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LIGHT DIAGNOSTICS™
KIT DFA SimulFluor HSV/VZV
Suplemento Español De la Lengua
3295 125
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Uso propuesto
El Kit DFA SimulFluor® HSV/VZV de Light Diagnostics™ está pensado para la detección y la identificación simultáneas de los virus del herpes simple (HSV) 1 y 2 y del virus de la varicela-zoster (VZV) de los pacientes con lesiones vesiculares, orales, genitales, o de piel, usando muestras directas y confirmación del cultivo. Las muestras negativas en el examen directo deben confirmarse con el cultivo.
Resumen y explicación
El virus del herpes simple (HSV) y el virus de la varicela-zoster (VZV) son miembros de la familia Herpesviridae. Son virus grandes, con envoltura, con un diámetro de casi 190 nm, con un ADN lineal bicatenario. Ambos virus causan multitud de enfermedades humanas y son particularmente graves en los pacientes inmunocomprometidos.
Existen dos serotipos de HSV distinguibles biológicamente, clasificados como tipo 1 (HSV1) y tipo 2 (HSV2). Los serotipos están muy relacionados con extensas homologías en la secuencia de su ADN. El HSV es una causa importante de enfermedades conjuntivales, respiratorias, del sistema nervioso central, genitales, y generalizadas (1-4). HSV infecta las superficies mucocutáneas, después entra en los ganglios de la raíz dorsal donde se produce la nueva replicación viral, seguida por un período de latencia. La reactivación está acompañada por la excreción viral en, o cercana al, sitio mucocutáneo original de infección, con o sin los signos y síntomas clínicos asociados. Las lesiones recurrentes son generalmente menos graves que la infección primaria.
El HSV1 causa gingivoestomatitis, faringitis intensa, tonsilitis, ocasionalmente encefalitis en los lactantes y los niños durante las infecciones primarias. Las lesiones oculares, nasales, orolabiales y orofaríngeas ocurren en niños y en adultos. Debido a la ubicuidad del HSV1 y a la facilidad de diseminación a través de gotitas de Pflügge, fomites y contacto directo, la mayoría de los adultos experimenta la infección por HSV1 durante el curso de su vida.
El HSV2 se asocia más frecuentemente con lesiones genitales dolorosas, uretritis y cervicitis en adultos. Si el virus está presente en el canal de parto en el momento del nacimiento, ya sea por infección primaria o recurrente, es posible que se produzca la infección generalizada grave en el recién nacido. De esta forma, las infecciones genitales maternas por HSV plantean un riesgo considerable para el feto y el recién nacido.
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La expulsión del virus en el momento del parto es con frecuencia la vía de transmisión de la madre al recién nacido. La infección neonatal por HSV es generalmente sintomática y a menudo mortal, con una tasa de mortalidad del 70%
en los casos no tratados. Se puede presentar clínicamente como una infección localizada en la piel, ojos y mucosa, como encefalitis, o como enfermedad diseminada.
El aciclovir, famciclovir, foscarnet y otros nucleósidos análogos pueden reducir los síntomas y la expulsión del virus en el herpes oral y genital, encefalitis herpética, herpes neonatal y queratitis herpética (5-7).
El HSV se puede recuperar fácilmente a partir de las muestras clínicas, después del cultivo en estirpes celulares tales como HEp2, MRC-5, A549, HEK, NCI-H292, y otras. El tiempo de incubación en los cultivos fijos o giratorios varía entre 1 y 7 días con citopatología evidente. Las muestras adecuadas incluyen torundas oculares, torundas de las lesiones vesiculares, saliva, exudados faríngeos, líquido cefalorraquídeo y tejidos, según lo indicado por los síntomas clínicos. La orina también puede ser una muestra válida.
El VZV causa dos síndromes clínicos diferentes: varicela (sobre todo en los niños), y herpes (zoster) (predominante en los adultos), (8-10). La característica más notable de la varicela consiste en una erupción vesicular generalizada que está acompañada generalmente por fiebre. Pueden aparecer complicaciones, tales como neumonía, en los recién nacidos y en los pacientes inmunocomprometidos con una mortalidad del 10 al 40%.
El zoster se produce como reactivación del virus latente de la varicela, y puede producirse como consecuencia de casi cualquier estímulo, tal como miedo, ansiedad, etc. Las mujeres embarazadas tienen un mayor riesgo de neumonía por varicela que otros adultos. La neuralgia postherpética es otra complicación de la varicela y del zoster, y es un problema significativamente mayor en los pacientes inmunocomprometidos.
Al igual que con el HSV, el aciclovir es el fármaco de elección para reducir los síntomas de la infección por VZV (8,11,12). En 1995 se aprobó una vacuna contra la varicela para uso en Estados Unidos; esta vacuna brinda una tasa de protección del 75 al 85% en los niños (10,13,14).
El VZV se puede aislar de muestras clínicas, generalmente lesiones de piel, pero también de pulmón, ojo, garganta y líquido vesicular en los cultivos celulares de fibroblastos humanos diploides. Su citopatología es bastante distinta de la del HSV. Sin embargo, el virus es más lábil que el HSV y es posible que no crezca en el cultivo a menos que se tenga cuidado durante el transporte de la muestra al laboratorio.
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El propósito de combinar los anticuerpos para HSV y VZV en un solo reactivo de análisis es que ambos virus pueden causar muchos de los mismos síntomas y resultados clínicos. El HSV se debe identificar para prevenir la propagación del virus a los recién nacidos durante el nacimiento y para prevenir la propagación de la enfermedad venérea a otros adultos. La identificación específica del virus en las muestras conjuntivales permite el tratamiento precoz con el aciclovir para reducir las posibilidades de ceguera.
Principio del análisis
El Kit DFA SimulFluor® HSV/VZV de Light Diagnostics™ utiliza un solo reactivo para la detección y la identificación simultáneas de HSV y de VZV. El componente primario que contiene los anticuerpos monoclonales, específicos para HSV 1 y 2, se unirá a la proteína principal de la cápside de 155kD en las células infectadas por HSV. El componente secundario que contiene los anticuerpos monoclonales, específicos para VZV, se unirá a la glucoproteína gp I y al antígeno inmediato precoz en las células infectadas por VZV. El reactivo que no se ha unido se elimina mediante lavado con PBS (phosphate-buffered saline, solución salina tamponada con fosfato). La iluminación con luz ultravioleta permite la visualización de los complejos antígeno-anticuerpo por medio de microscopía de fluorescencia. Cuando se utiliza un sistema de filtros para FITC, el complejo antígeno-anticuerpo de HSV muestra una fluorescencia color verde manzana y el complejo antígeno-anticuerpo de VZV despide una luz fluorescente color amarillo oro. Las células no infectadas se tiñen de un color rojo pálido debido a la presencia en el reactivo de Evans Blue.
Material incluido
1. SimulFluor HSV/VZV; 5235: Un frasco cuentagotas de 5 ml que contiene los anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno del HSV y específico para el antígeno de VZV, estabilizador de proteínas, Evans Blue y 0,1% de azida de sodio (conservante).
La cantidad suministrada es suficiente para 125 pruebas. Estimación se basa en las pruebas de caída de 40μL; el número real de las pruebas pueden variar.
2. HSV 1 & 2 Control Slides; 5093: Dos portaobjetos cada que contienen un pocillo para células HEp-2 infectadas por HSV 1, un pocillo para células infectadas por HSV 2 y un pocillo para células no infectadas.
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3. VZV Control Slides; 5088: Dos portaobjetos cada que contienen un pocillo para fibroblastos del prepucio humano infectados por VZV (aislado clínico) y un pocillo para fibroblastos de prepucio humano no infectados.
4. Phosphate-Buffered Saline (PBS); 5087: Un paquete de sales para solución salina tamponada con fosfato.
5. Tween 20/Sodium Azide Solution (100X); 5037: Un frasco de 10 ml que contiene el concentrado de Tween 20 y azida sódica.
6. Mounting Fluid; 5013: Un frasco cuentagotas de 10 ml que contiene glicerina tamponada con Tris, un ampliador de la fluorescencia y azida sódica al 0,1% (conservante). Guarde a temperatura entre 2°C y 25ºC.
