Cuantificación de Cadmio en Cocoa en Polvo Comercial a través de Análisis Directo del Sólido en Suspensión mediante Espectroscopía de Absorción Atómica en
Modalidad de Horno de Grafito
Trabajo de grado en Química
Manuela Delgado Murillo
Director.
Dr. Ricardo Eusebio Rivas Hernández
Palabras clave: Cocoa en polvo comercial, Cadmio, ETAAS, Análisis en sólido directo, Muestras de sólidos en suspensión
Grupo de Investigación Química Analítica Aplicada, Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes.
Universidad de los Andes
2021
Índice de Contenidos
Agradecimientos 4
Resumen 5
Listado de abreviaturas, figuras, tablas y ecuaciones 6
1. Introducción 8
2. Planteamiento del problema 12
3. Objetivos 13
3.1. Objetivos Generales 13
3.2. Objetivos Específicos 13
4. Metodología 14
4.1. Obtención de muestra representativa y preparación de la suspensión 14 4.2. Optimización del programa de calentamiento y uso de modificador
para la determinación de Cd mediante GF-AAS
16
4.3. Caracterización de las variables analíticas del método propuesto 18
4.4. Estudio de interferencias 19
4.5. Verificación del efecto de matriz y Estudio de recuperación 19 4.6. Cuantificación de muestras comerciales de cocoa en polvo y
validación del método con material de referencia certificado
19
5. Resultados y Análisis 20
5.1. Preparación de la suspensión 20
5.2. Optimización del programa de calentamiento y uso de modificador para la determinación de Cd mediante GF-AAS
21
5.3. Caracterización de los parámetros analíticos del método propuesto 30
5.4. Estudio de interferencias 32
5.5. Estudios de recuperación y efecto de matriz 33
5.6. Cuantificación de muestras comerciales de cocoa en polvo y validación del método con material de referencia certificado
36
6. Conclusiones 38
7. Referencias Bibliográficas 38
Agradecimientos
Me siento muy orgullosa de haber escogido la Universidad de Los Andes para confiar mi aprendizaje; a sus profesores y personal de apoyo gracias, no pude haber tomado una mejor decisión.
A mis padres, mi apoyo incondicional y mis mejores guías, gracias.
A mi hermana Laura Liliana, mi amiga, mi confidente, mi soporte en los momentos de incertidumbre, gracias.
A mis compañeros, con quienes compartí los mejores momentos y también los difíciles, con los que no hubiera encontrado el optimismo y ánimo para enfrentar retos que parecían imposibles, también gracias.
A mis grandes amigos Oscar Dony y María Camila Ríos, compañeros incondicionales, excelentes personas, estudiantes admirables con quienes pasé los momentos especiales de estos años, amigos gracias.
A mis profesores y director de tesis Ricardo Rivas; que orgullo trabajar con quien comparte su conocimiento recelo, excelente profesional y educador, ellos tuvieron siempre la disposición y paciencia para dirigir, enseñar y corregir mis errores y valorar mis aciertos, gracias.
A todos los miembros de la institución gracias, me siento muy orgullosa de formar parte de la familia uniandina.
Resumen
Teniendo en cuenta que la cocoa en polvo contiene niveles apreciables de cadmio, y que la acumulación de este metal puede llegar a generar efectos adversos en la salud humana, es importante mantener su monitoreo en matrices de tan importante consumo en Colombia. Existen métodos para la determinación cuantitativa de este elemento en complicadas matrices derivadas del chocolate, requiriendo habitualmente la digestión de la muestra, el uso exhaustivo de reactivos químicos y por ende una cantidad de desechos derivados de los análisis que es bastante importante. Por esta razón se propone el desarrollo de una alternativa para la determinar los niveles de cadmio presentes en muestras comerciales de cocoa en polvo mediante análisis directo del sólido en suspensión en virtud de sus diversas ventajas, como son: el uso de cantidades de muestra más reducidos y un tiempo de análisis mucho más corto, al prescindir de la etapa de digestión exhaustiva. De igual manera, al utilizar la técnica de espectroscopía de absorción atómica en la modalidad de horno de grafito, se aprovecha su austeridad para el uso de cantidades reducidas de muestra, tanto líquidas como sólidas y por ende de suspensiones; aprovechar el control de la temperatura del horno de grafito para modificar la composición química del cadmio sin previa digestión; y un aspecto muy importante, servirse de su alta sensibilidad para determinar cuantitativamente concentraciones por el orden de las subtrazas de Cd. Sin embargo, el uso de suspensiones puede tener complicaciones derivadas de posible heterogeneidad de la suspensión que se coloca dentro del horno, que consecuentemente generen una señal irreproducible de cadmio; por lo cual será de primordial necesidad la preparación de la suspensión con suficientemente homogeneidad y estabilidad para lograr resultados aceptablemente reproducibles entre rachas de medidas.
Listado de abreviaturas, figuras, tablas y ecuaciones
Abreviaturas:
OMS: Organización Mundial de la Salud
JECFA: Comité Mixto de Expertos en Aditivos Alimentarios PTMI: Ingesta Mensual Tolerable Provisional
GF-AAS: Espectroscopía de Absorción Atómica en Horno de Grafito
HR-CS-AAS: Espectrofotómetro de Absorción Atómica de Fuente Continua y Alta Resolución
Figuras:
Figura 1. Cocoa en polvo suspendido al hacer uso de ácidos para homogeneizar.
