células se centrifugaron durante 25 min a una velocidad de 3,046  g a 4º C. Se retiró el sobrenadante y la pastilla se resuspendió en 12.5 mL de CaCl₂ 0.1 M frío. La suspensión anterior se incubó por 20 min a 0º C. Pasado el tiempo de incubación, se centrifugó a 3,046  g durante 40 min a 4º C. Se retiró el sobrenadante y la pastilla se resuspendió en 4.3 mL de CaCl₂ 0.1 M, mezclando con 700 μL de glicerol estéril en frío y se alícuotó, se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -70º C.

6.1.2. Transformación de células DH5-α

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ayuda de una espátula en placas de medio LB-Ampicilina sólido (100 μg/mL) y se incubaron a 37º C toda la noche.

6.2. Expresión y purificación de la proteína recombinante fusionada a GST 6.2.1. Preparación de la resina Glutatión

La resina acoplada a glutatión (Sigma) se preparó pesando 0.204 g de sólido (700 mg sólido/10 mL) para una columna aproximadamente de 3 mL. La resina se hidrató con 48 mL de amortiguador de equilibrio PBS 1X (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4. 7H2O 4.3 mM y KH2PO4 1.4 mM, pH 7.4) o agua destilada estéril en una

proporción de 200 mL de agua por gramo de resina y se mantuvo toda la noche a 4º C o por lo menos 2 h antes de proceder a la purificación de la proteína.

6.2.2. Expresión de la proteína recombinante GST-NS3

(30)

19

6.2.3. Purificación de la proteína recombinante GST-NS3 de los cuatro serotipos

La purificación de las proteínas solubles se realizó de acuerdo con lo descrito por Smith y Johnson en 1988. Brevemente, el sobrenadante (dializado) conteniendo las proteínas de fusión solubilizadas se mezclaron con la resina glutatión-agarosa (Life Technologies). Después de la absorción por 30 min, la resina se colectó y se lavó por centrifugación a 1,713 × g durante 3 min con amortiguador de fosfatos. Tanto la GST como las proteínas de fusión fueron eluídas por competencia con 1 mL de una solución de glutatión libre (Sigma) (15 mM de glutatión en 50 mM de Tris-HCl pH 8.0), y luego fueron precipitadas con acetona para eliminar el amortiguador de elución.

6.3. Geles de Poliacrilamida-SDS

Las proteínas recombinantes fueron analizadas electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 10% conteniendo SDS al 0.1% en presencia de amortiguador de muestra (glicerol 2%, SDS 4%, Tris-HCl 50 mM pH 6.8, β-ME 200 mM, azul de bromofenol 0.2%), a un voltaje de 200 volts en presencia del amortiguador de corrida 1X (Tris 25 mM, Glicina 190 mM y SDS 0.1%), las proteínas fueron visualizadas por tinción con Azul de Coomassie (Laemli, 1970).

6.4. Cuantificación de la proteína recombinante GST-NS3 6.4.1. Micro ensayo de proteína

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20

las gotas de la proteína “problema” con cada uno de los estándares de BSA para obtener una estimación de la concentración de la proteína.

6.5. Aislamiento de mastocitos tisulares de ratón 6.5.1. Preparación del tejido intestinal

Se obtuvieron pequeños segmentos de intestino y se colocaron en varias cajas Petri con 25 mL de solución de Hank’s (HBSS) con suero fetal al 5% (HBSS-5). Se removieron las células mesentéricas adherentes y la grasa por medio de unas pinzas y tijeras. Los fragmentos se lavaron tres veces utilizando 100 mL de solución salina al 0.9% en un matraz con agitación suave y a temperatura ambiente para remover la materia fecal. El material lavado se cortó con tijeras en cubos de 0.3 cm3_.

Se colocaron los cubos en cajas Petri y se lavaron de la siguiente manera, un lavado con 25 mL de HBSS conteniendo 0.13 mM de EDTA durante dos veces por 5 min cada lavado, posteriormente con 25 mL de N-acetil-L-cisteína a una concentración de 50 mM durante 1 min y finalmente dos lavados en HBSS-5 por 10 min cada uno, los lavados se realizaron con agitación suave y a 37º C.

