Efecto de la adición de fracción vasculoestromal de grasa a la sutura de lesiones meniscales crónicas en zona avascular del menisco de cerdo

w ww . e l s e v i e r . e s / a r t r o s c o p i a

Original

Efecto

de

la

adición

de

fracción

vasculoestromal

de

grasa

a

la

sutura

de

lesiones

meniscales

crónicas

en

zona

avascular

del

menisco

de

cerdo

Jorge

Díaz

Heredia

_,

_Susana

_Alonso

_Güemes

_,

_Adrián

_Cuéllar

_Ayestarán

y

Miguel

Angel

Ruiz

Iban

a_{ServiciodeCirugíaOrtopédicayTraumatología,HospitalUniversitarioRamónyCajal,Madrid,Espa ˜na}

b_{ServiciodeCirugíaOrtopédicayTraumatología,HospitalGaldakao-Usánsolo,Usansolo,Vizcaya,Espa ˜na}

i n f o r m a c i ó n

d e l

a r t í c u l o

Historiadelartículo:

Recibidoel29deseptiembrede2014 Aceptadoel2dediciembrede2014

On-lineel18defebrerode2015

Palabrasclave:

Menisco

Célulasmadremesenquimales Fracciónvasculoestromal Estudioexperimental Zonaavascular

r

e

s

u

m

e

n

Objetivo:Laadicióndirectadecélulastroncalesmesenquimalespuedeaumentarlas

posibi-lidadesdecuracióndelaslesionesmeniscalesenzonaavascular.Elobjetivodeesteestudio esaveriguarsilaaplicaciónpostoperatoriadelafracciónvasculoestromal(FVE)obtenidaa partirdetejidoadiposopuedetenerunefectoenlavascularizaciónylaproliferacióncelular enelmeniscosuturado.

Métodos:A4cerdos(8rodillas)selesrealizóunalesiónlongitudinalde10mmenzona

avasculardelmeniscomedialdeambasrodillas.Dosmesesmástardesereparólalesiónde ambasrodillasconunpuntosimple.Almismotiemposeobtuvieron50gdegrasaabdominal delaqueseconsiguieron2cm3 _{deFVE(dondeseobjetivólapresenciade}

aproximada-mente1-5×106_{célulastroncalesmesenquimales)yseinyectaronenunadelas2rodillas}

decadacerdo4hdespuésdelacirugía(grupoFVE),siendolaotrarodillaelgrupode con-trol.Losanimalessesacrificaron15díasdespués.Seevaluaronlossiguientesparámetros histológicosentinciónconhematoxilina-eosina:gradodecuración,neovascularizacióndel tejido,proliferacióndefibrocondrocitosalrededordelalesiónypresenciaderepoblación condrocitaria.

Resultados: Latasadecuración(nocurado/cicatrizaciónparcial/curacióncompleta)parael

grupodeFVSfue1/1/2,yparaelgrupocontrolfuede2/2/0(diferenciasnosignificativas). ElgradodeneovascularizaciónfuemayorenelgrupoFVE(3,25vs.2).Elgradodeproliferación defibrocondrocitosfuemayorenelgrupoFVE(2,5vs.1,75).Aparecieronformacionesde condrocitosisogénicosen2meniscosdelgrupoFVEyenningunodelgrupocontrol.

Conclusiones:LainyecciónintraarticularpostoperatoriainmediatadeFVEpareceaumentar

laneovascularización,laproliferaciónfibrocondrocíticaylarepoblacióndecondrocitosa los15díasdespuésdelareparacióndeunalesiónmeniscalencerdos.

Niveldeevidencia:Estudioexperimental.

∗ _{Autorparacorrespondencia.}

Correoelectrónico:[email protected](J.DíazHeredia). http://dx.doi.org/10.1016/j.reaca.2014.12.001

Relevanciaclínica: Seplanteaunamaneradeadministracióndecélulastroncalesquepuede sermássencilladeimplementarenhumanosqueelcultivocelular.

