Control del crecimiento y tamaño de los discos imaginales de Drosophila Melanogaster

Universidad Autónoma de Madrid Departamento de Biología Molecular

Facultad de Ciencias

Control del crecimiento en los discos imaginales de Drosophila Melanogaster

TESIS DOCTORAL

Antonio José Montes Ruiz

Madrid, 2016

Control del crecimiento en los discos imaginales de Drosophila Melanogaster

Memoria presentada por Antonio José Montes Ruiz para optar al grado de Doctor en Ciencias por la Universidad Autónoma de Madrid

Departamento de Biología Molecular Facultad de Ciencias

Antonio José Montes Ruiz-Licenciado en Biología Director de Tesis:

Prof. Ginés Morata Tutor de la tesis:

Prof. José Félix de Celis

resumen

La perturbación del crecimiento en los discos imaginales provoca una respuesta homeostática a través de la vía PCP para regular el tamaño del disco.

Nosotros estamos estudiando los mecanismos de control de tamaño en el disco imaginal de ala mediante el bloqueo proliferativo de diferentes regiones genéticas y los compartimentos. Esto lo realizamos mediante la eliminación de la actividad del gen cdc2/cdk1 a través de RNA interferente.

En nuestros experimentos bloqueamos la actividad cdk1 en dominios sin restricción de linaje como Rotund (Rn), spalt(Sal) y pannier (Pnr) y dominios de linaje cerrados como los compartimentos posterior y dorsal.

Observamos que tras el bloqueo de la división celular en los diferentes dominios tienen un efecto menor en el tamaño, forma e identidad del dominio. Análisis de linaje mediante pulsos de BrdU y marcado genético de linaje indican que, bajo las condiciones de restricción proliferativa, el dominio se construye a través del reclutamiento de células externas al dominio. Esta observación demuestra un poderoso mecanismo homeostático que controla el tamaño y la identidad.

El bloqueo de la división celular en los compartimentos posterior (P) y dorsal (D) tiene diferentes respuestas. Tras 48 hrs de inactivación de cdk1, en los compartimento P y D es capaz de regular el tamaño a través del incremento de tamaño celular. Sin embargo, este mecanismo de puede compensar la falta proliferativa más de 72 hrs de inactivación y provoca una reducción de los compartimentos, siendo mucho más pequeños. Además, observamos una disminución de la vía de Hippo como es indicado por genes diana de yorkie como diap1, expanded, cyclinE.

Interesantemente, este incremento de regulación de los genes diana de Yorkie se observa en los bordes de compartimentos, los cuales, además, muestran un incremento de proliferación celular.

Encontramos una orientación anómala de la orientación de las divisiones cerca del borde A/P que es representado por la localización anómala de Dachs. De este modo, también observamos cambios en los genes de polaridad de la vía Ft/Ds/Fj. Finalmente, con mutantes de Dachs, no solo observamos la pérdida de la respuesta proliferativa en los compartimentos, sino que también se impide el reclutamiento en dominios de linaje abierto en fondo mutantes para los genes de la vía Ft/Ds/Fj. Todos los experimentos en los que se causó un problema de tamaño fueron validados con el marcador Dilp8.

summary

Growth perturbation in imaginal discs provoke a homeostatic response through PCP pathway aimed to regulate disc size

We are studying the mechanisms of growth control in the wing disc by analyzing the response to blocking the growth of different genetic domains or compartments. This is achieved by compromising, by RNA interference, the activity of the cdk1 gene. In our experiments we block cell proliferation in either open lineage domains like the Rotund (Rn) or closed lineage domains like the posterior (P) compartment.

The Rn domain covers approximately 40% of the wing disc, and we find that blocking cell division has a minor effect on the size, shape and identity of the domain. Pulse and chase experiments using BrdU incorporation as cell division marker indicate that under these conditions the Rn domain is built by the continuous recruitment of cells from outside. This observation demonstrates a powerful homeostatic mechanism controlling size and identity.

Blocking cell divisions in the posterior (P) or in the dorsal (D) compartment has different effects in compartment size and cell response. After 48 hrs of inactivation of cdk1, P and D compartments are able to regulate size by increasing the cell size. However, this control mechanism cannot cope with longer (72 hrs) inactivation and the compartments become much smaller. In addition, we observe down regulation of the Hippo pathway as indicated by the up regulation of the Yorkie targets diap1, expanded, cyclinE and bantam. Interestingly, this up regulation of Yki targets extends to the anterior or the ventral compartment, which exhibit an increase of cell proliferation in the vicinity of the compartment borders. We also find that anterior clones of cells near the A/P or the D/V boundary show abnormal orientation, which results from alterations in the expression of planar polarity genes like four jointed and dachs. Furthermore, the induction of over-proliferation across the A/P border requires the activity of the dachs gene. Taken, together these observations suggest the existence of crosstalk between compartments through Ft/Ds/Fj PCP pathways to regulate the correct size of the disc.

abreviaturas

Abreviaturas

ael after egg laying

ap apterous

BrdU 5-Bromo-2-Deoxyuridine

Brk Brinker

CDC25 /string Cell Division Cycle Homolog CDK1/CDC2 Cyclin-dependant Kinase 1

CDK2 Cyclin-dependant Kinase 2

ci cubitus interruptus

CycB ciclina B

CycE Ciclina E

D Dachs

dILPs Drosophila insulin-like peptides Dilp-8 Drosophila-insulin like peptide 8

dll distalless

DNA Acido desoxiribonucleico

Dpp decapentaplegic

Ds Dachsous

EdU 5-ethynyl-2-deoxyuridine

EGFR epidermal growth factor receptor

en engrailed

Fj Four-jointed

Flp Flippase

FRT Flippase Recognition Target

Ft Fat

Gal80^TS GAL80 temperature sensitive

GFP Green Fluorescent Protein

Hh Hedgehog

Hpo Hippo

iRNA interference RNA

N Notch

nb nubbin

Omb optomotor-blind

PH3 Phospo-histone 3

pnr pannier

PI3K phosphoinositol-3-kinase

RBF Retinoblastoma-family protein

rn rotund

sal spalt

Shh Sonic hedgehog

TGF Tumour growth factor

Tkv Thickveins

TOPRO To-Pro-3

TORC1 Taget of Rapamicin complex 1

UAS Upstream Activation Sequence

vg vestigial

Wg Wingless

Wts Warts

Yki Yorkie

introducción

1) El problema general del tamaño de órganos y tejidos en el cuerpo de los animales

Uno de los retos de la biología del desarrollo es entender cómo el crecimiento y la proliferación celular, asi como la orientación de las divisiones, se orquestan para alcanzar el tamaño y la forma correcta de órganos y tejidos. El mecanismo subyacente es altamente preciso, como indica el hecho de que en un mismo individuo se pueden superponer de forma exacta la parte izquierda y derecha, excepto en los casos de asimetrías funcionales. Cuando se comparan los tamaños y proporciones de los individuos de una misma especie, se observa que todos poseen las mismas dimensiones con una variación muy pequeña de sus valores.

Hay dos mecanismos generales que controlan el desarrollo del cuerpo de un animal. En primer lugar, se requieren factores de crecimiento que activen los procesos de proliferación celular. Varios de estos factores se han identificado en diversas especies animales como Wingless(Wg)/Wnt, Decapentaplegic(Dpp)/

Tumour growth factor(TGF), Hedgehog (Hh)/Sonic hedgehog(Shh), Notch(N), EGFR (epidermal growth factor receptor), etc. En segundo lugar, existe un mecanismo que bloquea el crecimiento una vez que un organismo ha alcanzado el tamaño adecuado. Este es un proceso cuyas características se desconocen.