El lavado final se descartó y el tejido se cortó en piezas de 1 mm3_{, los cuales se}

colocaron en varias cajas Petri, se añadieron 25 mL de HBSS conteniendo SFB al 20% y 1 mg/ml de colagenasa (Sigma). Se incubó por 90 min a 37º C con agitación suave. Se decantó el líquido a un tubo cónico de 50 mL y se centrifugó por 10 min a 150 g a 4º C. Se descartó el sobrenadante, y la pastilla se resuspendió en 5 mL de HBSS-5 y se mantuvo sobre hielo. Se incubaron los fragmentos de tejido nuevamente durante 60 min adicionales con 25 mL de HBSS con SFB al 20% y 0.5 mg/ml de colagenasa. Se dispersó el tejido mecánicamente, subiendo y bajando el líquido a través de una jeringa estéril, se eliminó cualquier tejido no dispersado pasando sobre tela de organza.

6.5.2. Recuperación de mastocitos

(32)

21

se centrifugó por 10 min a 150  g a 4º C y el sobrenadante fue descartado. La pastilla celular se resuspendió en 5 mL de HBSS-5 y se filtró a través de una tela de organza para eliminar los cúmulos celulares formados por células mueras y/o activadas. La tela se lavó con 5 mL de HBSS-5 y se combinó con el primer eluido, para tener un volumen total de suspensión celular de entre 8 a 9 mL.

6.5.3 Propagación in vitro y mantenimiento de cultivos de MC/9 y mastocitos de cultivo primario

La línea celular MC/9 y los MCs de cultivo primario fueron propagados en medio de DMEM con 4 mM de L-glutamina, 4.5 g/L de glucosa y 1.5 g/L de bicarbonato de sodio, suplementado con 2 mM de L-glutamina, 0.05 mM 2-mercaptoetanol, 10% suplemento T-STIM (BD) y suero fetal bovino (SFB) al 10%. Las células se incubaron a 37º C, 5% de CO2 y 95% de humedad relativa, de acuerdo con las

condiciones del distribuidor ATCC.

6.6. Estimulación in vitro de la línea celular MC/9 las células MCs de ratón con las proteínas recombinantes GST-NS3DEN1, GST-NS3DEN2, GST-NS3DEN3, GST-NS3DEN4

Las células MCs de la línea celular MC/9 y los MCs de ratón (1  106_células/mL)

(33)

22

6.7. Caracterización de los MCs por citometría de flujo

Al finalizar el tiempo de incubación de los MCs, las células de cada pozo se colocaron en tubos de 1.5 mL de forma independiente y se centrifugaron a 189 g durante 5 min, el sobrenadante se recolectó y se almacenó a -20º C para la determinación de citocinas y quimiocinas por ELISA. Las células fueron recolectadas y centrifugadas en las condiciones antes descritas, se descartó el sobrenadante y se resuspendieron en 100 L de PBS 1X frío. A esta suspensión se agregó gammaglobulina humana polivalente (Beriglobina P Behring) para bloquear los receptores Fc, posteriormente se incubaron durante 30 min a 4º C. Al término de la incubación las células se lavaron dos veces con PBS 1X y se resuspendieron en un volumen de 100 μl. Los anticuerpos utilizados para citometría de flujo fueron el α-CD117-Pacific blue, α-CD45-PE. Se incluyó un control anti-isotipo con el anticuerpo -isotipo IgG1. Y finalmente las células se lavaron con PBS 1X, se leyó cada marcaje de acuerdo con su fluorocromo en el citómetro de flujo (Attune acoustic focusing cytometer).

6.8. Determinación de citocinas intracelulares en mastocitos MC/9 y cultivo primario por citometría de flujo

(34)

anti-23

IFNγ-PE y anti-TNFα-PECy7. Se incluyó un control anti-isotipo con el anticuerpo  -isotipo IgG1. Y finalmente las células se lavaron con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 1%, se leyó cada marcaje de acuerdo con su fluorocromo en el citómetro de flujo (Attune acoustic focusing cytometer).