Figura 2. Optimización del porcentaje a utilizar del modificador de fosfatos.
Figura 3. Señales de Cd obtenidas al variar el volumen de inyección de HF en la suspensión.
Figura 4. Señales de Cd obtenidas al variar el volumen de inyección de HNO3 en la suspensión.
Figura 5. Señales de Cd obtenidas al variar el volumen de inyección de la mezcla HNO3:HF en la suspensión (3 mL de suspensión)
Figura 6. Error en optimización del tiempo de calcinación.
Figura 7. Optimización del tiempo de calcinación.
Figura 8. Curva de calcinación.
Figura 9. Señales de Cd de algunas temperaturas evaluadas para determinar la temperatura de calcinación.
Figura 10. Temperatura de atomización.
Figura 11. Señales de algunas temperaturas evaluadas para determinar la temperatura de atomización.
Figura 12. Curva de calibración haciendo uso de estándares acuosos para la determinación de parámetros analíticos.
Figura 13. Curva de calibración preliminar para determinar el rango de linealidad.
Figura 14. Curva de calibración utilizada para medir el efecto de matriz y porcentaje de recuperación.
Figura 15. Curva de calibración obtenida para la cuantificación de Cd en las diferentes marcas de cocoa en polvo comercial y para el material de referencia certificado.
Tablas:
Tabla 1. Condiciones instrumentales iniciales para la medición de Cd en GF-AAS establecidas por defecto en el software del equipo.
Tabla 2. Programa de calentamiento optimizado para la medición de Cd mediante GF- AAS.
Tabla 3. Parámetros analíticos obtenidos.
Tabla 4. Resultados obtenidos del estudio de interferentes.
Tabla 5. Parámetros de las regresiones lineales para la calibración y adición estándar de Cd.
Tabla 6. Porcentaje de recuperación
Tabla 7. Concentración de Cd obtenida para las diferentes marcas de cocoa en polvo comercial y para el material de referencia certificado.
1. Introducción
Desde siempre, los metales pesados han tenido gran importancia debido a su impacto sobre el medio ambiente y asimismo sobre la sociedad. En parte, el uso excesivo de fertilizantes químicos y la contaminación industrial (p. ej. tecnología, agropecuaria y minería) generan en los suelos de cultivos un excesivo contenido de metales pesados, provocando a su vez su incorporación a los ríos, las plantas, los animales y consecuentemente a los alimentos.1,2,3 Muchos de estos metales se concentran disueltos y en forma de partículas suspendidas en los suelos y sedimentos respectivamente, por lo que las plantas los absorben gradualmente hasta el punto de acumularse e inevitablemente distribuirse a lo largo de la cadena alimentaria y llegar finalmente al cuerpo humano, donde puede generar graves problemas de salud.4
Uno de estos metales pesados es el cadmio, que es relativamente raro en la naturaleza y normalmente no se encuentra en estado libre, lo que indica que este metal se asocia por la afinidad a otros metales como zinc, plomo o cobre y de igual manera a elementos como el oxigeno (óxido de cadmio), cloro (cloruro de cadmio) o azufre (sulfuro de cadmio).5 Por ejemplo, una gran parte del cadmio producido es obtenido como subproducto de la fundición y refinado de los minerales de zinc, cuya distribución en el ambiente se hace circunstancial de manera conjunta. Las fuentes principales de exposición e insumo de los seres vivos frente a este metal son principalmente el agua y los alimentos de origen agrícola. De forma específica, las concentraciones presentes en estas fuentes de insumo dependen en gran medida del nivel de contaminación existente en la zona de producción.1 De manera general, los productos que provienen de las plantas presentan una concentración de cadmio mayor a aquellos que no, siendo entre 8 y 25 μg diarios un promedio de insumo diario para el ser humano.6 Cuando la concentración de cadmio se encuentra a niveles altos en el cuerpo humano, ya sea por exposición directa o por su
consumo, se producen ciertas enfermedades asociadas a la su exposición crónica, dentro de las cuales se pueden citar: la anemia, las disfunción renal, osteoporosis, e incluso cáncer de próstata y de pulmón. Por otro lado, cuando la intoxicación es aguda se puede producir neumonitis, edema pulmonar, gastroenteritis, vomito, dolor abdominal y falla renal.1,7,8
Por su parte, la organización Mundial de la Salud (OMS) ha relacionado diversos síntomas que presentan los seres humanos asociados a la contaminación con cadmio con factores como la cantidad del elemento presente en el cuerpo, el tiempo de exposición a la fuente del mismo, la forma química presente y con la vía de insumo del metal.1 Por esto, resulta de gran importancia mantener un control estricto respecto a la concentración de estos metales de toxicidad importante en los alimentos de manera general y en el agua considerada como potable, ya que un producto comercial no debería sobrepasar los límites permitidos por los organismos de salud. De hecho, una dieta con exposición a niveles elevados de cadmio, y a largo plazo, estará fuertemente asociada en el humano a diversos efectos negativos en los riñones, incluyendo una disminución de la función renal.7,8
Por otro lado, la cocoa en polvo (o “cacao en polvo”) es uno de los productos provenientes de un proceso industrial que se lleva a cabo sobre los granos (semillas) secos y fermentados, extraídos del árbol de cacao (Theobroma cacao L.)7; proceso que se inicia con la fermentación, seguido del secado, limpieza, desgranado y por último el tostado del grano. Posteriormente, este grano tostado se muele y se refina para así obtener un producto líquido (licor) con sólidos suspendidos y mantequilla de cacao. Particularmente, para la obtención de la cocoa en polvo, se requiere extraer desde este licor los sólidos presentes, como componentes sin grasa del cacao, para así volver a molerlos, tamizarlos y finalmente obtener el polvo deseado de la cocoa.7
En el 2013, la OMS y el Comité Mixto de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA) evaluaron la concentración de cadmio en los productos provenientes del cacao. Se estimó que la exposición dietética potencial del cadmio procede de todos los alimentos en general. Los adultos consumidores de productos que provienen del cacao consumen entre un 30 y un 69% de la ingesta mensual provisionalmente tolerable (PTMI) para el humano, mientras que los niños entre edades comprendidas desde los seis meses de edad hasta los doce años consumen hasta un 96% de esta PTMI.9
Según lo anteriormente expuesto, se justifica la importancia de cuantificar debidamente y de manera efectiva el contenido de cadmio en un alimento tan habitualmente consumido como la cocoa en polvo.