©2015PublicadoporElsevierEspaña,S.L.U.ennombredeFundaciónEspañolade Artroscopia.

Effect

of

the

addition

of

the

stromal

vascular

fraction

from

adipose

tissue

to

the

suture

of

chronic

meniscal

injuries

in

the

avascular

area

of

the

meniscus

in

pigs

Keywords:

Meniscus

Mesenchymalstemcells Stromalvascularfraction Experimentalstudy Avascularzone

a

b

s

t

r

a

c

t

Objective: Theadditionofmesenchymalstemcellsmayincreasethechanceofhealing

ofmeniscallesionsintheavascularzone.Theobjectiveofthisstudyistofindoutifthe postoperativeapplicationofthestromalvascularfraction(SVF)fromadiposetissuecan haveaneffectonvascularizationandcellproliferationinthesuturedmeniscus.

Methods:Fourpigs(8knees)underwentalongitudinalinjuryof10mmintheavasculararea

ofthemedialmeniscusinbothknees.Twomonthslatertheinjurywasrepairedonboth kneeswithasimplesuture.Atthesametime50gofabdominalfatwasremovedand2cm3

ofSVFwaspurified(inwhichitwasfoundtocontainapproximately1-5×106_mesenchymal

stemcells).Thiswasinjectedintooneofthekneesofeachpig4hafterthesurgery(SVF group),usingtheotherkneeasthecontrolgroup.Theanimalsweresacrificedafter15days. The followinghistologicalparameters withhematoxylin-eosinstainingwereevaluated: degreeofhealing,neo-vascularizationoftissueandtheproliferationoffibro-chondrocytes aroundthelesionandthepresenceofnewchondrocytes.

Results: The healingrate(unhealed / partial healing/ healed) for theSVF groupwas

1/1/2,and was2-2-0forcontrolgroup(non-significantdifferences).The degreeof neo-vascularizationwashigherintheSVFgroup(3.25vs2).Thedegreeoffibro-chondrocytes proliferationwasgreaterintheSVFgroup(2.5vs1.75).Theformationofisogenic chondrocy-teswasobservedin2meniscioftheSVFgroupandnoneinthecontrolgroup.

Conclusions: Thepostoperativeintra-articularinjectionofSVFmightincreasethe

neovas-cularization,theproliferationoffibro-chondrocytesandtherepopulationofchondrocytes 15daysaftertherepairofmeniscalinjuryinpigs.

Evidencelevel: Experimentalstudy.

Clinicalrelevance: Asystemfortheuseofstemcellsispresentedthatmightbeeasierto

implementinhumansthatcellcultures.

©2015PublishedbyElsevierEspaña,S.L.U.onbehalfofFundaciónEspañolade Artroscopia.

Introducción

Losmeniscossonpartesesencialesenlafuncióndelarodilla ysonobjetofrecuentedelesión.Laresecciónmeniscaltiene efectosdeletéreosbienconocidosporloqueelcirujanodebe intentarconservarlamayorparteposibledemenisco1–3_.Sin embargo,el tejido meniscaltieneunpotencial regenerador muyescasodebidoa,entreotrasrazones,supobre celulari-dady,enlazonacentralavascular,alaausenciadevasosy delascélulasprogenitorasquesehallanenellos4_.Portodo esto,lasterapiasregenerativascelularestienenuncampode aplicaciónsignificativoenlaafecciónmeniscal5_.Eneste sen-tido,sehaevaluadoenanimaleselusodecélulastroncales mesenquimales(CTM)tantoparaeltratamientodedefectos tisularescomoparamejorarlasposibilidadesdereparación deunasuturameniscal6–10_.

