Efecto de la suplementación lipídica en vacas
Holstein lactantes, sobre el perfil de ácidos
grasos de la leche, perfil metabólico y su
asociación con la expresión génica en tejido
mamario
Sorany Milena Barrientos Grajales
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Producción Animal Medellín, Colombia
Efecto de la suplementación lipídica en vacas
Holstein lactantes, sobre el perfil de ácidos grasos
de la leche, perfil metabólico y su asociación con la
expresión génica en tejido mamario
Sorany Milena Barrientos Grajales
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Doctora en Ciencias Agrarias
Director (a):
Ph.D., Diana María Bolívar Vergara Codirector:
Ph.D., José Julián Echeverri Zuluaga
Línea de Investigación: Genómica Nutricional Grupo de Investigación:
Biodiversidad y Genética Molecular “BIOGEM”
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Producción Animal Medellín, Colombia
Agradecimientos
Han sido muchas las personas que de una u otra manera me acompañaron durante el proceso de formación como Doctora y realizaron aportes invaluables desde el ámbito personal y académico que permitieron la culminación de manera satisfactoria de esta investigación. Amigos, colegas, familia, sin su apoyo no hubiera sido posible alcanzar este sueño, por esto solo me queda decirles GRACIAS.
En primer lugar, agradezco a Dios, quien estuvo a mi lado en cada paso, levantándome durante los tiempos difíciles personales, dándome la fuerza suficiente para continuar con el reto de mi formación doctoral y la culminación satisfactoria de estre trabajo de investigación. Agradezco a mis hijos Emiliano y Angélica Celis Barrientos, ellos son el motor de mi vida y quienes me impulsaron a emprender este camino. Sin reproches ni quejas aceptaron las ausencias y el poco tiempo disponible que tenía para ellos. A mi madre Mireya Grajales por su apoyo incondicional, quien desde niña inculcó en mi la importancia de la educación y con su ejemplo me enseñó a seguir siempre adelante por más difícil que fueran las circunstancias.
A mis compañeros de investigación Nancy Rodríguez y Juan Esteban Gómez, con los cuales conformamos un excelente equipo de trabajo que nos permitió sobre pasar los impases propios de la investigación y sacar adelante este proyecto.
Agradezco a mis tutores, la Doctora Diana María Bolívar Vergara quien, con su enorme paciencia, entrega, comprensión y disposición, más que una tutora fue una madre que me llevo de la mano durante todo este camino. A los doctores Julián Echeverri y Albeiro López, quienes hicieron aportes invaluables en el desarrollo de esta investigación, además de contribuir enormemente a mi formación académica y personal. A la Doctora Nélida Rodríguez, un gran ser humano quien fue mi tutora en la pasantía, le agradezco haberme abierto las puertas de su grupo de investigación y de su hogar durante mi estadía en Uruguay.
en tejido mamario
A todo el personal de la estación agraria Paysandú de la Universidad Nacional de Colombia, de quienes siempre tuvimos la mayor disposición y compromiso con el proyecto.
Agradezco a COLCIENCIAS por la financiación del proyecto “Modulación de la expresión génica en glándula mamaria mediada por factores nutricionales en vacas Holstein” Contrato 2015-021 y a la Vicedecanatura de investigación y extensión quien en el marco de la Convocatoria Nacional de Proyectos para el Fortalecimiento de la Investigación, creación e innovación de la Universidad Nacional de Colombia 2016-2018, aportó recursos que permitieron la realización de la presente investigación.
Agradezco a la vida y la maravillosa oportunidad que me brindó de estudiar en la mejor universidad de este país. Todo lo que sé se lo debo a mi querida Universidad Nacional de Colombia quien siempre tendrá un espacio especial en mi corazón.
Resumen
La leche es un alimento de origen animal que desde hace muchos años ha formado parte de la dieta humana y representa para la población una fuente fundamental de nutrientes y energía en las distintas etapas de la vida. Desde el punto de vista nutricional, la leche es un alimento básico en el marco de una dieta equilibrada, ya que en su composición están presentes numerosos nutrientes esenciales para la salud y el bienestar humano en cantidades relativamente elevadas, y con una adecuada biodisponibilidad. Siendo la leche una fuente importante de ácidos grasos, principalmente saturados, su consumo se ha disminuido o ha sido reemplazado por otro tipo de productos, con el fin de reducir la ingesta de este tipo de nutrientes que en los últimos años se ha asociado con el incremento del colesterol sanguíneo y con un mayor riesgo de ateroesclerosis y enfermedades coronarias. Sin embargo, estudios recientes muestran que el consumo de productos lácteos tiene efectos benéficos para la salud, debido a la gran cantidad de nutrientes que conforman la matriz compleja de este alimento, a demás, se han encontrado beneficios adicionales si estos productos se encuentran enriquecidos con acidos grasos monoinsaturados (MUFA). La leche producida en los sistemas de lechería especializada en pastoreo, cuenta con un mayor contenido de ácidos grasos insaturados en comparación con otros sistemas, lo cual constituye una ventaja para el desarrollo de estrategias que permitan incrementar los contenidos de ácidos grasos insaturados (UFA). La suplementación con fuentes lipídicas es una de ellas, sin embargo, la síntesis de la grasa láctea depende de multiples factores ambientales, fisiológicos y nutricionales, los cuales interactúan entre si e influyen en el metabolismo del tejido mamario y en la expresión génica. Dentro del complejo enzimático que participa en la síntesis de ácidos grasos (AG), se encuentra la estearoil CoA desaturasa, encargada en insertar insaturaciones en el carbono 9 de los AG de 10 a 18 carbonos y es la responsable de la síntesis endógena del ácido linoleico conjugado (CLA). El gen que codifica para esta enzima tiene un polimorfismo que se ha asociado con mayores contenidos de UFA en leche, pero aun se desconoce su frecuencia en poblaciones bovinas del país. Como respuesta a esta problemática se plantea la presente investigación que tiene como objetivo evaluar la relación del polimorfismo A293V del gen
en tejido mamario
SCD1 con la composición de la leche y la grasa láctea, así como el efecto de la suplementación lipídica, sobre el perfil de ácidos grasos de la leche, algunos parámetros metabólicos y su asociación con la expresión génica en tejido mamario de vacas Holstein lactantes. Para tal fin se planteó el desarrollo de esta investigación en tres fases: en la primera fase se determinó las frecuencias alélicas y genotípicas del polimorfismo A293V del gen SCD1, encontrando que el genotipo AA es el más abundante en la población Holstein de Antioquia, además los animales que presentaron dicho genotipo mostraron un mayor contenido de grasa en la leche en términos de porcentaje y kilogramos, respecto a los animales con genotipo VV. Adicionalmente, los animales con genotipos AA y AV presentan mejores contenidos de ácido miristoleico (C14:1 cis-9) y una mayor conversión del ácido saturado C14:0 a su forma monoinsaturada, aunque no hubo efecto significativo sobre la insaturación de los ácidos grasos C16:0, C18:0 y C18:1 tras-11. En la segunda fase, se realizó una técnica de gas in vitro como prueba preliminar para seleccionar el tratamiento que se implementaría en el ensayo in vivo, en ella se estudió el proceso de biohidrogenación ruminal de los aceites de girasol y linaza, solos o mezclados con aceite de pescado, identificando que todos los aceites evaluados, redujeron la digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) de manera significativa y la digestibilidad in vitro de la fibra en detergente neutro (DIVFDN) fue afectada por la inclusión de aceite de girasol. Así mismo, el aceite de pescado mostró tener un efecto protector durante las primeras 12 horas de incubación, sobre la biohidrogenación de los UFA de 18 carbonos y los ácidos grasos polinsaturados (PUFA), cuando se mezcla con aceite de linaza. En la tercera y última fase, teniendo en cuenta los resultados de la prueba in vitro, se desarrolló un experimento en el cual se evaluó el efecto de la inclusión de 700 gr/día de aceite de girasol en la dieta de vacas lactantes, sobre la expresión génica del tejido mamario. Se identificaron 13 genes expresados diferencialmente (DEGs), los cuales participan principalmente en procesos de respuesta inmune, diferenciación celular y trasporte de membrana, además, los genes más abundantes dentro del transcriptoma mamario correspondieron a las principales proteínas de la leche (CSN1S1, CSN2, PAEP (LGB), CSN3, CSN1S2 y LALBA). Finalmente, se analizó el efecto de la suplementación lipídica sobre el perfil de ácidos grasos de la leche y sobre algunos metabolitos sanguíneos. A partir de este análisis se estableció que el aceite de girasol tiene efectos significativos sobre el perfil lipídico de la leche, reduciendo el contenido de algunos de los SFA de cadena corta y media. Adicionalmente se indentificó que su inclusión a razón de 700 gr/día
en dietas de vacas lactantes, no afectó el consumo de matería seca del forraje ni los niveles sanguíneos de los metabolitos evaluados.La presente investigación brinda nuevo conocimiento respecto al impacto que tiene la suplementación lipídica en la dinámica ruminal, el perfil metabólico y en los mecanismos moleculares que se desarrollan en la glándula mamaria de vacas lactantes, contribuyendo al desarrollo de estrategias desde un enfoque genético y nutricional para el mejoramiento de la calidad composicional de los productos lácteos.
