BIBLIOTECA DE LA FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA QUIMICA
Evaluación de azúcares reductores y rendimiento de polihidroxibutirato usando Bacillus sp en hidrolizados
enzimáticos de peladilla de espárrago
TESIS
Para optar el Título Profesional de Ingeniero Químico
Autores: Br. Azañedo Vargas, María Del Carmen Br. Tello Cruzado, Bryan Kevin Asesor: Dr. Cruz Monzón, José Alfredo
Trujillo – Perú
2022
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JURADO CALIFICADOR
--- Dr. Quilcat León, Vito Erasmo
PRESIDENTE
MIEMBRO
--- Dr. Cruz Monzón, José Alfredo
ASESOR
--- Dr. Ortiz Linares, Jorge William
SECRETARIO
--- Ms. Vásquez Blas, Carlos
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Dedicatoria
A Dios, porque mediante la fe de mi querida abuelita María, siempre se encarga de darme señales que me regresan al camino correcto de la honestidad, humildad y paciencia.
A mi mamá Flor, que me ha apoyado incondicionalmente toda su vida, siempre estuvo en los momentos más difíciles y me brindo su amor y ánimos para continuar adelante.
A mi padre Dionicio, que a pesar de la distancia se mantiene llenando mi alma de optimismo y fuerzas para hacer frente a cualquier dificultad.
A mi amigo y compañero Bryan, que sin su apoyo, paciencia y comprensión conmigo este trabajo no hubiera podido ser completado.
A mi asesor Dr. José Alfredo Cruz Monzón y al Ing. Anthony Fuentes, por su disposición y paciencia cuando necesitábamos algún consejo o sugerencia para continuar con este trabajo.
Finalmente, pero no menos importante, a todos los miembros del “Laboratorio de Investigación Tecnologías Limpias y/o emergentes”, porque ellos nos han brindado sus conocimientos y su apoyo, pero terminamos encontrando algo más en todos ellos, una gran amistad.
María Del Carmen Azañedo Vargas
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Dedicatoria
Dedico este trabajo en primer lugar a mis padres Moisés Tello y Rosa Cruzado por su apoyo incondicional, por su compresión y paciencia en el trascurso de la elaboración de esta investigación.
A mi asesor el Dr. Cruz Monzón, José Alfredo por dedicarnos su tiempo y dirigirnos en esta labor, así como también al Ing. Anthony Fuentes por su apoyo y orientación a su vez a los integrantes de la pasantía del “Laboratorio de Investigación Tecnologías Limpias y/o emergentes” quienes estuvieron presentes en el periodo de investigación, a todos ellos por brindarnos sus conocimientos y experiencias
A mi amiga y compañera María Del Carmen que sin su entusiasmo y esfuerzo no hubiera sido posible la realización de esta investigación. También a mis amigos más cercanos quienes me aconsejaron y apoyaron emocionalmente para culminar este trabajo.
Bryan Kevin Tello Cruzado
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Agradecimientos
Los autores agradecen a la Universidad Nacional de Trujillo por facilitar la gestión y ejecución del proyecto PIC 08-2014, “Aprovechamiento de Residuos Agroindustriales Regionales en la producción de Plásticos Biodegradables”, dentro de la “III Convocatoria de Proyectos de Investigación Científica y Tecnológica” financiado con recursos de CANON minero, bajo cuyo patrocinio se realizó el presente trabajo de investigación.
De igual manera, los más sinceros agradecimientos para el Dr. José Alfredo Cruz Monzón, asesor de la presente tesis y Ing. Anthony Fuentes por brindar consejos, soporte, supervisión y críticas constructivas en todo momento durante el desarrollo de esta tesis.
Así mismo a Benjamín Honorio, Bryan Roncal, Briguitte Barrios, Juan Alva, Sofía Llontop y Luz Cueva por su apoyo, sus conocimientos y experiencias compartidas, que han sido significativos en el desarrollo de esta tesis.
A toda la familia del “Laboratorio de Investigación Tecnologías Limpias y/o emergentes”, por su sincera amistad, apoyo, motivación, interés y ánimos hacia nosotros porque gracias a ellos pudimos levantarnos cada vez que parecía más lejos la culminación de esta tesis e hicieron que el desarrollo de este trabajo sea agradable y divertido.
Los Autores
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Índice
Dedicatoria ...iii
Dedicatoria ... iv
Agradecimientos ... v
Índice ... vi
Índice de tablas ... xi
Índice de figuras ... xi
Resumen ... xvii
Abstract ... xvii
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN... 1
1.1 Realidad Problemática ... 1
1.2 Antecedentes ... 3
1.3 Marco teórico y conceptual ... 8
1.3.1 Residuos agroindustriales ... 8
1.3.2 Biomasa lignocelulósica ... 9
1.3.2.1Hemicelulosa ... 10
1.3.2.2Celulosas ... 11
1.3.2.3Ligninas ... 11
1.3.3 Peladilla de espárrago ... 12
1.3.4 Aprovechamiento de la biomasa lignocelulósica ... 13
1.3.5 Tipos de pretratamiento a la biomasa ... 14
1.3.5.1Pretratamiento biológico... 15
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1.3.5.2Pretratamiento térmico ... 16
1.3.5.3Pretratamiento físico ... 16
1.3.5.4Pretratamiento químico... 17
1.3.5.4.1 Pretratamiento ácido………..……….18
1.3.5.4.2 Pretratamiento álcali………..……….18
1.3.5.4.3 Pretratamiento organosolv...………..………….19
1.3.6 Hidrólisis enzimática ... 20
1.3.7 Fermentación ... 20
1.3.8 Azúcares reductores ... 21
1.3.9 Bioplásticos ... 21
1.3.9.1Tipos de bioplásticos ... 21
1.3.9.2Polihidroxialcanoatos ... 22
1.3.9.2.1 Estructuras de los PHAs ... 23
1.3.9.2.2 Polihidroxibutirato (PHB) ... 24
1.3.9.2.3 Bacillus sp como productoras de PHA ... 24
1.3.9.3Aplicaciones ... 24
1.4 Problema ... 26
1.5 Hipótesis ... 26
1.6 Objetivos ... 27
1.6.1 Objetivo general ... 27
1.6.2 Objetivos específicos ... 27
1.7 Justificación del problema ... 28
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2.1 Materiales y reactivos ... 29
2.2 Equipos ... 31
2.3 Metodología de trabajo ... 32
2.3.1 Material de estudio ... 32
2.3.2 Acondicionamiento de la peladilla de espárrago ... 32
2.3.3 Pretratamiento de la peladilla de espárrago ... 33
2.3.4 Obtención de azúcares reductores por hidrólisis ... 33
2.3.5 Microorganismo utilizado... 34
2.3.5.1 Reactivación del microorganismo ... 34
2.3.5.2 Curva de calibración de la bacteria B23 ... 35
2.3.6 Preparación del inóculo para la fermentación ... 35
2.3.7 Fermentación ... 36
2.3.8 Recolección de datos ... 36
2.3.8.1 Cuantificación de biomasa... 37
2.3.8.2 Cuantificación de azúcares reductores ... 37
2.3.8.3 Cuantificación e identificación de PHB ... 37
2.3.9 Diseño experimental ... 38
2.4 Análisis de datos ... 41
CAPÍTULO III: RESULTADOS ... 42
3.1 Análisis previo ... 42
3.2 Diseño de plackett-burman con 5 variables ... 43
3.3 Diseño compuesto central ... 50
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3.5 Cuantificación de consumo de azúcares reductores ... 58
3.6 Cuantificación de la producción de biomasa de bacteria ... 59
3.7 Cuantificación e identificación de la production PHB ... 60
3.8 Rendimiento de biomasa en base de sustrato consumido ... 62
3.9 Rendimiento y productividad de PHB obtenido ... 63
CAPÍTULO IV: DISCUSION ... 67
CAPÍTULO V: CONCLUSIONES ... 70
CAPÍTULO VI: RECOMENDACIONES ... 71
CAPÍTULO VII: REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 73
CAPÍTULO VIII: ANEXOS ... 88