6.9. Tinción de mastocitos con azul de toluidina

Para la tinción se utilizaron portaobjetos para cito-centrifugación, las células se colocaron y se fijaron en solución fijadora de Mota (8% de acetato de sodio en 100 mL de agua, se adicionarán de 2 a 4 mL de ácido acético para disolver la sal, adicionar 100 mL de etanol al 100%) durante 20 min. Posteriormente, se centrifugaron las células y los portaobjetos se sumergieron en etanol al 30% para eliminar el fijador. Los portaobjetos se lavaron dentro de un contenedor con agua destilada. Posteriormente, los portaobjetos se sumergieron en la solución de toluidina ácida durante 10 min. Se sumergieron en etanol al 30% y luego nuevamente en agua destilada y se dejaron secar al aire. Se observaron en el microscopio para visualizar los gránulos dentro del citoplasma de los mastocitos.

6.10. Determinación de la expresión de citocinas por ELISA

(35)

24

les adicionaron 50 μL de los anticuerpos de detección citocina-biotinilado y anti-quimiocina-biotinilado (R&D System) en una dilución de 10-200 ng/mL las placas se incubaron durante 1 h a 37º C. Después de la incubación las placas se lavaron 4 veces con PBS-T, posteriormente se adicionaron 50 μL de una solución de estreptavidina–HRP (R&D System) a una dilución 1:100 y las placas se incubaron durante 40 min a temperatura ambiente. Terminada la incubación, las placas se lavaron 4 veces con PBS-T. Finalmente, a las placas se les añadieron 50 μL del reactivo sustrato 2,2'-azino-bis (3-etilbenzoniazolina-6-ácidosulfónico) (ABTS), se incubaron durante 15 min protegidas de la luz y la reacción fue parada por la adición de 50 μL de ácido cítrico 1 M. Las placas se leyeron en un lector de ELISA (Multiskan) a 450 nm.

6.11 Análisis estadístico

(36)

25 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1 Expresión y purificación de las proteínas recombinantes GST-NS3DEN1, GST-NS3DEN2, GST-NS3DEN3 y GST-NS3DEN4

Para cumplir con el primer objetivo se expresaron y purificaron las proteínas por cromatografía de afinidad a glutatión, sin embargo, las cuatro proteínas formaron cuerpos de inclusión en el sistema procarionte utilizado, por lo que antes de la purificación los cuerpos de inclusión formados se solubilizaron con urea. Una vez solubilizados los cuerpos y eliminada la urea, el extracto se sometió a la columna de glutatión para la purificación de la proteína GST-NS3. Para determinar la homogeneidad de las proteínas se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) al 10% (Figura 7).

Figura 7. Purificación de la proteína recombinante GST-NS3. La proteína GST-NS3DEN1 fue expresada en bacterias E. coli DH5-α transformadas con el plásmido pGEX-NS3DEN1 y separada

en un gel SDS-PAGE al 10% teñido con azul de Coomassie. M) Marcador de peso molecular; carril

1, extracto bacteriano sin inducir; carril 2, extracto bacteriano inducido con IPTG; carril 3,

sobrenadante; carril 4, pastilla; carril 5, dializado; carril 6, material no unido y carril 7-8 diferentes

(37)

26

En general, la probabilidad de expresar con éxito una proteína soluble disminuye considerablemente a pesos moleculares por encima de 60 kDa. El alto nivel de expresión de proteínas de fusión en E. coli puede dar lugar a la formación de un producto insoluble, conocido como cuerpo de inclusión (Schein, 1989). Sin embargo, la formación de los cuerpos de inclusión dificulta la purificación de dichas proteínas, ya que las vuelve insolubles. La asociación intermolecular de dominios hidrofóbicos (generalmente con el RNA) se cree que es la razón de la formación de los cuerpos de inclusión (Villaverde y Mar, 2003). Se ha reportado que la formación de cuerpos de inclusión puede ser minimizada si se modifican algunos parámetros del crecimiento bacteriano, tales como bajar la temperatura de crecimiento (20-30º C), inducir por un periodo de tiempo más corto e incrementar la aereación durante el cultivo (Saluta y Bell, 1998). Este mismo efecto se observó con la purificación de otras proteínas recombinantes del DENV, tales como la NS2 (León-Juárez et al., 2016) y NS3 (Álvarez-Rodríguez, et al., 2012).

7.2 Propagación in vitro y mantenimiento de cultivo MC/9

La línea celular fue cultivada y propagada de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ATCC) en las condiciones mencionadas en la metodología, y puesta en placas de cultivo de 96 pozos con fondo redondo pues se observó un mejor desarrollo en volúmenes pequeños.