Palabras clave: Genotipo, leche, grasa, biohidrogenación, transcriptoma, metabolismo,
en tejido mamario
Effect of lipid supplementation in lactating
Holstein cows on the fatty acid profile of milk,
metabolic profile and its association with gene
expression in mammary tissue
Abstract
Milk is a food of animal origin that for several years has been part of the human diet and represents for the population a fundamental source of nutrients and energy in the different stages of life. From a nutritional point of view, milk is a basic food in the framework of a balanced diet, since its composition contains many nutrients essential for human health and well-being in relatively high quantities, and with adequate bioavailability. As milk is an important source of fatty acids, mainly saturated, its consumption has been reduced or has been replaced by other types of products, in order to reduce the intake of this type of nutrients that in recent years has been associated with increase in blood cholesterol and with an increased risk of atherosclerosis and coronary heart disease. However, recent studies show that the consumption of dairy products has beneficial effects on health, due to the large amount of nutrients that make up the complex matrix of this food, additional benefits have been found if these products are enriched with monounsaturated fatty acids (MUFA). Milk produced in specialized grazing dairy systems has a higher content of unsaturated fatty acids compared to other systems, which constitutes an advantage for the development of strategies that allow increasing the content of unsaturated fatty acids
(UFA). Supplementation with lipid sources is one of them, however, the synthesis of milk fat depends on multiple environmental, physiological and nutritional factors, which interact with each other and influence the metabolism of breast tissue and gene expression. Within the enzymatic complex that participates in the synthesis of fatty acids (FA), is the stearoyl CoA desaturase, responsible for inserting unsaturations in carbon 9 of the FAs of 10 to 18 carbons and is responsible for the endogenous synthesis of linoleic acid conjugate (CLA). The gene that codes for this enzyme has a polymorphism that has been associated with higher UFA contents in milk, but its frequency in bovine populations of the country is still unknown. In response to this problem, the present investigation is proposed that aims to evaluate the relationship of the A293V polymorphism of the SCD1 gene with the composition of milk and milk fat, as well as the effect of lipid supplementation on the fatty acid profile of milk, some metabolic parameters and their association with gene expression in breast tissue of lactating Holstein cows. For this purpose, the development of this research in three phases was proposed: in the first phase, the allelic and genotypic frequencies of the A293V polymorphism of the SCD1 gene were determined, finding that the AA genotype is the most abundant in the Holstein population of Antioquia, in addition to Animals that presented this genotype showed a higher fat content in milk in terms of percentage and kilograms, compared to animals with VV genotype. Additionally, animals with AA and AV genotypes have better myristoleic acid contents (C14: 1 cis-9) and a higher conversion of C14: 0 saturated acid to its monounsaturated form, although there was no significant effect on the unsaturation of fatty acids. C16: 0, C18: 0 and C18: 1 after -11 In the second phase, an in vitro gas technique was performed as a preliminary test to select the treatment that would be implemented in the in vivo test, in it the ruminal biohydrogenation process of sunflower and linseed oils was studied, alone or mixed with fish oil, identifying that all the evaluated oils reduced the in vitro digestibility. of dry matter (DIVMS) significantly and in vitro fiber digestibility in neutral detergent (DIVFDN) was affected by the inclusion of sunflower oil. Likewise, fish oil was shown to have a protective effect during the first 12 hours of incubation, on the biohydrogenation of 18-carbon UFA and polyunsaturated fatty acids (PUFA), when mixed with linseed oil. In the third and last phase, taking into account the results of the in vitro test, an experiment was developed in which the effect of the inclusion of 700 gr / day of sunflower oil in the diet of lactating cows was evaluated, on the gene expression of breast tissue. Thirteen differentially expressed genes (DEGs) were identified, which mainly participate in immune response processes, cell differentiation and membrane transport, in addition, the most abundant genes within
en tejido mamario
the mammary transcriptome corresponded to the main milk proteins (CSN1S1, CSN2, PAEP (LGB), CSN3, CSN1S2 and LALBA). Finally, the effect of lipid supplementation on the fatty acid profile of milk and on some blood metabolites was analyzed. From this analysis it was established that sunflower oil has significant effects on the lipid profile of milk, reducing the content of some of the short and medium chain SFAs. Additionally, it was identified that its inclusion at a rate of 700 gr / day in the diets of lactating cows did not affect the dry matter intake of the forage or the blood levels of the metabolites evaluated. The present research provides new knowledge regarding the impact of lipid supplementation on ruminal dynamics, metabolic profile and molecular mechanisms that develop in the mammary gland of lactating cows, contributing to the development of strategies from a genetic and nutritional approach to improving the compositional quality of dairy products.
Contenido
... Pág.
Resumen ... IX
Abstract ... ¡Error! Marcador no definido.
Lista de figuras ... XIX
Lista de tablas ... XX
Introducción ... 1
Referencias ... 4
1. Revisión bibliográfica ... 7
1.1 Consumo de alimentos lácteos y salud humana ... 7
1.2 Composición de la grasa láctea ... 11
1.3 Síntesis de la grasa láctea ... 13
1.3.1 Suministro de ácidos grasos exógenos al tejido mamario ... 15
1.3.2 Activación y transporte intracelular de los ácidos grasos ... 17
1.3.3 Síntesis de novo y desaturación de ácidos grasos ... 17
1.3.4 Síntesis de TAG y formación de glóbulos de grasa de la leche ... 18
1.4 Papel de los genes SCD1 y SREBP1 en la composición de los ácidos grasos de la leche ... 18
1.5 Implicaciones del metabolismo ruminal sobre la composición de la grasa láctea 20 1.5.1 Efecto de la suplementación con ácidos grasos insaturados sobre la calidad de la grasa de la leche ... 22
1.6 Genómica nutricional: una herramienta para el estudio de la interacción nutriente-gen ... 24
1.6.1 La dieta y su relación con la expresión de genes implicados en el metabolismo lipídico en glándula mamaria ... 27
1.7 Consideraciones finales ... 30
1.8 Referencias ... 32
2. Structure and genetic diversity of SCD1 gene and its association with production traits in Holstein cows ... 46
2.1 Abstract ... 46
2.2 Resumo ... 47
2.3 Introduction ... 48
génica en tejido mamario
2.4.1 Ethical considerations... 49
2.4.2 Área and populations of study ... 49
2.4.3 Dairy control ... 49
2.4.4 DNA extraction from blood cells ... 50
2.4.5 Identification of A293V polymorphism of SCD1 gene ... 50
2.4.6 Statistical analysis ... 51
2.5 Results ... 53
2.5.1 Allele and genotype frequencies ... 53
2.5.2 Genetic diversity ... 55
2.5.3 Structure and genetic differentiation of populations ... 56
2.5.4 Genotype effect on productive traits ... 56
2.6 Discussion ... 58
2.7 Conclusions ... 60
2.8 Acknowledgements ... 60
2.9 Bibliography ... 61
3. El polimorfismo A293V del gen SCD1 bovino está relacionado con el perfil de ácidos grasos de la leche en vacas Holstein ... 65
3.1 Resumen ... 65 3.2 Introducción ... 66 3.3 Materiales y métodos ... 68 3.3.1 Consideraciones éticas ... 68 3.3.2 Población de estudio ... 69 3.3.3 Toma de muestras ... 69