Anexo 1: Protocolos de Análisis y curvas de calibración ... 88
8.1.1 Determinación de azúcares reductores por método DNS (Miller) ... 88
8.1.1.1 Procedimiento para analizar las muestras ... 88
8.1.1.2 Procedimiento para elaboración de la curva de calibración ... 89
8.1.2 Cuantificación de producción de biomasa por peso seco ... 90
8.1.2.1 Procedimiento para analizar las muestras ... 90
8.1.2.2 Procedimiento para elaboración de la curva de calibración ... 91
8.1.3 Cuantificación del Polihidroxibutirato usando HPLC ... 92
8.1.3.1 Procedimiento para analizar las muestras ... 92
Anexo 2: Resultados detallados de cada etapa y análisis estadístico ... 94
8.2.1 Datos de Optimización de Pretratamiento ... 94
8.2.1.1 Análisis Previo ... 94
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8.2.1.3 Diseño Compuesto Central ... 102
8.2.2 Datos del proceso de fermentación ... 106
8.2.2.1 Datos del inóculo ... 106
8.2.2.2 Datos de la fermentación ... 106
8.2.2.3 Resultados de la fermentación para la cuantificación de biomasa de bacteria ... 109
8.2.2.4 Resultados de la fermentación para la cuantificación de azúcares reductores ... 111
8.2.2.5 Resultados de la fermentación para la cuantificación de PHB ... 113
8.2.3 Cromatogramas ... 117
Anexo 3: Evidencias fotográficas ... 122
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Índice de tablas
Tabla 1 Copolimeros usando diferentes fuentes de carbono y diferentes tipos de bacterias. ... 4
Tabla 2 Copolimeros usando hidrolizados ácidos o enzimáticos como fuente de carbono ... 6
Tabla 3 Materiales ... 29
Tabla 4 Reactivos ... 30
Tabla 5 Equipos ... 31
Tabla 6 Niveles para la prueba de Plackett-Burman ... 38
Tabla 7 Prueba de Plackett-Burman ... 39
Tabla 8 Niveles del Diseño Experimental para la Fermentación ... 40
Tabla 9 Diseño Experimental 32 ... 40
Tabla 10 Resultados porcentaje de biomasa deslignificada ... 46
Tabla 11 Resultados de la concentración de azúcares reductores después de la hidrólisis ... 47
Tabla 12 Resultados de porcentaje de azúcares reductores ... 48
Tabla 13 Resultados del porcentaje de rendimiento total después de la hidrólisis ... 49
Tabla 14 DCC con 1 repetición ... 50
Tabla 15 Resultados de porcentaje de biomasa deslignificada... 51
Tabla 16 Resultados de las concentraciones de azúcares reductores ... 52
Tabla 17 Resultados de porcentaje de azúcares reductores ... 52
Tabla 18 Resultados de los rendimientos totales promedios ... 53
Tabla 19 Ecuación y variables del Diseño Compuesto Central... 56
Tabla 20 Condiciones de la Optimización del pretratamiento de la peladilla de espárrago ... 57
Tabla 21 Resultados del proceso de escalamiento para obtener azúcares reductores ... 58
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Tabla 23 Datos obtenidos del pretratamiento previo realizado ... 94
Tabla 24 Datos obtenidos de los ensayos con y sin pretratamiento de la hidrólisis enzimatica ... 95
Tabla 25 Datos obtenidos del pretratamiento realizado de la peladilla de espárrago ... 97
Tabla 26 Resultados obtenidos después pretratamiento y el hidrólisis ... 98
Tabla 27 Desviación Estándar y % Error de pretratamiento de la peladilla de espárrago ... 99
Tabla 28 Desviación Estándar y % Error obtenidos después pretratamiento y la hidrólisis .... 99
Tabla 29 Rendimiento total promedio, desviación Estándar y %Error………..100
Tabla 30 Datos obtenidos del pretratamiento de la peladilla de espárrago ... 102
Tabla 31 Resultados obtenidos después pretratamiento y la hidrólisis ... 103
Tabla 32 Desviación Estándar y % Error de pretratamiento de la peladilla de espárrago ... 104
Tabla 33 Desviación Estándar y % Error obtenidos después pretratamiento y la hidrólisis .. 104
Tabla 34 Rendimiento total promedio, desviación Estándar y % Error ... 105
Tabla 35 Medio de cultivo, volumen y concentración de azúcares reductores para inóculo . 106 Tabla 36 Medio de cultivo utilizado para la fermentación ... 107
Tabla 37 Elementos traza utilizados para la fermentación ... 107
Tabla 38 Diseño para el primero bloque 1 de la fermentación ... 108
Tabla 39 Diseño para el primero bloque 2 de la fermentación ... 108
Tabla 40 Diseño para el primero bloque 3 de la fermentación ... 109
Tabla 41 Resultados: desviación estándar y %Error de dosis de inóculo de 0.255 g/L ... 109
Tabla 42 Resultados: desviación estándar y %Error de dosis de inóculo de 0.509 g/L ... 110
Tabla 43 Resultados: desviación estándar y %Error de dosis de inóculo de 0.75 g/L ... 110
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Tabla 44 Resultados: desviación estándar y %Error de la concentración de AR de 0.255 g/L ... 111 Tabla 45 Resultados: desviación estándar y %Error de la concentración de AR de 0.509 g/L ... 112 Tabla 46 Resultados: desviación estándar y %Error de la concentración de AR de 0.750 g/L ... 112 Tabla 47 Resultados: desviación estándar y %Error de Acumulación de PHB de 0.255 g/L 113 Tabla 48 Resultados: desviación estándar y %Error de Acumulación de PHB de 0.509 g/L 114 Tabla 49 Resultados: desviación estándar y %Error de Acumulación de PHB de 0.75 g/L .. 114 Tabla 50 Resultados de Qs, Qp y Concentración de PHB ... 115 Tabla 51 Resultados de rendimientoYx/s, Yp/s, Yp/x ... 116
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Índice de figuras
Figura 1 Estructura de la Hemicelulosa ... 10
Figura 2 Estructura de la celulosa... 11
Figura 3 Estructura de la lignina... 12
Figura 4 Categorías de procesos de pretratamiento de biomasa ... 14
Figura 5 Esquema del pretratamiento de biomasa lignocelulósica... 15
Figura 6 Estructura general de polihidroxialcanoatos ... 23
Figura 7 Rendimiento de azúcares reductores con pretratamiento y sin pretratamiento ... 42
Figura 8 Porcentajes de rendimiento total ... 44
Figura 9 Gráfica de Pareto para %Rendimiento ... 45
Figura 10 Gráfica de Superficie de respuesta para %Rendimiento Total ... 54
Figura 11 Gráfica de Superficie de respuesta para %Rendimiento Total ... 55
Figura 12 Promedio de sustrato (%) ... 59
Figura 13 Promedio de biomasa de bacteria en g/L ... 60
Figura 14 Promedio de PHB (%) ... 61
Figura 15 Rendimiento de biomasa de bacteria: Sustrato consumido por biomasa de bacteria 62 Figura 16 Consumo Volumétrico (Qs) ... 63
Figura 17 Gramos de PHB producidos por gramos de sustrato consumido ... 64
Figura 18 Gramos de PHB producido por gramos de biomasa de bacteria producida ... 64
Figura 19 Gramos de PHB producido por litro de fermentación realizada ... 65
Figura 20 Gramos de PHB producido por litro de fermentación realizada ... 66
Figura 21 Muestras analizadas para azúcares reductores y Espectrofotómetro UV-Vis. ... 88
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Figura 23 Efectos estimados de la hidrólisis enzimática de la peladilla de espárrago ... 101
Figura 24 Resultados de los Cromatogramas realizados ... 117
Figura 25 Peladilla de espárrago donado por la compañía Danper. ... 122
Figura 26 Acondicionamiento de la peladilla de espárrago ... 122
Figura 27 Pretratamiento con Etóxido de Sodio ... 123
Figura 28 Hidrólisis Enzimática ... 124
Figura 29 Escalamiento del pretratamiento de Peladilla de espárrago. ... 125