Materiales necesarios no suministrados
• Acetona, grado reactivo o mejor; en envase de vidrio
• Agua destilada o desionizada
• Testigos positivos, para procedimientos de aislamiento en cultivo (las cepas de HSV y VZV de referencia están disponibles de la ATCC® American Type Culture Collection, Colección Americana de Cultivos Tipo), Manassas, VA.
• Solución de hipoclorito de sodio al 0,05% (lejía doméstica diluida 1:100)
• Shell vials estériles con cubreobjetos de 12 mm para el crecimiento de MRC-5 o de otra estirpe celular permisiva para HSV/VZV
• Medio para cultivo de tejidos, RPMI o EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium, medio esencial mínimo de Eagle) con suero fetal precalostral (FBS) y antibióticos o equivalentes
• Medio de transporte viral que no sea inhibitorio para HSV/VZV (solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) con antibióticos, o equivalente)
• PBS estéril, pH 7,0 a 7,6
• Portaobjetos no fluorescentes
• Cubreobjetos del Nº 1
• Dispositivo aspirador con pipetas Pasteur estériles desechables
• Centrifugadora capaz de alcanzar 700 a 950 x g con cubetas de riesgo biológico y adaptadores para shell vials
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• Citocentrifugadora capaz de depositar suspensiones celulares en los portaobjetos
• Microscopio de fluorescencia con una lámpara de mercurio o halógena de 100 vatios, la combinación de filtros adecuada para FITC (pico de excitación = 490 nm, pico de emisión = 520 nm) con un aumento de 100x y 400x (objetivo seco)
• Opcional: combinación de filtros para TRITC (pico de excitación = 550 nm, pico de emisión = 570 nm) NOTA: El cambio de un filtro para FITC a un filtro para TRITC hará que la fluorescencia color verde manzana desaparezca y que la fluorescencia color verde amarilla despida luz fluorescente color rosa fuerte, lo cual contribuye a la confirmación de la tinción no específica
• Pinzas
• Cámara húmeda
• Incubadora a 37 ± 1ºC
• Una jeringa y aguja u otro instrumento para extraer el cubreobjetos del shell vial
• Baño de agua con ultrasonido
• Vórtex o agitador por ultrasonido
Estabilidad y almacenamiento
Si se almacena entre 2º y 8ºC, el Kit DFA SimulFluor® HSV/VZV de Light Diagnostics™ es estable hasta la fecha de caducidad que está impresa en la etiqueta del kit. No congele ni exponga a temperatura elevada. Deseche los restos de reactivos después de la fecha de caducidad del kit.
Advertencias y precauciones
En las SDS encontrará la clasificación GHS y el texto completo de las frases H.
Las SDS pueden encontrarse en www.merckmillipore.com.
5037, TWEEN® 20/ Sodium Azide, 100X
Palabra de advertencia Peligro
6 Indicación(es) de peligro
H302 + H332 Nocivo en caso de ingestión o inhalación.
H311 Tóxico en contacto con la piel.
H412 Nocivo para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos.
Declaración(es) de prudencia
P261 Evitar respirar el polvo/ el humo/ el gas/ la niebla/ los vapores/ el aerosol.
P273 Evitar su liberación al medio ambiente.
P280 Llevar guantes/ ropa de protección.
P301 + P312 EN CASO DE INGESTIÓN: Llamar a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA/ médico si la persona se encuentra mal.
P302 + P352 + P312 EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con abundante agua. Llamar a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA/ médico si la persona se encuentra mal.
P304 + P340 + P312 EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la persona al aire libre y mantenerla en una posición que le facilite la respiración. Llamar a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA/ médico si la persona se encuentra mal.
• Los portaobjetos de control HSV y VZV contienen células infectadas por virus sobre portaobjetos de vidrio que han sido fijados e inactivados en acetona. Como con cualquier reactivo o material biológico, los usuarios deben aplicar las Precauciones Universales mientras trabajan con estos productos.
• La mezcla o alteración de cualquiera de los reactivos puede ocasionar resultados erróneos.
• No sustituir con los reactivos de otros fabricantes.
• Si los tiempos y temperaturas de incubación son diferentes de los especificados se pueden obtener resultados erróneos. El usuario deberá validar estos cambios.
• No permita que los shell vials o los portaobjetos se sequen en ningún momento durante el proceso de tinción.
• Manipule todas las muestras y los materiales que entren en contacto con ellas como materiales potencialmente infecciosos y deséchelos con las precauciones adecuadas. Descontamine con 0,05% de hipoclorito de sodio.
• No pipetee los reactivos con la boca.
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Obtención de muestras
La detección precisa de HSV/VZV depende de la obtención apropiada de la muestra, del transporte y del almacenamiento. Las muestras para la detección directa y el aislamiento en cultivo se deben obtener de la base de una lesión vesicular con una torunda de dacrón. Es necesario raspar vigorosamente sobre la base expuesta de la lesión para recoger una muestra adecuada. Evite la contaminación de la muestra con sangre para prevenir la posibilidad de un resultado falso negativo por aglutinación de anticuerpos séricos.
El líquido vesicular, extraído con una aguja y una jeringa estériles, es una muestra ideal para el aislamiento pero inadecuada para la detección directa. Las muestras obtenidas con torundas se deben utilizar inmediatamente para hacer los frotis celulares directos o para colocar en medio de transporte viral. Las muestras se deben transportar en el hielo y cultivar o preparar para la detección directa cuanto antes. Dado que el VZV es muy lábil, las muestras se deben transportar al laboratorio lo antes posible e inocularlas en el cultivo 12 horas después de la recolección.
Si es necesario un almacenamiento de larga duración, se recomienda congelar a
≤ -70ºC.
Proceso de muestras
Muestra directa:
Se puede realizar la detección directa de la muestra siempre que estén disponibles las muestras adecuadas. Se recomienda realizar el aislamiento en cultivo para la confirmación de los negativos. Si la muestra disponible es escasa para realizar tanto la detección directa como el cultivo, someta la muestra solamente al aislamiento en cultivo.
Preparación de la muestra
Se puede utilizar material celular de la base de las lesiones vesiculares para la detección mediante inmunofluorescencia directa. Las células basales, parabasales e intermedias raspadas de la base de la lesión constituyen una muestra apropiada. Retire la costra de la vesícula y aspire todo el líquido vesicular (para su uso en los procedimientos de aislamiento). Humedezca una torunda de dacrón con agua estéril o medio de transporte y raspe vigorosamente la base de la lesión. Se debe evitar la contaminación de la torunda con sangre.
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Preparación de frotis celulares directos con torunda
Prepare los frotis celulares haciendo girar la torunda sobre la mitad superior del pocillo de un portaobjetos para microscopios. Haga rodar el lado opuesto de la torunda sobre la mitad inferior del pocillo y deje que el portaobjetos se seque totalmente al aire. Fije el portaobjetos en acetona fría (2 a 8 °C) durante 10 minutos, retírelo y séquelo completamente al aire. Los portaobjetos se deben teñir inmediatamente (véase “Procedimiento de tinción”) o en caso de necesidad, almacene los portaobjetos a -20 ºC o menos con desecante.
Todas las muestras preparadas como frotis celulares deben estar acompañadas por una muestra del líquido vesicular o una muestra obtenida con torunda para su uso en el aislamiento en cultivo celular.
Preparación de las muestras directas de las torundas en el medio de transporte Coloque inmediatamente la torunda en el medio de transporte, agite en el vórtex, y extraiga todo líquido adicional de la torunda presionando contra el interior del recipiente de transporte.
Reservar una muestra adecuada del material celular para el uso en el aislamiento en cultivo.
Deseche la torunda en una solución de hipoclorito de sodio. Centrifugue la suspensión de células entre 250 y 500 x g durante 10 minutos. Aspire el sobrenadante y resuspenda las células sedimentadas en una cantidad suficiente de PBS para obtener una suspensión levemente turbia (50 a 100 µl). La calidad de la preparación depende de la concentración de células en la suspensión. Las suspensiones densas son difíciles de leer y las suspensiones excesivamente diluidas pueden reducir la sensibilidad. Las suspensiones óptimas producirán manchas celulares con aproximadamente 25 células por el campo de 200x.