Con el fin de comprobar la presencia de este metal en la cocoa en polvo en sus niveles propios, se requiere de una técnica analítica muy sensible para dichas concentraciones (en el orden de las trazas e incluso subtrazas). Una de estas técnicas es la espectroscopía de absorción atómica en modalidad de horno de grafito (GF-AAS), que proporciona una capacidad de detección por debajo de la parte por billón para el cadmio. Adicionalmente, es una técnica para la cual no se requiere de un tratamiento muy complejo de la muestra, cuando se utiliza para el análisis de líquidos requiere de volúmenes muy reducidos para la medición (entre 10 y 40 microlitros) y también es idónea para la determinación directa de estos elementos metálicos en matrices sólidas. En este caso se puede introducir al lecho donde se soporta de la muestra (un pequeño tubo de grafito de unos 3 cm de longitud y 0,5 cm de diámetro) la matriz sólida en forma de suspensión, reduciendo notablemente el tiempo de preparación de muestra, al prescindir de la etapa de digestión.
Consecuentemente, al no contemplar en el procedimiento esta etapa, se reduce el riesgo de contaminación proveniente de los agentes ácidos y oxidantes requeridos para tal fin.
A su vez, se mantiene la alta sensibilidad requerida al no haber tampoco una pérdida de
los analitos por volatilización, efecto derivado de la elevación de la temperatura del proceso, o por pérdidas derivadas a una posible digestión incompleta de la muestra.10
Existen dos alternativas para analizar sólidos mediante esta técnica, ya sea por introducción directa de la muestra en el horno de grafito o mediante la preparación e inyección de una suspensión estable como si se estuviese inyectando la muestra líquida.
La manera más práctica es la segunda, haciendo uso de la suspensión11 en vista de que se aprovechan de manera combinada los beneficios tanto del análisis de sólidos como de la inyección de líquidos, en el sentido de que no se requiere de la digestión de la muestra y a su vez se introduce la misma de manera homogénea con la ayuda de un instrumento volumétrico. Un aspecto crítico de este tipo de metodologías se deriva de la incongruencia al usar patrones acuosos del analito para fines comparativos (calibración) de sensibilidad sobre las muestras de origen sólido. En otras palabras, usar patrones acuosos para medir muestras sólidas, no es lo más adecuado y conveniente. Sin embargo, mediante estudios de recuperación y de adición estándar puede verificarse la factibilidad de su uso para fines cuantitativos, a pasar de que no sean físicamente similares. La técnica de horno de grafito, de por sí, puede considerarse como una técnica de análisis de sólidos propiamente dicha, en vista de que todas las muestras líquidas introducidas al atomizador (tubo de grafito) requieren una etapa de secado que implica la evaporación total del disolvente, previo a la atomización de analito en estado sólido.