Figura 30 Reactivación del microorganismo, Bacteria B23 ... 126
Figura 31 Calibración de biomasa de bacteria... 127
Figura 32 Incubación del inóculo y fermentación ... 128
Figura 33 Cuantificación de biomasa de bacteria y PHB ... 129
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Resumen
La producción de biopolímeros se muestra como una alternativa viable para la sustitución de los plásticos tradicionales que actualmente es uno de los problemas globales importantes. Sin embargo, el reto consiste en buscar nuevas vías y fuentes económicas para la producción de los mismos. En ese sentido, se propuso evaluar la influencia de la concentración de azúcares reductores, obtenidos de la hidrólisis enzimática de peladilla de espárrago, en la producción de polihidroxibutirato a través de una fermentación bacteriana usando Bacillus sp. Para la optimización de las condiciones de pretratamiento se aplicó un diseño de Plackett-Burman y compuesto central para determinar los factores más importantes en la remoción de lignina. Para evaluar la influencia de la concentración de azúcares reductores y dosis de inóculo sobre la producción de PHB se aplicó un diseño experimental del 3*2. Los resultados muestran que las mejores condiciones de pretratamiento de eliminación de lignina se logra usando una concentración de NaOH del 2% en etanol, con un 5% de sólido respecto al líquido, a una temperatura de 93,5 °C y con un tiempo de 5 min en autoclave, mientras que las mejores condiciones de producción de PHB es usando una concentración de azúcares reductores de 15 g/L, con una dosis de inóculo de Bacillus sp de 0,75 g/L alcanzando una producción de 72,11 mg PHB/L y una producción volumétrica de 1 mg PHB/L.h.
Palabras Clave: Peladilla de espárrago, hidrolizado, Bacillus sp, PHB, fermentación,
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Abstract
The production of biopolymers is shown as a viable alternative for the substitution of traditional plastics, which is currently one of the important global problems. However, the challenge is to find new ways and economic sources for their production. In this sense, it was proposed to evaluate the influence of the concentration of reducing sugars, obtained from the enzymatic hydrolysis of asparagus peel, in the production of polyhydroxybutyrate through a bacterial fermentation using Bacillus sp. For the optimization of the pretreatment conditions, a Plackett- Burman and Central Compound design was applied to determine the most important factors in lignin removal. To evaluate the influence of reducing sugar concentration and microorganism dose on PHB production, an experimental design of 3*2 was applied. The results show that the best pretreatment conditions for lignin removal are achieved using a NaOH concentration of 2%
in ethanol, with 5% solid relative to the liquid, at a temperature of 93,5 ° C and with a time of 5 min in an autoclave, while the best PHB production conditions are using a reducing sugar concentration of 15 g / L, with a Bacillus sp dose of 0,75 g / L reaching a production of 72., mg PHB / L and a volumetric production of 1 mg PHB / L.h.
Key Words: Asparagus peladilla, hydrolyzate, Bacillus sp, PHB, fermentation
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CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN
1.1 Realidad Problemática
Debido al aumento exponencial de la población mundial hasta la actualidad, la demanda mundial de petróleo, nuestro principal recurso fósil para producir energía, productos químicos y materiales aumenta constantemente, se espera que los precios del petróleo sigan aumentando aún más. La producción desmedida de plásticos a base de petróleo demanda alternativas sostenibles a partir de recursos renovables (Pathak et al., 2014;
Jain and Tiwari, 2015; Emadian et al., 2017). Los plásticos a base de combustibles fósiles derivados del petróleo están respaldados por un recurso natural muy limitado (Rodriguez-Perez et al., 2018).
Las alternativas llamadas bioplásticos evolucionaron durante el desarrollo de los recursos renovables. La utilización de recursos renovables como los desechos agrícolas (en lugar de las fuentes de petróleo) y su biodegradabilidad en diferentes entornos permitió que estos polímeros fueran más fácilmente aceptables que los plásticos convencionales (Emadian et al., 2017). Además, los biopolímeros pueden reducir el impacto ambiental derivado de la eliminación de residuos plásticos debido al hecho de que el tiempo de biodegradación de los biopolímeros en la superficie del terreno en condiciones estándar es de aproximadamente dos meses (Hassan et al., 2013;
Rodriguez-Perez et al., 2018).
Dentro de los bioplásticos se encuentran los polihidroxialcanoatos (PHA) que son polímeros de base biológica con propiedades que se parecen mucho a las propiedades de los plásticos sintéticos. Los plásticos sintéticos similares a los PHA son
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termoplásticos moldeables, y podrían estar hechos a medida para una serie de aplicaciones que varían desde material de embalaje rígido hasta materiales altamente elásticos utilizados como recubrimientos. Los PHA son producidos naturalmente por ciertos microorganismos y plantas transgénicas (Aarthi and Ramana, 2011; Kaur et al., 2017). Los plásticos biodegradables como los polihidroxialcanoatos (PHAs) son más prometedores debido a su biodegradabilidad inherente, sostenibilidad y propiedades amigables con el medio ambiente. Los PHA son polímeros 100% biodegradables (Anjum et al, 2016). Mientras que el PHB es resistente a las radiaciones ultravioletas, insoluble en agua e impermeable al oxígeno. Estos atributos hacen de PHB un material adecuado para el uso de envasado de alimentos (Aarthi and Ramana, 2011; Kaur et al., 2017).
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1.2 Antecedentes
El PHA también se puede producir por fermentación utilizando materias primas económicas, lo que hace que su producción comercial sea económicamente factible (Ghate et al. 2011; Gowda, 2014).
Anjum, Zuber, Zia, Noreen, Anjum y Tabasum (2016), según su investigación, se ha utilizado una gran variedad de sustratos para la producción de PHA, de los cuales se tomaron en cuenta subproductos industriales, grasas y aceites, materias primas lignocelulósicas, materiales de desecho domésticos de tierras agrícolas, glicerol, azúcares y aguas residuales. En la Tabla 1 se mencionan algunos copolímeros obtenidos de diferentes fuentes de carbono y diferentes tipos de bacterias.
Khiyami, Fadual y Bahklia, (2011); Chookietawattana y Khonsarn, (2011); Ghate, Pandit, Kulkarni, Deepti, Mungi, y Patel, (2011); Sangkharak, y Prasertsan (2012);
Gowda y Shivakumar (2014) Mohapatra, Maity, Dash, Das, Pattnaik, Rath y Samantaray, (2017); Según los autores, existen varias fuentes de carbono de bajo costo como la melaza de caña de azúcar, la melaza de remolacha, el jarabe de dátiles, el suero y el lodo activado se usan con mayor frecuencia para la producción de PHA. En la Tabla 2 se muestran algunos copolímeros obtenidos a partir de hidrolizados ácidos o enzimáticos como fuente de carbono.