Eltejidoadiposorepresentaunaexcelentefuentede célu-las troncales ya que los depósitos subcutáneos de tejido

adipososonaccesibles(atravésdeliposucción),abundantes y reponibles. El tejido adiposo se compone fundamental-mente de 2 líneas celulares, los adipocitos maduros, y la fracciónvasculoestromal(FVE)11,12_{.LaFVEsecomponedeuna} pléyadeheterogéneadetiposcelularesincluyendo preadipo-citos,célulasendoteliales,célulasmusculareslisas,pericitos, macrófagos, fibroblastos y CTM derivadas de la grasa13,14_. Estas CTM derivadasde la purificacióndel lipoaspiradose diferencianinvitroenmúltipleslinajescelulares:adipocitos, condrocitos, hepatocitos, osteoblastos, célulasendoteliales, epiteliales,hematopoyéticas,neuronalesymiogénicas15–19_.

Alahoradeplantear el usoenhumanosdeCTM autó-genasel cultivocelularpresenta dificultadeslogísticasyde coste.LaFVEsepresentacomounaalternativaadecuada,y su efectividadyahasido comprobada enel usoclínicoen humanos20_.

ElobjetivodeesteestudioesevaluarelefectodeCTM autó-genasobtenidasmediantelapurificacióndelaFVEdegrasa sobreunalesióncrónicasuturadaenmeniscodecerdo,con

lahipótesisdequesonútilesparamejorarlosresultadosde dichasutura.

Material

y

métodos

Esteesunestudioexperimentalenelqueseutilizaron4cerdos hembrade20kg.Elprotocolodelestudiofueaprobadoporel ComitédeBienestarAnimaldenuestrocentro,yfuellevadoa cabodeacuerdoconlalegislacióneuropea.

Protocolodelesiónysuturameniscal

Se usó un modelo de lesión crónica de menisco medial segúnlatécnicadescritaporDíazHeredia21_{.Enunaprimera} intervención,bajoanestesiageneralyporunaartrotomía lon-gitudinalmedialseabordaelmeniscomedialdelcerdoycon unbisturíserealizaunalesiónmeniscalcompletade10mm delargo,paralelaalbordelibredelmeniscoysituadaenla unióndelcuerpoconelcuernoanterioryentreelterciomedio yelterciocentraldelmenisco(enlazonaavascular).Lalesión nosesuturaysecierraelabordajequirúrgico.Alosanimales selespermitelibertaddemovimientoensuzonade estabu-lacióndurante2meses.

Pasados2mesesdelalesiónmeniscalserealizala inter-vención para lasutura meniscal. Bajo anestesia general, y siguiendoelprotocolodelaprimeraintervención,atravésde lacicatrizseabordaelmeniscomedial.Seidentificalazona lesionadaenel cuernoanterior,secompruebaquenoesté cicatrizada,ysesuturaconunpuntosimpledeProlene®_5/0 colocadoenelcentrodelalesión,sedadesdeelmuromeniscal hasta1,5mmdelbordemedialdelalesiónyseanuda late-ralmente.Secierra el abordajey seles permite libertadde movimiento.

Extraccióndelafracciónvasculoestromal

Elprotocolodeextracciónypurificacióndelascélulasdela FVEusadoeseldescritoporGarcía-Olmoetal.20_. Inmedia-tamenteantesdelasegundaintervenciónsobrelarodillase realiza unalaparotomía tipoPfanestiely seobtienen unos 50cm3_{detejidoadipososubcutáneoeinguinal.Selava} exten-sivamente con volúmenes iguales de solución salina con tampónfosfatoestéril(GIBCOBRL,Paisley,ReinoUnido), solu-ciónsalinayanestésicolocal.Eltejidoresultantesedigiere concolagenasatipoi(GIBCOBRL)enconcentraciónfinaldel 0,075%ensoluciónsalinaa37◦Cdurante45minparaliberar lafraccióncelular.Lacolagenasaseinactivaa ˜nadiendomedio deEaglemodificadodeDulbeco(GIBCO)consuerobovinofetal (10%v/v), ylasuspensión decélulas resultantesse centri-fugadurante10mina250×g.Elprecipitadodecélulasselava consoluciónsalinacontampónfosfato,secentrifuga nueva-menteysetrataconclorurodeamonio160mMatemperatura ambientedurante10minparaeliminar cualquiereritrocito restante.Lascélulasposteriormenteselavan,sefiltrana tra-vésdemalladenailonde40␮mysesuspendenensolución Ringer-lactatoestéril(GriffolsS.A.,Barcelona,Espa ˜na)parala implantacióninmediatasinexpansión(FVE).Seresuspenden en2cm3_{desuerosalinoysehaceunrecuentoporcitometría} deflujodelnúmerodecélulasobtenido.