Utilice la suspensión de células para preparar las manchas celulares en varios pocillos de portaobjetos de 6 a 8 mm y deje que las manchas se sequen totalmente al aire. Fije el portaobjetos en acetona fría (2 a 8 °C) durante 10 minutos, retírelo y séquelo completamente al aire. Los portaobjetos se deben teñir inmediatamente (véase “Procedimiento de tinción”) o en caso de necesidad, almacene los portaobjetos a -20 ºC o menos con desecante.
Preparación de muestras directas con una citocentrifugadora
Lave y centrifugue la suspensión celular según lo descrito anteriormente.
Suspenda de nuevo las células por lo menos en 400 μl en PBS y aplique 200 μl a cada portaobjetos mediante citocentrifugación a 800 RPM durante 4 minutos (17). Seque las células al aire totalmente y fíjelas con la acetona según lo descrito anteriormente.
9 Muestras para aislamiento en cultivo:
Torundas. Las muestras de torunda (obtenidas según se describió anteriormente) en medio de transporte se deben agitar manualmente o en un agitador vórtex para desprender las células de la torunda. Para una mayor recuperación celular, sonicar la muestra a 8 a 12 Kc/seg, durante un minuto.
Deseche la torunda en una solución de hipoclorito de sodio. Centrifugue la muestra a 950 x g durante 7-10 minutos, deseche el líquido sobrenadante, resuspéndala en un volumen apropiado de medio de transporte sin suero, y utilice esto como inóculo para el aislamiento del virus.
Líquidos vesiculares. Los líquidos vesiculares se deben recolectar con una aguja y una jeringa estériles e inyectar inmediatamente en medio de transporte.
Utilícelo como inóculo para el aislamiento del virus.
Aislamiento del virus
Precaución: No se debe usar PBS con Tween 20 y azida de sodio en los procedimientos de aislamiento de virus.
Aislamiento en shell vial. Técnica de centrifugación mejorada:
1. Las células MRC-5 (u otra estirpe celular permisiva para HSV/VZV) se siembran sobre cubreobjetos en shell vials y se dejan crecer hasta alcanzar una confluencia ≥ 70%. Prepare por lo menos 2 shell vials por muestra.
2. Aspire el medio de crecimiento, agregue 0,2 a 0,5 ml del inóculo a cada frasco y centrifugue a 700 a 950 x g durante 60 minutos a temperatura ambiente (15 a 30ºC).
3. Aspire el inóculo y vuelva a alimentar inmediatamente con 1 ml del medio de mantenimiento celular (RPMI o equivalente complementado con gentamicina y FBS al 2%).
4. Incube en los frascos a 37ºC. Prepare los frascos para teñir 24-120 horas después de la inoculación. Se pueden preparar frascos adicionales para períodos de incubación más prolongados.
Nota: Las muestras con alta carga viral ya pueden mostrar tinción a partir de las 12 horas posteriores a la infección.
5. Aspire del medio de mantenimiento y lave suavemente los shell vials 3 veces con 1 ml de PBS. Precaución: No se debería verter la PBS directamente sobre la monocapa, sino dejarla descender por el lateral del frasco.
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6. Aspire el PBS del shell vial y fíje como sigue: añada 1 ml de la acetona fría (2º y 8ºC) (tenga cuidado, la acetona y el metanol son extremadamente inflamables y dañinos si se ingieren o se inhalan), aspire, y rellénelos inmediatamente con 1 ml de la acetona fría. Fijar durante 10 minutos a 2º y 8ºC.
7. Aspire la acetona y deje que los shell vials se sequen al aire totalmente.
Lave con 1 ml de PBS, aspire y tiña. Si es necesario el almacenamiento, añada 1 ml de PBS/azida sódica, cierre firmemente y guarde entre 2º y 8ºC.
Procedimiento de aislamiento en cultivo en tubos estándar:
1. Se cultivan las células MRC-5 (u otra estirpe celular permisiva para HSV/VZV) en tubos de cultivo hasta alcanzar ≥ 70% de confluencia.
2. Aspire el medio de crecimiento, añada entre 0,2 y 0,5 ml del inóculo y colóquelos en un soporte inclinado o en un tambor giratorio durante 1 hora a temperatura ambiente, o rótelos en forma manual frecuentemente durante 60 minutos a temperatura ambiente.
3. Aspire el inóculo y añada suficiente medio de mantenimiento para cubrir completamente la monocapa celular. Incube a 37ºC.
4. Examine la monocapa diariamente en busca de CPE (cytopathic effect, efecto citopático). Cuando el CPE sea ≥ 2+ (10 a 50 focos), aspirar el medio del cultivo y enjuagar la monocapa suavemente 3 veces con 1 ml de PBS.
5. Añada 0,5 ml de PBS y rasque el tubo de cultivo para retirar la monocapa celular, con lo que se resuspenden las células en el PBS.
6. Si es necesario, centrifugue la suspensión de células a 250 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
7. Resuspenda las células sedimentadas en PBS para obtener una suspensión levemente turbia (50 a 100 µl).
8. Utilice la suspensión de células para preparar las manchas celulares en varios pocillos de portaobjetos de 6 a 8 mm y deje que las manchas se sequen totalmente al aire.
9. Fije el portaobjetos en acetona fría (2º y 8ºC) durante 10 minutos (tenga cuidado, la acetona es extremadamente inflamable y dañina si se ingiere o inhala).
10. Saque el portaobjetos de la acetona y deje que se seque completamente al aire.
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11. El portaobjetos se debe teñir inmediatamente. Si fuera necesario almacenarlos, los portaobjetos deberían permanecer a ≤ -20ºC con un desecante.
Nota: Se debe sembrar una muestra de cada lote de estirpes celulares empleadas para el cultivo celular con las cepas de HSV y de VZV de referencia para asegurar la sensibilidad de la infección y un CPE apropiado. Los efectos citopáticos de HSV se detectan mediante la observación de focos de células agrandadas y refractivas en la monocapa.
Los efectos citopáticos típicos de VZV son la formación de focos pequeños y discretos de células redondeadas, hinchadas y refractivas. De igual forma, se han de hacer crecer cultivos celulares no inoculados y examinarlos diariamente. Estos funcionarán como testigo de la morfología celular normal y pueden resultar útiles para detectar un CPE temprano. A menos que estos cultivos celulares testigo tengan un crecimiento adecuado, los resultados del aislamiento en cultivo celular deben considerarse inválidos.
Procedimiento de prueba
Preparación del reactivo:
Disolución de PBS/Tween 20 - Disolver el contenido del paquete de PBS en 950 ml de agua desionizada o destilada. Agregue el contenido del frasco de Tween 20/azida de sodio (100X) al PBS; mezcle a fondo; c.s.p. un litro con agua desionizada o destilada. Transferir a un envase para almacenamiento, limpio y etiquetado, cerrarlo bien y guardarlo a la temperatura ambiente. Deseche la PBS si se torna turbio o forma un precipitado.
El resto de los reactivos se suministran listos para su uso.
Procedimiento (de tinción) inmunofluorescente directo sugerido:
1. Permita que los portaobjetos de testigo fijados en acetona, la muestra y los reactivos alcancen la temperatura ambiente.
Nota: No permita que se sequen los portaobjetos en ningún momento durante el proceso de tinción.
2. Agregue suficiente Reactivo SimulFluor para cubrir las células; 1 gota por mancha celular y 4 a 6 gotas para los shell vials.
3. Incube el portaobjetos a 37°C durante 30 minutos en una cámara húmeda.
4. Enjuague el portaobjetos suavemente con una piseta de Solución PBS/Tween 20 durante 10 a 15 segundos para eliminar el exceso de solución de anticuerpo monoclonal, tenga cuidado de dirigir el chorro lejos
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del pocillo. Para shell vials: aspire el reactivo del frasco y lave suavemente cada shell vial 3 veces con 1 ml de PBS/Tween 20.
5. Sacuda el exceso de reactivos del portaobjetos y seque cuidadosamente el área que rodea la mancha de células.
6. Prepare bajo un cubreobjetos con Mounting Medium acuoso pH 8,5 5013 o equivalente. Para shell vials: aspire el PBS/Tween de los shell vials.