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Tabla 1
Copolímeros usando diferentes fuentes de carbono y diferentes tipos de bacterias.
N° Tipo de PHA Tipo de
Bacteria
Tipo de Fuente
de sustrato T (°C) t (h) RPM pH
Concentración de
PHA Referencias
Bibliográficas
g/L %DCW
1 Poly-[®-3-hydroxybutyric acid](PHB)
Bacillus firmus
NII 0830 Glicerol crudo 30 48 200 NE 1,34 Althuri et al., 2013
2 Poly(3-hydroxybutyrate) Bacillus sp.
SV13
Piña y caña de
azúcar 37 10 a
12 200 6,0 a
6,.5 1,86 Suwannasing et al., 2015
3
Poly(3-hydroxybutyrate-co-3- hydroxyvalerate)[poly(3HB-co-
3HV)]
Bacillus cereus
FA11 Glucosa 30 48 150 7,0 3,10 Masood et al., 2012
4 P(3HB-co-3HV)
Bacillus circulans MTCC
8167
Dextrosa 37 72 180 7,0 5,10 x10^4 Da (Masa
Molecular del PHA) Phukon et al., 2012
5 PHB
Bacillus thuringiensis
KSADL127
Medio Complejo de Nitrógeno
Limitado
37 96 NE NE 137,00
mg/L Alarfaj et al. 2015
6 PHA
Bacillus megaterium
SRKP-3
Residuos lácteos 37 36 NE 7,0 11,30 Ram Kumar Pandian
et al., 2010
7 PHA B.thuringiensis
IAM 12077
Hidrolizado ácido de Almidón
37 48 120 7,5 2,80 Gowda y
Shivakumar, 2014
8 PHA B.thuringiensis
IAM 12077
Hidrolizado ácido de Piel de
mango
37 48 120 7,5 4,03 Gowda y
Shivakumar, 2014
9 PHA B.thuringiensis
IAM 12077
Hidrolizado
ácido de Pajilla 37 48 120 7,5 4,53 Gowda y
Shivakumar, 2014
10 PHA B.thuringiensis
IAM 12077
Hidrolizado ácido de Polvo de semillas de
fruta Jaca
37 48 120 7,5 3,93 Gowda y
Shivakumar, 2014
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11 PHB
BNPI-92 Glucosa 37 48 NE 7,0 0,0096
2019
12 PHAs Bacillus
aryabhattai
Sucrosa, glucosa
y fructosa 35 24 200 7,0 1,74 57,62 Tanamool et al., 2013
13 PHB-3HHX Bacillus cereus Glucosa 30 72 125 NE 0,44 13,77 Vijaya Abinaya et al,
2012
14 PHB Bacillus
licheniformis Glucosa 37 96 125 7,0 53,01 Dash et al, 2014
15 PHB
Bacillus megaterium
uyuni S29
Glucosa 35 24 120 6,7 70,00 Rodriguez-Contreras
et al, 2013
16 PHB Bacillus
mycoides DFC1 Glucosa 37 48 140 7,3 3,32 76,36 Ramana y
Narayanan, 2012
17 PHA
Bacillus thuringiensis
SBC4
Glucosa / elote 37 48 NE 7,0 44,96 Odeniyi et al., 2017
18 PHB
Bacillus megaterium
SRKP-3
Salvado de arroz
y agua de mar 36 36 NE 9,0 11,32 RamKumar Pandian
et al., 2010
19 PHB Bacillus subtilis
NG220
Aguas residuales de la industria
azucarera suplementadas
con maltosa y sulfato de
amonio
30 72 NE 4,2 a 6,9 5,29 51.8%
(w/w) Singh et al, 2011
20 PHB Bacillus cereus
PS 10
Hidrolizado de
Paja de arroz 30 24 150 6,0 a 8,0 10,61 23,30 Sharma et al., 2015
21 PHB Bacillus firmus
NII 0830
Licor negro pretratado con
ácido
30 90 NE NE 1,70 89,00 Sindhu et al., 2013
22 PHB Bacillus cereus
suaeda B-001
Hidrolizado acido de manojo
de frutas de palma aceitera
30 12 a
96 150 NE NE 55,40 Yustinah et al,
2019
Nota. Información recopilada de varias fuentes bibliográficas. Dónde: T= temperatura, t= tiempo, NE= No especifica.
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Tabla 2
Copolímeros usando hidrolizados ácidos o enzimáticos como fuente de carbono
N°
Tipo de PHA
Tipo de
Bacteria Tipo de sustrato
Concentración de Azúcares
Reductores (g/L)
Composición de los Azúcares Reductores
Tipo de Fuente de Nitrógeno
T
(°C) t (h) RPM pH Concentración de PHA
Referencias Bibliográficas
1 PHB
Ralstonia eutropha NCIMB 11599
Hidrolizado de salvado
de trigo 62,91 Glucosa (48,35 g/L) / Xylosa
(15,56 g/L) (NH4)2SO4 30,0 72 150 6,8 24,50 g/L Annamalai et al., 2016
2 PHB
MMCs (mixed Microbial
culture)
Hidrolizado de álamo
híbrido 30,00
Glucosa (18,00g/L) / Xylosa
(8,20g/L) /
galactosa+arabinosa+manosa (3,80g/L)
NE 22,0 20 300 7,0 27,00% CDW Dai et al., 2015
3 PHA Cupriavidus sp. KKU38
Hidrolizado de almidón
de yuca 20,00 Azúcares reductores (198,08
g/L) / Glucosa (159,06g/L) (NH4)2SO4 30,0 48 NE 7,0 61,60% DCW Poomipuk et al., 2014 4 PHB Cupriavidus
necator
Hidrolizado de Jacinto de
agua 35,00 NE (NH4)2SO4 27,5 72 120 7,0 4,30 g/L Radhika et
al., 2012 5 PHB
Bacillus cereus suaeda
B-001
Hidrolizado acido de Manojo de frutas de
palma aceitera
20,00 Xilosa 30,35 g/L / Glucosa
4,85 g/L (NH4)2SO4 30,0 12 a 96 150 NE 55,4% DCW Yustinah et al, 2019 6 PHB Bacillus
cereus PS 10
Hidrolizado de Paja de arroz
28%, w/v,
(20–35 ml/L) NE NH4Cl 30,0 24 150 6,0 a
8,0
10,61 g/L / 23,3%DCW
Sharma et al., 2015
7 PHA B.thuringiensis IAM 12077
Hidrolizado ácido de
Almidón 10,00 NE (NH4)2SO4 37,0 48 120 7,05 2,80 g/L
Gowda y Shivakumar, 2014 Hidrolizado ácido de Piel
de mango 10,00 NE (NH4)2SO5 37,0 48 120 7,5 4,03 g/L
Gowda y Shivakumar, 2014 Hidrolizado ácido de
Pajilla 10,00 NE (NH4)2SO6 37,0 48 120 7,5 4,53 g/L
Gowda y Shivakumar, 2014 Hidrolizado ácido de
Polvo de semillas de fruta Jaca
10,00 NE (NH4)2SO7 37,0 48 120 7,5 3,93 g/L
Gowda y Shivakumar, 2014
Nota. Información recopilada de varias fuentes bibliográficas. Dónde: T= temperatura, t= tiempo, NE= No especifica
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Gowda y Shivakumar (2014); se afirma que, la economía del proceso revela que el uso de sustratos de carbono económicos y renovables, como los desechos y subproductos agroindustriales como materia prima, puede contribuir a una reducción de hasta un 40- 50% en el costo total de producción.