Por microscopía de contraste de fases las células mostraron la morfología característica de las mismas (Figura 8).

7.3 Caracterización de la línea celular MC/9 por citometría de flujo

(38)

27

El CD117 regula el crecimiento, la migración, la supervivencia y las funciones efectoras de los MCs, siendo esta combinación de marcadores altamente específica para reconocer poblaciones de MCs (Brown et al., 2011).

Figura 8. Microscopía de células MC/9 de ratón. Los mastocitos sin estimular (A) y estimulados con LPS a una concentración de 1 g/mL (B) fueron observados por microscopía óptica de contraste de fases a un aumento de 40X.

(39)

28

Figura 9. Caracterización de la línea celular MC/9 por citometría de flujo. A) Delimitación de la población celular viable para su análisis: Se basó en las características de tamaño y granularidad utilizando mastocitos sin estimular y sin tinción. B) Control de Isotipo IgG1, se observa una nula fluorescencia que garantiza la especificidad de los anticuerpos utilizados para caracterización. C)

Delimitación de la zona de positividad en el Dotplot para las tinciones de caracterización, se utilizaron

células sin teñir. D) Población de mastocitos MC/9 positivos a la tinción por CD45-PE y CD117

Pacific-Blue.

7.4 Determinación de la expresión intracelular de IFN-γ en mastocitos de la

línea celular MC/9 por citometría de flujo

(40)

29

10). Los MCs sin estimular tuvieron una producción basal de IFN-γ del 34.18%

(Figura 10 A), mientras que el control positivo un 96.95% (Figura 10 B).

Figura 10. Expresión de IFN-γ en la línea celular MC/9 estimulados con las proteínas recombinantes GST-NS3DEN a las 24 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul). B) Comparación por sobreposición de poblaciones de la expresión de IFN-γ en MCs sin estimular (rojo) y estimulados con GST-NS3DEN1 (azul), C)

estimulados con GST-NS3DEN2 (verde), D) estimulados con GST-NS3DEN3 (morado), E)

estimulados con GST-NS3DEN4 (rosa) y F) estimulados con GST-NS3DEN pool (naranja). Las

células se estimularon durante 24 h.

(41)

30

que las células estimuladas con LPS, aumentando aproximadamente un 60% con respecto al porcentaje de MCs productores de IFN-γ en el control basal (Figura 11).

Figura 11. Porcentaje de MCs de la línea celular MC/9 productores de IFN-γ tras 24 horas de

interacción con las proteínas recombinantes GST-NS3DEN. Las células fueron estimuladas con 10 g/mL de cada una de las proteínas recombinantes y el pool y con 1 g/mL de LPS. Promedio de

3 repeticiones  Desviación Estándar de la Media (DE). *Indica diferencias estadísticas significativas.

(Dunnet, p<0.001).

El porcentaje de células productoras de IFN-γ en las siguientes 48 h de interacción osciló en un rango del 62-82%, siendo menor bajo la estimulación de la proteína recombinante GST-NS3DEN3 con estimulación del 62% de MCs productores de IFN-γ y manteniéndose el DEN1 como el serotipo de mayor estimulación pues se observó un 82.05% de MCs activados para la producción de dicha molécula (Figura 12).

24 h 0

50 100 150

LPS SE

GST-NS3DEN1 GST-NS3DEN2 GST-NSTDEN3 GST-NS3DEN4 GST-NS3DENpool ***

Tiempo de interacción

%

M

a

s

to

c

it

o

s

I

F

N

-



(42)

31

Figura 12. Expresión de IFN-γ en la línea celular MC/9 estimulados con las proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a las 48 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul), B) estimulados con GST-NS3DEN1 (azul), C)

estimulados con GST-NS3DEN2 (verde), D) estimulados con GST-NS3DEN3 (morado), E)

estimulados con GST-NS3DEN4 (rosa) y F) estimulados con GST-NS3DEN pool (naranja). Las

células fueron estimuladas durante 48 h.

(43)

32

Figura 13. Porcentaje de MCs de la línea celular MC/9 productores de IFN-γ tras 48 h de

(Dunnet, ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05).