Los mecanismos de control funcionan a nivel organísmico (respuesta general a los niveles nutricionales, véase mas adelante) y a nivel autónomo de tejido u órgano. Estos últimos son de especial interés en este trabajo. Por ejemplo, en una serie de estudios de trasplante de apéndices provenientes de salamandras de diferente tamaño, los apéndices trasplantados tenían el mismo tamaño que hubiese tenido en su lugar de origen, aunque el cuerpo del huésped fuera de distinto tamaño que el original. De estos trabajos, se dedujo que los diversos órganos poseen un mecanismo intrínseco que determina su tamaño independientemente del resto del cuerpo (Twitty y Schwind 1931).

2) Los discos imaginales de Drosophila como sistema modelo para investigar los mecanismos de control de tamaño

Después de más de un siglo de investigación en Genética, en Drosophila se han desarrollado una serie de conceptos y métodos experimentales que hacen que sea un organismo muy adecuado para la investigación del control de tamaño.

Drosophila es un insecto holometábolo en el que su desarrollo larvario compuesto por tres fases larvarias diferenciadas por mudas cuticulares. Después de un periodo embrionario de 24 horas comienza el desarrollo larvario que dura 4 días a 25ºC y se divide en tres etapas de primer, segundo y tercer estadio larvario. Durante estos 4 días los discos imaginales multiplican el número de células 1000 veces, además de, simultáneamente, generar un patrón genético en la que cada célula adquiere una determinación. Al final del tercer periodo larvario, en respuesta

Figura 1. Ciclo Biológico de Drosophila Melanogaster

Tomado de Flymove

a estímulos hormonales, la larva se aleja de la fuente de alimento y localiza un punto donde entra en pupación.

En este momento, los discos imaginales ralentizan su crecimiento, y las células se acumulan en la fase G2 del ciclo celular. La metamorfosis ocurre durante el estadio de pupa y culmina en la eclosión de la mosca adulta.

Los discos imaginales han aportado un estupendo sistema para estudiar la relación entre el patrón y crecimiento, debido a su simple estructura y al amplio abanico de herramientas genéticas disponibles. Cada disco imaginal empieza con un conjunto de células con la identidad de la estructura cuticular adulta a la que va a dar lugar. En el caso del disco de ala, este crece desde un primordio de 50 células hasta alcanzar aproximadamente 30000 células (Martín & Morata 2006). Inicialmente en el desarrollo, el disco está subdividido en regiones de linaje restringido y especificadas por genes selectores, denominadas compartimentos. Estas regiones se originan a partir de pequeños grupos de células, llamadas policlones. Las células de los diversos compartimentos no se mezclan debido a que poseen diferentes afinidades celulares. Inicialmente se forman el compartimento posterior, determinado por el gen engrailed (en) y por la falta de en se determina el compartimento anterior a través de cubitus interruptus (ci). Mientras que a principio del segundo estadio se especifican el compartimento dorsal a través del gen selector apterous (ap) y por defecto, el compartimento ventral.

En Drosophila hay respuesta organísmica de tamaño a niveles nutricionales, metabólicos, mutaciones en dmyc, vía de la insulina, etc. Mutaciones en genes necesarios para la función normal de la vía insulínica, por ejemplo chico, dan lugar a moscas de pequeño tamaño. Asimismo, mutaciones en un efector de la vía como

Figura 2. Representación de los discos imaginales en la larva de Drosophila Melanogaster y los tejidos a los que da lugar en adulto

Tomado de Alberts y cols., 2002

funcional entre los niveles insulínicos y la actividad de la hormona Ecdisona con objeto de incrementar el periodo de crecimiento en situaciones en las que el desarrollo de los discos esta comprometido: el efector de este mecanismo es la hormona péptido como insulina de Drosophila 8 (Dilp-8). Esto será comentado mas adelante

Hay también un control intrínseco en los discos imaginales, puesto de manifiesto en los experimentos clásicos de trasplante de discos imaginales (Bryant 1971; Hadorn 1963; Schubiger 1971). Cuando discos imaginales inmaduros fueron trasplantados en el abdomen de una hembra adulta, estos, alcanzaron aproximadamente el tamaño esperado para un disco maduro a final de periodo larvario (Bryant & Levinson 1985), demostrando así la existencia de un mecanismo intrínseco y robusto de control de tamaño que puede funcionar en un ambiente heterólogo.

Adicionalmente, cuando los discos imaginales han llegado a alcanzar el tamaño adecuado, paran su crecimiento aunque se alargue el periodo larvario (Martín & Morata 2006; Simpson et al. 1980). Experimentos clásicos demostraron que fragmentos de discos imaginales, los cuales eran trasplantados en el abdomen de moscas adultas, en algunos casos, tenían un crecimiento regenerativo que les permitía alcanzar el tamaño final esperado. Así, el mecanismo que controla el tamaño, no solo actúa durante el crecimiento fisiológico, si no también durante el regenerativo (Bryant 1971; Hadorn 1963; Schubiger 1971).

El número inicial de células de los diferentes discos imaginales varía entre 20-50 (Brook et al. 1996). El número final no se ha medido en todos los discos; en el caso del disco de ala es de 32.000 células, producto de aproximadamente nueve divisiones del primordio original (Martín et al. 2009). Además, los discos imaginales poseen mecanismos homeostáticos que permiten alcanzar el tamaño final adecuado aunque se modifique el número de células durante el desarrollo. La irradiación de larvas durante el desarrollo

Figura 3. Formación de los compartimentos en el disco imaginal de ala. Cedido por Silvia Aldaz

temprano, que reducen considerablemente el número de células del disco, no impide que se formen discos con el tamaño final esperado, aunque sea necesario realizar divisiones adicionales a las que ocurren en el desarrollo normal (Haynie & Bryant 1977). Más aún, si se generan clones de células con distinto tipo de tasa proliferativa o incluso compartimentos con mayor ritmo de crecimiento (Martín & Morata 2006), no se afecta al tamaño final del disco imaginal (Morata & Ripoll 1975; Simpson & Morata 1981;

Weigmann et al. 1997; Neufeld et al. 1998). Estos resultados indican que existe un mecanismo robusto para alcanzar el tamaño preciso, que no cuenta número de divisiones de células sino que, probablemente, mide dimensiones físicas.