Chavez y Rojas (2019); según los resultados de su investigación sobre la composición de peladilla de espárrago, se encontró que: el 32% es celulosa; 17%, hemicelulosa; 12%, Lignina insoluble y 2%, lignina soluble total.
Hosseini, Koupaie, Dahadha, Bazyar, Lakeh, Azizi y Elbeshbishy, (2018); en este artículo, se explica que el pretratamiento químico generalmente está asociado con la tasa de pretratamiento más alta pero el sustancial consumo de químicos asociados con altos costos y preocupaciones ambientales es la mayor desventaja de métodos de pretratamiento químico.
Por otro lado, Mendoza y Azabache (2018), usando pretratamiento con alcóxidos se reporta que, trabajando con paja de arroz al 3% p/v (concentración de EtONa) y 100°C obtuvieron un porcentaje de recuperación de celulosa es de 75.8%.
Alarfaj, Arshad, Sholkamy y Munusamy, (2015); en esta investigación, encontraron que una serie de bacterias como Azetobacter, Bacillus, Archaebacteria, Methylobacteria y Pseudomonas acumulan PHB a niveles variables. Se sabe que más de 300 de esas especies producen PHB.
Alarfaj, Arshad, Sholkamy y Munusamy, (2015); Ghate, Pandit, Kulkarni, Deepti, Mungi, y Patel (2011); mostraron que Bacillus cereus, Bacillus subtillis, B. megaterium
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han demostrado producir mayores cantidades de PHB utilizando desechos agroindustriales con un nivel variable de fuentes de carbono.
Mohapatra, Maity, Dash, Das, Pattnaik, Rath, y Samantaray, (2017); mencionan que las especies de Bacillus son bien reconocidas por su capacidad para hidrolizar almidón en azúcares simples como maltosa y glucosa mediante la amilasa y la enzima pullulanasas, favoreciendo el crecimiento y la producción de PHA.
1.3 Marco teórico y conceptual 1.3.1 Residuos agroindustriales
Los residuos agroindustriales son materias orgánicas generadas en un proceso productivo y generalmente no son de utilidad posterior como materia prima para la cadena de producción (Vargas y Pérez, 2018). Además, a través de una tecnología limpia, se pueden reciclar mediante la utilización integrada de desechos o simplemente devolverse al lugar de origen, la naturaleza. (Poonsuk Prasertan, Suteera Prasertan y Aran, H-kittikun). Estos residuos consisten principalmente en melazas, cáscaras, bagazo, semillas, hojas, tallos, paja, pulpas, etc. (Sadh, Duhan y Duhan, 2018).
Tomando en cuenta el Reporte de Comercio Regional La Libertad (2018), los residuos agroindustriales provienen principalmente de las frutas y verduras:
arándanos frescos, paltas frescas, espárragos frescos y en conserva, alcachofas en conserva, uvas frescas, pimiento piquillo y demás alimentos balanceados. Según Promperú (2016) las principales empresas agropecuarias exportadoras de nuestra
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región fueron la Sociedad Agrícola Viru S.A, Camposol S.A., Danper Trujillo S.A.C, VitaPro S.A. y La Joya S.A.C. que tienen en común la mayor producción de residuos agroindustriales como bagazo de caña de azúcar, cascarilla de arroz y trigo, broza y brácteas de alcachofa, broza y peladilla de espárrago, entre otros.
1.3.2 Biomasa lignocelulósica
Los materiales Lignocelulósicos provienen principalmente de residuos agrícolas por su contenido elevado de celulosa y hemicelulosa (Arenas-Cárdenas, 2017), son recursos naturales, renovables, fácilmente disponibles, amigables con el medio ambiente, biodegradables y de bajo costo con características ventajosas y tienen una importancia significativa para el sector industrial (Fortunati, Mazzaglia y Balestra, 2019). El biomaterial lignocelulósico residual agroindustrial proporciona una fuente biológica natural renovable y económica para la producción rentable de biocombustibles a gran escala, así como la producción de productos químicos a granel finos, que pueden incluir biocatalizadores industriales (Unuofin, Okoh, & Nwodo, 2018).
Cada año, los desechos agroindustriales ricos en biomasa se producen en grandes cantidades (miles de millones de toneladas) en todo el mundo, pero la mayoría de estos simplemente se desechan o se queman (Hassan, Williams, & Jaiswal, 2018).
La mayor parte de la biomasa vegetal de bajo valor se llama lignocelulósica, y se refiere a los principales biopolímeros constituyentes, que son la celulosa, la hemicelulosa y la lignina (Hafemanna, Battistib, & Maran, 2019).
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También es sabido que las variabilidades de características de residuos agroindustriales dependen de la materia prima y del proceso que los generó, sin embargo, parte de su composición química es similar y son denominados como residuos orgánicos (Burga, 2018).
1.3.2.1 Hemicelulosa
La hemicelulosa tiene una estructura amorfa aleatoria con poca fuerza, además, consiste en polímeros cortos y ramificados (Vishaha et all, 2012).
La hemicelulosa es un polisacárido que está formado por pentosas y hexosas.
Las pentosas se pueden tipificar como xilosas y arabinosas mientras que las hexosas en glucosas, manosa y galactosa (Figura 1). En menor medida podemos encontrar ácidos urónicos como 4-OMetilglucurónico, D- Glucurónico, y D-Galacturónico (Munguia Aguilar, 2016).
Figura 1
Estructura de la Hemicelulosa
Nota. Extraído de Vishaha et all, 2012.
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1.3.2.2 Celulosas
La celulosa es un polisacárido orgánico con la fórmula (C6H10O5)n, formado por una cadena lineal de varios cientos e incluso más de diez mil unidades de D-glucosa unidas por el enlace β (1→4) (Figura 2). La celulosa es un componente estructural esencial de las paredes celulares en las plantas superiores y es el polímero orgánico más abundante en la tierra. Muchas moléculas de celulosa paralelas forman microfibrillas debido a que están unidas mediante puentes de hidrógeno y fuerzas de Van de Walls; por lo tanto, tiene regiones cristalinas que son mecánicamente fuertes y altamente resistentes al ataque enzimático, son menos degradables y solubles (Vishaha et all, 2012).
Figura 2
Estructura de la celulosa.
Nota. Extraído de Vishaha et all, 2012.
1.3.2.3 Ligninas
La lignina es el compuesto orgánico más abundante después de la celulosa.
Además, la lignina es insoluble en agua y se considera un material ópticamente inerte que se ha demostrado que solo se disuelve en agua a temperaturas
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elevadas (a partir de 180 ° C) (Hosseini, Dahadha, Bazyar Lakeh, Azizi, &
Elbeshbishy, 2018).
Por lo general, la lignina resulta ser la fracción más compleja y más pequeña (Figura 3), que representa alrededor del 10% al 25% de la biomasa (Shahzadi et al, 2014).
Figura 3
Estructura de la lignina
Nota. Extraído de Zahed et al, 2018.
1.3.3 Peladilla de espárrago
El espárrago (Asparagus officinalis L.) es un vegetal herbáceo bajo en calorías, nutricional y comercialmente importante, perteneciente a la familia Asparagaceae (Chitrakara, Zhang, & Adhikari, 2019).
La peladilla de espárrago es un subproducto crudo de las plantas conserveras que procesan el espárrago, este subproducto es usualmente usado como alimento de ganado al cual se enriquece con proteínas (Bardales, y otros, 2011).
