Establecimiento de un
procedimiento diagnóstico para Lawsonia intracellularis
Resumen
Tanto el cuadro clínico como la observación de las lesiones macroscópi- cas son insuficientes para el diagnóstico certero de la enteropatía prolife- rativa porcina (EPP). Además, Lawsonia intracellularis es una bacteria que no crece en medios in vitro convencionales en ausencia de enterocitos, así que tanto el aislamiento como el diagnóstico serológico resultan com- plicados (Huerta y col., 2003). De este modo el examen post mórtem de los animales con diarrea y retraso en el crecimiento resulta de gran interés para su diagnóstico. La constatación del aumento de tamaño del íleon, de los ganglios linfáticos y de las lesiones microscópicas proliferativas típicas son una herramienta determinante a la hora de caracterizar la enfer- medad, cuando se utilizan de forma conjunta. La técnica de Warthin Starry resultó ser rápida y simple en su desarrollo y permitió identificar, además del agente etiológico, estructuras histológicas, patológicas y la respuesta celular. Además, la técnica de inmunoperoxidasa fue la prueba de referen- cia para el diagnóstico de L. intracellularis y permitió identificar diferentes etapas en la patogenia de la enfermedad (incluyendo los animales en recuperación) y grado de infección. La técnica de PCR de mucosa ileal permitió identificar animales con poca cantidad de L. intracellularis en la mucosa y su asociación con las lesiones, por lo que se concluye que su aplicación podría ayudar a determinar infecciones subclínicas. La técnica de PCR de materia fecal dio lugar a la identificación de cerdos que siguie- ron eliminando bacterias de manera intermitente durante varias semanas.
Palabras claves: Lawsonia intracellularis, enteropatía proliferativa porcina, diagnóstico.
Summary
Diagnosis of Lawsonia intracellularis
Both clinical observation and gross lesions are insufficient for accurate diagnosis of porcine proliferative enteropathy (PPE), so it is recommended laboratory diagnosis, and can be direct or indirect. Furthermore, Lawsonia intracellularis is a bacterium which does not grow on conventional media in vitro in the absence of enterocytes, therefore isolation as serological diag- nosis is complicated (Huerta et al., 2003). Thus the post-mortem exami- nation of animals with diarrhea and growth retardation is of great interest for diagnosis. The finding of increased size of the ileum, the lymph nodes and microscopic lesions typical proliferative, is a reliable tool when cha- racterizing the EPP, when used together. Warthin Starry technique proved to be quick and simple in its development and identified, in addition to the etiologic agent, histological structures, pathological and cellular response.
Moreover immunoperoxidase technique was the gold standard for the histo- pathological diagnosis of L. intracellularis, and identified different stages in the pathogenesis of the disease (including animals in recovery) and degree of infection. The PCR technique of ileal mucosa identified animals with little amount of L. intracellularis in mucosa and associated injuries, which conclu- des that its implementation could help determine subclinical infections. The PCR technique stool in turn led to the identification of bacteria eliminating pigs continued intermittently for several weeks.
Key words: Lawsonia intracellularis, porcine proliferative enteropathy, diagnosis.
Judith Bertone, Silvia Romanini, Raúl Yaciuk, Natalia Illanes, Bibiana Pelliza y Ana Cabral Imágenes cedidas por los autores
Contacto con los autores: Departamento de Patología Animal - Universidad Nacional de Río Cuarto - Córdoba - Argentina.
Email: jbertone@ayv.unrc.edu.ar
SUIS Nº 95 Marzo 2013 n 15
L
a enteropatía proliferativa porci- na (EPP) o ileítis porcina es consi- derada por numerosos investiga- dores como una de las principales enfermedades transmisibles en la produc- ción intensiva de cerdos en todo el mundo.Está producida por Lawsonia intracellula- ris, una bacteria Gram (-) que manifiesta como principales signos clínicos anorexia, diarrea, retraso del crecimiento y aumento de la mortalidad en la etapa de finalización (Jensen y col., 2006).
La distribución de esta enfermedad es mundial. En Estados Unidos y algunos países de Europa, el porcentaje de explo- taciones afectadas supera al 90% (McO- rist y col., 2003). En un estudio realizado en 22 explotaciones de la zona de mayor producción porcina de Argentina, me- diante la técnica ELISA en suero y PCR en materia fecal, se observó que un 90,9%
de las granjas eran seropositivas. En este estudio se concluyó también que L. intra- cellularis está presente de forma endémica a lo largo del país y de las explotaciones, y que el mayor impacto de la enfermedad se da en los animales de 15 semanas de edad (Corrales y col., 2009).