3) Compartimentos y control de tamaño

Como se indica anteriormente, los discos imaginales están subdivididos en regiones topográficas definidas genéticamente, denominadas compartimentos. Los compartimentos representan áreas de linaje restringido es decir, no puede haber intercambio de células entre compartimentos (Garcia-Bellido et al. 1973). El compartimento anterior, definido por la actividad del gen ci y el posterior, definido por la actividad del gen en provienen de un conjunto de células diferentes desde el embrión. Posteriormente en el disco de ala, a principio del segundo estadio larvario, aparecen una nueva subdivisión de compartimento, la dorso/ventral definida por la actividad del gen ap en la región dorsal. Los bordes de compartimentos poseen propiedades organizativas en cuanto a la generación del patrón génico en el disco de ala, por ese motivo se denominan organizadores. En el organizador antero/posterior, debido a la expresión de hh, se produce la expresión de Dpp (Restrepo et al. 2014), y en el borde dorso/ventral aparece la expresión de Wg debido a la activación

Figura 4. Modelo de actuación de los morfógenos en el disco de ala para la formación del patrón génico

de N (Swarup & Verheyen 2012). En ambos casos, estos genes van a especificar el patrón génico debido a su difusión desde la fuente, formando un gradiente de concentración, es decir, actúan como morfógenos, aunque el papel de Wg como morfógeno se ha cuestionado recientemente (Alexandre et al. 2014). Este gradiente de concentración da información

posicional a las células y activa una batería de genes que dan lugar a un mosaico génico que, especificarán y finalmente determinaran el desarrollo de las diversas regiones en que se subdividen los discos. En el caso concreto del disco del ala, se especificaran los genes spalt (sal) y optomotor-blind (omb) desde la región más central a la más periférica del disco, y en el caso de wg, se especifican genes como vestigial (vg), rotund (rn) o nubbin (nb). En el caso de disco ventrales en general, y de los discos de pata en concreto, no solo dpp es especificado por hh, si no que wg también es especificado en el borde antero-posterior, al igual que Dpp. En este caso, Dpp tiene expresión dorsal, mientras que Wg tiene expresión ventral, pero ambos en forma de cuña. En estos discos, los subdominios son especificados por los gradientes de concentración de ambos genes pero de manera conjunta, donde ambos genes a altas concentraciones especifican a distalless (dll), mientras menores niveles junto con dll, dan lugar a dachshund (dac) (Morata 2001)

Estas subdivisiones dependen de posición y no tienen un componente de linaje exclusivo como ocurre con los compartimentos. Esto quiere decir que no hay restricción de linaje y cualquier célula del disco imaginal puede potencialmente adquirir la identidad definida por esos genes. Es más, entender cómo las células adquieren las diversas identidades regionales es muy relevante para entender cómo cada una de las partes del disco imaginal y, por consiguiente, el disco total, alcanza el tamaño correcto. Un caso de interés es el mecanismo de formación de la región del apéndice ala (Zecca & Struhl 2007b). Las células que expresan vg, que confiere identidad ala, envían una señal de corto alcance que induce a células vecinas a expresar vg, y de esta forma son reclutadas a la identidad ala. Este fenómeno de reclutamiento puede ser de especial interés en los procesos homeostáticos que se describen más adelante.

Hay varias evidencias que demuestran que los compartimentos se comportan como unidades de crecimiento independientes (Garcia-Bellido et al. 1973; Martín & Morata 2006). Cuando se ralentiza la proliferación del compartimento anterior debido a una mutación Minute, con respecto a un compartimento posterior, se forma un ala en la que ambos compartimentos son de tamaño y forma normal. Esto se debe a que, durante el desarrollo, el compartimento posterior detiene su crecimiento cuando alcanza el tamaño definido, mientras el compartimento anterior más lento continua creciendo hasta que también alcanza el tamaño adecuado. El resultado es un ala de tamaño normal. Con estos datos, se podría interpretar que las subdivisiónes del disco en unidades controladoras de tamaño podría permitir un control mas preciso de su tamaño total.

Figura5. Modelo de actuación de los morfógenos en el disco de pata para la formación del patrón génico

4) Mecanismos específicos de crecimiento y proliferación celular

La identificación de las conexiones entre los programas de desarrollo y los reguladores de crecimiento y división celular es esencial para comprender cómo el tejido alcanza el tamaño y la forma correcta.

El control del ciclo celular depende de las oscilaciones en el nivel y actividad de las ciclinas (Lee &

Orr-Weaver 2003). En Drosophila, el incremento de los niveles de ciclina o su actividad pueden acelerar el ciclo celular. La tasa limitante que regula la fase G1-S es la Ciclina E (cycE), la cual actúa con la Quinasa dependiente de ciclina 2 (CDK2), y la fase G2-M es limitada por CDC25/string, un activador del complejo Quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1/CDC2)/ciclina B (CycB). Así, la comprensión de como los complejos CDK2/CycE y CDK1/CycB son regulados es un tema central para la comprensión del control del ciclo celular en Drosophila.

En el caso de los discos imaginales, el tema central de nuestro estudio, crecen mediante proliferación celular con las fases del ciclo celular G1-S-G2-M. En este tipo de crecimiento, la división y crecimiento celular son regulados por las mismas vías de señalización. La proliferación celular es promovida por la alimentación, que induce la liberación de hormonas como los “Peptidos como insulina de Drosophila”

(dILPs) (Hietakangas & Cohen 2009). Estos dILPs promueven el crecimiento celular a través de la activación Figura 6. Regulación a través de CDK1 del ciclo célular

estimulan la producción de ribosomas (vía el factor de transcripción Myc) y su actividad (a través de la quinasa S6K la cual fosforila la proteína ribosómica S6).

5) La vía Hippo (Hpo)/Warts (Wts)

La vía Hpo/Wts es una vía de señalización evolutivamente conservada, la cual controla el tamaño de los órganos desde Drosophila hasta humanos a través de la proliferación y supervivencia celular por supresión del coactivador transcripcional Yki. Aunque identificado primeramente en Drosophila, esta vía ha sido identificada en el control del tamaño de los órganos y varios tipos de cánceres humanos (Tapon et al. 2002;

Dong et al. 2007). El bloqueo de la vía de señalización genera grandes sobrecrecimientos, lo que indujo a pensar en su papel regulador del tamaño. Estos sobrecrecimientos vienen dados por la activación de Yorkie (Yki), el cual es esencial para la transcripción de una batería de genes implicados en crecimiento, división y supervivencia celular. Ejemplo de esto es el microRNA bantam, el cual previene la traducción de Hid, el gen inhibidor de la apoptosis diap1, y cycE (Huang et al. 2005; Thompson & Cohen 2006). Además de estos genes, también pueden activar genes capaces de influir en la vía, como four-jointed y expanded que pueden activarla o inhibir respectivamente (Cho et al. 2006; Hamaratoglu et al. 2006). Adicionalmente, también puede activar genes implicados en el patrón génico como wg y serrate (Cho et al. 2006).

Figura 7. Esquema de la vía de Ft/Ds/Fj y de Hippo, y sus homólogos en vertebrados

6) Los genes de polaridad planar y la vía Hpo

La polaridad celular planar es el proceso por el que las células se coordinan en el plano de un tejido. Este fenómeno ocurre tanto en invertebrados como en vertebrados por dos complejos bien caracterizados: la vía

“nuclear” y la via Fat/Dachsous/Four-jointed (Ft/Ds/Fj). La vía nuclear posee 7 componentes: Flamingo (Starry night), Strabismus (Van Gohg) y Frizzled como receptores transmembrana, y Dishevelled, Diego y Prickle (Spiny-legs) como proteínas citoplasmáticas. Estos forman complejos asimétricos dentro de las células que, de manera macroscópica, dan lugar a la polaridad de los tejidos, como la orientación de tricomas y quetas. Además, la pérdida de algunos de los componentes de esta vía provoca la pérdida de la organización de estos complejos, demostrando una regulación muy fina.