La región La libertad posee 20 mil hectáreas que son trabajadas por las empresas agroindustriales en la producción de espárrago verde y espárrago blanco,
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pimiento piquillo y morrón, alcachofa, palta, mango, uva, papaya andina y criolla, granos andinos y arándanos (IPEH, 2015). El espárrago es uno de los diez vegetales más famosos del mundo y es considerado el "rey de las verduras", debido a su sabor delicado y a un contenido relativamente más alto de aminoácidos, proteínas y vitaminas que otras frutas y verduras (Chen et al, 2014).
Desde la década de los ochenta hubo un incrementó en la producción de Asparagus officinalis “espárrago” en nuestro país, gracias a que los precios se volvieron más atractivos en el mercado, empezó a aumentar las superficies de sembrado, además de aparecer nuevas plantas procesadoras incrementándose también la producción de peladilla. La peladilla se puede usar de varias maneras, incluso para la alimentación animal, la fabricación de pasta y papel, y para producir bioenergía (Chen et al, 2014).
1.3.4 Aprovechamiento de la biomasa lignocelulósica
La variedad residuos agroindustriales que aparecen disponibles, se presentan como alternativa para la producción de compost y bioenergéticos. Sin embargo, en un menor nivel de aprovechamiento estos sirven como alimento para animales, para fabricación de bloques o ladrillos y otros productos de interés con un valor agregado (Vargas y Pérez, 2018).
La biomasa siempre fue un recurso energético muy utilizado, tradicionalmente como leña o carbón sin una transformación previa muy sofisticada (Martínez, 2013).
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1.3.5 Tipos de pretratamiento a la biomasa
Los métodos de pretratamiento (Figura 4) se pueden agrupar en físicos, fisicoquímicos, químicos, biológicos y procesos que combinan estos métodos.
Figura 4
Categorías de procesos de pretratamiento de biomasa
Nota. Recuperado de Mupondwa, Lia, Tabilb, Sokhansanj, & Adapae, 2017.
PRETRATAIENTO
Físico
Reduccion de tamaño
Microondas o alta reducción de energía
Explosión de catalizador sin catalizar
Físico- químico
Explosión catalizada
Álcali de microondas
Agua caliente liquida
Químico
Ácido o alcalino
Solventes organicos
Liquidos iónicos
Biológico Microorganismos
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En la Figura 5, se observa el efecto del pretratamiento en la biomasa lignocelulósica y la remoción de la lignina y la hemicelulosa.
Figura 5
Esquema del pretratamiento de biomasa lignocelulósica
Nota. Recuperado de Mosier, y otros, 2005.
1.3.5.1 Pretratamiento biológico
El pretratamiento biológico implica el uso de microorganismos naturales que poseen enzimas capaces de construir la pared celular de la biomasa lignocelulósica. Estos microorganismos incluyen hongos marrones, hongos blancos y de podredumbre blanda, y bacterias (Mupondwa, Lia, Tabilb, Sokhansanj, & Adapae, 2017). Estos métodos han tenido mucho éxito en la reducción del grado de polimerización de celulosa, en la hidrólisis de la hemicelulosa (Hosseini, Dahadha, Bazyar Lakeh, Azizi, & Elbeshbishy, 2018).
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1.3.5.2 Pretratamiento térmico
En el caso del pretratamiento térmico, la energía térmica romperá los enlaces de hidrógeno en la estructura cristalina de la celulosa y la lignocelulosa, exponiendo y aumentando así las áreas de superficie accesibles para el funcionamiento de microorganismos y enzimas. Durante los procesos térmicos, una parte de la hemicelulosa se hidroliza y forma ácidos. Se supone que estos ácidos catalizan la hidrólisis adicional de la hemicelulosa (Hosseini, Dahadha, Bazyar Lakeh, Azizi, & Elbeshbishy, 2018).
1.3.5.3 Pretratamiento físico
El pretratamiento físico puro no utiliza productos químicos. La reducción de tamaño mediante métodos mecánicos, una de ellas es el corte, a través de la cual se aumenta la superficie de la biomasa lignocelulósica y la cristalinidad de la celulosa también pueden disminuir en cierta medida en condiciones de molienda ultrafinas (Liu, y otros, 2019).
Los métodos de pretratamiento físico incluyen mecánicos (p. Ej., Rectificado, desbastado, fresado, fresado con cuchilla y corte con tijera), irradiación con microondas, irradiación con ultrasonido de baja frecuencia, explosión de vapor y tratamientos con agua caliente líquida (Kumar, Duc, & Dharmaraja, 2018).
Sin embargo, la mayoría de los métodos aplicados no pueden eliminar la lignina (Hosseini, et al, 2018).
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Además, los pretratamientos de irradiación con ultrasonido y microondas tienen una serie de deméritos y estos pueden resumirse en términos de insensibilidad energética, producción de posibles ácidos fenólicos inhibidores como subproductos, procedimientos de operación complejos y monitoreo estricto de equipos, que limitan colectivamente sus aplicaciones comerciales (Kumar, Duc, & Dharmaraja, 2018).
1.3.5.4 Pretratamiento químico
Los métodos químicos han demostrado ser muy efectivos no solo para aumentar el área de superficie accesible de la biomasa lignocelulósica, sino también porque pueden proporcionar una de significación parcial a completa.
También se puede lograr la disminución significativa en la cristalinidad de la celulosa, así como la solubilización parcial o completa de las hemicelulosas. El pretratamiento químico generalmente se asocia con la tasa de pretratamiento más alta. Los importantes consumos químicos asociados con los altos costos y las preocupaciones ambientales es la mayor desventaja de los métodos de pretratamiento químico (Hosseini, et al, 2018).
Utilizando ácidos fuertes (HCl, H2SO4 y HNO3), álcalis (NaOH, KOH, Ca(OH)2, amoníaco e hidrazina), solventes orgánicos (benceno, éter, ciclo hexano, hexano, etanol y metanol), ozono (O3) y líquidos iónicos, se sabe que los métodos de pretratamiento químico tienen efectos positivos significativos en la estructura nativa de la biomasa lignocelulósica (Kumar, Duc, &
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Dharmaraja, 2018). Dentro del pretratamiento químico se encuentran los subtipos de pretratamiento ácido y álcali, solventes orgánicos (Mupondwa, Lia, Tabilb, Sokhansanj, & Adapae, 2017).
1.3.5.4.1 Pretratamiento ácido
El pretratamiento con ácido diluido utilizando H2SO4 es uno de los métodos de pretratamiento químico más utilizados, esto se a que se considera tiene una alta recuperación (80-90%) de azúcares de hemicelulosa (Saha, Iten LB, Cotta, & Wu, 2005; Mupondwa, Lia, Tabilb, Sokhansanj, & Adapae, 2017).
1.3.5.4.2 Pretratamiento álcali
El pretratamiento alcalino suele tener características deseables que resultan favorables, estos métodos alcalinos utilizan en productos químicos no contaminantes y no corrosivos como el hidróxido de sodio, carbonato de sodio e hidróxido de calcio (cal) y amoníaco (acuoso, líquido y gaseoso). Además de que dicho pretratamiento se realiza bajo condiciones más suaves que el pretratamiento con ácido (Kim, Lee &
kim, 2015).