Inyeccióndelafracciónvasculoestromal

Encadaanimalseusólarodillaizquierdacomogrupo con-trolylarodilladerechaparaeltratamientoconFVE.Cuatro horastras lasuturameniscalylaobtencióndeltejido adi-poso se seda al animal con ketamina intramuscular y se infiltralaFVEmedianteinyecciónintraarticularenlarodilla derecha.

Obtencióndemuestrasyanálisishistológico

Losanimalessemantuvieronestabuladossinrestricciónpara elmovimientodelasextremidadesdurante2semanas. Enton-cesfueronsacrificadosmedianteunainyecciónintravenosade Propofol®_{.Serealizóunaartrotomíatransversasubpatelary} seextrajeronambosmeniscosmedialescompletos.

Se fijaron los meniscos en formaldehído (solución A DiaPath®_{)durante15días,ysedescalcificaronconácido} hidro-clóricoyEDTA(soluciónBDiaPath®_{)durante3semanas.Se} incluyeronenparafinayserealizaroncortesde5-10␮menel planocoronaldelmeniscoperpendicularmentealalesión.Los meniscosseti ˜neronconhematoxilina-eosina.Seevaluaron lossiguientesparámetroshistológicos:gradodecuración(no curado/cicatrización parcial/curación completa), la neovas-cularizacióndeltejidoylaproliferacióndefibrocondrocitos alrededordelalesión(ambasconunaescalasemicuantitativa de5grados)ylapresenciaderepoblacióncondrocitaria(por evaluacióndeformasisogénicas).Seanalizaronlasmuestras bajomicroscopiaa20xya100x.

Análisisestadístico

Elanálisisestadísticoserealizó conel programaSPSS16.0. Todas las variables fueronconsideradas como no paramé-tricas.Lasdiferenciasencontradasenlasdiversasvariables fueronevaluadasusandoeltestdeFriedman.Elnivelde sig-nificaciónaceptadofuep<0,05.

Resultados

TraslapurificacióndelaFVEseobtuvieronsiempreentre2y 4×106_{células.Seconfirmólaviabilidadcelularconazulde} tripán(Sigma,StLouis,MO,EE.UU.),ysiemprefuesuperioral 95%.

Durantelasegundaintervenciónalos2mesesdelalesión no se objetivó que ninguna de las roturas meniscales se hubieracuradoespontáneamente.

Al evaluar los resultados a los 15 días tras la sutura meniscal yaportedeCTM,latasa decuración(nocurado/ cicatrizaciónparcial/curacióncompleta)paraelgrupotratado fue1/1/2yparaelgrupocontrolfuede2/2/0(p>0,05).Lamedia delgradodeneovascularizaciónfuemayorenelgrupotratado (3,25±1,5vs.2±1,4)(p>0,05).Lamediadelgradode prolifera-cióndefibrocondrocitosfuemayorenelgrupotratado(2,5±1 vs.1,75±0,5)(p>0,05).Aparecieronformacionesde condroci-tosisogénicosen2meniscosdelgrupotratadoyenninguno delgrupodecontrol(fig.1).