La EPP se manifiesta clínicamente de dos formas en las granjas infectadas: una forma crónica, con tres tipos de lesiones macroscópicas bien diferenciadas (que son la adenomatosis intestinal, la ente- ritis necrótica y la ileítis regional) y una forma aguda, la enteropatía proliferativa hemorrágica (Gebhart y Guedes, 2001).
Estas formas difieren mucho en sus mani- festaciones clínicas, aunque mantienen la misma lesión de base, macroscópicamen- te caracterizada por el engrosamiento de la mucosa del íleon y, en menor grado, del ciego y del colon, y microscópicamente por la hiperplasia de los enterocitos in- maduros de las criptas (Carvajal y col., 2005a). Además, presenta una tercera forma subclínica, sin diarrea evidente pero con mayor o menor impacto en los parámetros productivos como los índices de conversión, ganancia de peso media diaria y uniformidad en cerdos de termi- nación (McOrist y col., 2007).
Tanto el cuadro clínico como la observa- ción de las lesiones macroscópicas son in- suficientes para el diagnóstico certero de EPP, por lo que se recomienda un diagnós- tico laboratorial, directo o indirecto (Law- son y col., 2000; Carvajal y col., 2005). En función del incremento de casos de ileítis en la casuística de nuestro departamento y
su reciente asociación con otros microor- ganismos como el circovirus porcino tipo 2 (PCV2) (Jensen y col., 2006; Machuca y col., 2008), nos propusimos establecer una rutina de diagnóstico confiable y eco- nómica para ser aplicada en el servicio de diagnóstico histopatológico que brinda el Departamento de Patología Animal.
MATERIALES Y MÉTODOS Se realizó un muestreo no probabilístico de conveniencia sobre un total de 61 cer- dos con diarrea, de entre 8 y 21 semanas de edad, en 21 criaderos intensivos de 8 provincias de Argentina. El muestreo in- cluyó: necropsia, observación de las lesio- nes macroscópicas, determinación del co- lor y de la consistencia de las heces, toma de muestras de los últimos 10 cm del íleon en formol al 10%, raspado de mucosa y materia fecal. Las técnicas empleadas en mucosa intestinal incluyeron hematoxili- na eosina (HE), Warthin Starry (WS), in- munoperoxidasa (IPX), PCR en mucosa y en materia fecal.
El estudio estadístico se realizó a través del análisis de contingencia para variables cate- gorizadas, útiles para comparar dos o más variables categorizadas del programa InfoS- tat versión 2010 (Di Rienzo y cols., 2010).
RESULTADO Y DISCUSIÓN La mayoría de los cerdos con diarrea mos- traron una importante disminución de su condición corporal en la totalidad de las
explotaciones lo que lleva a un retraso de la producción y heterogeneidad de los lotes (figura 1).
En este estudio se pudo ver una gran varie- dad de consistencias y colores de las heces localizadas en el recto. Las diarreas pre- dominantes no fueron las descritas como características en L. intracellularis, de co- lor gris verdoso o gris cemento (Carvajal y col., 2005a). Esto podría ocurrir por diversas causas: varios agentes patógenos pueden estar presentes como causantes de estas diarreas, pudiendo existir infecciones concomitantes que modifiquen el color original de la diarrea, úlceras gástricas, etc.
Por lo que el color y la consistencia de las heces resultaron inespecíficas y no sirvie- ron para caracterizar a EPP.
Muestras de elección
Las muestras de elección para ser enviadas a los laboratorios de referencia, incluyen:
■
n Para histoquímica e inmunohistoquímica se remitirá una porción de íleon (2 cm), 10 cm por delante de la válvula ileocecal, en formol al 10% bufferado debidamen- te identificado.
■
n Para PCR de mucosa se recomienda lavar la mucosa con una solución fisiológica estéril con la finalidad de disminuir los potenciales inhibidores que se encuentran en la materia fecal (Ladinig y col., 2009). Posteriormente se raspa la superficie de la mucosa ileal con una espátula de plástico estéril hasta obtener una muestra de aproximadamente un 1 cm3 de mucosa, que se introducirá en tubo Eppendorf es- téril correctamente identificado, conteniendo 1 ml de PBS estéril para evitar la des- hidratación. Se debe transportar la muestra refrigerada a 7 °C hasta el laboratorio.