Por otro lado, una posible desventaja pudiera deberse a que la preparación de dicha suspensión requiere de una agitación constante para mantener la mencionada homogeneidad estable en el tiempo. En ese sentido, al pretender introducir las muestras al horno de grafito haciendo uso del automuestreador del equipo, que no cuenta con un sistema de agitación in situ, implica una limitación. El automuestreador, cuya función es inyectar de la manera más automática y repetitiva, pierde de esta manera su potencialidad
referida a la automatización de la medida, incluso si contase con un agitador magnético extremadamente pequeño12, ya que es posible la adherencia de algunas de las partículas sólidas sobre el mismo. Por esto, en la mayoría de los casos la agitación se debe hacerse por separado a expensas de los componentes del equipo, de manera manual con un agitador magnético preferiblemente y con una velocidad controlada. De igual forma, la inyección de la suspensión dentro del horno de grafito debe ser manual, lo cual implica una precisión disminuida en las medidas arrojadas por la medida del equipo.10
2. Planteamiento del problema
Teniendo en cuenta los efectos adversos que presentan el cadmio en la salud humana y el habitual y prolongado consumo de productos derivados del cacao, es de gran importancia desarrollar un método para cuantificar este metal en la cocoa en polvo. En vista de que los métodos para la determinación cuantitativa de este elemento en estas matrices recurren tradicionalmente a procedimientos que contemplan la digestión húmeda de la muestra,13,14 resulta interesante plantear una metodología basada en la utilización de suspensiones con base a las ventajas que esta modalidad representa. Esta propuesta se centra en la preparación de una suspensión lo más homogénea posible de cocoa en polvo, a su vez parcialmente disuelto, con el fin de determinar de forma cuantitativa los niveles presentes de cadmio para la determinación del elemento en muestras comerciales de cocoa en polvo. De esta manera, se pretende desarrollar una metodología rápida y simple, con un procedimiento a corto tiempo, y a su vez haciendo uso de curvas de calibración acuosas, para determinar los niveles de cadmio presentes en la matriz sólida de cocoa mediante el análisis directo haciendo uso de la técnica de absorción atómica bajo la modalidad de horno de grafito (GF-AAS). De igual manera se pretende determinar si la concentración de cadmio en la cocoa en polvo que se vende comercialmente en el mercado
nacional está efectivamente por debajo del límite permitido por los organismos regulación de calidad colombianos (1,5 mg/kg).15
3. Objetivos de la investigación
3.1. Objetivo General
Desarrollar una metodología adecuada para la determinar de forma cuantitativa los niveles de cadmio presentes en muestras comerciales de cocoa en polvo mediante análisis directo del sólido en suspensión, utilizando espectroscopía de absorción atómica en la modalidad de horno de grafito.
3.2. Objetivos Específicos
▪ Preparar una suspensión lo suficientemente homogénea y estable para su inyección efectiva en el sistema de atomización (horno de grafito) del equipo de absorción atómica, con el propósito de obtener mediciones adecuadamente repetibles.
▪ Implementar una estrategia para el muestreo y preparación de la muestra, en términos de toma y representatividad estadística, previo a la preparación de la suspensión del sólido.
▪ Optimizar los parámetros del programa de calentamiento de horno de grafito, relacionado con el uso de un modificador químico, con fines de obtener la mayor sensibilidad posible en las señales de cadmio.
▪ Verificar la robustez del método desarrollado a través de un estudio de interferencias de posibles iones presentes en la matriz que afecten la sensibilidad.
▪ Caracterizar el método terminado mediante parámetros estadísticos como límites de detección y cuantificación, intervalo lineal de trabajo y sensibilidad asociada a la masa característica del elemento según el método ya optimizado.
▪ Verificar la precisión y la exactitud del método, mediante estudios de recuperación y a través del análisis de un material de referencia certificado.
4. Metodología
4.1. Obtención de la muestra representativa y preparación de la suspensión
Se adquirieron 5 muestras de cocoa en polvo en mercados locales de la ciudad de Bogotá. A cada una de estas se le realizó el método conocido como apilar y dividir en cuartos. Esto con el fin de trabajar con una muestra representativa de cada marca comercial de cocoa en polvo y reducir al mínimo la distorsión en el muestreo. El método consistió en dividir en cuartos la cantidad total de cocoa en polvo.
Posteriormente, cada uno de estos cuartos se maceró, se apiló en una forma cónica que después se alisó y se dividió cada uno nuevamente en cuatro cuartos.
Finalmente, se eligieron dos cuartos apuestos, de manera aleatoria. Este procedimiento de corte, elección aleatoria de dos cuartos apuestos, mezcla, molienda y “reapilado” se realizó hasta obtener la masa de muestra necesaria para llevar a cabo todos lo anlaísis.16
Se preparó una suspensión de cocoa en polvo lo suficientemente estable y homogénea para lograr obtener mediciones repetibles y cuyas señales en el sistema de detección arrojasen perfiles de forma gaussiana (picos gaussianos). Para lograrlo, normalmente se utiliza un estabilizante de la suspensión, específicamente
el surfactante Tritón X-100, utilizados generalmente y en principio para muestras de origen alimenticio17. Este se caracteriza por ser un surfactante complicado de utilizar debido a su elevada viscosidad, por lo cual se prefirió el uso de Tween-20, que también funciona para este tipo de muestras y mostró mejores resultados al momento de evaluarse como agente estabilizante de la suspensión.
Por otro lado, se tomaron 100 g de la muestra representativa del paquete de cocoa en polvo utilizado, se trituraron en un mortero de ágata y se tamizaron hasta obtener un tamaño de partícula inferior a 150um (150 micras). Finalmente, la suspensión se compuso de 0,1 g de cocoa en polvo, 100 mL de agua desionizada (para evitar posibles rastros de Cd) y 500 μL de Tween-20.
Se ha reportado que el uso de ácido nítrico y/o fluorhídrico disminuye la viscosidad de la suspensión, en este caso debido al Tween-20, homogeneizando el medio y consecuentemente evitando errores de repetibilidad por efectos de cambios en la masa del sólido suspendido que se inyecta manualmente en el horno de grafito.18,19,20 Adicionalmente, el uso de ácido fluorhídrico ayuda a disolver parcialmente los silicatos, si están eventualmente presentes en la matriz.17,21 Por esta razón se decidió convenientemente que la mezcla de ácidos necesaria para hacer de la suspensión un medio más homogéneo e idóneo era de HNO3 y HF en una proporción 1:5 respectivamente.