Levante cada cubreobjetos con una aguja doblada fijada a una jeringa pequeña y sáquelo cuidadosamente con pinzas. Prepare cada cubreobjetos con el LADO DE LAS CÉLULAS HACIA ABAJO sobre un portaobjetos de vidrio con líquido de preparación.
7. Seque el exceso de líquido de los bordes del portaobjetos.
Nota: Para obtener los mejores resultados, examine los portaobjetos inmediatamente después de preparar. Si los portaobjetos tuvieran que almacenarse después de la tinción, guárdelos entre 2º y 8ºC en un envase seguro y protegidos de la luz.
8. Examine los portaobjetos, con un microscopio de fluorescencia a 160-200x, en busca de células que presenten fluorescencia. Puede realizarse un examen detallado a 400x.
Nota: El buen funcionamiento del microscopio de fluorescencia tiene una importancia crucial para lograr resultados de análisis satisfactorios. Dado que los objetivos, la intensidad y potencia de la lámpara y los filtros pueden afectar a los resultados, el empleo de un testigo positivo verificará el funcionamiento de los reactivos, la metodología de cultivo y el microscopio.
Interpretación de los resultados
Control de calidad
Hay que mantener y probar en paralelo shell vials inoculados con cepas de referencia de HSV, de VZV, y cultivos no inoculados para asegurar la idoneidad de los procedimientos de cultivo, aislamiento y tinción. Los portaobjetos de testigo proporcionados en el kit son para demostrar el funcionamiento apropiado de los componentes del kit y los procedimientos durante la tinción inmunofluorescente.
Nota: Examinar bien todo el cubreobjetos o el pocillo del portaobjetos para detectar la presencia de fluorescencia asociada a las células.
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Cuando se visualiza con un sistema de filtros para FITC, una fluorescencia color verde manzana brillante en el citoplasma y en la membrana celular indica una reacción positiva para HSV. Una fluorescencia color amarillo oro en el núcleo y/o citoplasma de las células infectadas indica una reacción positiva para VZV.
El patrón de fluorescencia es finamente granular y puede estar presente en las células basales, parabasales o intermedias.
Muestra directa:
Cuando se visualiza con un sistema de filtros para FITC, una fluorescencia color verde manzana brillante en el citoplasma y en la membrana celular de las células epiteliales infectadas indica una reacción positiva para HSV. Una fluorescencia color amarillo oro en el núcleo y/o citoplasma de las células epiteliales infectadas indica una reacción positiva para VZV. El patrón de fluorescencia es finamente granular y puede estar presente en las células basales, parabasales o intermedias.
Una reacción de tinción positiva para HSV y/o VZV requiere la presencia de al menos 2 células epiteliales que presenten fluorescencia específica. Un resultado presumiblemente negativo está indicado por la ausencia de fluorescencia en un muestreo mínimo de 20 células epiteliales. La presencia de menos de 20 células epiteliales en la muestra indica que ésta es inadecuada, y la prueba se considera inválida.
Precaución: Se debe ignorar la tinción fluorescente de los fragmentos celulares, que se debe a que el conjugado queda atrapado en dichos fragmentos.
Si los testigos positivo y negativo no pueden ser claramente distinguidos, la prueba se debe considerar inválida. Un resultado negativo no descarta la infección por HSV o VZV o ambos. El resultado negativo puede deberse a diversos factores como: una muestra inadecuada, incorrecta obtención y manipulación de la muestra, técnica de cultivo incorrecta, estirpe celular o temperatura inadecuadas durante el aislamiento u otros factores mencionados en la sección de “Resolución de problemas”. Todos los resultados negativos provisionales deben informarse como “No se observa ningún virus”. Resulta útil examinar las células negativas antes que las positivas para determinar si hay tinción inespecífica.
Aislamiento y confirmación del cultivo celular:
Primero, examine los portaobjetos testigo para asegurar el aislamiento en cultivo y los procedimientos de tinción apropiados. Si los testigos no funcionan adecuadamente, el análisis se considera inválido.
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Cuando se visualiza con un sistema de filtros para FITC, una fluorescencia color verde manzana brillante en el citoplasma y en la membrana celular de las células infectadas indica una reacción positiva para HSV. Una fluorescencia color amarillo oro en el núcleo, en el citoplasma y/o en la membrana celular de las células infectadas indica una reacción positiva para VZV.
Una reacción de tinción positiva para HSV y/o VZV requiere la presencia de al menos 2 células intactas que presenten fluorescencia específica. La ausencia de fluorescencia y la presencia de un color rojo pálido debido a la tinción de contraste con Evans Blue, indican una reacción negativa provisional.
Confirmación de la tinción de VZV
La tinción color amarillo oro de las células infectadas por VZV se puede confirmar mediante un examen con un sistema de filtros para TRITC. Bajo de un filtro para TRITC, las células infectadas por HSV no muestran tinción fluorescente, mientras que las células infectadas por VZV muestran una tinción fluorescente de color rosa brillante.
Limitaciones
• Un resultado negativo en el análisis directo de la muestra no descarta la posibilidad de infección por HSV o VZV y se debe confirmar por aislamiento en cultivo.
• Un resultado negativo en los cultivos celulares no descarta la infección por HSV o VZV. Un resultado negativo puede deberse a diversos factores como: momento de la obtención en el curso de la infección, incorrecta obtención y manipulación de la muestra, técnica de cultivo incorrecta, estirpe celular o temperatura inadecuadas durante el aislamiento u otros factores mencionados en la sección de “Resolución de problemas”.
• El uso de un objetivo de 10x (ampliación 100x) puede no proporcionar los suficientes aumentos para visualizar la morfología de las células y el patrón de la tinción, particularmente en las células infectadas por VZV.
• Los anticuerpos monoclonales usados en este kit se prepararon con cepas prototipo y es posible que no detecten todas las variantes antigénicas o nuevas cepas de HSV y/o de VZV, o las que hayan experimentado cambios en la región epítopo diana.
• Los procedimientos de tinción directa de la muestra detectan el antígeno para HSV y/o VZV de los frotis vesiculares y no se pueden utilizar para determinar la viabilidad de HSV y/o de VZV.
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• VZV es un agente muy lábil. El cultivo se debe realizar en el plazo de 12 horas tras la obtención de las muestras. Si resulta necesario, se recomienda congelar a ≤ -70 ºC.
• La proteína A, producida por determinadas bacterias, se une a la porción de Fc del anticuerpo monoclonal usado en el Kit DFA SimulFluor® HSV/VZV de Light Diagnostics™. Se podría identificar una contaminación bacteriana en un aislado de cultivo tisular y tales muestras se deben eliminar del análisis. Sin embargo, la tinción podría diferenciarse por el tamaño y la morfología. La presencia del Staphylococcus aureus (que produce la proteína A) dará lugar a la fluorescencia de la pared de la célula que es brillante, pequeña (0,8 a 1,0 µm) y esférica.
• No se han establecido las características del funcionamiento de esta prueba para la monitorización del tratamiento.
• El buen funcionamiento del microscopio de fluorescencia tiene una importancia crucial para lograr resultados de análisis satisfactorios.
Dado que los objetivos, la intensidad y potencia de la lámpara y los filtros pueden afectar a los resultados, el empleo de los testigos adecuados verificará el funcionamiento de los reactivos, la metodología de cultivo y el microscopio.
• Restringido a usuarios profesionales.
Valores esperados
SITIO 1
En un laboratorio hospitalario que también actúa como laboratorio regional de referencia en el noreste de EE.UU., se sometieron a análisis para detección de HSV o VZV 203 muestras, entre diciembre de 1997 y junio de 1998. Los aislados de HSV no se subtipificaron. Se aisló el HSV a partir de 58 muestras con una frecuencia global del 28,6%, mientras que el VZV se identificó en 21 muestras con una frecuencia del 10,3%. Sesenta y siete (32%) de las muestras fueron de regiones genitales, 16 (7,9%) fueron de la cavidad bucal (incluyendo labios, garganta, etc.), 111 (54,7%) fueron lesiones de piel y 4 (2%) fueron muestras oculares. Las muestras restantes eran de tejidos variados o no se registró el sitio. A continuación se indica la frecuencia relativa de HSV o de VZV de cada tipo de muestra.
