INFORME ANUAL 1995 ,
LINEA 9
ESTRUCTURA, FUNCION Y MANIPUlAClON
DE PEPTIDOS Y PROTEINAS
9.1 Aislamiento y caracterizacion qufmica y funcional de enzimas y de toxinas de venenos de reptiles ponzofiosos
9.2 Purificacion
y
caracterizacion qufmica de toxinas de venenos de alacranesy
de 105genes que las codifican9.3 Aislamiento y caracterizacion de receptores especfficos, mediante el uso de toxinas peptfdicas
9.4 Caracterizacion funcional de toxinas peptfdicas
9.5 Purificacion y caracterizacion del activador del plasminogeno de la saliva de murcielagos hematofagos, y triatomidos mexicanos
9.6 Desarrollo y optimizacion de metodos y sistemas de purificacion de protefnas y peptidos 9.7 Produccion de anticuerpos monoclonales contra peptidos y protefnas
9.8 Ingenierfa de protefnas
9.9 Estudio de enzimas en condiciones de limitacion de agua 9.10 Evolucion dirigida de peptidos y protefnas
9.11 Estructura, funcion, regulacion y evolucion de 105dominios estructurales de 105 reguladores transcripcionales en bacterias
9.12 Sfntesis de peptidos para control de malaria
9.13 Aislamiento y caracterizacion de polipeptidos con afinidad a metales
9.14 Analisis del alosterismo enzimatico por metodos de cristalograffa de protefnas 9.15 Evolucion de la estructura y funcion de protefnas
PROGRAMA 9.1
Aislamiento y caracterizacion qufmica y funcional de enzimas y de toxinas de venenos de reptiles ponzofiosos
Los venenos de saurios yofidios ponzof\osos son fuentes muy ricas de enzimas. Por medio de cro-matograffa de afinidad ymetodos convencionales depurificacion, se han obtenido en forma homoge-nea una calicrefna ydos actividades de plasmino-geno del veneno del saurio
Heloderma horridum,
ade-mas de una toxina: "Helotermina", con actividad hipotermica. Su caracterizacion permite explicar, a nivel molecular, las relaciones filogeneticas del Heloderma con otros organismos ysu participa-cion en la fisiopatologfa de la intoxicacion porla mordedura de este animal. Asimismo, se estu-dian algunos componentes toxicos del veneno de la serpiente Taipan.
Tambien se realiza un estudio de tamizado pa-ra detectar estas y otras actividades enzimaticas en el veneno de una veintena de vfboras endemi-cas de nuestro pafs. Se explora su potencial en investigacion basica y aplicacion de estas herra-mientas tan selectivas.
eAislamiento ycaracterizacion de toxinas del ve-neno de laserpiente
Oxyuranus
scutellatus scutellatus
F.ZAMUDIO, V.CHIAPPINELLI YL.D.POSSANI I994/I/D/DRMB
INSTITUTO DE BIOTECNOlOGiA
-Cl
o
n
a
c
i6
n d
e
l gen
e
que
co
di
fica
par
a
l
a
h
e
l
o
t
e
r
-m
ina,
un
a
t
ox
in
a
del
ve
n
e
n
o
del H
e
l
oderma ho
r
r
i-d
um h
o
rridu
m
B. BECERRIL,J. M. MOCHCA, W D. SCHLEUNING,F Bo
U-VARYL.D.POSSANI I9891P/S/DRM B/DMM
-
P
uri
f
i
cac
i
6
n
y ca
r
ac
t
e
ri
zaci6
n d
e
un
a fos
f
o
li
pasa
d
el a
l
ac
r
an Hadruru
s
ca
n
ca/ourus
R.COSSIO,B. M. BRIAN, F ZAMUDIO, F CORONAS YL.D.
POSSANI 1991trlS/DRMB
PROGRAMA
9.2Purifi
c
aci6n
yca
r
ac
teriza
c
i
6
n qufmica
d
e
to
x
inas d
e
l
v
eneno d
e a
la
c
ranes
y
de los gen
es
que las codifi
ca
n
Los vene
n
os de m
u
c
h
as espec
i
es d
e
a
l
acra
ne
s
c
o
nt
ie
n
e
n
po
l
ipep
t
i
d
os y
pr
o
te
f
n
as a
lt
a
mente t
6-x
i
cos
para el h
o
mbre
.