3.3.4 Extracción de DNA y análisis molecular ... 69
3.3.5 Análisis de composición de la leche y perfil de ácidos grasos ... 70
3.3.6 Índices de insaturación (DI) ... 72
3.3.7 Índice aterogénico (AI) ... 72
3.3.8 Análisis estadístico ... 73
3.4 Resultados... 73
3.5 Discusión ... 76
3.6 Conclusiones ... 79
3.7 Referencias ... 80
4. Biohidrogenación ruminal de tres fuentes lipídicas y su efecto sobre la digestibilidad de la materia seca y la fibra de dietas para vacas lecheras ... 85
4.1 Resumen ... 85 4.2 Highlights ... 86 4.3 Introducción ... 87 4.4 Materiales y métodos ... 89 4.4.1 Consideraciones éticas ... 89 4.4.2 Localización ... 89 4.4.3 Tratamientos e incubación ... 89
4.4.4 Composición química de la dieta y substratos ... 90
4.4.5 Análisis estadístico ... 94
4.5 Resultados... 95
4.5.1 Efecto de la inclusión de diferentes aceites sobre la DIVMS y la DIVFDN ... 95
4.5.2 Biohidrogenación de los principales ácidos grasos insaturados ... 96
4.6.1 Digestibilidad in vitro de la materia seca y la FDN ... 106
4.6.2 Biohidrogenación de los ácidos oleico, linoleico y linolénico ... 107
4.6.3 Principales intermediarios y productos finales de la biohidrogenación in vitro de los ácidos grasos insaturados de 18 carbonos ... 109
4.6.4 Efecto de la suplementación sobre DHA y las sumatorias de ácidos grasos 112 4.7 Conclusiones ... 114
4.8 Agradecimientos... 115
4.9 Referencias ... 116
5. RNA-seq differential gene expression analysis in mammary tissue from lactating dairy cows supplemented with sunflower oil ... 125
5.1 Abstract ... 126
5.2 Introduction ... 127
5.3 Materials and methods ... 128
5.3.1 Ethical considerations... 128
5.3.2 Animals and treatments ... 128
5.3.3 Estimation of forage consumption ... 131
5.3.4 Mammary tissue biopsies ... 132
5.3.5 RNA extraction and sequencing ... 133
5.3.6 Data processing ... 134
5.3.7 Validation by qRT–PCR ... 135
5.3.8 Statistic analysis ... 136
5.4 Results ... 136
5.4.1 Forage consumption ... 136
5.4.2 RNA extraction and sequencing ... 137
5.4.3 Differential gene-expression analysis ... 146
5.4.4 Enrichment analysis ... 153
5.4.5 Validation by qRT–PCR ... 153
5.5 Discussion ... 154
5.5.1 Forage consumption ... 154
5.5.2 RNA extraction and sequencing ... 155
5.5.3 Differential expression analysis ... 156
5.6 Conclusions. ... 159
5.7 Acknowledgements ... 159
5.8 Referencias ... 160
6. Consumo de materia seca, contenido de ácidos grasos de la leche y variables metabólicas de vacas suplementadas con aceite de girasol ... 169
6.1 Resumen ... 169
6.2 Introducción ... 170
6.3 Materiales y métodos ... 172
6.3.1 Consideraciones éticas ... 172
6.3.2 Animales y tratamientos ... 172
6.3.3 Estimación del consumo de EE y de ácidos grasos individuales ... 173
6.3.4 Análisis en leche y sangre ... 173
6.3.5 Análisis estadístico ... 174
6.4 Resultados y discusión ... 174
6.4.1 Consumo de materia seca del forraje ... 174
6.4.2 Consumo de extracto etéreo y de ácidos grasos individuales ... 177
Composición de la leche y de la grasa láctea ... 178
génica en tejido mamario
6.5 Conclusiones ... 188 6.6 Referencias ... 189
Lista de figuras
... Pág.
Figura 1-1. Síntesis de la grasa láctea en la célula epitelial de la glándula mamaria. ... 15 Figura 2-1: 145 bp amplified fragment in a region of SCD1 bovine gene. ... 54 Figura 2-2: Restriction patterns for SCD1 bovine gene using SatI endonuclease. ... 54 Figura 4-1. Cambios en la proporción de los ácidos grasos linolénico (A), linoleico (B) y
oleico (C) para los tratamientos evaluados durante los tiempos de incubación. ... 101
Figura 4-2. Cambios en la proporción de PUFA (A), MUFA (B) y SFA (C) para los
tratamientos evaluados durante los tiempos de incubación ... 105
Figure 5-1. Principal component analysis for the control group (CON) and the
supplemented group (OIL) ... 145
Figure 5-2. Volcano plot of the expressed genes indicating the differentially expressed
genes (DEG) with an absolute fold-change value of 2 and a false discovery rate <0.15. ... 146
Lista de tablas
... Pág.
Tabla 1-1. Contenido de ácidos grasos de la leche proveniente de animales en diferentes
sistemas de alimentación. ... 13
Tabla 2-1: Description of the study population ... 49 Tabla 2-2: Allele and genotype frequencies of SCD1 bovine gene in four towns of Antioquia
... 55
Tabla 2-3: Heterocigocity and Hardy-Weinberg equilibrium for SCD1 bovine gen ... 55 Tabla 2-4: FST paired among four subpopulations from Antioquia ... 56
Tabla 2-5: Descriptive analysis for milk production, fat percentage, protein percentage, fat
kilograms and protein kilograms variables ... 57
Tabla 2-6: Average milk yield, fat percentage, protein percentage, fat kilograms and protein
kilograms for each genotype ... 57
Tabla 2-7: Linear regression parameters estimated for analyzing allele replacement ... 58 Tabla 3-1. Efecto del polimorfismo A293V del gen SCD1 sobre la composición de la leche
y el perfil de ácidos grasos de la grasa láctea de vacas Holstein ... 75
Tabla 4-1. Ingredientes y composición química del forraje y alimento balanceado ... 91 Tabla 4-2. Composición de ácidos grasos del forraje, alimento balanceado y aceites
evaluados ... 93
Tabla 4-3. Composición estimada de los ácidos grasos incubados en cada tratamiento a
partir de las materias primas utilizadas ... 94
Tabla 4-4. Digestibilidad in vitro de la materia seca y de la fibra en detergente neutro de
una dieta de forraje y concentrado, cuando se incluyen diferentes aceites ... 96
Tabla 4-5. Efecto de la inclusión de diferentes aceites, sobre la proporción de los
principales precursores e intermediarios de la biohidrogenación ruminal in vitro de los ácidos de 18 carbonos ... 99
Table 5-1. Ingredients and chemical composition of the experimental diets assessed.
Table 5-2. Lipid composition (g/100 g total fatty acid) of the diets assessed in this study
... 131
Table 5-3. Estimated forage, concentrate feed and energy intake consumption of the diets
... 137
Table 5-4. Classification of the genes expressed according to their level of expression in
the control group (CON) and the group supplemented with sunflower oil (OIL) ... 139
Table 5-5. Genes with the highest expression levels in all samples and their main functions
... 141
Table 5-6. Genes differentially expressed in mammary tissue of cows supplemented with
sunflower oil ... 147
Table 5-7. Main genes differentially expressed with absolute fold-change value >2 and
P-value <0.05 ... 149
Table 5-8. Differentially expressed genes related to lipid metabolism with an absolute
fold-change value >2 and a P-value <0.05 ... 151
Table 5-9: Gene ontology (GO) analysis for differentially expressed genes ... 153 Tabla 5-10: Correlations between the expression values obtained by RNA-seq and by
qRT–PCR ... 154
Tabla 6-1. Efecto de la suplementación con aceite de girasol sobre el consumo de materia
seca del forraje y la composición y concentración de ácidos grasos en la leche. ... 176
Tabla 6-2. Consumo de extracto etéreo y de ácidos grasos en vacas lactantes del grupo
control y suplementado con aceite de girasol ... 178
Tabla 6-3. Producción de grasa, acidos grasos totales e individuales en la leche de vacas
suplementadas con aceite de girasol ... 181
Tabla 6-4. Media, desviación estándar y nivel de significancia de algunos metabolitos
Introducción
La grasa de la leche y de los productos lácteos realizan un aporte importante de ácidos grasos principalmente saturados (SFA) y vitaminas esenciales en la dieta de los humanos, además juega un papel importante en los atributos sensoriales de estos alimentos. A pesar de esto, actualmente algunos
consumidores
han optado por reemplazar en su dieta la leche y los derivados lácteos, por productos descremados osustitutos
como las bebidas vegetales, con el fin de reducir el consumo de SFA, los cuales desde tiempo atrás se han relacionado con un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares(Forouzanfar et al.
