LABORATORIO DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
MICROBIOLÓGICA DE LOS ALIMENTOS
CURSO AGOSTO - DICIEMBRE DE 2010
P R Á C T I C A # 4
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE AGUA
INTRODUCCIÓN
Para los fines de control sanitario de la potabilidad de una fuente de abastecimiento de agua, la frecuencia de los análisis está en función de la población, por ejemplo, para una ciudad de cinco millones de habitantes, se considera que la vigilancia sanitaria es satisfactoria con la aplicación a 500 exámenes mensuales. Las muestras de agua deben ser colectadas en lugares estratégicamente distribuidos dentro de la ciudad. Decir que la vigilancia sanitaria es satisfactoria, significa que los resultados obtenidos son válidos ya sea que resulten o no positivos a la contaminación.
El proceso de la potabilización del agua involucra dos etapas principales: su acondicionamiento físico y su acondicionamiento microbiológico. Ocasionalmente se hace necesario eliminar o disminuir la concentración de algunas sustancias químicas.
El análisis de laboratorio para el control de la potabilidad del agua desde el punto de vista bacteriológico incluye tres pruebas: el recuento de bacterias mesofílicas aerobias, la estimación del NMP (número mas probable) de organismos coliformes y la valoración del cloro residual.
El valor de la cuenta de colonias en placa a 35°C ha encontrado apoyo y rechazo por diferentes autoridades. Generalmente se acepta que las aguas protegidas contra la contaminación natural, contienen bajo número de bacterias: menos de 100/mL. En consecuencia el hallazgo de cifras elevadas se interpreta como una indicación de exposición a cualquier tipo de contaminación. La técnica del NMP es, incomparablemente, más sensible que el recuento en placa, ya que pone de manifiesto unos cuantos gérmenes o uno solo, en un gran volumen de muestra, teóricamente litros. Por esta razón encuentra aplicación en el análisis del agua en donde la presencia de dos
organismos coliformes en 100mL, ya reclama atención especial en su sistema de abastecimiento. El hipoclorito de sodio o de calcio y el cloro gaseoso por su efectividad, economía y facilidad de aplicación y de control se utilizan ampliamente en la desinfección del agua. Una concentración de 0.1 a 0.3 ppm de cloro residual en el agua destinada para el consumo humano es satisfactoria.
Con el presente estudio se pretende evaluar los riesgos de contaminación fecal reciente en el agua distribuida por Aguas de Municipio en la ciudad de Durango así como evaluar la calidad sanitaria de diferentes marcas comerciales de agua embotellada.
FUNDAMENTOS. (En la versión electrónica, comienza a teclear aquí los fundamentos de la práctica)
M É T O D O.
Toma de la muestra.
Las muestras de agua que se destinan para examen bacteriológico deben colectarse tomando las precauciones necesarias para evitar el ingreso de microorganismos ajenos a la fuente de abastecimiento de que se trate; por ejemplo, cuando se colectan muestras de agua de la llave deberán limpiarse, previamente con toda escrupulosidad frotando con papel absorbente limpio, el exterior y el interior de esa llave y dejar salir el agua a toda capacidad durante tres minutos. Se dispondrá por tanto de frascos estériles de vidrio de tapón esmerilado de 500mL de capacidad, transparente y de boca ancha. En su interior se colocarán, previo a la esterilización 0.4mL de solución de tiosulfato de sodio al 10% a fin de inactivar y detener la acción del cloro que pudiera contener el agua. El frasco con muestra que se va a usar para determinar cloro residual no llevará tiosulfato.
El agua de estanque o de río se colocará en frascos de los arriba descritos, la boca del frasco se orientará de manera que reciba directamente la corriente del agua.
En el caso del hielo se debe colectar la muestra con un picahielo y cucharilla metálica estériles.
En todos los casos es indispensable evitar que el cuello o tapón del frasco se ponga en contacto con los dedos o cualquier otro material. El tapón se retirará del frasco solamente el tiempo necesario para colectar la muestra.
El frasco se llenará a los 2/3 de su capacidad. Esto deja un espacio suficiente para homogenizar la muestra.
El examen de la muestra colectada debe iniciarse tan rápidamente como sea posible a fin de evitar disminución o aumento en el número de bacterias presentes. No es necesario refrigerar la muestra, pero la recomendación se hace en el sentido de conservarla, durante el transporte, a la temperatura a la que se encontraba en el momento de la recolección. Cuando el examen se inicia 3 horas después de colectada la muestra, los resultados empiezan a ser inciertos.