Más adelante se llevaría a cabo un estudio de adición estándar para verificar el efecto de matriz sobre la señal de cadmio, para lo cual se preparó una suspensión colocando 0,0125 g de cocoa en polvo sobre 100 mL de agua desionizada, fortificando con 200 μL de Tween-20, 100 μL de HNO3 y 500 μL de HF.
4.2. Optimización del programa de calentamiento y uso de modificador para la determinación de Cd mediante GF-AAS
Un aspecto importante para la determinación de cualquier elemento metálico haciendo uso del horno de grafito es su respectivo programa de calentamiento. En el cuadro 1 se muestra el programa recomendado por defecto según el software del equipo de absorción atómica y exclusivo para la medición de Cd (ASpect CS 2.2.1.0.). Con el propósito de simplificarlo y a su vez adaptarlo convenientemente para la matriz de cocoa en polvo, debieron hacerse una serie de modificaciones en todas las etapas (secado, calcinación y atomización) hasta obtener un programa relativamente corto y austeramente energético que permitiese las mayores medidas de absorbancia en la señal analítica del cadmio y sin pérdidas apreciables en la sensibilidad. En otras palabras, un programa de calentamiento efectivo con un menor número de etapas, de lapsos temporales cortos y a su vez disminuidos energéticamente (mínimas temperaturas posibles). Todo esto, en con el fin de aumentar la vida útil de los tubos de grafito y del impacto que proporciona al método un menor gasto de energía para el equipo de absorción atómica.
De igual manera, el objetivo fue que todos estos parámetros buscaran que la respuesta analítica obtenida (señales de cadmio) fuera representada por perfiles de absorbancia gaussianos (que representan una volatilización/atomización adecuada) y repetibles, que apuntaron a una alta sensibilidad y precisión en la medida del elemento.
Tabla 1. Condiciones instrumentales iniciales para la medición de Cd en GF-AAS establecidas por defecto en el software del equipo.
Todos los análisis realizados con GF-AAS en esta investigación se llevaron a cabo en un espectrofotómetro de absorción atómica de fuente continua y alta resolución (HR-CS-AAS) modelo CONTRAA800 (Analytik Jena, Alemania) en modalidad de horno de grafito, utilizando la línea principal de absorción del Cd (228,80 nm) como línea de trabajo y monitoreando el valor de la absorbancia respectiva mediante la suma de 3 píxeles correspondientes en el sistema de detección (CP±1).
Un aspecto importante, para evitar la marcada volatilización del Cd durante las etapas previas a la atomización de este metal en su forma elemental, es el uso a concentraciones adecuadas de los bien conocidos modificadores de matriz. Estas son sustancias que se agregan deliberadamente, ya sea a la muestra o de manera separada dentro del horno de grafito con el propósito de “modificar” la forma química del analito. Así, se aprovecha una nueva estabilidad térmica, para permitir un aumento de la temperatura de las etapas de secado y calcinación, necesarias para una liberación efectiva y completa de la matriz de la muestra sin pérdidas aparentes de elemento en cuestión. En otras palabras, se “modifica” la composición
química del cadmio a una forma química altamente refractaria cuya temperatura de vaporización es superior a la necesaria para descomponer y evaporar exhaustivamente los componentes de la matriz.
Se determinó que el modificador adecuado era el de fosfato de amonio, con lo cual se procedió a verificar el efecto de la concentración (en %m/v) del mismo (0%, 0,125%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1% y 1,25%) sobre la sensibilidad y forma de pico del cadmio, encontrando una concentración óptima y suficiente de 0,75%.
Cabe destacar un parámetro muy importante, no antes mencionado, como lo es el volumen de inyección del modificador en el horno. El mismo fue de 10 μL, al igual que el volumen tanto de estándares como de las muestras (en suspensión) para todas las determinaciones respectivas.
4.3. Caracterización de las variables analíticas del método propuesto
Teniendo en cuenta que la determinación de este metal se hizo de manera directa sobre la cocoa en polvo (sólido en suspensión), fue de gran importancia verificar si un método de calibración externa, con el uso de patrones acuosos, pudo ser factible para la cuantificación de forma directa.
Inicialmente se realizó una curva de calibración preliminar, con el fin de determinar el rango de linealidad, esta se realizó de 0 a 4ppb. Posteriormente, se realizó una curva de calibración de 0 a 2,5ppb con el fin de determinar los parámetros estadísticos como el LOD, LOQ, rango de linealidad, masa característica y concentración máxima de trabajo.
4.4. Estudio de interferentes
Con el fin de probar si la señal de Cd se mantenía constante frente a la presencia de otros iones, se realizó el estudio de interferencias, que consistió en aumentar la concentración de diversos iones y verificar la concentración máxima de los mismos que haría cambian en un 5 % la sensibilidad del cadmio. Para esto, se añadieron cantidades progresivas de los iones (Ca+, Mg+, Fe3+, K+, Na+, Zn+, Mn2+, Cu2+, NH4+, SO42-, PO43-, Cl-, CO32-) y glucosa hasta observar dicho cambio en la medida directa de la absorbancia respecto al blanco.