El porcentaje de células productoras de IFN-γ a las 72 h de interacción osciló en un rango de 93-99% (Figura 14).

El análisis estadístico de los resultados mostró una diferencia estadísticamente significativa entre el porcentaje de MCs productores de IFN-γ cuando se compararon los MCs sin estimular y los estimulados con los cuatro serotipos y el

pool de la proteína recombinante GST-NS3DEN (***p<0.001), la producción es muy

(44)

33

Figura 14. Expresión de IFN-γ por mastocitos de la línea celular MC/9 estimulados con las proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a las 72 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul), B) estimulados con GST-NS3DEN1

(azul), C) estimulados con GST-NS3DEN2 (verde), D) estimulados con GST-NS3DEN3 (morado), E)

(45)

34

Figura 15. Porcentaje de MCs de la línea celular MC/9 productores de IFN-γ tras 72 horas de

(Dunnet, p<0.001).

Por lo anterior, los resultados de la expresión de IFN-γ indican que hubo un porcentaje considerable de MCs activados por la interacción con las cuatro proteínas recombinantes GST-NS3DEN y el pool. La forma de actuar del IFN-γ es induciendo la expresión de genes dependiendo del tipo celular y de la presencia de otras citocinas que sinergizan como la 1α, 2, TNF-α, o antagonizan como la IL-4 (Mata-Espinosa y Hernández-Pando, 2008). Además, se sabe que los MCs al ser activados producen IL-2 y TNF-α por lo que explicaría la expresión a la exposición a las 24 h, mientras que, en relación con la disminución a las 48 h, los MCs también producen IL-4 que pudiera disminuir la expresión de los MCs, sin embargo, la presencia del TNF-α pudo haber influido en el aumento a las 72 h por la sinergia descrita.

72 h 0 50 100 150 SE LPS GST-NS3DEN1 GST-NS3DEN2 GST-NSTDEN3 GST-NS3DEN4

GST-NS3DEN pool

***

(46)

35

7.5 Determinación de la expresión intracelular de TNF-α en mastocitos de la

línea celular MC/9 por citometría de flujo

Otra de las citocinas que intervienen en la activación de los MCs y de muchos tipos celulares, es el TNF-α, por lo que se determinó su producción por citometría de flujo. Los MCs previamente estimulados con las proteínas recombinantes GST-NS3 de los cuatro serotipos del DENV y un pool, utilizando un anticuerpo monoclonal anti TNF-α acoplado a PE-Cy. El porcentaje de MCs productores de TNF-α en las primeras 24 h de interacción osciló en un rango de 0.055-0.135% (Figura 16).

Figura 16. Expresión de TNF-α por mastocitos de línea celular MC/9 estimulados con las proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a las 24 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul), B) estimulados con GST-NS3DEN1

(47)

36

El análisis estadístico de los resultados obtenidos se realizó mediante una ANOVA con la prueba de Dunnet. Observándose una diferencia estadísticamente significativa únicamente entre el porcentaje de MCs productores de TNF-α comparado con los MCs sin estimular y las células estimuladas con LPS con una ***p<0.001 (Figura 17).

Figura 17. Porcentaje de MCs de la línea celular MC/9 productores de TNF-α tras 24 h de

(Dunnet, p<0.001).

El porcentaje de MCs productores de TNF-α en las siguientes 48 h de interacción osciló en un rango de 97-98%, siendo los menores con la proteína GST-NS3DEN4 y el pool de las cuatro proteínas recombinantes GST-NS3, ambos con un porcentaje del 97.9% de MCs productores de TNF-α y para el estímulo con GST-NS3DEN2 un porcentaje del 98.45% de MCs productores de TNF-α. (Figura 18).

24 h 0 50 100 150 SE LPS GST-NS3DEN1 GST-NS3DEN2 GST-NSTDEN3 GST-NS3DEN4 GST-NS3DEN pool ***

(48)

37

Figura 18. Expresión de TNF-α por mastocitos de la línea celular MC/9 estimulados con las proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a las 48 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul), B) estimulados con GST-NS3DEN1

(49)

38

Figura 19. Porcentaje de MCs de la línea celular MC/9 productores de TNF-α tras 48 h de interacción con las proteínas recombinantes GST-NS3DEN. Las células fueron estimuladas con 10 g/mL de cada una de las proteínas recombinantes y el pool y con 1 g/mL de LPS. Promedio de

3 repeticiones  Desviación Estándar de la Media (DS). *Indica diferencias estadísticas significativas.