■
n Para PCR de materia fecal se debe tomar, con una espátula de plástico estéril, aproximadamente 1,5 ml de contenido intestinal del íleon y colocarlo en el interior de un tubo Eppendorf estéril adecuadamente identificado, que contenga 1 ml de PBS estéril para evitar la deshidratación. La extracción se debe realizar siguiendo las precauciones recomendadas, como en las bacteriologías, para evitar conta- minaciones con ADN extraño (Huerta y col., 2003) y, finalmente, remitir las mues- tras refrigeradas a 7 °C al laboratorio.
Figura 1. Cerdo de 8 semanas de edad con retraso en el crecimiento y diarrea.
En la necropsia, en el examen externo del íleon se observó un engrosamiento difuso de la serosa, con pliegues longitudinales y transversales engrosados, edematosos e hiperémicos, que conferían un aspecto reticular a la misma (figura 2).
El mesenterio de algunos cerdos se obser- vó engrosado, blanquecino y presentaba un exudado líquido al corte, además de
la presencia de hiperplasia en la cadena ganglionar linfática mesentérica con hipe- remia y edema (figura 3).
El engrosamiento de la mucosa del íleon presentó pliegues longitudinales y transver- sales que le daban un aspecto cerebroide húmedo pero no mucoso, debido al edema presente (figura 4). El estudio estadístico indica que el examen macroscópico post
Figura 2. La superficie de la serosa se observa reticulada, edematosa y algo hiperémica.
Figura 3. Mesenterio con edema e hiperemia y aumento de tamaño de la cadena de ganglios linfáticos (flecha).
Figura 4. Mucosa ileal estriada y con edema en su superficie.
Figura 5. Cripta ramificada tapizada por enterocitos inmaduros y ausencia de células caliciformes, e infiltrado mononu- clear en la lámina propia (flecha), HE 40×.
Figura 6. Cripta ramificada con parte del epitelio aún hiperplásico y el resto con hiperplasia de células caliciformes, indicativo de recuperación y células gigantes en lámina propia (flechas), HE 10×.
mórtem tiene un valor limitado para el diagnóstico de L. intracellularis, como in- dican otros estudios (Ladinig y col., 2009), a pesar de que la presencia de edema de mesenterio asociado con engrosamiento del íleon es un valioso indicativo de EPP, según sugieren Guedes y col. (2002b).
Las lesiones microscópicas encontradas en la tinción con hematoxilina-eosina (HE)
18 n SUIS Nº 95 Marzo 2013
fueron las típicas EPP en íleon: atrofia de vellosidades, hiperplasia del epitelio de las criptas, criptas alargadas y ramificadas, au- sencia de caliciformes e infiltrado mononu- clear; y se encontró asociación con la pre- sencia de la bacteria intracelular a través de distintas técnicas diagnósticas aplicadas en mucosa y en materia fecal (figura 5).
Además se determinaron criptas de la mu- cosa ileal en vías de recuperación, que se caracterizan por la hiperplasia de células caliciformes (McOrist y col., 1996), y la respuesta inflamatoria percibida por la presencia de células de tipo mononuclear, células gigantes e histiocitos en lámina pro- pia del íleon distal, depleción linfoidea en folículos de las placas de Peyer, abscesos, cristales y linfocitos intraepiteliales infiltra- dos entre los enterocitos hiperplásicos de las criptas de la mucosa ileal (figura 6).
Como era de esperar, el hecho de hallar una asociación estadística significativa entre la presencia de lesiones microscópicas típicas y el hallazgo frecuente de microorganis- mos intracelulares con las características morfológicas y de coloración de la bac- teria L. intracellularis, permitió concluir que la enfermedad se encontraba presente (p=0,008) (Rodríguez y col., 2004). Con la tinción de Warthin Starry (WS) se determi- nó la presencia de una bacteria intracelular con forma de S sigmoidea de color negro en la porción apical del citoplasma de los enterocitos inmaduros, de las criptas de Lieberkühn (figura 7).
Al igual que Jensen y col. (2010) conside- ramos que la inmunoperoxidasa (IPX) es la prueba de elección para el diagnóstico histopatológico de infección por L. intra- cellularis, ya que marcó in situ al antígeno bacteriano, reveló cambios en los tejidos y permitió determinar la asociación de las bacterias con las lesiones (p<0,0001).
Se observó una reacción de color marrón en el interior del citoplasma apical de los enterocitos inmaduros de las criptas, en los macrófagos de la lámina propia y en las células gigantes que conforman la re- acción inflamatoria granulomatosa en la mucosa de animales con infección (figu- ra 8) y sólo en macrófagos de la lámina propia y principalmente de la submucosa, en animales en vías de recuperación, sin presencia de antígeno en los enterocitos.