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1.3.5.4.3 Pretratamiento organosolv
El método de solución orgánica ha atraído la atención y ha demostrado potencial para la utilización en el tratamiento no celulósico (Behera, Arora, Nandhagopal, & Kumar, 2014). Este método implica el uso de disolventes orgánicos como etanol, metanol, acetona, etilenglicol y fenol, y se denominan colectivamente procesos de organosolución porque disuelven la lignina que se recupera durante la etapa organofílica (Mupondwa, Lia, Tabilb, Sokhansanj, & Adapae, 2017).
El solvente permite disminuir la severidad de las condiciones de reacción. Se puede obtener lignina libre de azufre con alta pureza y bajo peso molecular apto para la fabricación de bioplásticos (Brodin, Vallejos, Tanase, Area, & Chinga-Carrascp, 2017).
1.3.5.4.4 Pretratamiento usando alcóxidos
Teóricamente hablando, el pretratamiento CH3ONa, CH3OK y C2H5ONa, que funciona como una combinación de álcalis y solventes orgánicos, puede tener un mejor efecto en la eliminación de lignina y mejorar la eficiencia enzimática que el tratamiento previo con álcalis u organosolv solo. Sin embargo, aún no se han publicado muchos informes al respecto de este método de pretratamiento (Huang, y otros, 2016).
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1.3.6 Hidrólisis enzimática
La hidrólisis enzimática resulta ser una operación unitaria donde se da un proceso de conversión de lignocelulosa para despolimerizar la biomasa, usando enzimas. La hidrólisis enzimática ofrece muchas ventajas, que incluyen mayores concentraciones de azúcar y etanol y menores costos operativos (Modenbach &
Nokes, 2013).
1.3.7 Fermentación
La fermentación se puede definir como un proceso biológico de oxidación incompleta por el cual un microorganismo obtiene energía para su desarrollo a partir del consumo de fuentes de carbono (Harris, 2012). Los PHAs se producen bajo condiciones controladas de valor de tensión de oxígeno disuelto, temperatura y PH en biorreactores ("fermentadores") que pueden ser de diferentes tamaños y tipos (Koller, 2018).
Las fermentaciones pueden ser naturales, producto de las condiciones ambientales que permite a los microorganismos interactuar con sustratos orgánicos susceptibles; la fermentación también puede ser artificial, cuando el hombre propicia las condiciones necesarias para su realización (Reyes, 198 Neira, 2012).
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1.3.8 Azúcares reductores
Los azúcares reductores son aquellos que en su estructura principal poseen su grupo carbonilo (grupo funcional) intacto (como ejemplos tenemos: lactosa, glucosa, galactosa, fructosa, manosa, maltosa) y que a través de estos reaccionan con otras moléculas; mientras que los azúcares no reductores, no poseen su grupo carbonilo libre, entre estos tenemos sacarosa y trehalosa (Pilatasig & Mayra, 2015).
1.3.9 Bioplásticos
Los bioplásticos, son funcionalmente similares a los plásticos sintéticos, pero además ambientalmente sostenibles. Como cualquier otro material polimérico, la degradabilidad de los bioplásticos está determinados por factor de su composición, grado de cristalinidad y factores ambientales, los cuales conlleva a tiempos de degradación que van desde varios días hasta varios años (Atiwesh, Mikhael, Banoub, & Le, 2021).
1.3.9.1 Tipos de bioplásticos
Los bioplásticos se clasifican principalmente en función de su biodegradabilidad, tipo de estructura de monómero y fuente de materias primas utilizadas. Según la estructura del monómero, los bioplásticos también se pueden dividir en tres categorías diferentes, a saber. Copolímeros de longitud de cadena corta (SCL), longitud de cadena media (MCL) y PHB que contienen
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monómeros de bioplásticos de longitud de cadena corta y longitud de cadena media (SCL-MCL) (Tripathi et al., 2012).
Un tercer enfoque para la clasificación de los bioplásticos se basa en la materia prima utilizada para su producción. Los tipos de bioplásticos comúnmente utilizados se basan en celulosa, almidón, glucosa y aceite, etc (Kaur, Khajuria, Parihar y Singh, 2017). También se debe considerar a los polímeros producidos por síntesis química a partir de monómeros bioderivados y monómeros a base de petróleo (por ejemplo, poli (succinato de butileno) o PBS; poli (tereftalato de trimetileno) o PTT) (Robertson, 2008; Mittal, 2012; Byun yTeck, 2014).
1.3.9.2 Polihidroxialcanoatos
Los polihidroxialcanoatos o PHA son biopoliésteres sintetizados intracelularmente por ciertos microorganismos como reserva de energía y carbono, los cuales al ser extraídos de la célula se detectan propiedades físicas similares a los plásticos que tradicionalmente provienen del petróleo.
(Gonzáles, Meza, Gonzalés y Córdova, 2013). Los PHA tienen un amplio espectro de monómeros que proporcionan al PHA propiedades variables y distintas. Entre ellos, el poli (D-3-hidroxibutirato) (PHB) es el más estudiado (Byun y Teck, 2014).
Entre los biopolímeros más estudiados que incluyen PHAs, ácido poliláctico (PLA), poli (succinato de butileno) (PBS), polietileno (PE), poli (tereftalato de trimetileno) (PTT) y poli (p fenileno) (PPP) que contienen al menos uno
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monómero sintetizado mediante transformación bacteriana, los PHA son los únicos que pueden sintetizarse en un ambiente acuoso suave, ya que otros requieren agua libre, catálisis de metales y temperatura elevada (Chen, Wu, Jung, & Sotavento, 2011).
1.3.9.2.1 Estructuras de los PHAs
Se han informado alrededor de 150 congéneres diferentes de PHA (Zhang et al., 2019). La estructura general de los PHA se muestra en la Figura 6. Si el grupo es R = CH3, el polímero resultante se llama polihidroxibutirato o ácido polihidroxibutírico, mientras que si R = C3H7, el polímero se llama polihidroxioctanoato (PHO) y así sucesivamente (Razaa, Abida, & Banat, 2017).
Figura 6
Estructura general de polihidroxialcanoatos
Nota. Recuperado de Razaa, Abida, & Banat, 2017.
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1.3.9.2.2 Polihidroxibutirato (PHB)
El PHB es diferente de la mayoría de los otros plásticos biodegradables, ya que es insoluble en agua y resistente a la degradación hidrolítica. Se ha aislado una amplia variedad de copolímeros de PHA de bacterias, incluidas las cianobacterias marinas de agua dulce (Kaur, Khajuria, Parihar, & Singh, 2017).
1.3.9.2.3 Bacillus sp como productoras de PHA
La bacteria Bacillus sp se considera un mejor candidato para la producción de PHA debido a la capacidad de producir mejores polímeros y condiciones de fermentación menos estrictas (Valappil, Boccaccini, Bucke, & Roy, 2007; Koller, 2018; Mohammed, Panda y Ray, 2019).
Las especies de Bacillus son bacterias grampositivas; son aerobios o anaerobios facultativos y catalasa positivos (Amin, Rakhisi, & Ahmady, 2015). Los bacilos producen esporas que pueden ser cilíndricas, ovales o redondas (Kuebutornye, Delwin, & Lua, 2019).
1.3.9.3 Aplicaciones
El desarrollo de compuestos continuos reforzados con fibra es esencial para la fabricación de materiales en aplicaciones de carga. Sin embargo, los materiales desarrollados no pueden competir directamente en términos de resistencia con los materiales tradicionales Por esta razón, se proponen que los compuestos
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reforzados con fibra natural se limiten al uso en aplicaciones de carga baja a media (Battegazzorea, Abtb, Maspochb, & Frachea, 2019). También tenemos las aplicaciones de envasado de alimentos basados en mezclas de PLA-PHB plastificadas con D-limoneno, estos materiales destinados a ser utilizados en aplicaciones a corto plazo, como el envasado de alimentos, no solo son deseables por su naturaleza renovable de sus componentes, sino también su degradación (Arrieta, López, Hernández, & Rayón, 2013).