2015)
. Sin embargo, estudios recientes muestran que el consumo de productos lácteos tiene efectos benéficos para la salud, debido a la gran cantidad de nutrientes que conforman la matriz compleja de este alimento, los cuales interactúan entre sí y determinan sus propiedades nutricionales(Feeney y McKinley 2020)
. Dentro de estos nutrientes se encuentran algunos ácidos grasos insaturados con efectos cardioprotectores que se encuentran exclusivamente en alimentos de rumiantes como el ácido linoleico conjugado (CLA) y el transvaccénico (TVA)(Bruen et al. 2017)
. Adicionalmente, algunas evaluaciones indican que el consumo de productos lácteos enriquecidos con ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) tiene efectos favorables sobre algunos biomarcadores de salud cardiovascular, por lo cual la modificación natural del perfil de ácidos grasos de la leche ofrece una estrategia para reducir la ingesta de SFA de los consumidores, al tiempo que conserva los beneficios nutricionales y cardiometabólicos de la matriz alimentaria láctea(Givens 2017; Markey et al. 2017)
.En los sistemas de producción de lechería especializada del país, los animales se encuentran bajo pastoreo con una base forrajera conformada principalmente por gramíneas las cuales son ricas en PUFA. Estas condiciones especiales de alimentación hacen que la leche presente un perfil de ácidos grasos con un menor contenido de SFA y mayores de UFA (incluyendo CLA), en comparación con los encontrados en los sistemas de producción en donde los almidones y ensilajes tienen una importante participación. Si bien los niveles basales de UFA en la leche de animales en pastoreo es mayor, se pueden
alcanzar mejores niveles a través de la inclusión de aceites vegetales en la dieta de las vacas lactantes (Palmquist y Griinari, 2006; Angulo et al., 2012b; Kouba et al., 2019), sin embargo la incorporación de estos compuestos en la leche no solo dependen de la estructura de la dieta sino también de la transformación que sufren los ácidos grasos insaturados dietarios y de la formación de compuestos intermediarios a nivel ruminal producto de la biohidrogenación (Chilliard et al., 2007; Doreau & Ferlay, 2015). Adicionalmente, el metabolismo de los lípidos en la glándula mamaria a partir del cual se realiza la síntesis de novo de los ácidos grasos de cadena corta y media presentes en la leche, sumado a los ácidos grasos provenientes de la movilización de reservas corporales durante los periodos de déficit energético (Bernard et al. 2018), son factores que influyen en el contenido de ácidos grasos de la leche, por lo que sus variaciones y efectos combinados hacen que la respuesta animal no sea siempre la misma cuando se pretenden establecer estrategias para la modificación del perfil lipídico de la grasa láctea
(Kalač y
Samková 2010; Hanus et al. 2018)
.El complejo proceso de síntesis y secreción de la grasa realizado por la glándula mamaria, requiere de una eficiente captura de nutrientes por el tejido mamario y la coordinación en la expresión y regulación de múltiples genes. Aunque se han dado grandes avances en el conocimiento de la fisiología de la glándula mamaria lactante, los mecanismos de adaptación implicados en la biosíntesis y secreción de los ácidos grasos de la leche siguen siendo en gran medida desconocidos. Una mejor comprensión de la regulación de la síntesis de la grasa láctea dentro de la glándula mamaria, es fundamental para el desarrollo de estrategias que permitan mejorar el balance energético de la vaca lactante y mejorar el valor nutricional de la leche para los consumidores humanos
(Bernard et al. 2013)
. Es así como la genómica nutricional al estudiar los mecanismos moleculares implicados en la interacción alimento-genotipo y cómo ésta afecta el fenotipo(Kaput y Rodriguez 2004)
, se ha convertido en una poderosa herramienta que permite definir los genes y vías moleculares relacionadas con los cambios en la alimentación y/o las características fenotípicas.Por otro lado, las variaciones significativas en el nivel de insaturación de los ácidos grasos de la leche entre vacas de la misma raza y recibiendo la misma dieta, sugieren que la genética juega un papel importante y que las variaciones dentro de los genes que codifican para enzimas clave en el metabolismo de los lípidos podrían estar asociadas con las
concentraciones de algunos ácidos grasos de la leche. Tal es el caso de la enzima steaoryl CoA desaturasa (SCD1) la cual es responsable de la conversión de los ácidos grasos saturados C10:0 – C18:0 a sus respectivos MUFA, además está involucrada en la síntesis de ácido linoleico conjugado (CLA) en la glándula mamaria de los rumiantes (Corl et al., 2001). La identificación de las frecuencias de variantes alélicas para el gen SCD1 entre las vacas Holstein de algunos hatos del norte de Antioquia, además de establecer si existe alguna asociación de los genotipos con algunas características productivas, son el primer paso para comprender de una mejor manera los efectos genéticos sobre la composición de ácidos grasos de la leche y el futuro establecimiento de programas de evaluación genómica como estrategia a largo plazo para obtener leche con mayor contenido de ácidos grasos insaturados.
Teniendo
en cuenta todo lo anterior, la presente investigación tuvo como objetivo evaluar la relación del polimorfismo A293V del gen SCD1 con la composición de la leche y la grasa láctea, así como el efecto de la suplementación lipídica, sobre el perfil de ácidos grasos de la leche, algunos parámetros metabólicos y su asociación con la expresión génica en tejido mamario de vacas Holstein lactantes. Con el fin de mostrar de una manera organizada los principales hallazgos de la investigación, el documento se encuentra dividido en seis capítulos. En el capítulo uno se realiza una revisión de los tópicos más relevantes relacionados con esta investigación, dentro de ellos se encuentran la calidad composicional de la leche, los mecanismos de síntesis y secreción de la grasa láctea, el papel de algunas variantes génicas sobre la síntesis de ácidos grasos insaturados de la leche, las implicaciones del metabolismo ruminal en el perfil lipídico de la leche y el uso de la genómica nutricional como herramienta clave en estudios de producción animal. Después de esto, se encuentran los capítulos dos y tres en los que se describen los principales hallazgos en cuanto al polimorfismo A293V del gen SCD1 y su importante efecto sobre el contenido y composición de la grasa en la leche. En el cuarto capítulo se muestran los resultados de una prueba in vitro realizada con el fin de seleccionar la dieta o tratamiento que sería llevado al ensayo in vivo. Para esto se hizo una comparación en la biohidrogenación ruminal de los aceites de girasol (GI), linaza (LIN) y pescado (PES) y su efecto sobre la DIVMS y la DIVFDN. En el capítulo quinto se hace una descripción del transcriptoma de tejido mamario de vacas Holstein en respuesta a la inclusión de aceite de girasol en la dieta y en el capítulo seis, se analiza la composición de la grasa de la leche de animales suplementados con este aceite y algunas variables metabólicas. En elapartado final se enumeran algunas conclusiones y consideraciones finales del trabajo investigativo.
Referencias
Angulo J, Mahecha L, Nuernberg K, Nuernberg G, Dannenberger D, Olivera M, Boutinaud M, Leroux C, Albrecht E, Bernard L (2012) Effects of polyunsaturated fatty acids from plant oils and algae on milk fat yield and composition are associated with mammary lipogenic and SREBF1 gene expression. Animal 6, 1961–1972.
doi:10.1017/S1751731112000845.
Bernard L, Bonnet M, Delavaud C, Delosière M, Ferlay A, Fougère H, Graulet B (2018) Milk Fat Globule in Ruminant: Major and Minor Compounds, Nutritional Regulation and Differences Among Species. European Journal of Lipid Science and Technology 120,. doi:https://doi.org/10.1002/ejlt.201700039.
Bernard L, Leroux C, Chilliard Y (2013) Nutritional regulation of mammary lipogenesis and milk fat in ruminant : contribution to sustainable milk production. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias 26, 292–302.
Bruen R, Fitzsimons S, Belton O (2017) Atheroprotective effects of conjugated linoleic acid. British Journal of Clinical Pharmacology 83, 46–53. doi:10.1111/bcp.12948.
Chilliard Y, Glasser F, Ferlay A, Bernard L, Rouel J, Doreau M (2007) Diet, rumen biohydrogenation and nutritional quality of cow and goat milk fat. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 109, 828–855. doi:10.1002/ejlt.200700080.