Figura1–Corteaxialdelmeniscomedialdelcerdoalniveldelalesiónmeniscal(flechanegra)suturada.Tinción

hematoxilina-eosina,ampliaciónoriginal20×.Peseaquehanpasadosolo2semanas,lacuracióndelalesiónesevidente. Seaprecianzonasdeneovascularizaciónextensas(detalleA)enlazonadelesiónmientrasqueaambosladosdelazona lesionadaestasnoaparecen,confirmandoquelalesióninicialserealizóenzonaavascular.Tambiénseaprecia

hipercelularidadevidenteaexpensasdefibrocondrocitosmadurosenlazonalesionada(detalleB).Asimismoseaprecian

enalgunaslocalizacionesformacionesisogénicasdecondrocitos(detalleC,círculospeque ˜nos).

Discusión

ElusodeCTMmediantelainyecciónintraarticulardelaFVE deltejidoadiposoparaeltratamientodelesionescrónicasen zonaavasculardelmeniscomedialdelcerdoparecefavorecer laneovascularización,laproliferacióndefibrocondrocitosyla repoblacióncondrocíticaevaluadasalas2semanas postrata-miento.

Lanecesidaddeconservarlamayorparteposibledetejido meniscal en la cirugía de las lesiones meniscales es una reglaesencialdeestacirugía.Lastécnicasactualesdesutura meniscal se encuentrancon limitaciones relacionadas con lascaracterísticasmecánicasybioquímicasdelmenisco,de maneraquelaslesionesqueseproducenenlazona avascu-lardelmeniscopresentantasasdecuraciónconlastécnicas actualesdeentornoal20-30%22_{. Existe,pues,lanecesidad} dedise ˜narestrategiasbiológicasquemejorenlas expectati-vasdelassuturasmeniscalesenzonaavascular.

LasCTMobtenidasdegrasasehanutilizadoampliamente enterapéuticaderegeneracióntisular.Enestudiosprevios9,23

sehacomprobadoqueelusodeCTMderivadasdegrasatiene un efectopositivo en lacuraciónde lesiones enel cuerno anteriordelmeniscomedialdelconejo.Latasadeéxitode lasuturaprimariafuemayorcuandosea ˜nadieron10×5CTM. EsteestudioserealizóusandoCTMalogénicasproliferadas, queesadecuadoparasuusoexperimentalperoquepresenta diversasdificultadeslogísticasyeconómicasparatrasladarlo alaclínicaconhumanos.

LaFVEeselproductodelipoaspiraciónqueseobtienede laliposuccióndeltejidoadiposo.Lalipoaspiracióncontiene unagranpoblacióndecélulasllamadascélulasadiposas deri-vadas, que comparte muchas similitudescon lasCTM14,24_. García-Olmo et al.20 _{handemostrado que el usode laFVE} presenta un comportamientosimilar a lasCTM autógenas proliferadas en lesiones de fistulas de Crohn. La FVE ha sidousadaenhumanoseneltratamientodelasfístulasde Crohn25–27_{,enelmanejodeenfermedadesautoinmunescomo} laesclerosismúltiple28_{ylaesclerodermia}29_,enelcampode lacirugíaplástica24,30,31_{,yparatratarlesionescardiacas}32_y pulmonares33,34_{.Encirugíaortopédica,lainyección} intraarti-culardeFVEenhumanossehadescritoparaeltratamiento

delesionesosteocondralesdeastrágalo35_{yparaelmanejode} laartrosisderodilla36_{.Hayqueresaltarquenosehandescrito} complicacionesmayoresrelacionadasconelusodelaFVEen lainfiltraciónintraarticularenrodillaenhumanos.

Unaestrategiaatractivaparalaregeneraciónesla inyec-ción intraarticular de células progenitoras que pueden participarenlaregeneracióndelostejidosymejorarla.Este enfoquepresentavariasventajas:(i)esfácildellevaracabo enunrégimenambulatorioconmínimamorbilidad;(ii)puede serutilizadoparatratarlesionesindividualeso enfermeda-desdegenerativas;(iii)funcionaen2direcciones,entregando las células que pueden activamente regenerar los tejidos da ˜nadosysecretanfactorestróficosyantiinflamatoriosque puedenrestablecerlahomeostasisconjunta37,38_;(iv)sepuede repetir; y (v) minimiza ladifusión sistémica de lascélulas implantadas8_.