Cabe destacar la menor sensibilidad de WS en estos animales, ya que no produce ningún tipo de reacción distinguible en las células inflamatorias de la mucosa y de la submucosa.
Varios autores coinciden en que la PCR de mucosa ileal es tan sensible como la IPX, aún en casos sospechosos de EPP sin engrosamiento o cambios histopato- lógicos visibles (Guedes y col., 2002a).
A pesar de que en nuestro estudio varios animales se encontraron en la etapa de recuperación y no presentaban cambios proliferativos evidentes, fue capaz de de- tectarlos (p<0,0001), aún con un número
poco significativo de reacción como se de- terminó mediante la IPX. Quizás por esto es conveniente utilizar la PCR en estudios epidemiológicos, para detectar infeccio- nes subclínicas (Ladinig y col., 2009).
A diferencia de lo expresado por Jones y col. (1993a) en este estudio no se encon- tró una asociación significativa entre la presencia de L. intracellularis en las des- cargas fecales y las lesiones proliferativas
Figura 7. Estructuras bacterianas intracelulares con forma sigmoidea o coma de color negro (flecha), correspondientes a L. intracellularis, WS 100×.
Figura 8. Reacción positiva en glándulas, macrófagos y células gigantes de la lámina propia (flecha), IPX 40×.
(p=0,1191). La PCR MF podría detectar la liberación de L. intracellularis en animales que están enfermos, en recuperación, con infección sólo en colon o que han ingerido L. intracellularis de heces contaminadas pero que no desarrollan la enfermedad.
Los animales que las liberan a largo plazo en las heces son cerdos infectados sin sig- nos clínicos aparentes, que actuarían como reservorio manteniendo la carga en el am- biente, lo que coincide con lo expresado por Guedes y Gebhart (2003a).
Por último, al revisar la bibliografía se ob- servó que algunos autores indicaban que las variables podían comportarse de dife- rente manera en cuanto a lo que aportan a la presentación de la enfermedad, por lo que se analizó qué sucedía cuando sólo algunas variables eran consideradas, como engrosamiento de la pared intestinal, au- mento de tamaño del ganglio linfático, to- das las lesiones microscópicas e IHQ. En este caso se observó una asociación signi- ficativa (p=0,0088), lo que concuerda con Jones y col. (1993a), que demostró asocia- ción entre un intestino macroscópicamente engrosado y la presencia de cambios proli- ferativos y microorganismos intracelulares con una significación a un valor p=0,0078.
BIBLIOGRAFÍA
Carvajal, A.; Pozo, J.; Garcia, C.; Collazos, J.; Rubio, P.
2005a. Enteropatia proliferativa suína. Suis Brasil 8: 34-42.
Corrales Morales, P.; Pelliza, B.; Tamiozzo, P.; Carranza, A.; Illanes, N.; Bertone J.; Ambrogi A. 2009. Perfil sero- lógico y por PCR de Lawsonia Intracellularis en cerdos de distintas edades en granjas porcinas de la República Argentina. Rev Med Vet. 90, 3/4: 34-38.
Di Rienzo, J.; Casanoves, F.; Balzarini, M.; Gonzalez, L.;
Tablada, M.; Robledo, C. InfoStat versión 2010. FCA, UNC.
Gebhart, C.; Guedes, R. 2001. Proliferative enteropathy:
diagnostic and immunity. Proceeding AASV 353-357.
Gebhart, C.; McOrist, S. 2005. Patogenia, inmunología y diagnóstico de la enteropatía proliferativa porcina. Sim- posio Europeo sobre Enterisol® Ileitis. www.boehringer- ingelheim.es
Guedes, R.; Gebhart, C.; Winkelman, N.; Mackie-Nuss, R.; Marsteller, J. 2002a. Compararison of different me- thods for diagnosis of porcine proliferative enteropathy.
Can J Vet Res. 66: 99-107.
Guedes, R.; Gebhart, C.; Armbruster, G. Roggov, B.
2002b. Serologic follow-up of a repopulated swine herd after an outbreak of proliferative enteropathy. Can J Vet Res. 66: 258-263.
Guedes, R.; Gebhart, C. 2003. Onset and duration of
fecal shedding, cell-mediated and humoral immune res- ponses in pigs after challenge with a pathogenic isolate or attenuated vaccine strain of Lawsonia intracellularis.
Vet Microbiol. 91: 135-145.
Huerta, B.; Arenas, A.; Carrasco, L.; Maldonado, A.; Ta- rradas, C.; Carbonero, A.; Perea, A. 2003. Comparison of diagnostic techniques for Porcine Proliferative Entero- pathy (Lawsonia intracellularis infection). J Comp Path.