4.5. Verificación del efecto de matriz y estudio de recuperación
Se realizó una curva de calibración con estándares acuosos y una curva de adición estándar en la que se agregaron 5 alícuotas de 100 μL de una solución estándar de 250 ppb de Cd y se midió la absorbancia por triplicado con cada adición. En cada adición se agregaban 10 μL del modificador de fosfatos 0,75% y 10 μL de la suspensión de cocoa en polvo. A partir de las curvas obtenidas se determinó si existía un posible efecto de matriz al comparar las pendientes de estas. De igual manera se determinó el porcentaje de recuperación con algunos de los puntos de la misma curva de adición estándar.
4.6. Cuantificación de muestras comerciales de cocoa en polvo y validación del método con material de referencia certificado.
Teniendo todo el método, se procedió a cuantificar 5 muestras diferentes de cocoa en polvo para verificar si la concentración de Cd estaba por debajo del límite
permitido según la normativa colombiana. De igual manera se utilizó un material de referencia certificado SMR 1573a (hojas de tomate certificado por NIST) para comprobar si la trazabilidad del método.
5. Resultados y análisis
5.1. Preparación de la suspensión
Inicialmente se realizaron diversas pruebas visuales para determinar la cantidad adecuada de surfactante que se debía agregar a la suspensión para que a simple vista fuera homogénea, es decir, que no hubiera partículas de cocoa en polvo de distintos tamaños y que estas no estuvieran distribuidas de manera diferente en la suspensión. Por otro lado, se utilizó Tween-20 ya que fue más fácil manejarlo respecto al Tritón X-100 y se generó una suspensión mucho más clara y homogénea visualmente utilizando un volumen menor respecto al requerido con Tritón X-100.
Por otro lado, se realizaron unas pruebas para determinar el ácido o ácidos (HF, HNO3 o la mezcla de ambos) que podrían ayudar a la homogenización de la suspensión, con el fin de evaluar el posible uso del automuestreador. Cuando se agregaron diferentes volúmenes de los ácidos evaluados, se observó la sedimentación inmediata de la cocoa en polvo en la suspensión (figura 1), por lo que las inyecciones en todo el estudio fueron manuales, donde la suspensión se agitaba en una plancha de agitación externa al equipo.
Figura 1. Cocoa en polvo suspendido al hacer uso de ácidos para homogeneizar.
Izquierda: Inmediatamente de suspender la agitación. Derecha: 5 minutos sin agitación.
5.2. Optimización del programa de calentamiento y uso de modificador para la determinación de Cd mediante GF-AAS
Antes de realizar las mediciones fue necesario determinar el volumen de inyección tanto del modificador como de suspensión. Para esto se tomaron varias medidas y se determinó que 10 μL de cada uno de estos era adecuado.
Antes de optimizar el programa de calentamiento, se buscó cual era el porcentaje de modificador adecuado para retrasar la salida (atomización) de las señales de Cd y que estas fueran óptimas (figura 2). Por esta razón, se utilizaron las condiciones recomendadas por el software ASpect CS 2.2.1.0. (tabla 1) para medir las diferentes concentraciones de modificador de fosfatos (NH4H2PO4).
Es importante aclarar que se utilizó este modificador ya que tiene efectos comprobados sobre la salida (atomización) de Cd a diferentes concentraciones22 y al experimentar con este, se obtuvieron señales óptimas.
Adicionalmente, aunque se ha logrado demostrar que los modificadores no tienen un alto grado de eficiencia con las suspensiones ya que no estan en contacto directo entre si,23 se logró encontrar una concentración adecuada de este para retrasar la señal de Cd y obtener mediciones adecuadas, en este caso la concentración fue 0,75%. Adicionalmente, es importante aclarar que las moléculas del modificador junto con el Cd generan una mezcla refractaria sobre el horno de grafito haciendo que se puedan utilizar temperaturas suficientemente altas sin que haya una pérdida del analito antes de la etapa de atomización (pérdida de la sensibilidad analítica).24
Figura 2. Optimización del porcentaje a utilizar del modificador de fosfatos.
Por último, es importante tener en cuenta que el modificador hace que el analito se estabilice y por tanto permita la exposición a temperaturas de calcinación lo suficientemente altas para eliminar los posibles interferentes químicos.25
De igual forma se estudio cual de estos ácidos mostraba señales de Cd repetibles y con forma Gaussiana. En las figuras 3, 4 y 5 se pueden observar estas señales obtenidas al agregar diferentes volúmenes de cada uno de los ácidos de forma individual y en una mezcla de estos.
Figura 3. Señales de Cd obtenidas al variar el volumen de inyección de HF en la suspensión.
Específicamente, en la figura 3 se puede observar que con un volumen de 2000 μL se obtiene una señal de Cd óptima, sin embargo, al hacer las mediciones con la
mezcla de ácidos (figura 5) fue posible observar que con una relación 5:25 respectivamente, la señal de Cd también era óptima y en este caso fue la escogida ya que era mucho menos volumen de ácidos que el requerido haciendo uso únicamente de HF. Por otro lado, en la figura 4 se observa que las señales de Cd obtenidas al utilizar únicamente HNO3 no presentaban un comportamiento adecuado ya que se observan dos señales, que indican que hay dos especies de Cd, donde una parcialmente parece estar en forma disuelta (Cd2+ acuoso).
Figura 4. Señales de Cd obtenidas al variar el volumen de inyección de HNO3 en la suspensión.