En el momento mismo de la recolección debe determinarse la concentración de cloro residual; si no se cuenta con equipo portátil, transportar entonces la muestra lo más rápido posible al laboratorio.
M A T E R I A L E S Y M E D I O S D E C U L T I V O. Para cada muestra se requiere:
1 Frasco estéril de vidrio de tapón esmerilado de 1 litro de capacidad, transparente y de boca ancha. En su interior se colocarán previo a la esterilización 0.4mL de solución de tiosulfato de sodio al 10% con el fin de inactivar y detener así la acción del cloro que pudiera contener el agua.
1 Frasco de dilución limpio (sin tiosulfato).
2 Cajas petri estériles para vaciar 15mL de agar para métodos estándar (AME).
1 Tubo de ensaye limpio para la prueba de cloro residual.
5 Tubos con 10mL de caldo lactosado concentración 200% y campana de fermentación.
2 Tubos con 10mL de caldo lactosado concentración sencilla y campana de fermentación.
2 Pipetas de 10mL estériles. 3 Pipetas de 1mL estériles. 1 Pipetas de 2mL limpias.
7 Tubos con 10mL de caldo lactosado verde bilis brillante al 2%.
1 Caja de petri con agar eosina azul de metileno solidificado. 1 Picahielo estéril.
1 Cuchara estéril.
1 Colorímetro de Taylor y reactivo de ortotolidina.
P R O C E D I M I E N T O
Recuento de bacterias mesofílicas aerobias.
Para cada muestra analizada seguir los siguientes pasos:
a) Agua potable : Inocular por duplicado 1mL del agua de muestra en el centro de una caja petri estéril agregar 15mL de agar para métodos estándar (AME ) fundido y enfriado a 44 – 46°C. No debe transcurrir más de 20 minutos entre estas dos operaciones.
Inmediatamente incorporar el inóculo al medio mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás hacia delante. Evitar el derrame del líquido y su contacto con la cubierta de la caja. Dejar solidificar e incubar a 37°C
durante 48 horas. Contar las colonias desarrolladas en la placa, incluso las puntiformes y reportar como UFC/mL. b) Hielo : Dejar fundir la muestra completamente y
proceder como con el agua potable.
c) Agua purificada : Limpiar escrupulosamente el exterior de la botella o garrafón, abrir junto al mechero y proceder como con el agua potable.
Número más probable de organismos coliformes (NMPOC ) a) Prueba presuntiva
- Inocular con 10mL de muestra cada uno de los 5 tubos de fermentación con caldo lactosado de doble concentración de 200%.
- Inocular con 1mL de muestra un tubo de fermentación de concentración sencilla.
- Inocular con 0.1mL de muestra un tubo de fermentación de concentración sencilla.
- Incubar los 7 tubos a 35 – 37°C durante 48 +/- 3 horas.
- Observar cuidadosamente cada tubo. La presencia de gas en cualquier cantidad dentro de la campana de fermentación hace positiva la prueba. Además, el tubo positivo mostrará denso desarrollo bacteriano. La ausencia de gas en los tubos hace negativa la prueba. b) Prueba confirmativa
- Transferir individualmente de cada tubo positivo de 2 a 3 asadas del cultivo a un tubo de fermentación con caldo verde brillante bilis al 2%.
- Incubar a 35 – 37°C durante 48 +/- 3 horas.
- La formación de gas en cualquier cantidad dentro de la campana hace positiva la prueba. La ausencia de gas en los tubos hace negativa la prueba.
- Determinar el NMP de organismos coliformes en la muestra de acuerdo con la tabla 4.1
c) Prueba complementaria
- De los tubos que den positiva la prueba confirmativa se toma una asada y se inoculan placas petri con agar EMB previamente solidificado por el método de siembra en estrías.
- Se incuban las cajas de 24 a 48 horas a 35 – 37°C.
- Observar el tipo de crecimiento. En el medio EMB, las colonias típicas de coliformes crecen de color café obscuro o azul obscuro con la porción central elevada y usualmente aunque no siempre con un brillo metálico o rosa pálido o gris y mucosas con o sin estrías de brillo metálico.
Determinación del cloro residual
- Aplicar el ensayo de las fuentes de agua sujetas a cloración que no hayan sido sometidas a la acción de carbón activado.
- Efectuar la prueba en un tubo limpio enjuagando varias veces con el agua por examinar.