La inyección intraarticular de CTM39 _{ya se ha usado} previamente para el tratamiento de lesiones meniscales. Murphyetal.40_{realizaronunareseccióncompletadelmenisco} medialyelligamentocruzadoanteriorparaprovocarartrosis encabras; posteriormente realizaban infiltraciones intraar-ticularesde CTM derivadas de médula ósea,y observaban presenciadeestascélulasenelmeniscoregeneradoymenor progresióndelaartrosisenlasrodillastratadas.Losautores asociabanlosbuenosresultadosobtenidosnosoloalaacción propiadelasCTM,sinotambiénasuefectoreclutadorde tró-ficoparaotrascélulas.Horieetal.8_{investigaronelpotencial} paralaregeneracióndelmeniscodelainyección intraarticu-lardeCTMderivadasdelamembranasinovialenunmodelo deratascondefectomeniscal.Sedemostrólaparticipación activadelasCTMinyectadasenelprocesoderegeneración, adhiriéndosealossitioslesionadosysintetizandonuevos teji-dos;tambiénseapreció,conanálisisdeimageninvivo,quelas célulasinyectadasnosemovilizabanfueradelaarticulación inyectada.Esteesuntemacrucialdelaseguridadconrespecto aunaposibleaplicaciónclínicaenhumanos.Otrointeresante puntoenestetrabajoesquelosautorespodíandetectar acti-vidadMSC en la articulación hasta 28 días después de la inyecciónperonotrasuntiempomáslargo.Estopuede expli-carseporelhechodeque,despuésdeactivarlaregeneración delostejidos, lamayor partede lascélulasmueren mien-tras queunas pocaspermanecenenel tejido neoformado. Estoesunapruebamásqueapoyalahipótesisde lasCTM comoliberadorasdefactorestróficosparalareparacióndelos tejidos.

EnelpresenteestudioelusodelaFVEylainyección intraar-ticularbajosedacióndelascélulasobtenidashaposibilitado elaportedeCTMaunalesiónmeniscalenunintervalo hora-riode4h.Esteespaciotemporalaportaventajaslogísticasy económicassobreloquesetardaríaenobtener CTM autó-genasproliferadas,yesaceptablealahoradeplantearnos laincorporaciónclínicadeesta terapia.Losresultados his-tológicos a2semanas delasutura einfiltración delaFVE permitenobjetivarunainfluenciabeneficiosadelasmismas, favoreciéndose la neovascularización en lazona lesionada comopasoinicialeindispensableparalareparaciónde los tejidos. También se produce un aumento de la prolifera-ción de fibrocondrocitos y la diferenciacióncondral de las células,que setraduceenuniniciode lareparaciónde la lesión.

Limitaciones

Elestudio con animalesde experimentaciónaporta nume-rosos factores de distorsión, uno de ellos es la variación de comportamiento entre individuos con un número tan peque ˜nodeanimales.Estefactorfueesencialtambiénenla imposibilidad deobtenerresultadoscon relevancia estadís-ticaenelanálisishistológico.Sinembargosiempreseplanteó el estudiocomo exploratoriode lasposibilidades dela téc-nica,quepareceprometedora.Sedebeevaluaramáslargo plazolainfluenciadelainfiltraciónintraarticulardelaFEVen meniscostantonosuturadoscomosuturados.

Conclusiones

ElusodeCTMmediantelainyecciónintraarticulardelaFVE deltejidoadiposoasociadoalasuturadelesionescrónicasen zonaavasculardelmeniscomedialdelcerdoparecefavorecer laneovascularización,laproliferacióndefibrocondrocitosyla repoblacióncondrocíticaevaluadasalas2semanas postrata-miento.

Conflicto

de

intereses

Losautoresdeclarannotenerningúnconflictodeintereses.

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