La vía (Ft/Ds/Fj) es también un componente esencial de la polaridad planar. La cadherina atípica es activada por la unión de otra protocadherina, denominada Ds, con la que forma uniones heterodiméricas entre células vecinas (Willecke et al. 2008; Rogulja et al. 2008). Ds se expresa en gradiente, donde los mayores niveles están en la zona proximal del disco y disminuyen hacia la zona distal. Así, la distribución asimétrica dentro del tejido tiene una representación celular en la distribución asimétrica de los heterodímeros dentro de la

Figura 8. Esquema de funcionamiento de la vía de Ft/Ds/Fj, el patrón de expresión de sus genes y cómo se organiza a nivel celular dentro del tejido.

célula, colocándose Ds en mayor proporción en la cara distal de las células (Brittle et al. 2012). Fj es una quinasa del aparato de Golgi y es capaz de fosforilar a ambas protocadherinas, provocando una mayor afinidad de Ft por Ds, mientras que disminuye la afinidad de Ds por Ft (Ishikawa et al. 2008). También posee un gradiente de expresión complementario a Ds, mayor en la zona más distal del disco, y declina hacia la zona más proximal. Ft y Ds parece que actúan como si fueran receptor-ligando respectivamente, aunque parece que Ds también puede actuar como receptor (Willecke et al. 2008). Toda la actividad de Ft es mediada por Dachs (D), una miosina atípica que se localiza en la región apical de la célula (Mao et al.

2006). La disposición de D en la célula es un marcador de su polaridad próximo-distal.

El sistema Ft/Ds/Fj está relacionado con la orientación de las divisiones celulares. En el disco de ala se han realizado experimentos en los que cuando se sobreexpresan Fj o Ds tanto en clones como en compartimentos se produce una repolarización de la distribución asimétrica de la proteína D de entre 5 o 6 células de distancia del clon o el compartimento (Ambegaonkar et al. 2012).

La vía Ft/Ds/Fj también regula la actividad de Hpo a través del efector D, que a su vez regula la estabilidad de Wts (Cho et al. 2006) y por lo tanto el proceso de proliferación celular. La actividad de D está regulada por la quinasa fj. El hecho de los discos de ala mutantes para ft sean de mayor tamaño que los normales es una indicación de la interacción entre las vías Ft/Ds/Fj e Hpo. Tradicionalmente el gen ft se ha considerado como un supresor de tumores debido a su fenotipo mutante

7) Modelos de control de tamaño de los discos imaginales

La mayor parte de los modelos que intentaron o intentan explicar cómo los discos imaginales regulan su crecimiento para alcanzar el tamaño esperado, son modelos verticales. En estos modelos, un grupo de células del disco imaginal, cuya región se denomina organizadores, regulan el tamaño del resto del disco mediante la expresión de morfógenos. Los morfógenos son moléculas que difunden desde una fuente, y actúan aportando información posicional a las células debido a su gradiente de concentración. Dpp es uno de los morfógenos más estudiados, el cual es producido por las células anteriores del borde antero-posterior (Restrepo et al. 2014), y wg, el cual es producido por las células del borde dorso-ventral (Swarup & Verheyen 2012). Debido a la incapacidad de generar buenos anticuerpos contra Dpp, la mayoría de las observaciones sobre la difusión de la proteína se han realizado con construcciones en las que se sobreexpresa una fusión de la proteína fluorescente verde (GFP) a Dpp (Entchev et al. 2000; Teleman & Cohen 2000).

Las evidencias de que Dpp promueve el crecimiento del disco son variadas e inequívocas. El incremento en la señalización de Dpp puede resultar en un incremento del ala con duplicación del patrón, mientras que las mutaciones que reducen los niveles de Dpp reducen el tamaño del ala o incluso provocan su desaparición (Restrepo et al. 2014). Un simple modelo en el cual la concentración de Dpp influye directamente sobre la proliferación pronostica una diferencia de proliferación entre la zona medial y lateral del disco imaginal.

En cambio, la proliferación es homogénea a través del disco, al menos durante el tercer estadio larvario.

Un segundo tipo de modelo es en el que las células comparan sus niveles de actividad de Dpp (Wartlick et al. 2011). Este modelo se basa en que la concentración de Dpp se incrementa con el tiempo, de modo que

los gradientes de Dpp escalan con el disco. Se calculó mediante los niveles de GFP-DPP, que cuando las células incrementaban los niveles de actividad de Dpp un 50%, las células se dividían. En cualquier caso, los mecanismos moleculares que median este modelo no han sido descubiertos aun.

Un tercer modelo propone que la proliferación viene dada por la pendiente del gradiente de Dpp (Day

& Lawrence 2000). En este caso, el extremo lateral del disco funciona como un sumidero, de modo que con el crecimiento del disco disminuirá la pendiente Dpp, pudiendo las células detectar cuanto disminuye la pendiente. Pero una segunda opción es que las propiedades de las células sean determinadas por la concentración local de Dpp, y así la información posicional contenida en el gradiente de Dpp sea traducida en otros gradientes de información posicional. Ahora las células podrán comparar esas características con sus vecinas y, las que excedan de cierto valor, se dividirán para disminuir las diferencias. Un trabajo ha demostrado que Dpp puede regular la vía Hpo/Wts para traducir la pendiente del gradiente de Dpp en una repuesta proliferativa. La proteína D es polarizada al eje antero-posterior y dorso-ventral en los cuales wg y Dpp son expresados y requiere a la protocadherina supresora de tumores Ft (Rogulja et al. 2008). Ellos demostraron que Dpp puede modular la actividad Hpo/Wts, a través de Ft mediante la modificación del patrón de expresión de Ds y Fj. Esta observación sugiere que la actividad de Dpp es traducida por Ft vía D a la vía Hpo/Wts, suprimiendo su actividad e incrementando la expresión de los genes diana de Yki y la proliferación celular. Estos autores proponen un modelo en el cual la expresión en gradiente de Fj y Ds modula la actividad de Hpo/Wts. La actividad polarizada de Ft se infiere de la localización polarizada de

Figura 9. Modelos verticales y horizontales de crecimiento

D. Así, altos niveles de Ds sobre la cara distal de la célula, polarizará la actividad de D y permitirá que la transducción de la señal en la región distal dentro de la célula (Rogulja et al. 2008; Willecke et al. 2008).

Además, Fj posee un patrón de expresión en gradiente en la región mas distal del disco y opuesta a Ds, cuyo patrón gradual de expresión en el disco es proximal.

Estos tres modelos no tienen por qué ser excluyentes, e incluso se han realizado experimentos en los que se ha eliminado el gradiente de Dpp mediante la sobreexpresión de thickveins (Tkv), el receptor de Dpp, como del represor de la vía Brinker (Brk) (Martín et al. 2004; Schwank et al. 2011). En este caso, las células no pueden detectar los niveles de Dpp, pero siguen teniendo un tamaño normal, excepto en la región mas lateral, debido a la eliminación del represor Brk. Este experimento argumenta que el gradiente de Dpp no es necesario para el crecimiento del disco en sí mismo. De este modo, se propuso un modelo en el que la región medial está controlada por la vía de Ft, mientras que las regiones laterales están reguladas por Dpp, actuando en paralelo (Schwank et al. 2011) para generar un disco de tamaño correcto.