EI
ais
lamiento
y
l
a c
ar
a
cte
-riza
c
i
6
n qufmic
a
de estos c
o
mponente
s t6x
icos
han permitid
o
de
s
cubrir el mecanismo m
o
lecular
d
e
ac
c
i
6
n d
e
l
os
mi
s
mo
s.
Entr
e
l
o
s anim
a
le
s
cu
-yo v
en
e
no h
a s
id
o a
mpliam
e
nt
e es
tudi
a
d
o
,
es
tan
l
as s
erpiente
s y
l
os a
lacr
a
ne
s
.
P
o
r me
dio d
e t
e
c
-n
icas c
r
o
m
a
t
og
r
a
fi
c
a
s
y e
le
c
tr
oc
in
e
t
i
c
as
se
ha
p
o
did
o s
ep
ara
r un
g
r
a
n numer
o d
e
po
l
i
p
ep
tid
os
y p
r
o
t
ef
n
as
n
e
ur
o
t
6x
ica
s co
n
efec
t
o
bl
o
qu
e
ad
o
r
sob
re rec
e
pt
o
re
s
(
a
c
e
til
co
lin
aJ
, canal
es
i
6
nic
os
(N
a
+
,
K+, Ca
+
+
)y una serie imp
o
rtante d
e
fun
c
io-n
es
fisiol6gica
s
como secreci6n pancre
a
tica,
hi-p
o
termia
y
l
i
bera
c
i
6
n d
e
n
e
urotransmi
s
ores
.
La
s
t
ox
in
as
han
s
ido purificada
s
a homo
g
enei
-d
a
d
y s
u c
o
mp
osici6
n de
a
min
oac
id
os
yl
a s
e
c
uen
-c
ia p
r
ima ria h
a
s
id
o
0esta
e
n
vf
a
s
de determ
i
nar
s
e
.
-A
is
l
a
mient
o y
c
a
ra
c
terizaci
6
n qufmica de t
ox
inas
del veneno del alacran Cent
r
uroid
es
noxiu
s
Hoffmann
L.D.POSSANI, B.M. MARTIN,A N. RAMIREZ,F CORONAS,
FZAMUDIO YE.CARBONE I982/P/S/DRMB
-
A
i
s
l
a
m
i
ent
o
y carac
t
e
ri
za
c
i6
n
de
una
tox
in
a
del
v
enen
o
d
e
l
a
l
ac
r
a
n C
e
nt
ru
r
oid
es
li
m
pi
d
u
s
l
impid
u
s
K
a
r
s
ch que af
ec
t
a a
crusta
ceos
c. BALDERASYL. D.POSSANII987/P/S/DRMB
-Ai
s
l
a
mient
o
de
ge
n
es
qu
e co
d
i
fican p
a
r
a
dif
e-r
e
nt
es
t
ox
in
as
de
a
l
ac
ran
es
B. BECERRIL, F ZAMUDIO, A VAZOUEZ, M. C. GARCIA,
F Bo UVAR,M. CORONA Y L. D.POSSANI
I988/P/S/DRMB/DMM
-Cl
o
n
ac
i
6
n d
e
l
g
ene que
co
difi
ca
para l
a
n
oxi
u
s
-t
ox
ina a p
a
rtir de un ban
co
de
c
DNA d
e
l
a
l
a
cr
a
n
Ce
ntruroides no
x
iu
s
FMARTINEZ,B.BECERRIL,B. MARTIN,X. SOBER6N,F BoU
-VARYL. D.POSSANI I993/P/S/DRMB/DMM
-C
lo
n
aci6
n d
e
l
ge
n
e
que
cod
i
fi
c
a
p
a
ra un
a to
x
i
na
de
c
ru
s
t
aceos d
el
a
lacr
a
n
C
e
ntruroides
l
impid
u
s
lim
-pidus
M.C. GARCIA,B.BECERRIL,C.BALDERAS,F BOUVAR YL.D.