Corl BA, Baumgard LH, Dwyer DA, Griinari JM, Phillips BS, Bauman DE (2001) The role of Δ9-desaturase in the production of cis-9, trans-11 CLA. The Journal of Nutritional Biochemistry 12, 622–630. doi:10.1016/S0955-2863(01)00180-2.
Doreau M, Ferlay A (2015) Digestion and utilisation of fatty acids by ruminants. Animal Feed Science and Technology 45, 379–396. doi:10.1016/0377-8401(94)90039-6.
Feeney EL, McKinley MC (2020) “The dairy food matrix: What it is and what it does.” (Elsevier Inc.) doi:10.1016/b978-0-12-815603-2.00008-5.
Forouzanfar MH, Alexander L, Bachman VF, Biryukov S, Brauer M, Casey D, Coates MM, Delwiche K, Estep K, Frostad JJ, Astha KC, Kyu HH, Moradi-Lakeh M, Ng M, Slepak E, Thomas BA, et al. (2015) Global, regional, and national comparative risk assessment of 79 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks in 188 countries, 1990-2013: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. The Lancet 386, 2287–2323. doi:10.1016/S0140-6736(15)00128-2.
Givens DI (2017) Saturated fats, dairy foods and health: A curious paradox? Nutrition Bulletin 42, 274–282. doi:10.1111/nbu.12283.
Hanus O, Samkova E, Křížova L, Hasoňova L, Kala R (2018) Role of fatty acids in milk fat and the influence of selected factors on their variability—a review. Molecules 23, 1– 32. doi:10.3390/molecules23071636.
Kalač P, Samková E (2010) The effects of feeding various forages on fatty acid composition of bovine milk fat: A review. Czech Journal of Animal Science 55, 521–537. doi:10.17221/2485-cjas.
Kaput J, Rodriguez RL (2004) Nutritional genomics: the next frontier in the postgenomic era. Physiological genomics 16, 166–177. doi:10.1152/physiolgenomics.00107.2003. Kouba JM, Burns TA, Webel SK (2019) Effect of dietary supplementation with long-chain n-3 fatty acids during late gestation and early lactation on mare and foal plasma fatty acid composition, milk fatty acid composition, and mare reproductive variables. Animal Reproduction Science 203, 33–44. doi:10.1016/j.anireprosci.2019.02.005.
Markey O, Vasilopoulou D, Kliem KE, Koulman A, Fagan CC, Summerhill K, Wang LY, Grandison AS, Humphries DJ, Todd S, Jackson KG, Givens DI, Lovegrove JA (2017) Plasma phospholipid fatty acid profile confirms compliance to a novel saturated fat-reduced, monounsaturated fat-enriched dairy product intervention in adults at moderate cardiovascular risk: a randomized controlled trial. Nutrition Journal 16,. doi:10.1186/s12937-017-0249-2.
combinations of sunflower and fish oils in the diet. Animal Feed Science and Technology 131, 358–369. doi:10.1016/j.anifeedsci.2006.05.024.
1.
Revisión bibliográfica
1.1 Consumo de alimentos lácteos y salud humana
La leche y los productos lácteos son alimentos ricos en nutrientes. Proporcionan energía y una gran cantidad de proteínas y micronutrientes, entre los que se incluyen: calcio, magnesio, selenio, riboflavina y vitaminas B5 y B12, que son fundamentales para reducir el hambre y la desnutrición, en especial entre los más vulnerables (por ejemplo: mujeres embarazadas y niños). La mayoría de los países que poseen lineamientos para la alimentación recomiendan los lácteos como un componente de una dieta balanceada. A nivel mundial, la leche aporta en promedio 134 kcal de energía/persona por día, 8,3 g de proteínas/persona por día y 7,6 g de grasas/persona día, representando el 5%, 10% y 9% del suministro total de energía, proteínas y grasas, respectivamente. Es la quinta fuente de energía más grande y la tercera fuente de proteínas y grasas para los humanos, adicionalmente, los productos lácteos son una fuente de nutrición asequible para obtener los niveles recomendados de estos nutrientes (Food and agriculture organization of the united nations, 2018).
El consumo per cápita de leche y productos lácteos es mayor en los países desarrollados, pero la diferencia con muchos países en desarrollo se está reduciendo como consecuencia del aumento de la demanda en respuesta a un mayor nivel de los ingresos, el crecimiento demográfico, la urbanización y los cambios en los regímenes alimentarios. Esta tendencia es más pronunciada en Asia oriental y sudoriental, especialmente en países muy poblados como China, Indonesia y Vietnam. La creciente demanda de leche y productos lácteos ofrece a los productores (y a otros actores de la cadena láctea) ubicados en las zonas cercanas a las ciudades y que presentan un alto potencial productivo, una buena oportunidad para mejorar sus condiciones de vida mediante el aumento de la producción (Food and agriculture organization of the united nations, 2018).
Para el año 2016 el consumo percápita de leche a nivel mundial fue en promedio de 111 litros por habitante, el cual ha ido aumentado desde los últimos años a la par que el número de habitantes. Sin embargo, este consumo está muy por debajo del recomendado por la FAO y la organización mundial de la salud (OMS), el cual está alrededor de los 180 litros por año. En el mundo hay países que superan los 300 litros por persona por año en contraste con otros que no superan los 50 litros. Los países desarrollados presentan un consumo promedio de 240 litros mientras que los países en vía de desarrollo 80 litros por persona por año (Food and agriculture organization of the united nations, 2018). En el caso de Colombia, según cifras reportadas por FEDEGAN el consumo aparente percápita anual de leche para el 2019 fue de 158 litros/habitante, sin embargo, es un consumo por debajo del promedio mundial, lo cual constituye una oportunidad de crecimiento del sector.
Durante muchos años el consumo de ácidos grasos saturaros (SFA por sus siglas en inglés) se ha considerado como un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares (ECV), las cuales representan una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en gran parte de la población mundial (Forouzanfar et al., 2015). Diferentes estudios han establecido un efecto de SFA sobre el incremento en los niveles de lípidos sanguíneos como las lipoproteínas de baja densidad (LDL por sus siglas en inglés) (Vafeiadou et al., 2015) y sobre otros factores de enfermedad cardiometabólica (Siri-Tarino et al., 2016), es por esto que como medida de prevención, instituciones como la organización mundial de la salud (World Health Organisation) recomiendan reducir el consumo de SFA a menos del 10% del total de energía consumida (WHO, 2018). Sin embargo, los recientes meta-análisis de estudios de cohorte prospectivos y de ensayos controlados aleatorizados, son bastante contrastantes en sus resultados, ya que algunos afirman que existe una relación entre el consumo de SFA y ECV (Chait y Kim, 2010; Kim et al., 2020; Mazidi et al., 2020) mientras que otros encuentran un efecto neutro e inclusive benéfico (Dias et al., 2014; De Souza et al., 2015).
Estas discrepancias son explicadas en parte porque no todos los SFA son iguales y sus efectos dependen de sus características individuales como por ejemplo el tamaño, el número de dobles enlaces que contiene, entre otros (Markey y Kliem, 2020). Adicionalmente, las investigaciones se han centrado en el papel de un nutriente e ignoran el hecho que los alimentos consisten en una gran cantidad de nutrientes diferentes que están contenidos en una matriz compleja y que la naturaleza de su estructura y de los
nutrientes que contiene determinarán la digestión, absorción y las propiedades nutricionales de los alimentos (Siri-Tarino et al., 2016; Soedamah-Muthu y Guo, 2020). Así mismo, el incluir un nutriente en la dieta durante una prueba, implica la disminución en el consumo de otro, por lo cual debe considerarse dentro de los resultados el efecto de los nutrientes eliminados (Hosseini-Esfahani et al., 2020).
Siendo la leche y los productos lácteos una fuente importante de grasa y de ácidos grasos para gran parte de la población mundial, se han realizado numerosos estudios para determinar la asociación entre el consumo de estos productos con el riesgo de enfermedades cardiovasculares, principalmente por su contenido de SFA (Givens y Lovegrove, 2020). Los estudios prospectivos más recientes han encontrado que el consumo de lácteos muestra asociaciones neutrales o incluso beneficiosas con el riesgo de enfermedad cardiometabólica (diabetes tipo 2 y cardiopatía coronaria), sugiriendo que la matriz de los alimentos lácteos parece jugar un papel importante en los efectos que tiene el consumo de estos productos en los lípidos en sangre, aunque estos resultados deben interpretarse con cuidado debido a la considerable heterogeneidad de los estudios (Soedamah-Muthu y Guo, 2020).