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Tabla 1. Frecuencia de HSV y de VZV en diversas fuentes de muestra
Genital Oral Piel Ocular Otro
HSV 33,9% 25,0% 27,9% 0 14,3%
VZV 1,5% 0 16,2% 25,0% 14,3%
Oral: labio, boca, paladar
Otro: biopsia de tejidos, axila, tibia o desconocido SITIO 2
En un gran hospital de la costa oeste, se sometieron a análisis 283 muestras para detectar HSV o VZV, entre octubre de 1997 y junio de 1998. Se aisló HSV en 83 muestras (51 de HSV 2 y 32 de HSV 1) con una frecuencia global del 21,7%, mientras que el VZV se identificó en 17 muestras con una frecuencia del 4,4%.
Ciento sesenta y dos (42,3%) de las muestras fueron de regiones genitales, 109 (28,5%) fueron de la cavidad bucal (incluyendo labios, garganta, etc.), 90 (23,5%) fueron lesiones de piel y 10 (2,6%) fueron muestras oculares. Las muestras restantes procedían de tejidos variados y de lavado bronquial. En la tabla siguiente se indica la frecuencia relativa de HSV o de VZV aislado en cada tipo de muestra.
Tabla 2. Frecuencia de HSV y de VZV en diversas fuentes de muestra
Genital Oral Piel Ocular Otro
HSV 1 7,4% 23,9% 5,5% 20,0% 54,5%
HSV 2 15,4% 1,8% 5,5% 0 0
VZV 0% 0,9% 17,7% 0 0
Oral: incluye muestras de labio, boca, encía, garganta Otro: secciones de tejido, lavado bronquial
Especificidad y reactividad cruzada
Se evaluó el Kit DFA SimulFluor® HSV/VZV de Light Diagnostics™ para determinar la especificidad. Se analizó una muestra representativa de diversos microorganismos obteniéndose los siguientes resultados:
17 Tabla 1. Especificidad
Organismo Resultado
Virus herpes simple 1; ATCC VR733/735
aislados clínicos (9) + (tinción color verde)
+ (tinción color verde) Virus herpes simple 2; ATCC VR734
aislados clínicos (8) + (tinción color verde)
+ (tinción color verde) Virus varicela-zoster; cepa Oka + (tinción color oro)
Citomegalovirus; aislado clínico 70-35 -
Virus herpes humano 6 cepa Z-29 -
Virus de Epstein-Barr, linfa humana P3HR1 -
Adenovirus; cepas CDC V5002 -
Influenza A; aislado clínico -
Influenza B; aislado clínico -
Virus de la parotiditis CDC V5004 -
Parainfluenza 1 CDC V6004 -
Parainfluenza 2 CDC V7003 -
Parainfluenza 3 CDC V5003 -
Parainfluenza 4; ATCC cepa VR-1378 -
Virus respiratorio sincitial; cepa CDC A2 -
Virus de la rubéola; VR315 cepa M-33 -
Staphylococcus aureus
Trichomonas vaginalis -
Bordetella bronchiseptica -
Bordetella pertussis -
Chlamydia trachomatis -
Chlamydia pneumonia -
Candida albicans -
E. coli -
Staphylococcus epidermidis -
Streptococcus pneumonia -
Streptococcus pyogenes -
Mycobacterium tuberculosis -
Mycoplasma hominis -
Mycoplasma pneumoniae -
Corynebacterium diptheriae -
Legionella micdadei -
Legionella pneumophila -
Neisseria meningitidis -
Branhamella catarrhalis -
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También se analizaron cinco cultivos de la célula huésped para asegurar la ausencia de reactividad cruzada usando el Kit DFA SimulFluor® HSV/VZV de Light Diagnostics™. Se analizaron las células MRC-5, A549, Vero, LLC-Mk2
y HEp-2, y no se observó ninguna reactividad cruzada.
Se analizaron cultivos contaminados de Staphylococcus aureus (cepa de Cowan) usando el Kit DFA SimulFluor® HSV/VZV de Light Diagnostics™ para determinar la actividad de tinción de las bacterias productoras de proteína A. La tinción de S. aureus aparece como puntos de fluorescencia brillantes, pequeños y esféricos.
Características del funcionamiento
El funcionamiento del Kit DFA SimulFluor® HSV/VZV de Light Diagnostics™ en las pruebas directas de la muestra y en la confirmación del cultivo se comparó con dos dispositivos previamente evaluados y registrados para la detección de HSV 1, de HSV 2, y de VZV en cultivo.
Los estudios se realizaron en dos sitios de Estados Unidos: El sitio 1 estaba ubicado en el noreste y se realizó desde octubre de 1997 a junio de 1998; el sitio 2 estaba ubicado en la costa oeste y se realizó a partir de octubre de 1997 hasta enero de 1998.
Exactitud clínica
El Reactivo Kit DFA SimulFluor® HSV/VZV de Light Diagnostics™
contiene anticuerpos monoclonales dirigidos contra VZV y HSV, pero no distingue entre HSV tipo 1 y HSV tipo 2. Como parte de los estudios clínicos, se tipificaron algunos aislados de HSV mediante un dispositivo previamente evaluado y registrado bien como HSV tipo 1 o HSV tipo 2. En el sitio 1, 30 aislados de HSV tipo 1 y 25 aislados de HSV tipo 2 se identificaron como HSV.
En el sitio 2, se identificaron 51 aislados de HSV tipo 1 y 32 aislados de HSV tipo 2. A continuación se encuentran los resultados de la evaluación clínica.
Reproducibilidad
Las pruebas de reproducibilidad consistieron en paneles de aptitud ciegos de portaobjetos testigo con 12 pocillos. Los paneles se prepararon con células infectadas por HSV y VZV, y células no infectadas en portaobjetos fijados.
Cada portaobjetos de 12 pocillos contenía 8 pocillos infectados y 4 no infectados. Se analizaron los paneles en 2 sitios clínicos antes de la evaluación clínica del dispositivo.
En el sitio 1, cinco técnicos llevaron a cabo el panel de aptitud que dio como resultado la identificación de 40 de 40 pocillos positivos y 19 de 20 pocillos
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negativos, produciendo una coincidencia del 100% para los positivos y del 95%
para los negativos.
En el sitio 2, diez técnicos llevaron a cabo el panel de aptitud que dio como resultado la identificación de 80 de 80 pocillos positivos y 37 de 40 pocillos negativos, produciendo una coincidencia del 100% para los positivos y del 92,5% para los negativos. La prueba repetida de 2 paneles adicionales produjo una coincidencia del 100% de los pocillos positivos y negativos.
Evaluación clínica SITIO 1
Se sometieron a análisis doscientas tres muestras en un laboratorio hospitalario, que era también un laboratorio regional de referencia para las pruebas de HSV y VZV. Las muestras se colocaron en medios de transporte viral, se lavaron las células, se prepararon los portaobjetos y se fijaron con acetona. Los portaobjetos se tiñeron con los Reactivos SimulFluor HSV/VZV, HSV DFA previamente evaluado y registrado y VZV DFA previamente evaluado y registrado. Seguidamente se inocularon las muestras en células MRC-5 o HNF en tubos de cultivo estándar y se tiñeron al observar CPE.
De las 203 muestras sometidas a análisis para detectar HSV y/o VZV, 36 se excluyeron por ser muestras inadecuadas para la detección directa.
DETECCIÓN DE HSV MEDIANTE ANÁLISIS DIRECTO DE LA MUESTRA
Treinta y tres muestras resultaron positivas por análisis directo y cultivo. El cultivo identificó los 18 aislados adicionales y el SimulFluor HSV/VZV identificó incorrectamente 2 muestras como positivas para HSV.
