Bioinformática
Máster en Biotecnología
http://bioinfo2.ugr.es/bioinfo Dr. José L. Oliver
Biología Molecular: ‘un gen una proteína’ ‘un gen un laboratorio’ ‘un gen una tesis’
Genómica : ‘un genoma una tesis’
De ~nada a ~todo
2001
Antes se estudiaba el efecto de un gen
…ignorando así al 99.99% restante Ahora tenemos datos de todos los genes
¿Qué hacer con ellos?
¿Cómo derivar nuevo conocimiento?
Es necesario un nuevo enfoque, un cambio de paradigma
“If you can’t do Bioinformatics, you can’t do Biology”…
• Secuencias de genes y proteínas • Estructuras 3D
• Expresión génica (microarrays)
• Interacción entre proteínas (interactoma) • Secuenciación masiva • Genómica personalizada Computación Conocimiento biológico Salud Biotecnología Medio ambiente Genómica comparada Bases de datos Programas Biología Molecular Genómica ¿Qué es la Bioinformática?
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Grandes proyectos genómicos:
•
Genoma Humano
•
1000 Genomas
El Proyecto Genoma Humano
Sus objetivos fueron:
• Identificar los aprox. 20.000-25.000 genes en el genoma humano
• Determinar la secuencia de los 3.2 Gbp de nucleótidos que componen el genoma haploide y almacenar esta información en bases de datos
• Mejorar el software para analizar estos datos • Transferencia de tecnología al sector privado
• Abordar los aspectos éticos, legales y sociales (ELSI) que pudiera provocar el proyecto
El Proyecto Genoma Humano
• Fue una iniciativa internacional lanzada en la década de los 90 del pasado siglo para mapear y secuenciar el conjunto de genes del ser humano (genoma)
• Completado en 2003 con la publicación de la secuencia de referencia del genoma humano
Secuenciación masiva
SOLID Sequencing by Ligation (SBL) 454 Pyrosequencing (PS) Illumina Reversible Termination (RT)Secuenciación masiva
SANGER SECUENCIACIÓN MASIVA
Di-deoxy terminator Roche 454 GS FLX (PS) Illumina HiSeq 2000 (RT) SOLID V4 (SBL) Salida por proceso 1.6 Mb 600 Mb 200 GB 100 GB Tiempo/Proceso 1h 10 h 9 d 11 d Longitud media “reads” 800 pbs 400 pb 100 pb 75 pb Salida por día 38.4 Mb 1.44 GB 22.2 GB 9 GB
Usos frecuentes - Secuenciación de novo Captura de exones Resecuenciación Captura de exones Metagenómica Resecuenciación Captura de exones Metagenómica
David Deamer made this sketch in 1989 when the idea for nanopore sequencing came to him
MinION nanopore: a miniaturised single-molecule analysis system,
designed for single use and to work through the USB port of a laptop or desktop computer
Secuenciación de DNA mediante nanoporos de proteínas
• Proyecto financiado por los NIH: el nanoporo lo suministra una proteína, la alfa-hemolisina (aHL)
• Una de las hebras del DNA atraviesa este nanoporo, movida por un motor molecular de polimerasa
• Los nucleótidos se van identificando por un laser a medida que atraviesan el nanoporo
Conectando miles o millones de estos nanoporos, se espera secuenciar un genoma completo en… 10 minutos!
Importancia para el diagnóstico/pronóstico del cáncer y otras enfermedades
PacBio
Sequencing with the PacBio RS II system based on single molecule, real-time (SMRT) technology:
Long reads: Depending upon starting library, half of the data are in reads >14,000 base pairs long with the longest reads over 40,000 base pairs.
High accuracy: Perform de novo assembly of genomes and detect variants with greater than 99.999% accuracy. Sequence individual molecules with 99% accuracy at greater than Sanger lengths.
High sensitivity: Detect minor variants that are present at a frequency less than 0.1%.
Secuenciación masiva
APLICACIONES
Re-secuenciación Regulación Epigenómica
• SNVs y CNVs • Inserciones y
deleciones
• Expresión génica • ARNs pequeños
• Metilación del ADN • Histonas
El proyecto 1000 Genomas pretende la
caracterización de la variación genética en el
genoma humano
Trio project: whole-genome shotgun sequencing at high coverage
(average 42 X) of two families (one Yoruba from Ibadan, Nigeria (YRI); one of European ancestry in Utah (CEU)), each including two parents and one daughter.
Low-coverage project: whole-genome shotgun sequencing at low
coverage (2–6 X) of 59 unrelated individuals from YRI, 60 unrelated individuals fromCEU, 30 unrelated Han Chinese individuals in Beijing (CHB) and 30 unrelated Japanese individuals in Tokyo (JPT).