(Dunnet, p<0.001).

El porcentaje de MCs productores de TNF-α en las últimas 72 h de interacción osciló en un rango del 97-99% (Figura 20). El análisis estadístico mostró una diferencia estadísticamente significativa entre el porcentaje de MCs productores de TNF-α cuando se compararon los MCs sin estimular y MCs estimulados con los cuatro serotipos y el pool de la proteína recombinante GST-NS3DEN con una ***p<0.001. Las proteínas estimularon la producción de TNF-α de igual manera que el control positivo con LPS (Figura 21).

48 h 0

50 100 150

SE

LPS

GST-NS3DEN1

GST-NS3DEN2

GST-NSTDEN3

GST-NS3DEN4

GST-NS3DENpool

***

%

M

a

s

to

c

it

o

s

T

N

F

-

(+

(50)

39

Figura 20. Expresión de TNF-α por mastocitos de la línea celular MC/9 estimulados con las proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a las 72 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul), B) estimulados con GST-NS3DEN1

(51)

40

Figura 21. Porcentaje de MCs de la línea MC/9 productores de TNF-α tras 72 h de interacción con las proteínas recombinantes GST-NS3DEN. Las células fueron estimuladas con 10 g/mL de cada una de las proteínas recombinantes y el pool y con 1 g/mL de LPS. Promedio de 3 repeticiones

 Desviación Estándar de la Media (DE). *Indica diferencias estadísticas significativas. (Dunnet,

p<0.001).

7.6 Propagación in vitro y mantenimiento de cultivo primario

Los MCs para cultivo primario fueron extraídos de los intestinos de ratones de la cepa BALB/c tal como se describe en la metodología, una vez aislados, se colocaron en placas de cultivo de 24 pozos a las condiciones antes descritas, una vez adaptadas las células se procedió a la interacción con las proteínas recombinantes derivadas de NS3 del DENV (Figura 22).

72 h 0

50 100 150

SE LPS

GST-NS3DEN1 GST-NS3DEN2 GST-NSTDEN3 GST-NS3DEN4 GST-NS3DENpool ***

%

M

a

s

to

c

it

o

s

T

N

F

-

(+

(52)

41

Figura 22. Microscopía de mastocitos de cultivo primario de ratón. Los mastocitos aislados de la mucosa intestinal de ratón fueron estimulados con LPS a una concentración de 1 g/mL,

observados por microscopía óptica de contraste de fases a un aumento de 40X.

7.7 Caracterización de mastocitos de cultivo primario de ratón por citometría de flujo

(53)

42

Figura 23. Caracterización del cultivo primario de mastocitos de ratón por citometría de flujo.

A) Selección de los mastocitos de cultivo primario viables y homogéneos para su análisis: Selección con base en su tamaño y granularidad. B) Control de Isotipo IgG1, se observa una nula fluorescencia que garantiza la especificidad de los anticuerpos utilizados para caracterización. C) Control de

autofluorescencia de células sin tinción. D) Población de mastocitos de cultivo primario positivos a la

(54)

43

7.8 Determinación de la expresión intracelular de IFN-γ a las 24, 48 y 72 h de

cultivo primario por citometría de flujo

La expresión de citocinas de activación características de los MCs en el proceso de respuesta inmune ante el DENV se analizó mediante citometría de flujo, para ello, se interaccionaron los MCs con las cuatro proteínas recombinantes derivadas de NS3 del DENV y un pool de la proteína recombinante GST-NS3DEN durante 24, 48 y 72 h. Una vez transcurrido el tiempo de interacción se realizó la determinación de la producción de IFN- utilizando un anticuerpo acoplado a PE, el porcentaje de mastocitos productores de interferón fue calculado con respecto a la producción basal de MCs sin estimular, como control positivo se utilizaron MCs estimulados con LPS.