Pese a la información científica actual, muchos consumidores realizan un control de la cantidad de SFA provenientes de la leche que ingresan a su dieta, a través de la introducción de productos desnatados industrialmente, reduciendo el consumo de alimentos lácteos o incluso reemplazándolos por los denominados sustitutos de la leche dentro de los cuales se incluyen las bebidas vegetales. La visibilidad de varios nuevos sustitutos de la leche en los estantes de los supermercados es evidencia del incremento en la demanda del consumidor por este tipo de productos (Walsh y Gunn, 2020). Cifras de estudios de mercado de Euromonitor (www.euromonitor.com) indican que las ventas aumentaron más del doble entre 2009 y 2015 y han seguido creciendo exponencialmente desde entonces. Proyecciones similares de Nielsen (www.nielsen.com) indican una tasa de crecimiento anual continuo entre el 8% y el 12% hasta 2020 (Walsh y Gunn, 2020). Colombia no ha sido la excepción a esta tendencia, ya que según cifras publicadas en el diario la república, dentro de Suramérica, es el tercer país con mayor consumo de bebidas vegetales, solo por debajo de México con 23.7 millones de litros y Brasil con 2,6 millones de litros, los cuales son países con un número de habitantes muy superior al nuestro (Guevara Benavides, 2018). Si bien esta cifra puede parecer menor en comparación con
el volumen de consumo de leche bovina nacional, no se puede ignorar que es un mercado en expansión, con un crecimiento proyectado del 48% para el 2022 (Guevara Benavides, 2018).
Existen grandes diferencias en la composición química entre la leche bovina y las bebidas vegetales, siendo estas últimas suspensiones de material vegetal disuelto en agua que en apariencia se asemeja a la leche (Sethi et al., 2016), las cuales a menudo son fortificadas con calcio y vitaminas para mejorar su valor nutricional (Walsh y Gunn, 2020). En contraste, la leche bovina y los productos lácteos tienen un alto contenido de Ca, K y Mg quienes han sido asociados con reducciones en la presión arterial, además, las caseínas de la leche y las proteínas del suero son fuente de péptidos bioactivos, los cuales han sido reconocidos como reguladores de la presión arterial en un pequeño número de estudios en humanos (Jäkälä y Vapaatalo, 2010; Livingstone et al., 2012). Así mismo, contiene ácidos grasos insaturados con efectos cardioprotectores que se encuentran exclusivamente en los alimentos de rumiantes (carne y leche) (Bruen et al., 2017). Dicho esto, la reducción en el consumo o la eliminación en la dieta, de la leche y los productos lácteos no es una estrategia ideal para la menor ingestión de SFA ya que se limita la ingesta de los demás nutrientes presentes en la leche y de estos compuestos potencialmente protectores (Livingstone et al., 2012).
La modificación natural del perfil de ácidos grasos de los productos lácteos ofrece una estrategia para reducir la ingesta de SFA de los consumidores, al tiempo que conserva los beneficios nutricionales y cardiometabólicos de la matriz alimentaria láctea (Givens, 2017; Markey et al., 2017). En una investigación reciente, se evaluó el efecto del consumo de leche y productos lácteos en los cuales se reemplazó parte de los SFA por ácidos grasos insaturados mediante la suplementación en la dieta de vacas con aceite de girasol alto en oleico, sobre algunos biomarcadores de enfermedad cardiovascular, metabolismo de lípidos, función vascular e inflamación, en una población adulta con riesgo moderado de enfermedad cardiovascular (Markey et al., 2014; Markey et al., 2017). Los hallazgos recientes de este proyecto sugieren que el consumo de productos lácteos enriquecidos con MUFA y reducido en SFA durante un período de 12 semanas atenuó el aumento de las concentraciones séricas de LDL en ayunas y tuvo un efecto beneficioso sobre la función endotelial en comparación con la leche, el queso y la mantequilla con una composición de ácidos grasos convencional (Vasilopoulou et al., 2020).
Para poder realizar cambios deseables en el perfil de ácidos grasos, es necesario tener en cuenta los diversos factores que influyen en la composición de la grasa de la leche, dentro de los cuales se encuentran la raza (componente genético), el número de parto, la etapa de la lactancia, la dieta y el individuo (Palmquist et al., 1993; Foltys y Kirchnerová, 2012; Hanus et al., 2018; Samková et al., 2018). Sin embargo, estos factores continúan siendo estudiados por su amplia gama de variaciones y el gran número de posibles efectos combinados (Kalač y Samková, 2010; Hanus et al., 2018), los cuales hacen que la respuesta animal no sea siempre la misma cuando se pretenden establecer estrategias para la modificación del perfil de ácidos grasos de la leche.
1.2 Composición de la grasa láctea
La composición de la leche es una variable importante para la producción de derivados lácteos, ya que con un mayor contenido de sólidos se obtiene una mayor eficiencia en su producción, además el sistema de pago al productor bonifica el precio de litro de leche cuando tiene un mayor contenido de sólidos como grasa y proteína. El carácter biológico de la leche hace que sea muy variable en su composición y dicha variabilidad es necesario tenerla en cuenta cuando se evalúa su calidad. Existen diferencias en la composición de la leche entre razas; también varía durante el ciclo de lactancia y con el régimen alimenticio. El factor que presenta mayor variación en este sentido es la grasa, cuyo contenido y composición se ven influenciados por diversos aspectos relacionados con la genética, la época del año, la fase y el número de la lactancia, y principalmente por la alimentación (Piñeros et al., 2005).
La grasa de la leche bovina está conformada por aproximadamente 98% de triglicéridos, una pequeña cantidad de 1-2 diacilglicéridos y monoglicéridos (0,02%), ácidos grasos libres (0,22%) y menos del 2% de lípidos polares (Jensen et al., 1991; Angulo et al., 2009; Bernard et al., 2013). Los triglicéridos están constituidos por una unidad de glicerol al que están esterificados tres ácidos grasos en las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3 mientras que los lípidos polares varían su estructura de acuerdo al grupo al que se refiera (fosfoglicéridos, esfingolípidos y colesterol). La composición de los ácidos grasos (FA
por sus siglas en
inglés
) varía entre los tipos de lípidos. Los ácidos grasos insaturados (UFApor sus siglas
en inglés
) predominan en los fosfoglicéridos (70% insaturados, 30% saturados), mientras que los ácidos grasos saturados (SFA) predominan en los triglicéridos (30% insaturados,70% saturados), esfingolípidos (20% insaturados, 80% saturados) y glucolípidos (20% insaturados, 80% saturados) (Smith y Lowry, 1962).
De manera general se ha descrito que la grasa de la leche bovina está compuesta por 70% de SFA, 25% de monoinsaturados (MUFA
por sus siglas en inglés
) y 5% de poliinsaturados (PUFApor sus siglas en inglés
), sin embargo, la cantidad de grasa de la leche y su composición es muy variable ya que depende del metabolismo de los lípidos en el rumen, del metabolismo lipídico en la glándula mamaria y de los ácidos grasos liberados de las reservas corporales durante el balance energético negativo al inicio de la lactancia (Bernard et al., 2018). Los procesos metabólicos en el rumen y la composición de la microbiota ruminal se ven afectados por factores nutricionales, especialmente por el tipo de forraje, la relación forraje:concentrado, el uso de suplementos lipídicos y también por la interacción de estos factores que resultan en cambios en el flujo duodenal y en la proporción de cada ácido graso (Bernard et al., 2018). Teniendo en cuenta esto, la leche producida bajo los sistemas de producción colombianos, en los cuales los animales se encuentran en pastoreo permanentemente, presenta un perfil de ácidos grasos con un menor contenido de SFA y mayores de UFA con atributos benéficos para la salud como por ejemplo el ácido linoleico conjugado (CLApor sus siglas en inglés
), en comparación a los encontrados en la leche de animales en sistemas de producción donde los alimentos concentrados ricos en almidones tienen una importante participación en la dieta de los animales. Como ejemplo de esto, en la tabla 1-1 se puede observar en un trabajo realizado en Uruguay, el incremento en el contenido de 16:1 cis-9, 18:1 cis-9, 18:1 trans-11 y 18:2 cis-9 trans-11 (CLA), así como una reducción en SFA y un aumento en MUFA, entre animales que recibieron una dieta TMR exclusiva y los que adicionalmente tuvieron acceso a 8 horas de pastoreo al día. Así mismo, al comparar estos valores con los reportados en sistemas en pastoreo de lechería tropical y especializada del país, se nota en estos últimos, un mayor aporte de CLA y un perfil más saludable desde el punto de vista del aporte de SFA que realiza.Tabla 1-1. Contenido de ácidos grasos de la leche proveniente de animales en diferentes
sistemas de alimentación.