Actualmente el papel sobre la regulación del crecimiento por Dpp está en controversia debido a dos nuevos trabajos en los que se bloquea la difusión de Dpp. Se propone que su papel solo es esencial para la región medial del disco de ala (Harmansa et al. 2015) y por mutación del gen endógeno que durante los últimos estadios del periodo larvario tampoco parece esencial (Akiyama & Gibson 2015)

Además de estos modelos verticales, cada vez hay más trabajos que se enfocan para vislumbrar un papel más horizontal en la regulación del tamaño total del disco de ala. Esto quiere decir que parece ser una propiedad que emerge de las interacciones entre las células dentro del propio tejido.

Diferentes trabajos sobre la regulación y especificación de la zona presuntiva de ala por el gen vg son otras evidencias sobre el mecanismo que regula el tamaño del tejido mediante interacciones célula-célula. ve es crítico para la especificación del ala y su crecimiento, y su expresión requiere la actividad de la vía de N, Wg y Dpp. La expresión de Vg está bajo el control de dos diferentes regiones reguladores amplificadores, el amplificador del límite (vgBE) regulado por N y el amplificador cuadrante (vgQE) que es activado por las vías de Wg y Dpp (Kim et al. 1997; Williams et al. 1994). Así, se integran las señales más importantes para el desarrollo del disco. Tras el establecimiento del borde dorso-ventral, las células que expresan Vg envían una señal de corto alcance que induce a las células vecinas a expresar Vg (Zecca & Struhl 2007b). El rango del circuito de alimentación de la autoregulación de vg es mediado por contacto, siendo reclutadas una o varias células a la vez. El reclutamiento es mediado por el vgQE en respuesta a la actividad de Wg y Dpp.

La sobreexpresión de Vg, en células que expresan Vg, provoca una parada de la proliferación, pero en cambio provoca un incremento proliferativo en regiones proximales tanto autónomo como no autónomamente (Liu et al. 2000; Baena-Lopez & García-Bellido 2006; Zecca & Struhl 2007a). Esta proliferación no autónoma, está acompañado de una expresión autónoma de wg y fj, que a su vez pueden regular la vía Hpo (Liu et al. 2000; Baena-Lopez & García-Bellido 2006; Zecca & Struhl 2007b). Fj suprime la asociación entre Ft y Ds, lo cual incrementa la actividad de Yki, proponiendo esta vía como la reguladora del circuito de incorporación de células de Vg (Zecca & Struhl 2007b).

Este modo de crecimiento por incorporación a un dominio de modo inductivo hacia la periferia es recurrente durante el desarrollo, como ocurre durante en la formación de la retina (Baker 2007). En este caso, la ola de

reclutamiento va desde posterior hacia anterior, desde una región determinada en células que darán lugar a fotoreceptores y células accesorias, hacia una región no determinada y altamente proliferativa. En el caso del proceso de reclutamiento de la región del ala, eventualmente, deja de actuar por un mecanismo aun no descubierto. En cualquier caso, la capacidad difusible de wg desde el borde dorso-ventral es la implicada en el frente de crecimiento de la región presuntiva de ala. Este aspecto del modelo debe ser revisado con la reciente observación de que un alelo con una versión de wg anclado a membrana, y por lo tanto sin capacidad de difusión, puede generar un ala algo menor de tamaño (Alexandre et al. 2014).

8) Respuesta del mecanismo de control de tamaño a alteraciones experimentales.

Como se ha argumentado anteriormente, los discos imaginales poseen un mecanismo de control de tamaño muy robusto, incluso en ambientes heterólogos como después de trasplante en el abdomen de hembras adultas (Bryant & Levinson 1985).

Se han publicado numerosos experimentos en los que se ha modificado la tasa proliferativa en los discos imaginales y analizado la respuesta en cuanto al tamaño. Se demostró que clones de células que proliferan a un ritmo mucho mas rápido que sus vecinas son capaces de formar la mayor parte de un compartimento, pero el tamaño final de este es normal (Garcia-Bellido et al. 1973), indicando que existe un mecanismo de control de tamaño que integra diferencias de ritmo de crecimiento. Experimentos posteriores alterando el tamaño de las células (Weigmann et al. 1997; Neufeld et al. 1998) a su vez demostraron que estas variaciones no modificaban el tamaño de los compartimentos; se modificaba el número de células según el tamaño celular para construir un compartimento de tamaño normal. Así, se interpretó que el mecanismo de control de tamaño mide dimensiones físicas más que numero de células.

Además de estos experimentos, los experimentos de regeneración también ponen de manifiesto un mecanismo de control de tamaño robusto. En experimentos clásicos, discos jóvenes eran trasplantados en el abdomen de moscas adultas y alcanzaban el tamaño final esperado aun cuando disponían de tiempo adicional para crecer (Hadorn 1963; Schubiger 1971). Así, los mecanismos de control de tamaño no solo funcionan durante el crecimiento fisiológico, si no también durante el crecimiento regenerativo.

Mediante irradiación se produce muerte generalizada en todo el tejido aunque, a pesar de esto, también parece que los discos irradiados son capaces de alcanzar el tamaño esperado (Haynie & Bryant 1977). Tras la irradiación parece que se produce un incremento de la proliferación en todo el disco para compensar la muerte celular inducido por la irradiación, denominada proliferación compensatoria. Al ser un crecimiento difuso en todo el disco, podría pensarse que el mecanismo que regula la proliferación tras la irradiación podría ser el mismo que en el crecimiento durante el desarrollo. Los estudios actuales de regeneración utilizan la expresión de genes pro-apoptóticos bajo el sistema binario GAL4/UAS (Brand & Perrimon 1993). En este caso se ha podido estudiar como las células pueden contribuir a la reparación de las zonas dañadas (Herrera et al. 2013; Repiso et al. 2013) y las señales implicados en la recuperación durante la regeneración (Bergantiños et al. 2010; Smith-Bolton et al. 2009).

9) Perturbaciones del crecimiento provocan una respuesta organísmica general

El daño en los discos imaginales, por ablación mecánica o genética, induce retraso hacia la entrada a la metamorfosis (Stieper et al. 2008; Smith-Bolton et al. 2009). Esto permite a los organismos retrasar su programa de desarrollo, parando el crecimiento de la larva para sincronizar la zona dañada con el resto de tejido larvario antes del estadio pupal.

Así, la señal liberada desde el disco en crecimiento es una señal inhibitoria que previene la pupación hasta que el disco tenga completo el desarrollo.

Recientemente, Dilp8, una nueva hormona de la familia de la insulina, fue identificada como una señal que es liberada desde los discos imaginales en los que se ha perturbado su desarrollo.

Dilp8 actúa remotamente sobre el sistema nervioso central para inhibir la producción de ecdisona (Colombani et al. 2012;

Garelli et al. 2015). La identificación de

Dilp8 aporta una explicación mecanicista de como el crecimiento de los órganos es reconocido a nivel sistémico y coordinado con la maduración. Dilp8 puede ser un componente importante del mecanismo que regula la detención del crecimiento y la determinación del tamaño del órgano.

10) Planteamiento experimental de este trabajo

El planteamiento general de este trabajo es analizar las interacciones celulares que ocurren cuando se impide la división celular en varios compartimentos o dominios definidos de los discos imaginales. El objetivo general es estudiar la respuesta del conjunto del disco a la inhibición de la proliferación en diversas regiones.