POSSANI
I990/P/S/DRMB/DMM
- E
s
tudios comparativos de l
as s
ecuencias de
ami-n
oa
cid
o
s d
e
t
ox
in
a
s del v
e
nen
o
de los alacr
a
n
es
Cen
t
r
ur
o
i
des
i
n
fa
ma
t
us
infamatu
s
yC
e
ntrur
o
id
es
limpidu
s
l
impidus
M. D.DEHESA,B.M. MARTIN YL. D.POSSANI I989/P/SIDRMB/DMM
-Ai
s
l
a
mient
o
y
c
a
r
ac
teri
z
a
c
i
6
n d
e
t
o
x
i
na
s s
imila-res a la N
ox
iu
s
t
ox
in
a
del
ve
nen
o
de
a
l
ac
r
a
n
es
A NIETO, B. M. MARTIN, A N. RAMIREZ, G. GURROLA,F ZAMUDIO Y L. D. POSSANI
I9891P/S/DRMB
- Purifi
c
aci6n
y
c
a
ract
e
riz
ac
i
6
n de t
ox
ina
s
del ve
-nen
o
de
l
ala
c
r
a
n
T
ityu
s vah
i
e
n
s
i
s
L. D. POSSANI,F CORONAS,B.M. MARTIN, S. LUCAS,V EIKSTEDYP L. FLETCHER
I992/P/S/DRMB
-Caracteriza
c
i
6
n de gene
s
que c
o
dific
a
n para t
o
-x
ina
s
de ala
c
rane
s
del
g
ener
o
Tityu
s
B. BECERRIL, M. CORONA, B. MARTIN,M. C. MEliA, F Bo
U-VARY L. D. POSSANI I993/P/S/DRM B/DMM
,
.
INFORME ANUAL 1995
PROGRAMA 9.3
Aislamiento y caracterizacion de receptores especfficos, mediante el uso de toxinas peptfdicas
Las toxinas peptfdicas aisladas a homogeneidad, hasta el momento, son todas componentes que reconocen de manera especffica ciertos receptores de membrana. Por esta razon sehantransformado en herramientas muy utiles para el aislamiento y la caracterizacion qufmico-funcional de las m
o-leculas receptoras. Entre las toxinas aisladas y caracterizadas esta la a-toxina de elapidos
(
N
a
ja
naja
s
iam
e
n
s
i
s
),
utilizada en elaislamiento del recep-tor alaacetileolina; latoxina gama de
Ti
ty
u
s se
rru
l
a-tu
s,
usada en el aislamiento del canal de sodio; la noxiustoxina, especffica para el canal de potasio, y mas recientemente la taicatoxina, bloqueadora de canales de caleio. Todos estos peptidos naturales han sido marcados con isotopos radioactivos 0cromoforos fluorescentes para su uso como traza
-dores biologicos, 0se han utilizado para la sfnte
-sis de soportes para cromatograffa de afinidad.
-Caracterizacion de los sitios de union de la no-xiustoxina, un peptido del alacran
Ce
ntruroid
es
no-x
iu
s,
bloqueador de canales deP
G.GURROLA, YL. D. POSSANII990/P/S/DRMB
-Caracterizacion adicional del canal de potasio aislado del axon gigante de calamar, por incor
-poracion en bicapas lipfdicas artificiales
G. PRESTIPINO, A. N. RAMIREZ, A. LiEVANO, A. DARSZON Y L. D. POSSANI
I989/P/S/DGFM/DRMB
-EI uso de la toxina II-I 0 del veneno del alacran
Centru
r
oides
noxius
para la caracterizacion del canalde sodio del axon gigante de calamar
A. N.RAMIREZ, G. PRESTIPINO, A. LiEVANO, A. DARSZON Y
L. D. POSSANI
I989/P/S/DGFM/DRMB
-Clonacion de genes que codifican para toxinas del alacran
Pan
d
i
n
u
s
imp
e
r
ator
,
bloqueadoras de c a-nales de caleio sensible ala ryanodinaFZAMUDIO, R.CONDE, B. BECERRIL, B.MARTIN, H. H. VAL
-DIVIA YL. D. POSSANI
I993/P/S/DRMB
-Clonacion del gene que codifica para la fosfo li-pasa del alacran
Hadrurus wnwlourus
R.CONDE, L.COVARRUBIAS, B. BECERRIL, L. D. POSSANI I992/P/S/DRMB/DGFM
-Expresion del mensajero que codifica para el c a-nal de potasio "SHAKER" en celulas de insectos para el ensayo de nuevas toxinas de alacran
F G6MEZ YL. D. POSSANI I994/1/S/D RMB
PROGRAMA 9.4
Caracterizacion funcional de toxinas peptfdicas Los peptidos naturales y sinteticos han sido
uti-lizados como herramientas en la caracterizacion de ciertas funciones biologicas, desde el punta de vista electrofisiologico, neuroqufmico y morfo
-logico
El estudio del mecanismo de apertura ycierre de canales ionicos de membranas excitables ha sido beneficiado con el descubrimiento de las toxinas peptfdicas. Dela misma forma, el estudio de la liberacion de neurotransmisores 0el es
tu-dio de la pancreatitis experimental se ha podido
lIevar acabo gracias al uso de los peptidos na
tu-rales y sinteticos.