Figura 5. Señales de Cd obtenidas al variar el volumen de inyección de la mezcla HNO3:HF en la suspensión (3 mL de suspensión)
Un factor muy importante para la optimización del programa de calentamiento es el tiempo requerido en la etapa de calcinación. Inicialmente se cometió un error ya que se calcinó el modificador y las señales de Cd mostraban un comportamiento inadecuado (figura 6) debido a que el modificador no debe calcinarse, únicamente secarse ya que este pierde el efecto sobre la suspensión y solo una porción de Cd se “modifica” (se estabiliza térmicamente).
Figura 6. Error en optimización del tiempo de calcinación.
Al corregir este error, las señales de Cd obtenidas fueron mucho mejores ya que todo el Cd en la suspensión se modificó. En la figura 7 se pueden observar estas señales obtenidas, en donde la más óptima fue aquella con 20 segundos de calcinación y por tanto fue el elegido para el programa de calentamiento.
Por otro lado, se procedió a optimizar la temperatura de calcinación. En la figura 8 se puede observar la curva de calcinación donde se puede observar que gracias a la presencia del modificador utilizado se evitó la volatilización del analito en el rango de temperatura medido (300-1000) °C. Al observar las señales de Cd obtenidas a partir de esta curva de calcinación (figura 9), fue posible definir que la temperatura de calcinación adecuada era 600°C ya que la forma de la señal es óptima.
Figura 7. Optimización del tiempo de calcinación.
Figura 8. Curva de calcinación.
De igual manera, se procedió a optimizar la temperatura de atomización. En la figura 10 se observa la curva de atomización donde se evidencia que a temperaturas de 1000 y 1100°C no eran suficientes para atomizar. Luego de esto, al observar las señales de Cd obtenidas (figura 11) fue posible definir que la temperatura de atomización adecuada era 1300°C ya que la forma de la señal es óptima.
Figura 9. Señales de Cd de algunas temperaturas evaluadas para determinar la temperatura de calcinación.
Figura 10. Temperatura de atomización.
Figura 11. Señales de algunas temperaturas evaluadas para determinar la temperatura de atomización.
Ahora bien, con la temperatura de calcinación y atomización optimizadas, no fue necesario optimizar la rampa de temperatura de todas las etapas del programa de calentamiento especificada por defecto en el software, únicamente se determinó que para la calcinación era más adecuado utilizar 250°C/s en lugar de 300°C/s para evitar la formación de pequeñas cantidades de humo que puedan generar algún interferente de tipo físico en la señal del analito.
Por último, en la tabla 2 se resumen las condiciones optimizadas del programa de calentamiento asegurando una repetitividad en las mediciones de Cd mediante GF-AAS.
Tabla 2. Programa de calentamiento optimizado para la medición de Cd mediante GF- AAS.
5.3. Caracterización de los parámetros analíticos del método propuesto
Con el fin de evaluar el método, se determinaron los parámetros estadísticos (tabla 3) como el rango de linealidad, LOD, LOQ,27 concentración máxima, concentración característica y masa característica26,28 a partir de la curva de calibración presentada a continuación (figura 12).
Figura 12. Curva de calibración haciendo uso de estándares acuosos para la determinación de parámetros analíticos.
Tabla 3. Parámetros analíticos obtenidos.
Inicialmente, se comprobó el rango de linealidad a partir de una curva de calibración haciendo uso de estándares acuosos. Esta curva preliminar se observa en la figura 13. Se pudo evidenciar que la linealidad se mantenía hasta antes de 3 ppb. Por esta razón se decidió realizar las curvas de calibración de todos los estudios desde 0 hasta 2,5 ppb. Teniendo en cuenta la concentración característica de Cd reportada por el equipo (0,06 μg/L), es posible confirmar que el método propuesto presenta una mayor sensibilidad ya que la obtenida es menor. Por último, es importante tener en cuenta que la masa característica se define como la masa del analito inyectado dentro del horno de grafito que genera un valor de absorbancia de 0,0044 que en otras
y = 0,0466x + 0,0034 R² = 0,9965
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
ABSORBANCIA
CONCENTRACIÓN (PPB)
palabras indica que es el 1% de la radiación absorbida y es una medida directa de la sensibilidad del método.26
Figura 13. Curva de calibración preliminar para determinar el rango de linealidad.
5.4. Estudio de interferencias
La robustez en la determinación de Cd en suspensiones de cacao en polvo puede estar afectada por la cantidad de sustancias orgánicas e inorgánicas que generan un efecto de matriz sujeto a la concentración de dichas sustancias eventualmente interferentes. Un estudio de interferentes consiste en determinar la concentración de diferentes elementos en su forma iónica que pueden afectar, cada uno en su forma y medida, la sensibilidad del analito en el sistema de detección, atomizador de horno en este caso. Al fortificar progresivamente la suspensión de cocoa en polvo, con diferentes iones, se puede determinar la concentración mínima que afecta la
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16
0 0 , 5 1 1 , 5 2 2 , 5 3 3 , 5 4 4 , 5
ABSORBANCIA
CONCENTRACIÓN (PPB)
sensibilidad del Cd en un 5%. En la tabla 4 se presenta una tabla informativa con un resumen de los iones interferentes cuya concentración afecta cuantitativamente la determinación de Cd en suspensiones de cocoa en polvo bajo la técnica en cuestión.
Tabla 4. Resultados obtenidos del estudio de interferentes.