En los experimentos se ha utilizado el sistema Gal4/UAS/Gal80^TS para inactivar de forma controlada y durante el tiempo apropiado el gen cdk1, esencial para la compleción del ciclo celular. La herramienta de inactivación es una línea UAS con un RNAi de cdk1 y que demostramos que es altamente efectiva inhibiendo la función de cdk1. Aunque los objetivos mas concretos se describen en la sección apropiada, podemos mencionar aquí que hemos considerado dos tipos de dominios genéticos: aquellos que son de linaje abierto en los que las células del dominio afectado comparten linaje con sus vecinas fuera del dominio, y dominios de linaje cerrado – compartimentos- que tienen un linaje separado de las células del resto del disco.

El análisis de la respuesta incorporará el estudio de los sistemas genéticos relevantes a los procesos de crecimiento de los discos imaginales: los morfógenos Dpp y Wg, la vías Hpo and Ft/Ds/Fj así como el efecto sobre el mecanismo de alargamiento de la fase larvaria regulado por el péptido Dilp8.

Figura 10. Mecanismo de activación y actuación de Dilp8

materiales y métodos

Líneas Gal4 y UAS de Drosophila.

El sistemas GAL4/UAS es un sistema binario de expresión génica perteneciente a levadura (Brand &

Perrimon 1993). Este sistema consta del transactivador transcripcional denominado GAL4, que tras unirse a una región de reconocimiento llamada UAS, se activa la transcripción de un gen efector. La expresión de GAL4 es dependiente de su región de inserción en el genoma, ya que será influido por las regiones promotoras y amplificadores que regulen la expresión génica en esa zona. De modo que GAL4 reproducirá el patrón espacio-temporal de la región o regiones promotoras asociadas a esa región de inserción. También es posible realizar una construcción génica con la regiones promotoras y amplificadoras de interés y aislado de efectos de su posición de inserción mediante regiones aisladoras génicas. De este modo, el patrón espacio-temporal no dependerá de su región de inserción. Además de estos dos elementos, existe un represor de GAL4, llamado GAL80 \cite{Brand1993}. Esta proteína también debe ser expresada bajo regiones promotoras que reproduzcan un patrón de expresión. En este caso, se suele expresar bajo promotores ubicuos y constitutivos como el del gen de la tubulina. Hay una versión más reciente de la proteína GAL80 que es termosensible (GAL80^ts) (McGuire et al. 2003).

Las líneas GAL4 utilizadas fueron hh-Gal4 (Tanimoto et al. 2000),ap-Gal4 (Calleja et al. 1996), salEPv- Gal4 (cedido JF de Celis, CBMSO, Madrid, españa), pnr-Gal4 (Calleja et al. 2000), rn-GAL4 (St Pierre et al. 2002), dll-GAL4, dac-GAL4 (Calleja et al. 1996) y ci-GAL4, las cuales reproducen el patrón espacio temporal de los genes con los que se cuales se nombran.

Las líneas UAS utilizadas fueron, UAS-iCDK1 (Bloomington), UAS-flp (Bloomington), además de la versión termosensible de GAL80 bajo el promotor de la tubulina tub-GAL80^ts (Bloomington).

Figura 1. Esquema del funcionamiento del sistema binario GAL4/UAS mediante cruces de dife- rentes estirpes de Drosophila Melanogaster

Líneas LacZ y GFP

Cuando la falta de anticuerpos y/o la no disponibilidad de anticuerpos para analizar la expresión de un gen de lectura, aquel que nos informa sobre la actividad de una vía mediante la modificación de sus niveles o patrón de expresión, se utilizan líneas con inserción de genes chivatos. Estos genes como el gen de la proteína Lacz proveniente de E. coli o o el gen la proteína GFP proveniente de Aequorea victoria, se insertan como el gen de la proteína GAL4, reproduciendo su patrón de expresión. Las líneas utilizadas fueron, cycE- lacZ (Bloomington), ex-lacZ (Bloomington), diap-lacZ (Bloomington) y Dilp8-GFP \cite{Garelli2012}.

Líneas mutantes y líneas con diferente construcciones

Las líneas mutantes utilizadas para el análisis de los genes de la via no canónica de vía de la polaridad celular planar fueron, FtG-rv bloomington Ft15 casal, Ds38K Bloomington, DsUA071 Isabel Rodriguez, DGC13 bloomington. Además, he utilizado la líneas hs-Flp (Struhl & Basler 1993), que posee el gen de la proteína Flipasa (Flp) bajo el promotor de las proteínas activadas por calor. De esta manera, cuando se produce un golpe de calor a Drosophila, se induce la expresión de la proteína Flp que induce la recombinación entre secuencias llamadas diana reconocimiento de la flipasa (FRT). Esta línea servirá para inducir la recombinación de dos

secuencias FRT situadas en la misma orientación, lo cual provocara la escisión de todo lo que se encuentre entre las dos secuencias. De esta manera, se permitirá la expresión de lo que se encuentre bajo el promotor de actina. En el caso de la construcción act>stop>lacZ(Struhl & Basler 1993)se expresara Lacz y en el caso de act>stop>dachs-GFP, la proteína Dachs fusionada a GFP. Así, dependiendo del tiempo de calor, el número de células aleatoriamente e indeleblemente en el tejido será mayor o menos. Además, se podrá seguir la contribución de esa célula con la observación de su linaje mediante la marca indeleble de B-Gal.

En el caso del marcaje con Dachs-GFP se puede ver la localización de la proteína en la membrana células, indicando la orientación de las divisiones celulares.

Figura 2. Esquema de la generación de clones mediante re- combinación de secuencias FRT en “cis” mediado por la enzima Flipasa

Realización de experimentos

Para generar dominios con falta proliferativa cruzamos las líneas rn-Gal4, salEPV-Gal4 y pnr-Gal4 con UAS-GFP, UAS-iCDK1. Para provocar una falta proliferativa en los compartimentos posterior, dorsal o anterior cruzamos las líneas hh-Gal4, ap-Gal4, ci-Gal4 con UAS-GFP; UAS-iCDK1, tub-.Gal80ts. En el caso que el compartimento mantiene el tamaño final estuvieron 168h ael a 17ºC y posteriormente 48h a 29ºC (temperatura restrictiva para Gal80ts) hasta la disección. En el caso de reducir el tamaño del compartimento las larvas estarán 124h ael y posteriormente 72h a 29ºC hasta la disección.

Experimento de análisis del reclutamiento mediante adición de BrdU al medio

Para analizar el linaje por BrdU (5-Bromo-2-Deoxyuridina) se añaden 30 microlitros de la solución a 100 mg/ml de BrdU en la comida de las larvas 24h o 48h antes de la disección. Para demostrar la falta proliferativa en los dominios afectados, se realizó una incubación adicional con 5-ethinil-2´-deoxiuridina (EdU) tras la disección.

Para analizar el linaje por marcado indeleble por B-Gal, se mantienen las larvas 124h ael y posteriormente 24h a 29ºC. Tras este tiempo se vuelve a poner las larvas a temperatura permisiva para el Gal80ts, durante 96h antes de la disección.