Finalmente, alteraciones morfologicas y l
oca-lizaciones inmunohistoqufmicas se han podido
realizar 0visualizar gracias al uso de los peptidos
mencionados.
-Toxinas purificadas del veneno de los alacranes
Cent
r
u
r
o
i
des
infamat
u
s
i
nf
a
ma
t
us
yCe
n
truriodes
l
impidus
limpid us
en un modelo de secrecion pancreMicaM. D. DEHESA, A. DARSZON, P.L. FLETCHER,M. FLETCHERY
L. D. POSSANI I989tr!S/DGFM/DRMB
-Estudios del efecto de la taicatoxina en el meca -nismo de fertilizacion de ovulos de erizo de mar
A. DARSZON, I.M. MOCHCA YL. D. POSSANI I989/P/S/DGFM/DRMB
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGiA
eNuevas toxinas del veneno de alacranes mex i-canos que afectan los fenomenos de fecunda -cion en erizo de mar
F.ZAMUDIO, L. D. POSSANI, F.CORONAS A LiEVANO YA DARSZON
I 989/P/S/DGFM/DRMB
PROGRAMA
9.5Purificacion y caracterizacion del activador de plasminogeno de la saliva de murcielagos hematofagos, y de triatomidos mexicanos
EIactivador de plasminogeno (desmocinasa) de
Desmodus rotundus
degrada con gran eficiencia los coagulos sangufneos de mamfferos. Se pretende detallar la bioqufmica molecular de esta enzimay explorar su posible utilizacion como agente trombolftico. Su alta dependencia de fibrina, su especificidad y su baja inmunogenicidad p ermi-ten preyer su utilizacion rutinaria en pacientes con trombosis profundas.
ePurificacion ycaracterizacion qufmica de lad es-mocinasa, activador del plasminogeno de la sa-liva del vampiro
Desmodus
rotundus
E.G6MEZ, B.SOSA, R. MEDELLIN, W. D. SCHLEUNING YA ALAG6N
I985/P/S/DRMB
eDependencia de fibrina para la accion de lade s-mocinasa
B.SOSA,A ALAG6N Y W. D.SCHLEUNING I985/P/S/DRMB
PROGRAMA
9.6Desarrollo y optimizacion de metodos y sistemas de purificacion de protefnas y peptidos
Se pretende desarrollar metodologfas tanto ge -nerales como especfficas para la purificaci6n de polipeptidos utilizando principalmente tecnicas de cromatograffa de afinidad, de intercambio i
6-nico, de permeacion en gel yde alta resoluci6n,
electroforesis ydifusi6n a traves de membranas. Asimismo, se trabaja en el escalamiento de las
metodologfas de purificacion de peptidos es pe-cfficos.
e Utilizacion de la cromatograffa de intercambio i6nico para la purificacion de las cadenas de in -sulina humana producida en bacterias
N.CRUZ, G. GOSSET,M. MORALES Y F.BOLIVAR 1989!f/S/DMM
eSeparacion y purificacion en forma simultanea al proceso de fermentaci6n para la recupe ra-ci6n en Ifnea de anticuerpos monoclonales me -diante cromatograffa Ifquida de afinidad
A HIGAREDA, L. D. POSSANI YO.T.RAMfREZ 1991!f/DBI/DRMB
PROGRAMA
9.7Produccion de anticuerpos monoclonales y policlonales contra peptidos y protefnas
Se desarrollan metodologfas de produccion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra poli -peptidos especfficos, que seran utilizados para cuantificarlos, caracterizarlos ypurificarlos. Exi s-te tam bien un'proyecto destinado a desarrollar la produccion masiva de anticuerpos monoclonales.