Exon project: targeted capture of 8,140 exons from 906 randomly
selected genes (total of 1.4 Mb) followed by sequencing at high coverage (average >50 X) in 697 individuals from 7 populations of African (YRI, Luhya inWebuye, Kenya (LWK)), European (CEU, Toscani in Italia (TSI)) and East Asian (CHB, JPT, Chinese in Denver, Colorado (CHD)) ancestry.
•
La ‘Encyclopedia of DNA Elements’ (ENCODE) surge de una
colaboración internacional iniciada en 2003 y financiada por el
‘National Human Genome Research Institute’ (NHGRI).
•
El objetivo de ENCODE es elaborar un catálogo exhaustivo
de todos los elementos funcionales en el genoma humano,
incluyendo tanto ARNs como proteínas, asi como aquellos
elementos reguladores que controlan el tipo celular y el
momento del desarrollo en que un gen es activo.
•
La cuestión es: la suma de los exones de los aprox. 21.000
genes humanos no llegan al 2% del genoma ¿para que sirve
el 98% restante? ¿es ADN basura?
Algunas de las técnicas utilizadas en ENCODE
RNA-seq. Aislamiento y secuenciación masiva de ARN
CAGE. Captura y secuenciación masiva de los ‘caps’ metilados en los extremos 5’
del ARN. Estos ‘caps’ suelen formarse en los sitios de inicio de la transcripción
RNA-PET. Captura simultánea de ARNs con caps metilados y cola de poly-A, es
decir ARNs completos, seguida de la secuenciación de un trozo en cada extremo.
ChIP-seq. Inmunoprecipitación de las proteínas unidas a la cromatina y
secuenciación de las secuencias de ADN asociadas. Se suelen usar anticuerpos frente a factores de transcripción, proteínas no-histonas que se unen a la
cromatina, o bien histonas modificadas por metilación, acetilación, etc.
DNase-seq. La enzima DNasa I corta preferencialmente regiones de la
cromatina unidas a proteínas no-histonas y que corresponden a regiones
de ‘cromatina abierta’. Los puntos de corte se secuencian, obteniéndose
así un listado de sitios hipersensibles a DNasa I que corresponden a sitios
de cromatina activa.
FAIRE-seq. (Formaldehyde assisted isolation of regulatory elements).
Permite aislar regiones genómicas libres de nucleosomas.
RRBS (Reduced representation bisulphite sequencing). El tratamiento del
ADN con bisulfito convierte las citosinas no-metiladas en uracilo, mientras
que no afecta a las citosinas metiladas. Se usan enzimas de restricción que
cortan alrededor de los dinucleótidos CpG, con lo que se limita el análisis a
aquellas regiones ricas en CpG (islas CpG).
Principales hallazgos de ENCODE
La mayor parte del genoma (80.4%) se puede asociar con al menos una función en alguno de los 147 tipos celulares analizados. Puesto que puede haber hasta 2.000 tipos celulares, este porcentaje podría llegar a ser mucho más alto!
Los elementos específicos de primates están sometidos a selección natural deben ser funcionales
Se han descubierto 399.124 enhancers y 70.292 promotores
Muchas de los elementos funcionales encontrados se localizan en las regiones no-codificadoras de proteínas (fuera de los genes)
Los SNPs asociados con enfermedades mediante GWAS abundan en las regiones no-codificadoras y residen en zonas funcionales identificadas por ENCODE.
Muchas enfermedades se asocian con un determinado factor de transcripción que varía entre tipos celulares.
Felix Muerdter & Alexander Stark, Nature 512, 374–375 (28 August 2014)
Más de 1600 nuevos conjuntos de datos, lo que hace un total de 3300 entre ENCODE y modENCODE
Cautelas sobre el proyecto ENCODE (extraidas de las publicaciones de 2014):
“…although they are extremely data-rich, the papers expose how data sets that are created to catalogue all functional elements under standardized conditions are not sufficient for understanding the regulation of transcription, chromatin biology and enhancer function, nor the evolution of these mechanisms.”
Según Dan Graur esto quiere decir que:
• Not every piece of chewing gum attached to the soles of your shoes is functional.
• Moreover, the function of the sole of your shoe to which the chewing gum stuck is NOT to bind chewing gum.
• Bases de datos públicas en línea: EBI, NCBI
• El software se ejecuta en servidores remotos de acceso público: • Formularios Web: Copiar/pegar datos Resultados
• Ventajas:
• Datos actualizados on-line
• Acceso a software profesional permanentemente actualizado por sus propios autores
• No tendremos que instalar ningún programa ni base de datos en
nuestra máquina local, todo lo haremos a través de un navegador web • Podremos acceder a las prácticas del curso desde cualquier ordenador
(Windows, Linux, Mac…) con acceso a Internet
Los programas y bases de datos que utilizaremos
funcionan en servidores web:
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