Inmunohistoquímica e inmunodetección de la incorporación de BrdU

Los discos imaginales fueron fijados en una solución de paraformaldehido al 4% y 0,1% Tritón durante una hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos fueron diluidos en tampón de lavado (tampón fosfato salino con 1% de albumina de suero bovino y 3% de Tritón). Los anticuerpos usados fueron anti-Fas3, anti-ß-Galactosidasa, anti-Wingless, anti-patched y anti-cubitus interruptus de Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa city, USA, anti-BrdU de Roche, anti-fosfo-histona 3 de Millipore, anti-Distaless del laboratorio de Gerard Campbell y anti-Dcp1

Para la incorporación de Bromo-2´-deoxiuridina (BrdU), los discos imaginales de ala fueron cultivados en PBS suplementado con 1 mg/ml de BrdU (Roche) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los discos fueron posteriormente lavados en PBS y fueron fijados en una solucion de paraformaldehido al 4%

y 0,1% Triton durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se trataron tratados con RQ1 DNAsa (Promega) durante 2 horas. Finalmente los discos fueron inmunoteñidos como se describe arriba.

Para la 5-ethinil-2´-deoxiuridina (EdU), los discos de ala se cultivaron en medio PBS 1x suplementado con EdU durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después, los discos fueron lavados en PBS 1x, y luego fueron fijados en una solución de paraformaldehido al 4%, 0,1% Triton durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente para visualizar la incorporación de EdU se siguieron las instrucciones del kit (invitrogen)

Montaje de alas y patas adultas

Las alas adultas fueron montadas en medio de montaje Euparal tras la disección de las moscas en medio glicerol/alcohol.

Adquisición de imágenes y tratamiento de imágenes

Las imágenes de microscopia confocal se adquirieron con equipos Leica TCS SPE y Zeiss LSM 510. Para la obtención de alas y patas adultas, se dispuse de un microscopio de campo claro Zeiss Axiophot.

La proporción de los dominios con respecto al disco total se realizaron midiendo los dominios y el tamaño total del disco con la distribución FIJI de ImageJ y los porcentajes se relativizaron utilizando Microsoft Excel.

objetivos

1. Estudiar la respuesta de los discos imaginales de Drosophila a alteraciones en el crecimiento de diversas regiones de los discos, distinguiendo entre regiones de linaje abierto y de linaje cerrado- compartimentos

2. Analizar la respuesta de las regiones del disco no afectadas por la perturbación

3. Identificar los genes y las vías de señalización involucrados para ayudar a entender los mecanismos de control del tamaño

resultados

Resultado del bloqueo de la división celular en dominios de linaje abierto

1) La falta de división celular no impide el crecimiento de los diferentes dominios.

En estos experimentos hemos expresado el iRNA de gen cdk1/cdc2, al cual partir de ahora llamaremos icdk1, en los dominios definidos por los genes rn y sal en la región presuntiva de ala y pannier (pnr) en la región presuntiva del notum, utilizando el sistema GAL4/UAS. Los discos controles en los que solo se expresa GFP poseen valores de proliferación celular homogéneos en todo el disco, que puede ser observado por la marca de BrdU (Fig.1a-c´). Cuando expresamos icdk1, en los diferentes dominios queda en evidencia la pérdida de proliferación, como indica la falta de marca de BrdU en la zona verde donde también se expresa GFP (Fig.1d-f´). No se aprecian grandes diferencias entre los dominios con división celular normal y los que tienen la división bloqueada, pero para asegurar este punto medimos el tamaño de los dos tipos de dominios y los relativizamos con el tamaño total del disco para eliminar variabilidad. Como se puede observar ,la mayor diferencia fue el caso de sal>icdk1 en el que la diferencia fue de un 20%, mientras que fue de un 15% para rn>icdk1 y de un 3% para pnr>icdk1 (Fig.1g). Más adelante veremos que, aunque hay diferencias estadísticamente significativas para los dominios con falta proliferativa, estas diferencias no son biológicamente significativas.

En los experimentos que siguen hemos utilizado discos de genotipo rn>icdk1 para analizar las características de los dominios donde se inhibe la división celular, habiendo comprobado que los dominios sal>icdk1 y pnr>icdk1 manifiestan características similares

2) La expresión de icdk1 no induce apoptosis

En el experimento anterior se observa una cierta disminución del tamaño de los dominios donde se induce icdk1. Quisimos saber si parte de esta disminución del tamaño podía ser debido a un incremento de la apoptosis. Se pudo observar en discos rn>icdk1 que no hay un incremento de apoptosis por encima de los bajos valores normales que ocurre en el disco de ala

3) La falta de proliferación celular provoca en el dominio afectado un incremento de volumen celular.

Como fue descrito en los anteriores trabajos, que una de las posibles variables celulares que puede ser modulada para regular el tamaño de los tejidos es el tamaño celular (Weigmann et al.

1997; Neufeld et al. 1998). Para comprobar si existe un aumento de tamaño celular en nuestros experimentos realizamos tinciones para la proteína de membrana celular FAS3 que marca el contorno celular. Como se puede observar, las células de los dominios rn> icdk1 (Fig.3b,b)´, sal>

icdk1 (Fig.3d,d´) y pnr> icdk1 (Fig.3f,f´) donde se produce una parada proliferativa tienen mayor tamaño, como indica su mayor perímetro, que las de los controles (Fig.3a,a´,c,c´,e,e´). En los

Figura 1. Efecto sobre el cre- cimiento la falta de prolifera- ción en diferentes dominios sin restricción de linaje en el disco de ala. Se muestra en los dominios Rotund (a), Spalt (b), Pannier (c) marcados con la expresion de GFP, el creci- miento homogéneo mediante la incorporacion de BrdU (a´-c´).

Se observa la falta de incorpo- ración de BrdU en los dominios que expresan el iRNA de CDK1 (d´-f´). En la gráfica se observa el porcentaje del tamaño del dominio respecto al tamaño del disco imaginal total (g). Nótese que el tamaño es significativa- mente menor pero las diferen- cias no son muy grandes.

trabajos citados anteriormente, se propuso este incremento de volumen celular como un elemento regulador del tamaño que se modificaba activamente para alcanzar el tamaño final de la región afectada. Otra observación interesante es que encontramos una menor capacidad de tinción de DNA mediante el fluoroforo TOPRO ( Fig. 3a´´,b´´,c´´,d´´,e´´,f´´), que aparece más difusa que en las células normales. Esto puede ser debido a una pérdida de la concentración del DNA en núcleos de mayor tamaño, o pérdida de la heterocromatina, debido a estar parado el ciclo celular.

4) La inhibición de cdk1 induce altos niveles del marcador epigenético fosfo- histona 3.

El marcador epigenético fosfo-histona3 (PH3) aparece en las células que se encuentran en la fase mitótica del ciclo celular y, por lo tanto, están en fase proliferativa. Como se puede observar en las imágenes, los discos control en los que sólo se expresa GFP en los diferentes dominios, tienen distribuidas homogéneamente células con la marca PH3 (Fig.4a,a´,c,c´,e,e´). Esto implica, como comentamos arriba, que la proliferación en los discos imaginales es homogénea. En cambio, en los en rn>icdk1 (Fig.4b,b´)., sal> icdk1 (Fig.4d,d´). y pnr> icdk1 (Fig.4f,f´). se produce una acumulación de PH3 de modo autónomo. De este único dato podría interpretarse que hay una alta tasa proliferativa en los dominios donde se expresa icdk1, pero si tenemos en cuenta el apartado 1, podríamos interpretar que las células se están acumulando en la fase mitótica del ciclo celular.