eProduccion y caracterizacion preliminar de hi -bridomas productores de anti cuerpos monoclo -nales especfficos para la hormona humana esti -mulante detiroides
E.CALDER6N, A SALAS YA ALAG6N I988/P/S/DRMB
e Produccion masiva de anticuerpos monoclonales contra peptidos de alacranes
T. RAMIREZ, L. D. POSSANI, E. CALDER6N, F.ZAMUDIO, G. GURROLA Y A HIGAREDA
I989!f/S/DRMB/DBI
e-INFORMf ANUAL 1995
ticos que corresponden a secuencias de toxinas quimericas ynativas del veneno de alacranes
E.CALDER6N, T.OLAMENDI, G.GURROLA, FZAMUDIO, A. N. RAMIREZ Y L. D. POSSANI
I989/P/S/DRMB
-Caracterizacion del epftope del monoclonal neu-tralizante BDF2 alatoxina 2 de
C
e
ntruroid
es
n
ox
ius,
mediante peptidos sinteticos
E. CALDER6N, F ZAMUDIO, T.OLAMENDI, E. YORK, ).STE -WARTYL. D. POSSANI
1994/1/S/DRMB
-Cultivo de hibridomas en reactores agitados para la produccion masiva de anticuerpos monoclo-nales contra la hormona humana estimulante de tiroides ytoxinas del veneno de alacranes
T. RAMIREZ, A.ALAG6N, R.HERNANDEZ, FZAMUDIO YL. D. POSSANI
1991trlDBI/DRMB
PROGRAMA 9.8
Ingenierfa de protefnas
La comprension de la relacion entre la estructura y la funcion de las protefnas tiene profundas impli-caciones en la interpretacion molecular de feno-menos fisiologicos yen la aplicacion biotecnologi-ca de protefnas especfficas En este programa, se pretende abordar, atraves de sistemas modelo, diversos aspectos relacionados con la compren-sian de la relacion entre las estructuras primaria y terciaria de las protefnas y su funcion. Se inten-tara aplicar este conocimiento en el diseno de protefnas mejoradas para diversos fines. Se apli-can tecnicas de mutagenesis de alta eficiencia y metodos de busqueda simples para la obtencion de protefnas variantes.
-Mutagenesis y seleccion de variantes en la f3-lac-tamasa: alteracion de laconstelacion catalftica
I.OSUNA Y X. SOBER6N
I 991trlDMM/USOM
-Mutagenesis y seleccion de variantes en la f3-lac-tamasa: busqueda de cambios de especificidad
F.RANGEL, J. OSUNA YX. SOBER6N I990trlDMM/USOM
-Analisis del interruptor molecular y la especifi-cidad en la endonucleasa EcoRL
L. LEDEZMA, H. FLORES, E. MORETT Y X SOBER6N
1911DMMI
PROGRAMA 9.9
Estudio de enzimas en condiciones de limitacion de agua
El campo de la ingenierfa enzimatica es intere-sante desde el punta de vista de la enzimologfa basica, como una forma de estudiar las relaciones estructura-funcion de la catalisis enzimatica. Tam-bien es interesante desde el punta de vista apli-cativo ya que las enzimas se utilizan en diversos procesos a nivel industrial en las areas de tera-peutica, farmaceutica yalimentacion.
Los estudios con enfoque aplicado por
1
0
ge-neral tienen como objetivo preparar enzimas que adquieran ciertas caracterfsticas fundamentales que las hagan apropiadas para condiciones in-dustriales como: a) la prolongacion de la vida me-dia de la enzima, b) el aumento en la termorresis-tencia, c) los cambios en la direccion de la reaccion catalftica de la enzima nativa, d) la alteracion en la selectividad de la enzima para incrementar 0 disminuir su rango de substratos.Nos proponemos estudiar aspectos de la enzi-mologfa basica en solventes organicos utilizando micelas invertidas yuna 0dos enzimas solubles como modelo. Este programa constituye una co-laboracion con investigadores del Instituto de Fi-siologfa Celular. Con base en los antecedentes se espera ver cambios en el comportamiento de la enzima en el sistema micelar con respecto al agua. Lapregunta principal que se tratara de res-ponder es: (,como estan relacionados estos cam-bios en la funcion de laenzima con laestructura que adquiere est a en el sistema micelar?
Recientemente hemos encontrado que en los sistemas de micelas invertidas los desnaturali-zantes tienen un efecto activador sobre varias en-zimas. Debido a
1
0
anterior queremos tambienINSTITUTO DE BIOTECNOLOGiA
estudiar el mecanismo de activaci6n y utilizar los
desnaturaiizantes para derivar informaci6n sobre
la relaci6n estructura-funci6n en estos sistemas.