Uruguaya Colombia
Ácido graso (g/100g AG) Dieta TMR TMR y pastoreo Lecheríab tropical Lecheríac especializada Butírico (C4:0) 1,95 1,48 - 3,2 Capróico (C6:0) 2,03 1,56 1,31 2,2 Caprílico (C8:0) 1,66 1,32 0,99 1,3 Cáprico (C10:0) 4,14 3,42 1,78 3 Láurico (C12:0) 4,95 4,38 2,53 3,3 Mirístico (C14:0) 13,6 12,83 13,56 12,4 Miristoléico (C14:1:9-cis) 1,45 1,43 - 1,3 Palmítico (C16:0) 32,53 31,74 23,73 29,6 Palmitoléico (C16:1:9-cis) 1,81 2,07 1,58 1,6 Esteárico (C18:0) 9,39 9,96 16,61 11,8 Oléico (C18:1) 19 21,14 23,76 21,9 Trasvaccínico (C18:1 trans 11) 1,24 1,69 5,09 -
CLA (C18:2 cis 9, trans 11) 0,49 0,77 1,28 1,1
Linoléico (C18:2) 2,63 2,64 2,52 0,8
Linolénico (C18:3) 0,34 0,49 0,36 0,60
SFA 72,16 68,71 64,35 67,4
MUFA 24,39 27,29 31,04 23,5
PUFA 3,46 3,9 4,61 1,93
a Tomado de Mendoza et al., (2016) b Tomado de Prieto-manrique et al., (2016) c Tomado de Aguilar G. et al., (2009)
1.3 Síntesis de la grasa láctea
Los FA de la leche provienen de dos orígenes: los de cadena corta y media (C4:0 hasta C16:0), se derivan de la síntesis de novo en la glándula mamaria a través del complejo enzimático acetil CoA carboxilasa (ACC) y ácido graso sintetasa (FAS). Los precursores para su síntesis son el acetato y del 3-hidroxi butirato provenientes de la fermentación en el rumen de carbohidratos y de la absorción de butirato por el epitelio ruminal, los cuales viajan por sangre hasta el tejido mamario (figura 1-1). Los FA de cadena corta y media representan alrededor del 60% de los ácidos grasos secretados en la leche (Bauman et al., 2011). Por otro lado, los ácidos grasos de cadena larga (> 18C) y el 50% de los de 16 carbonos, son importados de la sangre y provienen de la movilización de reservas corporales en forma de ácidos grasos no esterificados (NEFA) o también pueden ser importados desde los triglicéridos en los quilomicrones y en las lipoproteínas de muy baja
densidad (VLDL) que circulan en la sangre, provenientes de la dieta y el metabolismo ruminal, a través de la enzima lipoprotein lipasa (LPL) (Barber et al., 1997; Clegg et al., 2001; Angulo et al., 2009; Bernard et al., 2013).
Dentro de los ácidos grasos encontrados en la leche sobresalen algunos por tener propiedades benéficas para la salud de los consumidores, por ejemplo, el ácido butírico (C4:0), el ácido tansvaccénico (TVA, trans-11, 18:1) y los ácidos linoleicos conjugados (CLA). Dentro del CLA se encuentra el ácido ruménico (CLA 18:2 9-cis, 11-trans) el cual se origina del rumen (7%) o de síntesis de novo (93%) en el retículo endoplasmático de la célula endotelial mamaria (MEC), a partir del ácido trans vaccénico (TVA) que proviene del rumen. Este proceso es conocido como desaturación y es llevado a cabo por medio del complejo enzimático Δ9 desaturasa conocido también como estearoil CoA desaturasa (SCD) que lleva a cabo la formación de los ácidos miristoleico (C14:1), palmitoleico (C16:1), y oleico (C 18:1 cis-9), utilizando como sustratos el ácido mirístico (C14:0), palmítico (C16:0), y esteárico (C18:0), respectivamente (Angulo et al., 2009). En la glándula mamaria bovina es posible la desaturación pero no la elongación de cadenas de más de 16 carbonos debido a que no existen las enzimas necesarias para hacerlo (Chilliard et al., 2000).
Figura 1-1. Síntesis de la grasa láctea en la célula epitelial de la glándula mamaria.
ACC: acetil Coa carboxilasa, AGPAT: acil glicerol fosfato acil transferasa, CD36: ácido graso translocasa, CLD: droplet lipídico citoplasmático, CoA: coenzima A, CM: quilomicrón, DGAT: diacil glicerol acil transferasa, ER: retículo endoplasmático; FA: ácido graso, FABP: ácido graso unido a proteína, FAS: ácido graso sintetasa, Glut1: transportador de glucosa 1, GPAT: glicerol 3 fosfato acil transferasa, LPL: lipoprotein lipasa, MFG: glóbulo de grasa lácteo, SCD: estearoil CoA desaturasa, TG: triglicérido, VLDL: lipoproteína de muy baja densidad (tomado de Bernard et al., 2013).
1.3.1 Suministro de ácidos grasos exógenos al tejido mamario
Los NEFAS que se encuentran en la circulación sanguínea provienen principalmente del metabolismo del tejido adiposo en donde inicialmente se realiza el proceso de síntesis de ácidos grasos a partir de los excedentes de acetato producido en la fermentación ruminal y que son almacenados como triglicéridos. Posteriormente, dependiendo de las necesidades energéticas del animal, se da la liberación de estos ácidos grasos a través de la lipólisis y son llevados por la sangre a diferentes tejidos. Para que los NEFAS que se encuentran en la circulación sanguínea puedan ingresar a la célula epitelial mamaria, es necesaria la actividad de una o más proteínas de unión o traslocadoras (Clegg et al., 2001).
Cuando las lipoproteínas son la fuente de ácidos grasos, su núcleo de triglicéridos debe ser primero hidrolizado extracelularmente por la lipoprotein lipasa (LPL) en cooperación con el receptor de VLDL (VLDLR). Esta enzima se encuentra ubicada en la superficie luminal de los capilares del tejido mamario y tiene una preferencia por la hidrólisis de los ácidos grasos ubicados en la posición sn-1 (3) de los triglicéridos de las lipoproteínas, donde generalmente se encuentran ubicados los ácidos grasos palmitato, estearato y oleato. Una vez dada la hidrólisis, los ácidos grasos liberados difunden lateralmente en el borde exterior de la membrana plasmática de las células endoteliales, cruzando a las células adyacentes en los puntos de contacto celular y llegando finalmente a la membrana basal de la célula epitelial mamaria (MEC) (Clegg et al., 2001). Un gradiente de concentración de ácidos grasos es necesario para darle dirección a esta difusión, por lo cual existen traslocadores o proteínas de unión que asisten el paso de ácidos grasos desde el dominio basal de la membrana plasmática hasta la MEC, como lo son la proteína de unión a ácido graso (FABP) y el receptor FAT/CD36 (Clegg, 1981; Brandt et al., 1988).
Existen diferencias significativas entre rumiantes y monogástricos desde el punto de vista del origen de los ácidos grasos que comprenden los triglicéridos de las lipoproteínas, las cuales se dan principalmente por diferencias en la fisiología digestiva y en el metabolismo hepático. En el caso de los rumiantes las lipoproteínas secretadas por los enterocitos (quilomicrones y VLDL) constituyen una baja proporción de las lipoproteínas plasmáticas debido al bajo contenido de lípidos que contienen las dietas basadas en forraje. En el hígado de los monogástricos, se ha demostrado que los ácidos grasos exógenos (los que no son sintetizados por el hepatocito) son llevados preferentemente hacia la esterificación y empaquetamiento en VLDL (Zammit, 1996), estos ácidos grasos provienen principalmente de la dieta a través de la VLDL intestinal, drenando primero al sistema linfático y desde allí a la circulación periférica. Cuando los ácidos grasos de la dieta no están disponibles, la síntesis hepática de novo compensa parcialmente el suministro de ácidos grasos para la esterificación y secreción de VLDL hepática, aunque en una menor proporción. En los rumiantes, en contraste, el suministro de ácidos grasos al hígado provenientes de la dieta es poco y los hepatocitos carecen de la capacidad enzimática para la síntesis de novo de ácidos grasos. Así, por defecto, la principal fuente de ácidos grasos hepáticos de los rumiantes son los NEFA plasmáticos. Es por esto que los niveles de triglicéridos sanguíneos son menores en rumiantes y que mientras en monogástricos hay diferencias significativas entre la composición de ácidos grasos de las lipoproteínas y de
los NEFAS, estas diferencias son mucho menos marcadas en rumiantes (Clegg et al., 2001).