A las 24 h de interacción, la producción de interferón por los MCs estimulados con las cuatro proteínas recombinantes y el pool de la proteína recombinante es menor al 1%, por otro lado, el control positivo presenta un 99.3% de MCs productores de interferón lo que garantiza la viabilidad y correcta activación de las células (Figura 24). En la respuesta inmune innata, al secretar IFN-γ, este activa a los macrófagos

(55)

44

Figura 24. Expresión de IFN-γ por mastocitos de cultivo primario estimulados con las proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a las 24 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul). B) Comparación por sobreposición de poblaciones de la expresión de IFN-γ en MCs sin estimular (rojo) y estimulados con GST-NS3DEN1

células se estimularon durante 24 h.

(56)

45

Figura 25. Porcentaje de MCs de cultivo primario productores de IFN-γ tras 24 horas de interacción con las proteínas recombinantes GST-NS3DEN. Las células fueron estimuladas con 10 g/mL de cada una de las proteínas recombinantes y el pool y con 1 g/mL de LPS. Promedio de

2 repeticiones  Desviación Estándar de la Media (DE). *Indica diferencias estadísticas significativas

(Dunnet, p<0.001).

Después de 48 h de interacción, la producción de IFN-γ aumentó en todos los estímulos de las cuatro proteínas recombinantes (Figura 26). Como se ha descrito, una de las primeras líneas de defensa contra la invasión de DENV es la producción de interferones (Rodenhuis-Zybert et al., 2010), y las respuestas inmunes mediadas por IFN-γ son cruciales para la eliminación temprana y tardía de la infección (Shresta et al., 2004). Por otro lado, algunos estudios sugieren que los niveles de esta citocina pueden correlacionarse con la resolución de la enfermedad en humanos, y otros han demostrado que el aumento de la producción de IFN-γ se correlaciona con mayores tasas de supervivencia en pacientes con DHF, sin embargo, el papel del IFN-γ en el dengue clínico es controvertido (Fagundes et al., 2011). 24 h 0 50 100 150

(57)

46

Figura 26. Expresión de IFN-γ por mastocitos de cultivo primario estimulados con las proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a las 48 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul), B) estimulados con GST-NS3DEN1

(58)

47

Figura 27. Porcentaje de MCs de cultivo primario productores de IFN-γ tras 48 h de interacción

con las proteínas recombinantes GST-NS3DEN. Las células fueron estimuladas con 10 g/mL de cada una de las proteínas recombinantes y el pool y con 1 g/mL de LPS. Promedio de 2 repeticiones

 Desviación Estándar de la Media (DE). *Indica diferencias estadísticas significativas (***Dunnet,

p<0.001)

Al final de las 72 h de interacción hubo una disminución de la producción de IFN-γ inducida por la proteína recombinante GST-NS3 de los cuatro serotipos y el pool, en un rango de 95.85-99.70% (Figura 28), encontrándose la menor producción de IFN-γ en el serotipo DEN1 con 95.85%, la producción de IFN-γ más alta por estimulación de las proteínas recombinantes fue por el pool con 97.35%, y el control de LPS con 99.70% (Figura 28, A, B y F). En diversos estudios se ha observado que los niveles de IFN- se incrementan, disminuyendo abruptamente un día después de la defervescencia, coincidiendo con la desaparición de la viremia (Suharti et al., 2003).

48 h 0

50 100 150

%

M

a

s

to

c

it

o

s

I

F

N

-

(+

) SE

LPS

(59)

48

Figura 28. Expresión de IFN-γ por mastocitos de cultivo primario estimulados con las proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a 72 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul), B) estimulados con GST-NS3DEN1

células fueron interaccionadas durante 72 h.

(60)

49

Figura 29. Porcentaje de MCs de cultivo primario productores de IFN-γ tras 72 horas de

(Dunnet, p<0.001).

7.9 Determinación de la expresión intracelular de TNF-α a las 24, 48 y 72 h de

cultivo primario por citometría de flujo

(61)

50

Figura 30. Expresión de TNF-α por mastocitos de cultivo primario estimulados con las

proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a las 24 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul), B) estimulados con GST-NS3DEN1

(62)

51

Figura 31. Porcentaje de MCs de cultivo primario productores de TNF-α tras 24 horas de interacción con las proteínas recombinantes GST-NS3DEN. Las células fueron estimuladas con 10 g/mL de cada una de las proteínas recombinantes y el pool y con 1 g/mL de LPS. Promedio de

(Dunnet, p<0.001).