eRelaci6n de la flexibilidad ycatalisis con la es -tructura proteica
G GARZA-RAMOS, G. MORENO, X.SOBER6N, A. DARSZON Y A. G6MEZ-PUYOU
1991/P/S/DGFM/DRMB/IFC
eRelaci6n estructura-funci6n de la triosafosfato isomeraza en sistemas no convencionales con bajo contenido de agua
M. SEPULVEDA, A. G6MEZ-POYOU, M. TUENA DE G6MEZ -PUYOU Y A. DARSZON
1991IP/DG FM/!FC
PROGRAMA 9.10
Evoluci6n dirigida de peptidos y protefnas La decada de los
90
hatrafdo cambios profundosen la metodologfa disponible para generar pro
-tefnas con nuevas propiedades La mutagenesis
combinatoria de protefnas es capaz de generar un repertorio de estructuras enorme, yeste gran repertorio s610puede ser aprovechado mediante tecnicas que permitan el analisis de un numero
enorme de variantes. El estudio de bacterias que contienen plasmidos 0 fagos mutantes s610 per-mite el estudio de alrededor de cien mil mutan-tes por experimento. Sin embargo, [as nuevas
tecnicas conocidas como "phage display"
(des-pliegue en fago) permiten el analisis de hasta 109
de variantes de secuencia proteica expuesta en la
superficie del fago M 13,Y asociada al genoma de
este. Estos nuevos esquemas de mutagenesis
masiva yanalisis de un alto numero de mutantes
mediante esquemas de selecci6n, se denomina
evoluci6n dirigida de ligandos y protefnas Esta
tecnologfa tiene un alto potencial para generar
nuevas estructuras de protefnas y peptidos con propiedades definidas Entre los proyectos de
evoluci6n dirigida que hemos iniciado se
inclu-yen el desarrollo de actividades enzimaticas mo
-dificadas por medio de recombinaci6n genetica por PCR, en combinaci6n con metodos de evolu -ci6n dirigida de protefnas. ParalaDNA ligasa como
enzima modelo, utilizando las secuencias dis po-nibles en las bases de datos, pretendemos pre-decir estructuras secundarias y posiblemente
estructuras terciarias, ya que no existen es tructu-ras tridimensionales publicadas para ninguna
DNA ligasa Pensamos que sera posible identificar en la secuencia de la protefna algunos dominios
de pegado a cofactores (ATP, NAD) asfcomo
domi-nios de pegado aDNA, terminal 3'-OH, etcetera. A partir de un mapa estructural rudimentario, lleva-remos a cabo mutagenesis por medio de oligo-nucle6tidos. Luego se Ilevara a cabo reco mbi-naci6n por PCR sexual, siguiendo lametodologfa
de Stemmer. Finalmente, se lIevaran a cabo ex pe-rimentos de selecci6n de DNA ligasas con activ i-dades interesantes determinadas por el esquema de selecci6n mismo. En los casos de la f3-1ac
ta-masa ylas enzimas con estructura debarril (a-f3)8'
se utilizan las estructuras tridimensionales
re-portadas como punta de partida para dirigir el
esquema de mutagenesis combinatoria a regio
-nes particulares de lasprotefnas, seguidas de PCR sexual. Asimismo, se hacen disecciones y per-mutaciones circulares, mediante DNA
recombi-nante, de las secuencias de aminoacidos. Estas construcciones se usan como punta de partida para generar repertorios mas numerosos de va-riantes, mediante sistemas de infecci6n por fa go y recombinaci6n inducida, con metodologfa si-milar ala utilizada en repertorios de anticuerpos por G. Winter y colaboradores.
eGeneraci6n de DNA ligasas modificadas media
n-te evoluci6n dirigida.
R.MIRANDA, G. HERNANDEZ-CHAvEZ YP.M. LiZARDI
I993/1/DRMB
e Disecci6n de dominios y evoluci6n dirigida de
f3-lactamasa
IOSUNA Y X. SOBER6N
1994/P/DRMB
INFORME ANUAL 1995
del tipo barril
a
-
1
3
mediante peptidos comple -mentantes y evoluci6n dirigida de las asasL.SEGOVIA,G.DEL Rro, G SAAB-RINC6N, E.HORJALES YX.