- A 1 – 2mL de la muestra adicionar 2 gotas de reactivo de ortotolidina. Invertir el tubo y comparar el color desarrollado con la escala del colorímetro de Taylor.
La tabla 4.1 da límites para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando son usados 5 tubos con 10mL, y 1 tubo con 1mL y 1 tubo con 0.1mL.
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA POTABLE
Agua potable + 0.4 mL de tiosulfato de sodio al 10%
Cuenta estándar Organismos coliformes técnica NMP
Inocular 10mL de agua a c/tubo
Vaciado en placa: * Inocular 1mL de agua e incorporar 15-20mL de
agar para métodos estándar con movimientos rotatorios. Incubar a 35ºC por 48 horas
**Inocular 1mL de agua
**Inocular 0.1mL de agua
Incubar a 35 ºC / 48 horas
* Tubos con 10mL de caldo lactosado al 200%
**Tubos con 10mL de caldo lactosado al 100%
Prueba Presuntiva
Pasar a la prueba confirmativa: Inocular 2 ó 3 asadas de los tubos que muestren gas en la campana a tubos con caldo verde brillante bilis al 2%
Tabla 4.1 Número más probable de organismos serie 5, 1, 1
Número de tubos positivos de: NMP/100mL Límite de NMP
5 tubos de 10mL 1 tubo de 1mL 1 tubo de 0.1mL Inferior Superior 0 0 0 0 5.9 0 1 0 2 0.05 13 1 0 0 2.2 0.05 13 1 1 0 4.4 0.52 14 2 0 0 5 0.54 19 2 1 0 7.6 1.5 19 3 0 0 8.8 1.6 29 3 1 0 12 3.1 30 4 0 1 15 3.3 46 4 0 0 20 5.9 48 4 1 0 21 6 53 5 0 0 38 6.4 330 5 0 1 96 12 370 5 1 0 240 12 3700 5 1 1 88
O B S E R V A C I O N E S
Fig 4.2 Morfología de las Bacterias Mesofílicas aerobias (BMA) en Agar para Métodos Estándar.
Número de colonias encontradas en la placa con agua potable:
Número de colonias
encontradas en la placa con agua potable:
Número de colonias encontradas en la placa con agua purificada:
Número de colonias encontradas en la placa con agua purificada:
Fig. 4.3 Prueba confirmativa del NMP
Fig 4.5 Prueba complementaria del NMP. Observaci de la morfolog
僘 colonial de los organismos coliformes en EMB
Comparaci de intensidad
del color de la muestra
R E S U L T A D O S.
No. de
muestr a
DESCRIPCIÓN DE
LA MUESTRA PROCEDENCIA CUENTA
ESTANDAR NMPOC /100mL CALIFICACIÓN SANITARIA
UFC /mL
A. de fresa " La michoacana " 7310 más 1,100
1 $16 / l Fijo
A. de horchata " Los molletes " ITD 290 3.6
2 con leche Fijo
$18 / l
A. de horchata Fracc. La Forestal 7040 43
3 $24 / l Ambulante
A. de cebada Plazuela Baca Ortiz 910 15
4
5 $10 / l Ambulante
A. de horchata " Que Gorditas " 900 290
6 $16 / l Fijo
1. Recuento de bacterias mesofílicas aerobias.
Cuenta estándar de colonias incubadas a 37°C durante 48 horas: _____________UFC / mL
Tabla 4.2. Resultados generales.
2. Estimación del número más probable ( NMP ) de organismos coliformes: Para la combinación: __________, ___________, ___________, de la tabla 4.1. El NMP/100mL de organismos coliformes es de:_________________ 3. Calificación sanitaria*: _____________________
*Consulta los siguientes documentos:
MODIFICACION A LA NORMA Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, Salud ambiental, agua para uso y consumo humano-Límites
permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización.
NORMA Oficial Mexicana NOM-041-SSA1-1993.Agua purificada envasada. Especificaciones sanitarias.
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
(En la versión electrónica comienza a teclear en este renglón el análisis que hiciste de tus resultados y su respectiva discusión)
CONCLUSIONES:
(En la versión electrónica comienza a teclear en este renglón tus conclusiones)
REFERENCIAS. (En la versión electrónica, anota en orden alfabético las referencias bibliográficas y de recursos electrónicos que hayas
consultado para tus fundamentos y para el análisis y discusión de resultados).
Fecha de realización de la práctica: ________________ Fecha de entrega de la práctica: ___________________ Firma del alumno: _________________________ Comentarios del profesor:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Evaluación: ___________