129: 179-185.
Jensen, T. K.; Vigre, H.; Svensmark, B.; Bille-Hansen, V. 2006. Distinction between Porcine Circovirus Type 2 Enteritis and Porcine Proliferative Enterophaty caused by Lawsonia intracellularis. J Comp Path. 135: 176-182.
Jensen, T.; Boesen, H.; Vigre, H.; Boye, M. 2010. Detec- tion of Lawsonia intracellularis in formalinfixed porcine intestinal tissue samples: comparison of immunofluo- rescence and in-situ hybridization, and evaluation of the effects of controlled autolysis. J Comp Path. 142: 1-8.
Jones, G.; Davies, P.; Rose, R.; Ward, G.; Murtaugh, M.
1993. Comparison of techniques for diagnosis of prolifera- tive enteritis of swine. Am J Vet Res. 54(12): 1980-1985.
Ladinig, A.; Sommerfeld-Stur, I.; Weissenböck, H. 2009.
Comparative evaluation of diagnostic methods for Lawso- nia intracellularis infection in pigs, with emphasis on cases lacking characteristic lesions. J Comp Path. 140: 140-148.
Lawson, G.; Gebhart, C. J. 2000. Review Proliferative Enteropathy. J Comp Path. 122: 77-100.
Machuca, M; Quiroga, M.; Cappucio, J. Piñeyro, P.; We- ber, N.; Alarcón, L.; Perfumo, C. 2008. Identificación inmunohistoquímica de circovirus porcino tipo 2 y Law- sonia intracellularis en muestras de Íleon de cerdos con lesiones de enteropatía proliferativa porcina. IX Congreso Nacional de Producción Porcina. 209.
McOrist, S.; Roberts, L.; Jasni, S.; Rowland, AC.; Law- son, GH.; Gebhart, C.; Bosworth, B. 1996. Developed and resolving lesions in porcine proliferative enteropa- thy: possible pathogenetic mechanisms. J Comp Path.
115(1): 35-45.
McOrist, S.; Barcillos, D.; Wilson, R. 2003. Global Patterns of porcine proliferative enteropathy. The Pig J. 51: 26-35.
McOrist, S.; Nistal, P.; Carvajal, A. 2007. Especial ileítis:
Etiología, patogenia, epidemiología y cuadro clínico.
www.3tres3iberico.com
Lawson, G.; Gebhart, C. J. 2000. Review Proliferative Enteropathy. J Comp Path. 122: 77-100.
Rodríguez, B.; Aranzazu, D.; Giraldo, G.; Alvarez, L.; Cano, E.; Isaza, B. 2004. Prevalencia de enteropatía proliferativa porcina y caracterización histopatológica de las lesiones asociadas en cerdos sacrificados en el Matadero Municipal de Medellín, Colombia. Rev Col Cienc Pec. 17(1): 11-19.
Conclusiones
■
n Las lesiones macroscópicas en general, el color y la consistencia de las heces no permiten caracterizar la EPP, por lo tanto no pueden ser utilizadas como únicas herramientas de diagnóstico.
■
n El aumento de tamaño del íleon, de los ganglios linfáticos y las lesiones microscó- picas proliferativas típicas son una herramienta determinate a la hora de caracte- rizar la EPP cuando son utilizadas en forma conjunta en el examen post mórtem.
■
n Los estudios microscópicos se hacen necesarios para dar un diagnóstico pre- suntivo de EPP, ya que dan información sobre la existencia de la enfermedad, la presencia del agente etiológico, la patogenia, la respuesta inflamatoria y la recuperación del tejido.
■
n La técnica de WS resultó ser rápida y simple en su desarrollo y permitió identificar, además del agente etiológico, estructuras histológicas, patológicas y la respues- ta celular.
■
n La técnica de IPX es la prueba de referencia para el diagnóstico histopatológico de L. intracellularis y permitió identificar diferentes etapas en la patogenia de la enfermedad y diversos grados de infección. Además, permitió determinar la aso- ciación entre la presencia de la bacteria y las lesiones macroscópicas y micros- cópicas. Su aplicación es relativamente sencilla.
■
n La técnica de PCR de mucosa ileal permitió identificar animales con poca canti- dad de L. intracellularis en mucosa y su asociación con las lesiones, por lo que su aplicación puede ayudar a determinar infecciones subclínicas.
■
n La técnica de PCR de materia fecal dio lugar a la identificación de cerdos que siguieron eliminando bacterias de manera intermitente durante varias semanas.