El desarrollo de compuestos de fibra natural totalmente biológicos, también conocidos como compuestos verdes, el cual reduce potencialmente el costo del material final, también mejora el rendimiento térmico y mecánico, un ejemplo de ello, es el uso del compuesto de PHB de tela de cáñamo como alternativas a la madera (Chuan, Muiruria, Thitsartarn, & Li, 2017). En el campo médico los PHAs tienen aplicaciones diversas. Sirven de soporte tridimensional para un posterior crecimiento celular para luego degradarse. Además de ser usados como materiales en la estimulación del crecimiento óseo o de fijación para la formación de hueso, también se utilizan frecuentemente en el tratamiento dental (Álvarez da Silva, 2016).
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Según la investigación de Sabarinathan (2018), las laminillas de PHB han ayudado efectivamente en la detección de células cancerosas. Los resultados indicaron que el PHB sintetizado puede ser una metodología prometedora y novedosa que consume menos tiempo para la detección de células cancerosas.
En comparación con la biopsia, este método es indoloro y el factor clave es que esta técnica puede usarse para la detección de células cancerosas en una etapa temprana.
1.4 Problema
¿La concentración de azúcares reductores obtenidos de hidrolizados enzimáticos de peladilla de espárrago afecta en el rendimiento y producción volumétrica de polihidroxibutirato (PHB), usando Bacilllus sp?
1.5 Hipótesis
Si. La concentración de azúcares reductores presentes en el hidrolizado enzimático de peladilla de espárrago afecta en el rendimiento de polihidroxibutirato usando bacillus sp, incrementando la productividad volumétrica hasta cierto nivel después de lo cual, el rendimiento no incrementará más debido a que, la alta concentración de azúcares en el hidrolizado inhibe al Bacillus sp limitando la biotransformación.
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1.6 Objetivos
1.6.1 Objetivo general
Evaluar la concentración de los azúcares reductores obtenidos por hidrólisis enzimática de peladilla de espárrago, que permita obtener la mayor acumulación y productividad volumétrica de polihidroxibutirato usando Bacillus sp.
1.6.2 Objetivos específicos
i. Evaluar las mejores condiciones para la optimización del pretratamiento de la peladilla de espárrago que permita la obtención de altas concentraciones de azúcares reductores usando la hidrólisis enzimática.
ii. Evaluar las mejores condiciones de concentración de azúcares reductores y dosis de inóculo Bacillus sp que permite un mayor rendimiento y productividad volumétrica de PHB.
iii. Evaluar la acumulación y productividad volumétrica de PHB a las mejores condiciones evaluadas.
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1.7 Justificación del problema
Día a día las empresas siguen produciendo desechos industriales que resultan ser contaminantes al medio ambiente, es por ello que surge la necesidad de reducir dicha contaminación. A su vez nos genera la necesidad de buscar alternativas para el aprovechamiento de estos desechos para generar un plástico que sustituya al tradicional, mediante fuentes renovables y de fácil obtención. Algunos de estos desechos agroindustriales poseen residuos lignocelulósicos los cuales pueden ser fuentes alternativas para producir bioplásticos (PHA).
Los plásticos tradicionales obtenidos de una fuente no renovable, como es el petróleo, poseen una estructura compleja formada por polímeros compactos y demasiado largos para que los organismos descomponedores puedan degradarlos. Por ello los bioplásticos, que pueden ser degradados por los microorganismos, se presentan como una alternativa viable para el aprovechamiento y reducción de desechos agroindustriales.
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CAPÍTULO II: MATERIALES Y METODOS 2.1 Materiales y reactivos
Para la realización de la presente tesis se utilizaron los siguientes materiales y reactivos que se muestran en la Tabla 3 y Tabla 4.
Tabla 3 Materiales
N° Nombre N° Nombre
1 Algodón estéril 25 Parafilm
2 Asa de inoculación 26 Placas Petri de plástico 3 Botella con tapa de 1 L 27 Placas petri de vidrio 4 Botella con tapa de 2 L 28 Piseta
5 Embudo de plástico 29 Probeta de 100 ml 6 Embudo de vidrio 30 Probeta de 10 ml
7 Fiola de 100 ml 31 Probeta de 1 L
8 Fiola de 10 ml 32 Probeta de 250 ml
9 Fiola de 1 L 33 Probeta de 25 ml
10 Fiola de 25 ml 34 Probeta de 500 ml
11 Fiola de 50 ml 35 Probeta de 50 ml
12 Guantes de látex 36 Puntas de micropipeta de 1 ml 13 Malla N°30 37 Puntas de micropipeta de 200 ul
14 Malla N°70 38 Termómetro (Rango -10 a 350°C)
15 Matraz de 125 ml 39 Tubos de ensayo de 16 x100 mm 16 Matraz de 1 L 40 Tubos con tapa con fondo redondo
de 13 x100 mm
17 Matraz de 250 ml 41 Tubos falcón con tapa de 15 ml 18 Matraz de 2 L 42 Tubos falcón con tapa de 50 ml 19 Matraz de 500 ml 43 Vaso de precipitación de 25 ml 20 Matraz de 50 ml 44 Vaso de precipitación de 50 ml 21 Mechero de Alcohol 45 Vaso de precipitación de 100 ml 22 Papel Aluminio 46 Vaso de precipitación de 1 L 23 Papel Filtro Sartorius N°389
24 Parafilm
Nota. Elaboración Propia
BIBLIOTECA DE LA FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
Tabla 4 Reactivos
N° Nombre Fórmula
1 Ácido 3,5-Dinitrosalicílico C7H4N2O7
2 Ácido Bórico H3BO3
3 Ácido Cítrico C6H8O7
4 Ácido Sulfúrico H2SO4
5 Agar Nutritivo
6 Agua Destilada H2O
7 Azida de Sodio NaN3
8 Bicarbonato de Sodio NaHCO3
9 Caldo Nutritivo
10 Citrato de Fierro y Amonio NH4Fe(Citrato) 11 Cloroformo
12 Cloruro de Amonio NH4Cl
13 Cloruro de Calcio CaCl2
14 Cloruro de Calcio Dihidratado CaCl2.2H2O 15 Cloruro de Cobalto Hexadidratado CoCl2.6H2O 16 Cloruro de Cobre Dihidratado CuCl2.2H2O 17 Cloruro de Manganeso Dihidratado MnCl2.2H2O 18 Cloruro de Níquel Hexahidratado NiCl2.6H2O 19 Enzima Celluclast
20 Etanol (96%) C2H5OH
21 Extracto de Carne 22 Extracto de levadura
23 Fosfato de Sodio Dibásico Na2HPO4
24 Fosfato de Potasio Dibásico K2HPO4
25 Fosfato Disódico Dihidratado Na2HPO4 .2H2O
26 Fosfato Dipotásico KH2PO4
27 Glucosa C6H12O6
28 Hidróxido de Sodio NaOH
29 Molibdato de Sodio Dihidratado Na2MoO4.2H2O 30 Peptona
31 Sulfato de Amonio (NH4)2SO4
32 Sulfato de Magnesio MgSO4
33 Sulfato de Magnesio Heptahidratado MgSO4. 7H2O 34 Sulfato de Zinc Heptahidratado ZnSO4. 7H2O 35 Tártaro de Sodio-Potasio NaKC4H4O6
Nota. Elaboración Propia