SOBER6N
I995/1/DRMB
PROGRAMA
9.1
1
Estructura, funci6n, regulaci6n yevoluci6n de 105dominios estructurales de 105reguladores transcripcionales en bacterias
En los Liltimos anos se han descrito en deta!le un gran nLimero de protefnas reguladoras dela trans -cripci6n, tanto debacterias, como de organismos eucariontes. Una observaci6n general esque este tipo de protefnas est<3n conformadas por varios dominios estructurales y funcionales distintos. Generalmente, la interacci6n especffica con las secuencias regulatorias del DNA se !leva a cabo a traves de un dominio diferente del dominio in vo-lucrado en la activaci6n de la transcripci6n. En algunos casos los reguladores transcripcionales contienen un dominio adicional involucrado en la regulaci6n global de la actividad de la protefna. En varios sistemas la construcci6n de protefnas truncadas 0hfbridas ha demostrado la indepe n-dencia estructural yfuncional de los diferentes do -minios. Sin embargo, nuestro conocimiento sobre la regulaci6n yevoluci6n de los diferentes dom i-nios es muy Iimitado. Los proyectos que estamos abordando tienen como objetivo fundamental en-tender algunos aspectos basicos de laestructura, de la funci6n, de los mecanismos de regulaci6n de laactividad ydelaevoluci6n de protefnas reg ula-tori as en bacterias. Nuestros modelos compr en-den dos familias de reguladores transcripcionales: lafamilia de los activadores que funcionan con la
RNA polimerasa sigma 54 (BEBP) Yde los regul
a-dores de la familia de "dos componentes".
eldentificaci6n de los motivos estructurales de NifA de R.meliloti yde B.japonicum involucrados en el control positivo
V. GONzALEZ, E. FLORES, X. SOBER6N, H. FLORES Y E.
MORElT
I992/P/DRMB
eRegulaci6n de la actividad de NifA de R. meliloti
por oxfgeno
K. JUAREZ,V.GONZALEZ, S. DAVILA, L. OLVERA,X SOBER6N
YE.MORElT
1993/P/DRMB
eEvoluci6n de los dominios estructurales de las familias "dos componentes" y BEBP
S. DAvILA, YE. MORElT
1992/P/DRMB
eRegulaci6n de laexpresi6n de la protefna regu -latoria NifA en B.japonicum
H. BARRIOS, R.GRANDE, L. OLVERAYE.MORElT
1991/P/DRMB
P
ROGR
AM
A
9.12Sfntesis de peptidos para control de malaria En los Liltimos anos el estudio de peptidos na tu-rales y sinteticos con act:vidad antimicrobiana se ha incrementado de forma exponencial, debi -do ala posibilidad de encontrar nuevos farmacos con posibles aplicaciones terapeuticas 0insecti ci-das. Una de las razones que hacen estos peptidos tan interesantes es el hecho de que son biod e-gradables y algunos de ellos son muy especfficos. Existe una importante especificidad a especie, para distintos grupos taxon6micos de animales. Dos familias importantes fueron descritas; por un lado estan las cecropinas ypor otro las defen -sinas. Ambos tipos de peptidos han sido es tu-diados tanto en aspectos de especificidad como deestructura qufmica. Nosotros hemos observado que un peptido sintetico, semejante acecropina, se mostr6 altamente t6xico al desarrollo del
P
l
as-modium bergei (causante de la malaria en Mexico) cuando fue administrado en el alimento de m os-c;uitos mantenidos en ellaboratorio. De esta fo r-ma un grupo multidisciplinario que involucra tres laboratorios independientes dellnstituto, el Centro de Paludismo de la Secretarfa de Salud en Tapachula, Chiapas, un grupo del Cinvest av-Mexico y un grupo del EMBL de Alemania, co
n-INSTITUTO DE BIOTECNOLOGiA
juntaron esfuerzos en el sentido de estudiar mas detenidamente este peptido con miras a la posi -ble obtencion de mosquitos transgenicos, re sis-tentes ala malaria.
eSfntesis de peptidos semejantes a Shiva- 3y su efecto en el desarrollo esporogonico de Plasmo -dium &ergei
F.ZAMUDIO, M. H. RODRiGUEZ YL. D. POSSANI I994/1/S/DRMB
PROGRAMA 9.13
Aislamiento y caracterizacion de polipeptidos
con afinidad a metales
eAislamiento y caracterizacion de dominios po li-peptfdicos con afinidad aCrt+6)
N.CRUZ, F.VALLE Y F.BolivAR
I993/P/DMM
eAislamiento y produccion de polipeptidos con afinidad aoxido de hierro (magnetita)
s. LEBORGNE Y F. VALLE
I994/P/DMM
PROGRAMA 9.14
Analisis del alosterismo enzimatico por metodos de cristalograffa de protefnas
La regulacion alosterica deenzimas es uno de los procesos clave para eldesarrollo delavida tal
co-mo la conocemos. Por eso, cuando Monod con-cibio la idea del alosterismo, el dijo que habfa descubierto el segundo secreta de la vida (el p ri-:nero erala estructura del DNA). Sin embargo, de s-de 1965enque seformularon dos teorfas difere n-tes para comprender dicho fenomeno, subsisten ambas teorfas diferentes para comprender dicho fenomeno y no se ha logrado una comprension detallada anivel atomico de la relacion entre es-tructura y propiedades alostericas. Por otra parte, las enzimas alostericas de estructura tridime n-sional conocida no Ilegan auna docena.