Prueba directa de la muestra de HSV vs aislamiento en cultivo Positivo por
cultivo Negativo por
cultivo Total Positivo por SimulFluor®
HSV/VZV 33 2 35
Negativo por SimulFluor®
HSV/VZV 18 78 96
Total 51 80 131
Sensibilidad = 64,7% (33/51) Intervalo de confianza del 95%: 50,1%-77,62%
Especificidad = 97,5% (78/80) Intervalo de confianza del 95%: 91,3%-99,7%
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DETECCIÓN DE VZV MEDIANTE ANÁLISIS DIRECTO DE LA MUESTRA
Veinte muestras resultaron positivas por análisis directo y cultivo. No se identificó ningún aislado adicional en el cultivo. SimulFluor® HSV/VZV identificó incorrectamente 16 muestras como positivas para VZV.
Prueba directa de la muestra de VZV vs aislamiento en cultivo Positivo por
cultivo Negativo por
cultivo Total Positivo por SimulFluor®
HSV/VZV 20 16 36
Negativo por SimulFluor®
HSV/VZV 0 96 96
Total 20 112 132
Sensibilidad = 100% (20/20) Intervalo de confianza del 95%: 83,2%-100%
Especificidad = 85,7% (96/112) Intervalo de confianza del 95%: 79,2%-92,2%
DETECCIÓN DE HSV MEDIANTE PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN EN CULTIVO
Cincuenta y ocho muestras resultaron positivas mediante ambos dispositivos tras la amplificación en cultivos celulares. No hubo discrepancias entre el SimulFluor HSV/VZV y los resultados del dispositivo previamente evaluado y registrado.
Aislamiento en cultivo de HSV
Positivo por
cultivo Negativo por
cultivo Total Positivo por cultivo por
SimulFluor HSV/VZV 58 0 58
Negativo por cultivo por
SimulFluor HSV/VZV 0 124 124
Total 58 124 182
Sensibilidad relativa = 100% (58/58) Intervalo de confianza del 95%: 93,8%-100%
Especificidad relativa = 100% (124/124) Intervalo de confianza del 95%: 97,1%-100%
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DETECCIÓN DE VZV MEDIANTE PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN EN CULTIVO
Veinte muestras resultaron positivas mediante ambos dispositivos tras la amplificación en cultivo. El dispositivo previamente evaluado y registrado identificó un aislado adicional que el SimulFluor HSV/VZV encontró negativo.
Aislamiento en cultivo de VZV
Positivo por
cultivo Negativo por
cultivo Total Positivo por cultivo por
SimulFluor HSV/VZV 20 0 20
Negativo por cultivo por
SimulFluor HSV/VZV 1 123 124
Total 21 123 144
Sensibilidad relativa = 95,2% (20/21) Intervalo de confianza del 95%: 76,2%-99,9%
Especificidad relativa = 100% (123/123) Intervalo de confianza del 95%: 97%-100%
SITIO 2
Se enviaron doscientas ochenta y tres muestras en medios de transporte viral a un laboratorio hospitalario de la costa oeste para su a análisis y se examinaron mediante análisis directo de la muestra para determinar la presencia de HSV y de VZV. Las células se lavaron por centrifugación, se colocaron en portaobjetos, se secaron al aire y se fijaron con acetona. Los portaobjetos fijados se tiñeron con los reactivos SimulFluor HSV/VZV, el DFA del HSV previamente evaluado y registrado y el DFA del VZV previamente evaluado y registrado. También se sembraron las muestras en células MRC-5, ya sea en tubos de cultivo estándar o en shell vial. Los shell vials se tiñeron en el plazo de 72 horas, mientras que las células de los tubos de cultivo estándar se tiñeron una vez que se observó CPE. Los portaobjetos se tiñeron del mismo modo que los portaobjetos de muestra directa.
DETECCIÓN DE HSV MEDIANTE ANÁLISIS DIRECTO DE LA MUESTRA
De las 283 muestras enviadas a un laboratorio hospitalario para analizar la presencia de HSV y/o VZV, 46 tenían un número de células insuficiente para el análisis directo de la muestra mediante SimulFluor HSV/VZV y el Kit HSV DFA previamente evaluado y registrado, y 1 estaba contaminada. Éstas se excluyeron del análisis.
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Catorce muestras resultaron positivas por análisis directo y cultivo. El cultivo identificó los 3 aislados adicionales no analizados por el SimulFluor® HSV/VZV y el SimulFluor® HSV/VZV identificó incorrectamente 1 muestra como positiva para HSV.
Detección directa de HSV vs aislamiento en cultivo Positivo por
cultivo Negativo por
cultivo Total Positivo por SimulFluor®
HSV/VZV 14 1 15
Negativo por SimulFluor®
HSV/VZV 3 218 221
Total 17 219 236
Sensibilidad = 82,4% (14/17) Intervalo de confianza del 95%: 56,6%-96,2%
Especificidad = 99,5% (218/219) Intervalo de confianza del 95%: 97,5%-100%
DETECCIÓN DE VZV MEDIANTE ANÁLISIS DIRECTO DE LA MUESTRA
Cuarenta y siete muestras de las 283 muestras sometidas a prueba para la detección de HSV y/o de VZV, no tenían las células adecuadas para el análisis directo de la muestra o en cultivo para determinar la presencia de VZV y fueron excluidas del análisis.
Once muestras fueron positivas mediante el SimulFluor® Reagent HSV/VZV en el análisis directo de la muestra y por cultivo. Dos muestras que eran positivas en el análisis directo de la muestra no pudieron crecer en el cultivo.
Detección directa de VZV vs aislamiento en cultivo Positivo por
cultivo Negativo por
cultivo Total Positivo por SimulFluor®
HSV/VZV 11 2 13
SimulFluor® HSV/VZV
Negative 0 232 232
Total 11 234 245
Sensibilidad = 100% (11/11) Intervalo de confianza del 95%: 71,5%-100%
Especificidad = 99,1% (232/234) Intervalo de confianza del 95%: 96,9% -99,9%
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Resolución de problemas
La preparación de las muestras depende mucho de la técnica y puede afectar a los resultados que se obtengan. Para poder solucionar posibles problemas de eficacia, es necesario examinar todos los pasos del proceso.
Una disminución muy marcada de la fluorescencia podría indicar:
1) Un deterioro de los reactivos
2) Problemas relacionados con la microscopía 3) Otros problemas del equipo o de la técnica
• Verifique la fecha de caducidad de todos los reactivos empleados.
• Si los reactivos no hubieran caducado, verifique el funcionamiento del microscopio y vuelva a examinar los portaobjetos control.
• Si aún no se determinara el problema, verifique la operación de todo el equipo según el folleto y repita el análisis.
Para solicitar asistencia, llame al Servicio Técnico de EMD Millipore Corporation. Para encontrar la oficina más cercana, visite
www.millipore.com/offices.
La sección de “Bibliografía” de este folleto informativo de IVD de Light Diagnostics™ aparece solamente en la versión completa en inglés. Consulte esta versión acerca de los detalles específicos del producto.
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Glosario de Símbolos
Símbolo Se utiliza para Símbolo Se utiliza para
Número de catálogo
El uso por parte AAAA-MM-DD o AAAA MM-
Fabbricante
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Precaución, consulte los
documentos adjuntos Contenido suficiente
para <n> pruebas
Diagnóstico in vitro de dispositivos médicos
Límites de temperatura
Consulte las instrucciones de uso
Los riesgos biológicos
Control
El control negativo
El control positivo
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GARANTÍA Y LIMITACIÓN DE RESPONSABILIDAD:
1. Millipore garantiza que sus productos cumplirán con sus especificaciones publicadas cuando sean usados de acuerdo con sus instrucciones durante un período de un año desde el envío de los productos.
2. El Cliente inspeccionará los Productos cuando éstos le sean entregados. Cualquier reserva relativa a defectos obvios o a falta de Productos, debidos a una posible falta por Millipore Iberica, S.A, debe ser notificada inmediatamente por escrito al transportista y por correo certificado a Millipore Iberica, S.A, durante los tres (3) días laborables siguientes a la entrega, o como muy tarde, durante los diez (10) días naturales siguientes a la fecha de facturación, en el caso de que se trate de una falta de Productos.
3. No puede devolverse un producto sin el previo acuerdo de Millipore Iberica, S.A, y sin seguir sus indicaciones al respecto. Cualesquiera de los Productos devueltos sin previo acuerdo de Millipore Iberica, S.A no serán abonados en la cuenta del Cliente.