Es más, como ya demostramos anteriormente, los dominios que expresan icdk1 pueden ser incluso algo más pequeños. Otra observación que nos resultó interesante es que la marca de PH3 es más intensa en la región proximal de los dominios que en la región distal. Hay muchas posibles interpretaciones como, por ejemplo, que el sistema GAL4/UAS tiene mayor expresión en las zonas proximales de los dominios. Nuestra interpretación fue que ese fenotipo celular era debido a

Figura 2. La expresión del iRNA de CDK1 no provoca muerte celular. No hay un incremento de muerte celular como se puede observar cuando se expresa el iRNA de CDK1 (b-b´) con respecto al control (a- a´).

Figura 3. Incremento de volu- men celular en las células que pierden la capacidad prolifera- tiva. Se observa una homoge- neidad en cuanto al volumen celular delimitado por la tin- ción de FasIII (a´, c´, e´). Las células que pierden la capaci- dad de proliferan incrementan su volumen celular como se ob- serva por el mayor tamaño de las células (b´, d´, f´). Además del incremento de volumen, es- tas células pierden la condensa- ción de la cromatina (a´´-f´´)

Figura R4. Las células que ex- presan l iRNA de CDK1 ad- quieren la marca epigenética PH3. En los discos controles se observa un patrón aleatorio de células teñidas contra la marca epigenética PH3 que marca cé- lulas en fase mitóticas. Cuando las células expresan el iRNA de CDK1 adquieren la marca mi- tótica PH3, indicando que las células mantienen bloqueadas en fase mitóticas.

que las células sufrían el efecto de la expresión de icdk1 en diferentes momentos, implicando otra manera de crecimiento del dominio, adicional al incremento de volumen celular del apartado 2.

Esto lo revisaremos mas adelante.

5) Las células deficientes en función cdk1 se encuentran detenidas en la fase M-G1 del ciclo celular.

Con los datos anteriores de falta de incorporación de BrdU como indicador de que las células no pasan por la fase S del ciclo de celular (Fig.1), y la acumulación de células con la marca mitótica PH3 (Fig.4), nos preguntamos en qué fase del ciclo celular se encuentran. Para ello utilizamos la herramienta Fucci-Fly (Zielke et al. 2014). Esta estirpe de Drosophila tiene dos proteínas de fusión bajo la acción de un promotor

que induce la expresión ubicua de ambas, que nos permitirá saber en cada momento en qué fase del ciclo celular se encuentra cualquier célula de la larva. Una de estas proteínas de fusión posee la proteína fluorescente roja (RFP) junto a la región reguladora de la proteína CycB, y la otra proteína de fusión posee una fusión de la GFP con la región reguladora de la proteína E2F. CycB se encuentra únicamente en la fase G2 del ciclo celular, mientras que E2F se encuentra durante toda las fases del ciclo celular, excepto en la fase S. Así, podemos observar un mosaico de colores en un disco control (Fig.5a-a´´) debido a la proliferación homogénea, excepto en

el borde dorsal ventral donde se encuentra la región no proliferativa descrita en trabajos anteriores (Johnston & Edgar 1998). En cambio, cuando en rn>icdk1 observamos la pérdida de CycB y permanencia de E2f en las células del dominio afectado. Esto implicaría que las células se encuentra entre fase M/G1, lo cual se correlaciona con la falta de marcaje con BrdU (Fig.1) y con el incremento de la marca mitótica PH3 (Fig.4)

6) La inhibición de cdk1 no modifica la expresión de los genes morfogenéticos

Figura 5. El bloqueo proliferativo mediante el iRNA de CDK1 mantiene a las células en fase M-G1. Se observa una distribución homogénea y con niveles heterogéneos de E2F en la región presuntiva de ala, excepto en el borde dorso-ventral donde se acumulan células en fase G1 y G2 (a-a´´). En el caso de células con ciclo celular bloqueado se encuentran en ausencia de ciclina B y con altos niveles de E2F, lo cual, delimita el bloqueo del ciclo celular en fase M-G1 (b-b´´).

wg y dpp

En estos experimentos comprobamos si había cambios en la expresión de wg y dpp mediante el cruce con estirpes que tenían insertados el gen lacZ dentro del marco abierto de lectura (ORF) de ambos genes. Así, se puede observar cómo el patrón de expresión en discos controles es igual rn>

icdk1 bajo la línea rn-GAL4 (Fig.6a-d´)

7) La diferenciación de estructuras adultas en células deficientes en función

cdk1.

Cuando se expresa icdk1bajo rn-Gal4, que se expresa en toda la región del ala excepto en la axila, el patrón de venas es mínimamente afectado y el tamaño de las alas es ligeramente más pequeño (Fig.7a). También se observa un mayor tamaño de los tricomas del ala, lo cual se puede deber a que las células son algo más grandes (Fig.7b, c). La única diferencia significativa es la falta de quetas en la triple fila, muy posiblemente debida a la inhibición de la división celular específica necesaria para diferenciar las quetas (Salle et al. 2012).

En estos experimentos también hemos estudiado el posible efecto de la falta de función de cdk1 en el disco de pata. Cuando se expresa icdk1 bajo dac-Gal4, se inactiva cdk1en la región medial Figura 6. Los morfógenos wg y dpp no cambian ante la falta proliferativa en el dominio especifi- cado por rotund. Se puede observar los patrones silvestre de wg (a-a´) y dpp (c-c´). En los casos que inducimos una parada de proliferación en el dominio especificado por rotund no observamos ningún cambio en el patron de wg (c-c´) ni de dpp (d-d´).

distal (desde la porción final distal del fémur hasta el tarso, Fig.7e). Observamos que, en ambos casos, estructuras dentro de las regiones afectadas se diferencian correctamente en cuanto a su morfología (Fig.7d-e). Como en el caso del ala en rn> icdk1 se observa la pérdida de las quetas en la región afectada (Fig.7a,d,e). El hecho

de que el patrón de venas del ala, las estructuras de las patas y las uniones entre segmentos estén correctamente formadas, implica que la inhibición de cdk1 no produce apenas interferencia con las vías de señalización implicadas en la morfogénesis de los discos imaginales.

8) El bloque proliferativo en

regiones sin restricción de linaje induce el fenómeno de reclutamiento celular para alcanzar el tamaño esperado.

Está descrito por trabajos anteriores (Weigmann et al. 1997; Neufeld et al. 1998) y en nuestros resultados también, que tras un bloqueo proliferativo se produce un incremento de tamaño celular.

La interpretación fue que el incremento de tamaño celular es debido a un mecanismo regulatorio para alcanzar el tamaño apropiado.

Sin embargo, es difícil imaginar que el aumento de tamaño, dentro de los límites permisibles, pudiera ser el único mecanismo de control en situaciones como rn>icdk1 o dll> icdk1 en las que en cerca del 50% del dominio se ha inhibido la división celular.

Debido a esto, pensamos en la posibilidad de que a causa de la falta proliferativa de los dominios tras la expresión de icdk1, células que inicialmente no formarían parte del dominio, se incorporarían a este para que finalmente tenga las proporciones esperadas, es decir, el mecanismo de respuesta Figura 7. El efecto de falta proliferati-

va en los tejidos adultos. El ala adulta presenta un patrón de venas casi nor- mal (a) pero hay mayor número de tri- comas y más grandes (b-b) debido al mayor tamaño de las células en el un ala silvestre (c-c). En la diferenciación de las patas se observa la formación de todos los segmentos y sus uniones. Nó- tese la ausencia de tricomas en las patas en la zona de expresión del iRNA de CDK1(d-f).