Transcurridas 48 h de interacción el porcentaje de MCs productores de TNF-α osciló desde 91.15% en los estimulados con la proteína recombinante GST-NS3DEN1 y hasta 93.55% con GST-NS3DEN2, en el control positivo de MCs estimulados con LPS se observó la activación de 94.55% de estas células produciendo TNF-α (Figura 32 B y C). El TNF-α, en presencia de IFN-, aumenta la lesión endotelial y destruyen plaquetas, siendo este uno de los mecanismos de trombocitopenia, fuga capilar, y adhesión al endotelio dañado (Rivas-Llamas et al., 2005), tal como sucede en el dengue grave. También el aumento de los niveles de TNF-α, IFN-γ, 1β, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) y las quimiocinas CCL2, CCL4, CCL5 y CXCL10 se han detectado en pacientes con DHF en comparación con DF (John et al., 2015).

24 h 0

50 100 150

(63)

52

Figura 32. Expresión de TNF-α por mastocitos de cultivo primario estimulados con las proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a las 48 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul), B) estimulados con GST-NS3DEN1

(64)

53

Figura 33. Porcentaje de MCs de cultivo primario productores de TNF-α tras 48 h de interacción con las proteínas recombinantes GST-NS3DEN. Las células fueron estimuladas con 10 g/mL de cada una de las proteínas recombinantes y el pool y con 1 g/mL de LPS. Promedio de

2 repeticiones  Desviación Estándar de la Media (DS). *Indica diferencias estadísticas significativas.

(Dunnet, p<0.001).

El porcentaje de MCs productores de TNF-α aumentó a las 72 h de interacción, osciló en un rango de 92.05 con la proteína recombinante GST-NS3DEN2 y 95.15% de MCs activados con GST-NS3DEN1. En el control positivo de MCs estimulados con LPS se activó la producción de TNF-α en un 94.7% de la población celular (Figura 34). Hay estudios que, en casos primarios, el progreso de FD a FHD se ha asociado con mayores niveles de TNF-α, IL-1 e IL-6, y varias pruebas sugieren que los niveles altos de citocinas tienen un papel en el desarrollo de FHD (de la Cruz Hernández et al., 2016). Otros estudios han encontrado un aumento significativo en IFN-γ y TNF-α en los pacientes con infección por dengue. Ambas son citocinas importantes proinflamatorias y se ha demostrado que se asocian con la gravedad de la enfermedad. Si bien la regulación al alza del IFN-γ puede inducir fuga de plasma, el TNF-α puede indicar la activación de las células endoteliales vasculares y puede aumentar la permeabilidad vascular que conduce a la fiebre hemorrágica (Huang et al., 2018).

48 h 0

50 100 150

(65)

54

Figura 34. Expresión de TNF-α por mastocitos de cultivo primario estimulados con las proteínas recombinantes y el pool de GST-NS3DEN a las 72 h. A) Control negativo de MCs sin estimular (rojo) y positivo de MCs estimulados con LPS (azul), B) estimulados con GST-NS3DEN1

(66)

55

Figura 35. Porcentaje de MCs de cultivo primario productores de TNF-α tras 72 h de interacción con las proteínas recombinantes GST-NS3DEN. Las células fueron estimuladas con 10 g/mL de cada una de las proteínas recombinantes y el pool y con 1 g/mL de LPS. Promedio de

(Dunnet, p<0.001).

7.10 Determinación de la expresión de citocinas y quimiocinas en mastocitos de línea celular MC/9 por ELISA

Los MCs, linfocitos, monocitos, macrófagos, células endoteliales, células hepáticas y células dendríticas son blancos del DENV, estas células producen citocinas y quimiocinas después de la infección (Chiou-Feng et al., 2005), algunos estudios han demostrado niveles altos de estas moléculas en los sueros de pacientes con dengue grave en comparación con los de dengue clásico. Las citocinas proinflamatorias implicadas en el dengue grave son principalmente: TNF-α, IFN-γ, IL-1β e IL-6 (Friberg et al., 2018), además se sabe que los MCs humanos producen una amplia variedad de quimiocinas como IL-8, CCL3, CCL4 y CCL5 en respuesta a antígenos virales (King et al., 2002).

72 h 0

50 100 150