4. Millipore Iberica, S.A no será responsable por el deterioro de los Productos adquiridos por el Cliente como consecuencia de las incorrectas condiciones de almacenamiento. A este efecto, el Cliente se obliga a respetar las especificaciones y condiciones de uso de dichos Productos; en caso de incumplimiento, no será aplicable ninguna de las garantías otorgadas por Millipore Iberica, S.A.
5. En el supuesto de incumplimiento de dicha garantía, Millipore únicamente estará obligado a reparar o reemplazar, a su elección, el producto o parte de éste. Si después de realizar esfuerzos razonables al efecto Millipore no es capaz de reparar o reemplazar el producto o parte de éste, entonces Millipore deberá devolver al cliente todo el dinero satisfecho por dicho producto o parte de éste.
6. Con carácter general, cualquier garantía otorgada por Millipore Iberica, S.A no es aplicable en los siguientes casos: instalación, uso y mantenimiento incorrectos de los Productos, sin cumplir con las instrucciones dadas por Millipore Iberica, S.A. desgastes ocasionados por uso ordinario de los Productos o falta del adecuado mantenimiento.
7. Millipore no será reputado responsable por perjuicios indirectos como perjuicio comercial, pérdida de clientela, pérdida de Pedidos, otros problemas comerciales, daño emergente, daños a su propiedad o marcas, sufridos por cualquier cliente como consecuencia del uso de los productos.
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Tween® es una marca comercial de ICI Americas Inc.
ATCC® es una marca comercial de la American Type Culture Collection Corporation.
2021 EMD Millipore Corporation, una división de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania. Todos los derechos reservados. EMD, EMD Millipore, Millipore, la marca M, Light Diagnostics, SimulFluor y todas las demás marcas comerciales, a menos que específicamente identificados anteriormente en el texto como perteneciente a un tercero, son propiedad de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania.
EMD Millipore Corporation
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MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hanover, Germany
LIGHT DIAGNOSTICS™
SimulFluor HSV/VZV DFA KIT
Deutsche Sprachenergänzung
3295 125
Verwendungszweck
Das Light Diagnostics™ SimulFluor HSV/VZV DFA Kit ist für die simultane Erkennung und Identifizierung von HSV 1 und HSV 2 (Herpes- simplex-Virus) sowie VZV (Varicella-Zoster-Virus) bei Patienten mit vesikulären, oralen, genitalen oder Hautläsionen mithilfe von direkten Einzelproben und Kulturbestätigung konzipiert. Wenn Proben bei direkter Untersuchung als negativ befunden wurden, muss das Ergebnis durch Zellkultur bestätigt werden.
Zusammenfassung und Erläuterung
HSV und VZV gehören der Familie der Herpesviridae an. Es handelt sich bei ihnen um große, behüllte Viren mit etwa 190 nm Durchmesser, die lineare doppelsträngige DNA enthalten. Beide Viren verursachen eine Vielzahl von Humankrankheiten und sind bei immungeschwächten Patienten besonders gefährlich.
Es gibt zwei biologisch unterschiedliche Serotypen von HSV, die als Typ 1 (HSV 1) und Typ 2 (HSV 2) unterschieden sind. Die Serotypen sind eng verwandt und verfügen über umfangreiche Sequenzhomologien ihrer DNA.
HSV ist eine wesentliche Ursache für Erkrankungen der Bindehaut, der Atemwege, des zentralen Nervensystems sowie für genitale und allgemeine Erkrankungen (1-4). HSV infiziert mukokutane Flächen, dringt dann in die dorsalen Basalganglien ein, in denen eine weitere Virusreplikation, gefolgt von einer Latenzperiode, erfolgt. Die Reaktivierung ist von einem Austritt von Viren am Ort oder in der Nähe des ursprünglichen mukokutanen Ortes der Infektion begleitet, mit den verbundenen klinischen Anzeichen und Symptome oder ohne sie. Wiederkehrende Läsionen sind gewöhnlich weniger schwerwiegend als die primäre Infektion.
HSV 1 verursacht Gingivostomatitis, starke Pharyngitis, Mandelentzündung und gelegentlich Enzephalitis bei Säuglingen und Kindern im Verlauf von Primärinfektionen. Okulare, nasale, orolabiale und oropharyngale Läsionen treten sowohl bei Kindern als auch Erwachsenen auf. Da HSV 1 überall verbreitet ist und leicht durch Sprühtröpfchen, Infektionsträger und direkten Kontakt übertragen wird, werden die meisten Erwachsenen im Lauf ihres Lebens mit HSV 1 infiziert
HSV 2 ist häufiger mit schmerzhaften genitalen Läsionen,
Harnröhrenentzündung und Zervizitis verbunden. Wenn das Virus aufgrund
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einer primären oder rekurrenten Infektion in zeitlicher Nähe zur Entbindung im Geburtskanal vorhanden ist, kann dies zu einer schwerwiegenden allgemeinen Infektion des Neugeborenen führen. Daher stellen maternale genitale HSV- Infektionen für den Fötus und das Neugeborene ein erhebliches Risiko dar.
Die Ausscheidung des Virus während der Entbindung ist eine häufige Art der Übertragung von der Mutter auf das Neugeborene. Die neonatale HSV-Infektion verläuft grundsätzlich symptomatisch und häufig tödlich, bei unbehandelten Fällen mit einer Sterblichkeitsrate von 70 %. Das klinische Erscheinungsbild ist möglicherweise eine lokale Infektion der Haut, Augen und Schleimhäute, Enzephalitis oder eine disseminierte Infektion.
Aciclovir, Famciclovir, Foscarnet und andere nukleoside Analoge können klinische Symptome und Virusausscheidung bei oraler und genitaler Herpes, Herpes-Enzephalitis, neonataler Herpes und herpetischer Keratitis verringern (5-7).
HSV kann aus klinischen Proben nach der Anzucht in vielen Zelllinien gewonnen werden, z. B. HEp2, MRC-5, A549, HEK, NCI-H292 u. a. Die Inkubationszeit beträgt bei stationären Kulturen und Kulturen in Rolltrommeln 1 bis 7 Tage mit apparenter Zytopathologie. Zu den geeigneten Proben zählen je nach den klinischen Symptomen Augenabstriche, Abstriche von vesikulären Läsionen, Speichel, Rachenabstriche, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit und Gewebe. Möglicherweise ist auch Urin als Probe geeignet.
VZV verursacht zwei unterschiedliche klinische Syndrome: Windpocken (Varizellen) – vor allem bei Kindern, und Gürtelrose (Zoster) – überwiegend bei Erwachsenen (8-10). Die auffälligste Eigenschaft von Varizellen ist ein allgemeiner Bläschenausschlag, der gewöhnlich mit Fieber einhergeht.
Komplikationen, z. b. Pneumonie, können bei Neugeborenen und immungeschwächten Patienten mit einer Sterblichkeitsrate von 10 bis 40 % auftreten.
Zoster tritt als Reaktivierung des latenten Varicella-Virus auf und kann durch fast jeden Reiz, z. B. Angst, Furcht usw. ausgelöst werden. Für schwangere Frauen ist das Risiko von Varizellen-Pneumonie höher als für andere Erwachsene. Eine weitere sowohl mit Varizellen als auch Zoster verbundene Komplikation ist die postherpetische Neuralgie, die bei immungeschwächten Patienten ein wesentlich größeres Problem darstellt.
Wie bei HSV ist auch bei einer VZV-Infektion Aciclovir das Medikament mit der größten Eignung zum Verringern der Symptome. 1995 wurde in den Vereinigten Staaten ein Varizellen-Impfstoff freigegeben, der Kinder mit 70-85% Sicherheit schützt (10,13,14).
VZV kann aus klinischen Proben, in der Regel von Hautläsionen, jedoch auch von Lunge, Auge, Rachen und Bläschenflüssigkeit, in humanen diploiden Fibroblast-Zellkulturen isoliert werden. Die Zytopathologie des Virus unterscheidet sich recht deutlich von der Zytopathologie von HSV. Das Virus ist jedoch unbeständiger als HSV und vermehrt sich nur dann in Zellkultur, wenn der Transport der Proben in das Labor mit Sorgfalt erfolgt.