5.5. Estudio de recuperación y efecto de matriz
Con el fin de determinar si el uso de estándares acuosos es viable para la calibración y cuantificación de Cd en las suspensiones de cocoa en polvo, es importante determinar si existe efecto de matriz por efecto de los componentes de la muestra real de cocoa. Este efecto se puede evaluar comparando las pendientes de cada una de las curvas (de calibración y de adición estándar) debido a que estas deben representar un valor (sensibilidad) muy similar, de lo contrario se considera existiría un efecto de matriz y no sería posible cuantificar el metal a partir de la curva de calibración, sino a través de extrapolación mediante una curva de adición estándar para cada muestra. En la figura 14 se puede observar la curva de calibración y de adición estándar de Cd y en la tabla 5 los respectivos valores de las pendientes. Es
de gran importancia que para llevar a cabo este estudio se debió reducir las cantidades iniciales propuestas a 0,125 mg/mL para la preparación de la suspensión ya que las muestras contienen considerables concentraciones de Cd.
Figura 14. Curva de calibración utilizada para medir el efecto de matriz y porcentaje de recuperación.
Tabla 5. Parámetros de las regresiones lineales para la calibración y adición estándar de Cd.
Teniendo en cuenta que las pendientes de la curva de calibración y de la curva de adición estándar presentan una diferencia mínima, se realizó la prueba t29 entre
ambas las pendientes con el fin de comprobar si esta diferencia era significativa. El resultado de dicha prueba confirmó una similitud significativa corroborando una ausencia de efecto de matriz. Esto da pie para asegurar la factibilidad de llevar a cabo la cuantificación del Cd de forma cuantitativa haciendo uso de estándares acuosos.
Adicionalmente, se realizó un estudio de recuperación para evaluar la exactitud del método. En la siguiente ecuación se muestra la expresión utilizada para determinar el porcentaje de recuperación según las absorbancias de algunos puntos en la curva de adición estándar.
% 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐴𝑀+𝑆− 𝐴𝑀
𝐴𝑆 × 100%
En donde AM+S es la absorbancia de la muestra conteniendo el estándar, AM es la absorbancia de la muestra y AS es la absorbancia del estándar de concentración conocida. En la tabla 6 se observan los porcentajes de recuperación de los puntos sobre la curva de adición estándar (0,5 y 1 ppb).
Tabla 6. Porcentaje de recuperación
Se puede observar según la tabla 6 que el porcentaje de recuperación en estos dos puntos arroja resultados dentro del intervalo de (100 ± 5)%, indicando la alta exactitud para la cuantificación del Cd en la cocoa en polvo con el método propuesto.
5.6. Cuantificación de muestras comerciales de cocoa en polvo y validación del método con material de referencia certificado.
Luego de confirmar que era posible cuantificar la cantidad de Cd en la cocoa en polvo con estándares acuosos, se realizaron las suspensiones de cada una de las marcas comerciales y del material de referencia certificado utilizando la concentración indicada anteriormente en cada una de las suspensiones (0,125 mg/mL) para las marcas de cocoa.
Figura 15. Curva de calibración obtenida para la cuantificación de Cd en las diferentes marcas de cocoa en polvo comercial y para el material de referencia certificado.
Para el material de referencia certificado se utilizó 0,73 mg/mL. En la figura 15 se observa la curva de calibración utilizada y el blanco de cada una de las muestras.
El cálculo de la concentración de Cd a partir de la curva de calibración se realizó con las 5 muestras de cocoa en polvo comercial y con el material de referencia certificado.
Estas se encuentran reportadas en la tabla 7.
Para las diferentes muestras de cocoa en polvo no fue posible realizar una comparación respecto a una concentración de Cd reportada. Sin embargo, teniendo en cuenta que existe un límite permitido por los organismos regulación de calidad colombianos (1,5 mg/kg)15 se revisó si estas marcas estaban por debajo de este.
Únicamente la marca 1 y 2 estaban por debajo del límite permitido, mientras que las marcas 3-5 lo sobrepasaban.
Respecto a la concentración de Cd reportada del material de referencia certificado,30 el valor obtenido presenta un error del 5,2%, el cual es un porcentaje muy bajo y se pudo deber a errores aleatorios.
Tabla 7. Concentración de Cd obtenida para las diferentes muestras de cocoa en polvo comercial y para el material de referencia certificado (SRM 1573a).
6. Conclusiones
Se desarrolló una metodología para la determinación cuantitativa de los niveles de Cd presente en las muestras de cocoa en polvo comercial a partir del análisis directo del sólido en suspensión, haciendo uso de GF-AAS. De igual forma, la suspensión realizada fue lo suficientemente homogénea y estable ya que se obtuvieron mediciones repetibles.
Se optimizaron los parámetros del programa de calentamiento de horno de grafito haciendo uso del modificador de fosfatos. El método se caracterizó por medio de parámetros estadísticos y se comprobó una mayor sensibilidad en el método desarrollado respecto al reportado por el equipo teniendo en cuenta la concentración característica. Así mismo, fue posible verificar la robustez del método a través de un estudio de interferentes. Por último, se verificó la precisión y exactitud y se logró validar el método a partir de la cuantificación de Cd en un material de referencia certificado (hojas de tomate, NIST-SRM1573a), obteniendo una concordancia cercana al 95%.
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