1.3.2 Activación y transporte intracelular de los ácidos grasos
Una vez que los ácidos grasos de cadena larga atraviesan la membrana, son esterificados con acetil CoA (CoA) antes de participar en las vías metabólicas, esta actividad enzimática es realizada por una familia de isoformas llamada acil-CoA sintetasa de cadena larga (ACSL) (Mashek y Coleman, 2006; Bionaz y Loor, 2008). Para la activación de los ácidos grasos de cadena corta, también existe una familia de enzimas denominada acil-CoA sintetasa de cadena corta (ACSS) las cuales tienen una gran afinidad por el acetato ya que la activación de este compuesto, es un paso fundamental para la síntesis de novo de ácidos grasos y para su utilización como fuente de carbono para la generación de energía (Fujino et al., 2001; Bionaz y Loor, 2008). Los ácidos grasos requieren ser transportados en el interior de la célula hacia las organelas en las cuales serán utilizados, para esto son utilizados trasportadores específicos como la proteína de unión a ácidos grasos (FABP) y la proteína de unión a Acil-CoA (ACBP o DBI) (Mcarthur et al., 1999; Bionaz y Loor, 2008). Algunos autores han reportado una relación positiva entre la FABP y la estearoil CoA desaturasa (SCD) indicando una función coordinada entre estas dos proteínas de tal manera que la FABP provee a la SCD de estearoil CoA o de otros sustratos como el 16:0 o el trans-11 18:1, para insertar una insaturación en el carbono 9 de estos ácidos grasos, los cuales serán utilizados posteriormente por las enzimas implicadas en la síntesis de TAG (Bernard et al., 2008; Bionaz y Loor, 2008).
1.3.3 Síntesis de novo y desaturación de ácidos grasos
La producción de ácidos grasos de cadena corta y de palmitato a partir de acetato, está bajo el control de la Acetil CoA calboxilasa alfa (ACACA), considerado el paso limitante de la tasa de síntesis de novo de ácidos grasos. En el siguiente paso el acetil CoA y el butiril CoA son el sustrato para la proteína multifuncional citosolica ácido graso sintasa, la cual tiene como producto final el palmitato y otros ácidos grasos de cadena corta (Palmquist, 2009).
Solo una pequeña fracción de los ácidos grasos absorbidos por la glándula mamaria son insaturados, debido al proceso de biohidrogenación ruminal, de este modo, la principal
enzima involucrada en la síntesis de ácidos grasos monoinsaturados es la estearoil CoA desaturasa. Dos isoformas de este gen han sido identificadas y caracterizadas en bovinos, la SCD1 y la SCD5. La SCD1 se ha identificado en tejido adiposo y mamario y la SCD5 se expresa casi exclusivamente en el cerebro (Lengi y Corl, 2007). La desaturación de los ácidos grasos de cadena muy larga es realizada por las enzimas ácido graso desaturasa 1 y 2 (FADS1 y FADS2 respectivamente), las cuales insertan un doble enlace en las posiciones 5 y 6 de los ácidos grasos polinsaturados, teniendo como producto final los ácidos araquidónico (20:4 n6), eicosapentaenoico (20:5 n3) y docosahexaenoico (22:6 n3) (Rodriguez-Cruz et al., 2006; Bionaz y Loor, 2008)
1.3.4 Síntesis de TAG y formación de glóbulos de grasa de la leche
Los Acil-CoA unidos a la FABP3 son utilizados como sustrato para la síntesis de TAG por medio de reacciones secuenciales de enzimas que se encuentran en el retículo endoplasmático. La primera en actuar es la glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAM) que es la encargada de insertar un Acil-CoA en la posición sn-1 del glicerol-3-fosfato. Luego, la enzima 1-acilglicerol-3-fosfato-aciltransferasa (AGPAT6) se encarga de insertar un Acil-CoA en la posición sn-2. Posteriormente la lipina1 (LPIN1) corta el grupo fosfato para formar diacilglicerol (DAG) y de esta manera se puede insertar el último Acil-CoA en la posición sn-3 por la acción enzimática de la diacilglicerol aciltransferasa (DGAT1) (Bionaz y Loor, 2008). Los glóbulos de grasa son formados en la membrana del retículo endoplasmático, a través de la incorporación de los triacilgliceroles (TAG) recién formados, el transporte hacia la membrana apical y su posterior liberación. En este proceso se encuentran involucradas las proteínas butirofilina (BTN1A1), xantina deshidrogenasa (XDH) y adipofilina (ADFP) (Robenek et al., 2006; Bionaz y Loor, 2008; Yadav et al., 2015b).
1.4 Papel de los genes SCD1 y SREBP1 en la composición
de los ácidos grasos de la leche
Las variaciones significativas en el nivel de insaturación de los ácidos grasos de la leche entre vacas de la misma raza y recibiendo la misma dieta, sugieren que la genética juega un papel importante en la determinación de la composición de la grasa láctea y que las variaciones dentro de los genes que codifican para enzimas clave en el metabolismo de los lípidos, podrían estar asociadas con las concentraciones de algunos ácidos grasos de
la leche. Tal es el caso de la enzima esteaoril Coa desaturasa (SCD1) la cual es responsable de la síntesis endógena del ácido linoleico conjugado en la glándula mamaria. Así mismo, la proteína de unión al elemento regulatorio de esterol (SREBP-1) juega un papel importante en la acumulación de ácidos grasos insaturados en la leche ya que actúa como factor de transcripción de varios genes implicados en el metabolismo lipídico, entre ellos el SCD1.
El gen SCD1 está localizado en el cromosoma 26 bovino, tiene una tamaño aproximado de 17Kb y está conformado por seis exones y cinto intrones (Schennink et al., 2008; Barton et al., 2010). Codifica para la enzima delta 9 desaturasa la cual se encuentra ubicada en el retículo endoplasmático y es responsable de insertar un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 realizando la conversión de los ácidos grasos saturados C10:0 – C18:0 a sus respectivos MUFA, además está involucrada en la síntesis de ácido linoleico conjugado (CLA) en la glándula mamaria de los rumiantes (Corl et al., 2001). Tres SNP han sido detectados en el marco abierto de lectura (ORF) en el exón 5 (Taniguchi et al., 2004; Kgwatalala et al., 2009), el tercer SNP causa una sustitución de una valina (alelo V) por una alanina (alelo A) en el residuo 293 de la proteína. Diferentes estudios han reportado una asociación significativa entre el genotipo para A293V y la composición de los ácidos grasos de la leche (Schennink et al., 2008; Kgwatalala et al., 2009), en particular el genotipo VV se ha asociado con mayor cantidad de C14:1 cis-9 (Conte et al., 2010).
El gen SREBP1 está localizado en el cromosoma 19, con un tamaño aproximado de 17Kb y está conformado por 19 exones (Hoashi et al., 2007). Tanto SREBP1 como SREBP2, se encuentran ubicadas en la membrana del retículo endoplásmico en sus formas inactivas, las cuales eventualmente son transportadas hasta el aparato de Golgi para su activación por clivaje proteolítico antes de entrar al núcleo y activar genes que contengan elementos de respuesta a esteroles como por ejemplo ACACA, FASN y SCD1. El transporte de las proteínas inactivas hacia el aparato de Golgi es bloqueado por esteroles a través de la proteína de detección de esteroles SCAP (proteína activadora del clivaje de SREBP). Además, las proteínas INSIG 1 y 2 interactúan con SCAP dependiendo de los niveles de oxisterol, regulando la capacidad de respuesta de SCAP para el procesamiento de SREBP1 y 2, ejerciendo este modo un control sobre la velocidad de la lipogénesis en tejido mamario (Espenshade y Hughes, 2007; Bionaz y Loor, 2008).