Das Zusammenfassen von HSV- und VZV-Antikörpern in einem einzigen Testreagenz ergibt Sinn, da beide Viren zahlreiche identische Symptome und klinische Befunde verursachen können. HSV muss erkannt werden, um die Ausbreitung des Virus auf Neugeborene bei der Geburt zu verhindern und die Ausbreitung der venerischen Krankheit auf andere Erwachsene zu verhindern.
Die spezielle Identifizierung des Virus in Bindehautproben ermöglicht die umgehende Behandlung mit Aciclovir, um das Risiko der Erblindung zu verringern.
Testprinzip
Mit Light Diagnostics™ SimulFluor HSV/VZV DFA Kit ist wird ein einziges Reagenz verwendet, um gleichzeitig HSV und VZV nachzuweisen und zu identifizieren. Die primäre Komponente mit monoklonalen Antikörpern, die für HSV 1 und HSV 2 spezifisch sind, bindet sich in HSV-infizierten Zellen an das Hauptkapsidprotein 155kD. Die sekundäre Komponente mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für VZV sind, bindet sich in VZV-infizierten Zellen an das Glykoprotein gp I und das Immediate Early-Antigen. Ungebundenes Reagenz wird durch Waschen mit PBS (phosphate-buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) entfernt. Die Bestrahlung mit ultraviolettem Licht macht den Antigen-Antikörper-Komplex durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar. Wenn ein FITC-Filtersatz verwendet wird, weist der HSV-Antigen-Antikörper-Komplex eine apfelgrüne Fluoreszenz und der VZV-Antigen-Antikörper-Komplex eine goldgelbe Fluoreszenz auf.
Aufgrund des im Reagenz vorhandenen Evans Blue weisen nicht infizierte Zellen eine mattrote Färbung auf.
Mitgelieferte Materialien
1. SimulFluor HSV/VZV Reagenz – 5235: Ein 5 ml-Tropffläschchen mit monoklonalen Maus-Antikörpern für das HSV-Antigen und das VZV- Antigen, Protein-Stabilisator, Evans Blue und 0,1 % Natriumazid (Konservierungsmittel).
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Bereitgestellte Betrag ist ausreichend für 125 Tests. Schätzung basiert auf Tests von 40 ul Tropfen beruhen; tatsächliche Anzahl der Tests können variieren.
2. HSV 1 & 2 Control Slides – 5093: Zwei Objektträger, die eine Vertiefung jeder mit HSV 1-infizierten HEp-2-Zellen, eine Vertiefung mit HSV 2-infizierten Zellen und eine Vertiefung mit nicht infizierten Zellen enthalten.
3. VZV Control Slides – 5088: Zwei Objektträger mit einer Vertiefung, jeder die mit VZV (klinische Isolate) infizierte Fibroblasten aus humanem Vorhautgewebe enthält und einer Vertiefung, die nicht infizierte Fibroblasten aus humanem Vorhautgewebe enthält.
4. Phosphate-Buffered Saline (PBS)– 5087: Ein Päckchen phosphatgepuffertes Kochsalz.
5. Tween 20 / Sodium Azide Solution (100X) – 5037: Ein 10 ml- Fläschchen mit Tween 20-/Natriumazid-Konzentrat.
6. Mounting Fluid – 5013: Ein 10 ml-Tropffläschchen mit Tris- gepuffertem Glyzerin, einem Fluoreszenz-Enhancer und 0,1 % Natriumazid (Konservierungsmittel). Bei temperatur lagern bei 2ºC - 25ºC.
Zusätzlich erforderliche, nicht mitgelieferte Materialien
• Azeton, chemisch rein oder besser; in Glasbehälter
• Deionisiertes oder destilliertes Wasser
• Positivkontrollen für die Kulturisolierung (HSV- und VZV- Referenzstämme können von der American Type Tissue Culture Collection ATCC® , Manassas, VA, bezogen werden.
• Natriumhypochloritlösung, 0,05 % (1:100-Verdünnung handelsüblichen Chlor-Bleichmittels)
• Sterile Shell-Vials mit 12 mm-Deckgläsern für die Anzucht von MRC- 5- oder anderen HSV/VZV-toleranten Zelllinien
• Gewebekulturmedien (RPMI oder EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) mit FBS (fetal bovine Serum, fötales bovines Serum) und Antibiotika, oder Äquivalent)
• VTM (viral transport medium, Virustransportmedium), das sich nicht hemmend auf HSV/VZV auswirkt (HBSS (Hank's balanced salt solution) mit Antibiotika, oder Äquivalent)
• Sterile PBS, pH 7,0 bis 7,6
• Mikroskop-Objektträger, nicht fluoreszierend
• Deckgläser Nr. 1
• Absauggerät mit sterilen Pasteur-Einwegpipetten
• Zentrifuge mit max. Schwerefeld von 700–950 x g mit Biogefahr- sicheren Bechern und Adaptern für Shell-Vials.
• Zytozentrifuge, die das Deponieren von Zellsuspensionen auf Objektträgern ermöglicht
• Fluoreszenzmikroskop mit 100 Watt-Quecksilber- oder Halogenlampe und für FITC geeigneter Filterkombination (Anregungsmaximum = 490 nm, Emissionsmaximum = 520 nm) mit 100facher und 400facher Vergrößerung (Trockenobjektiv)
• Optional: Filterkombination für TRITC (Anregungsmaximum = 550 nm, Emissionsmaximum = 570 nm) HINWEIS: Beim Wechseln von einem FITC-Filter zu einem TRITC-Filter verschwindet die apfelgrüne Fluoreszenz, und die gelbgrüne Fluoreszenz ändert sich in eine grellrosafarbene Fluoreszenz, so dass die Bestätigung einer unspezifischen Färbung erleichtert wird.
• Pinzette
• Feuchte Kammer
• Inkubator, 37 ± 1 °C
• Spritze und Nadel oder anderes Hilfsmittel zum Entfernen des Deckglases vom Shell-Vial
• Ultraschall-Wasserbad
• Vortex-Mischer oder Ultraschallgerät
Stabilität und Lagerung
Bei Lagerung bei 2° bis 8°C ist das Light Light Diagnostics™ SimulFluor HSV/VZV DFA Kit bis zu dem auf dem Etikett aufgedruckten Ablaufdatum stabil. Nicht einfrieren oder hohen Temperaturen aussetzen. Nach dem Ablaufdatum alle verbliebenen Reagenzien entsorgen.
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Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
Die GHS-Einstufung und den Volltext der H-Sätze entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt.
Das Sicherheitsdatenblatt finden Sie unter: www.merckmillipore.com.
5037, TWEEN® 20/ Sodium Azide, 100X
Signalwort Gefahr
Gefahrenbezeichnung(en)
H302 + H332 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken oder Einatmen.
H311 Giftig bei Hautkontakt.
H412 Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung.
Vorsichtsmaßnahmen
P261 Einatmen von Staub/ Rauch/ Gas/ Nebel/ Dampf/ Aerosol vermeiden.
P273 Freisetzung in die Umwelt vermeiden.
P280 Schutzhandschuhe/ Schutzkleidung tragen.
P301 + P312 BEI VERSCHLUCKEN: Bei Unwohlsein GIFTINFORMATIONSZENTRUM/ Arzt anrufen.
P302 + P352 + P312 BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser waschen. BeUnwohlsein GIFTINFORMATIONSZENTRUM/ Arzt anrufen.
P304 + P340 + P312 BEI EINATMEN: Die Person an die frische Luft bringen und für ungehinderte Atmung sorgen. Bei Unwohlsein
GIFTINFORMATIONSZENTRUM/ Arzt anrufen.
• HSV und VZV-Kontrollpräparate enthalten virusinfizierte Zellen auf Glasobjektträgern, die mit Aceton fixiert und inaktiviert wurden. Wie bei allen biologischen Reagenzien oder Materialien, sollte der Anwender beim Umgang mit diesen Produkten die entsprechenden allgemein gültigen Vorsichtsmaßnahmen einhalten.
• Die gemeinsame Verwendung bzw. die Abänderung von Reagenzien kann zu falschen Ergebnissen führen.
• Keine Reagenzien anderer Hersteller verwenden.