Hemos determinado la estructura cristalografi -ca de la Glucosamina 6-fosfato desaminasa de E.
co
li
,
en sus conformeros R(mas affn por el subs -trato) yT
(menos affn). Se estan estudiando dife -rentes complejos de la enzima con inhibidores ysubstratos, tanto en suestado R como T. Ademas, se han disenado y construido mutantes con fun-ciones alostericas y catalfticas alteradas.
Usando cristalograffa de protefnas, nos prop o-nemos determinar las conformaciones tanto de
10scomplejos citados como de los mutantes. Se busca tam bien relacionar lasestructuras tridimen -sionales con los cambios en lafuncion. La obten-cion de asimetrfas en laactivacion alosterica, que diferencian las propiedades del proceso de a c-tivacion enzimatica segun se produzca por efecto del activador alosterico (heterotropica) 0del pro
-pia substrato (homotropica), resulta de interes pa -ra continuar nuestros estudios estructurales en pos de un modelo mas detallado del alosterismo.
eRefinamiento de la estructura cristalografica del conformero T de la glucosamina 6-fosfato de -saminasa y elaboracion de un mecanismo para la transformacion alosterica, anivel atomico
G.OLIVA, M. M. ALTAMIRANO, M. L.CALCAGNOYE.HORIALES I993tr1DRMB/FM
eEstudio estructural de las modificaciones en la funcion alosterica de la glucosamina 6-fosfato desaminasa producido por mutantes 0por dif e-rentes ligantes homotropicos 0 heterotropicos
M. M. ALTAMIRANO, M. L. CALCAGNO YE.HORIALES
I995/1/DRMB/FM
eAnalisis de la relacion entre la variacion estru c-tural
y
funcional de la glucosamina 6-fosfato desaminasa de diferentes especies, utilizando modelizacion de protefnasR.ARREOLA, M. L.CALCAGNO, M. M. ALTAMIRANO, ).PL UM-BRIDGE YE.HORIALES
I995/P/DRMB/FM
e Determinacion de la estructura cristalografica de toxinas de alacran
G.GURROLA, L. D. POSSANI YE.HORJALES
INFORME ANUAL 1995
PROGRAMA 9.15
Evoluci6n de laestructura y funci6n de protefnas
La gran cantidad de estructuras cristalinas de pro -tefnas que se conocen ahora, aunada al enorme numero de secuencias proteicas determinadas, han dado un nuevo auge al estudio delaevoluci6n de la estructura y funci6n de las protefnas. Seha encontrado que protefnas con actividades enzi -maticas totalmente diferentes comparten un mi s-mo armaz6n molecular. EI ejemplo tal vez mejor conocido es el "TIM Barrel" el cual tiene a la fecha 33 hom610gos estructurales cubriendo todo tipo de actividades. Por otra parte, tambien se ha es -tablecido que existen motivos estructurales y de secuencia comunes entre protefnas de distinto origen evolutivo con armazones moleculares ese
n-cialmente distintos. Estos analisis han sido
en-riquecidos por las aportaciones de tecnicas mo -dernas de biologfa molecular, las cuales permiten la manipulaci6n de secuencias y laobtenci6n de actividades enzimaticas de novo. EIentendimie n-to de la evoluci6n de la estructura y funci6n de
protefnas tiene un gran potencial para el disefio y manipulaci6n de protefnas con caracterfsticas nuevas. En este momenta estamos trabajando con una familia de protefnas especfficas del cris -talino de vertebrados, las y-cristalinas
-Caracterizaci6n de las y-cristalinas en los princi -pales 6rdenes de reptiles expresi6n de las pro -tefnas
M. OLVERA YL.SEGOVIA 1995/P/DRMB
-Caracterizaci6n de las y-cristalinas en 10sprinc i-pales 6rdenes de reptiles: aislamiento y carac -terizaci6n de cDNAs
R.MARES YL.SEGOVIA I995/I/DRM B
-Caracterizaci6n de las y-cristalinas en los prin-cipales 6rdenes de reptiles: propiedades osm6 -ticas de gamma-cristalinas y su relaci6n con la estructura molecular
L.SEGOVIA