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MICROBIOLOGÍA
ARTÍCULO
ESPECIAL
Interrogantes
en
la
tecnología
de
la
inoculación
de
semillas
de
soja
con
Bradyrhizobium
spp.
Aníbal
R.
Lodeiro
LaboratoriodeInteraccionesentreRizobiosySoja(LIRyS),IBBM-FacultaddeCienciasExactas,UNLPyCCT-LaPlataCONICET, LaPlata,BuenosAires,Argentina
Recibidoel5demayode2014;aceptadoel6dejuniode2015 DisponibleenInternetel9desetiembrede2015
PALABRASCLAVE Bradyrhizobium; Soja; Inoculación; Competición; Supervivencia; Movilidad
Resumen Conelfindeaprovecharlafijaciónsimbióticadenitrógeno,elcultivodesojase inoculaconcepasseleccionadasdeBradyrhizobiumjaponicum,Bradyrhizobiumdiazoefficiens oBradyrhizobiumelkanii(conjuntamentereferidascomoBradyrhizobiumspp.).Elmétodomás comúndehacerloeslainoculaciónensemillas,yaseaqueestaserealiceenelmomento pre-vioalasiembraoqueseutilicensemillaspreinoculadasopretratadasmedianteeltratamiento profesionaldesemillas.Lametodologíadeinoculaciónnodebelimitarsearecubrirlassemillas conrizobiosvivos,sinoquetambiéndebeoptimizarlaschancesdeesosrizobiosparainfectar lasraícesynodular.Paraellolosrizobiosinoculadosdebenestarenunacantidadyunestado talesquelespermitansuperarla competiciónejercidaporlosrizobiosdelapoblación alóc-tona delsuelo, loscualesusualmentesonmenoseficacespara lafijacióndenitrógeno yasí diluyenelefectodelainoculaciónsobreelrendimiento.Estaoptimizaciónrequiereresolver algunosinterrogantes,quesonabordadosenelpresenteartículo.Concluyoquelosaspectos querequierenmásinvestigaciónsonlaadhesiónysupervivenciadelosrizobiosenlassemillas, laliberacióndelosrizobiosunavezquelassemillassedepositanenelsueloyelmovimientode losrizobiosdesdelasinmediacionesdelassemillashastalossitiosdeinfecciónenlasraíces. © 2015 Asociación Argentina de Microbiología. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un artículo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons. org/licenses/by-nc-nd/4.0/). KEYWORDS Bradyrhizobium; Soybean; Inoculation; Competition; Survival; Motility
Queriesrelatedtothetechnologyofsoybeanseedinoculation
withBradyrhizobiumspp.
Abstract With theaim ofexploitingsymbiotic nitrogenfixation, soybeancrops are inocu-lated with selected strains ofBradyrhizobium japonicum,Bradyrhizobium diazoefficiens or Bradyrhizobiumelkanii(collectivelyreferredtoasBradyrhizobiumspp.).Themostcommon methodofinoculationusedisseedinoculation,whetherperformedimmediatelybeforesowing
Correoelectrónico:[email protected] http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2015.06.006
0325-7541/©2015AsociaciónArgentinadeMicrobiología.PublicadoporElsevierEspaña,S.L.U.EsteesunartículoOpenAccessbajola licenciaCCBY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
orusingpreinoculatedseedsorpretreatedseedsbytheprofessionalseedtreatment.The met-hodologyofinoculation shouldnot onlycover theseeds withlivingrhizobia, butmust also optimizethechancesoftheserhizobiatoinfecttherootsandnodulate.Tothisend, inocu-latedrhizobiamustbeinsuchanamountandconditionthatwouldallowthemtoovercome thecompetitionexertedbytherhizobiaoftheallochthonouspopulationofthesoil,whichare usuallylesseffectivefornitrogenfixationandthusdilutetheeffectofinoculationonyield. Thisoptimizationrequiressolvingsomequeriesrelatedtothecurrentknowledgeofseed ino-culation,whichareaddressedinthisarticle.Iconcludethattheaspectsthatrequirefurther researcharetheadhesionandsurvivalofrhizobiaonseeds,thereleaseofrhizobiaoncethe seedsaredepositedinthesoil,andthemovementofrhizobiafromthevicinityoftheseedsto theinfectionsitesintheroots.
© 2015 Asociación Argentina de Microbiología. Published by Elsevier España, S.L.U. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons. org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Introducción
La soja, como todas las leguminosas, se caracteriza por poseerdosvíasdistintasparalacaptaciónyasimilaciónde nutrientes nitrogenados.Una de ellas parte de compues-tosnitrogenadossolublesqueseencuentrandisponiblesen la solución del suelo y la otrarequiere la asociación con rizobiosfijadores denitrógeno. Los rizobiosson procario-tas que incluyen ␣ y -proteobacterias, y pueden existir tantoenvidalibreenelsuelo comoasociados simbiótica-menteconlasraícesdelasleguminosasformandonódulos. Sinembargo,sololosrizobiosqueseencuentrandentrode losnódulossoncapacesdefijarnitrógeno.Allí,losrizobios encuentranunambienteconbajapresiónparcialdeO2,lo
quepermitelaexpresiónyactividaddelcomplejo nitroge-nasa.EstecomplejocatalizalareduccióndeN2atmosférico
aNH4+,elcualquedadisponibleparalaplanta.En
compen-sación,losrizobiosdentrodelnódulorecibenproteccióny energíaporparte de laplanta58,67,81.Esta asociación
sim-bióticaes altamenteespecífica,yenparticular lasojaes noduladaporunnúmeroreducidodeespeciesderizobios, entre las que se encuentran Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium diazoefficiens, Bradyrhizobium elkanii y Ensiferfredii22.
El proceso de nodulación es complejo y se desarrolla envarias etapas,que incluyen los siguientes eventos: un intercambiodese˜nalesmolecularesquepermitenel recono-cimientosimbióticoentrelaplantaylabacteria,laadhesión delabacteriaalasuperficieradical,lainfeccióndelaraíz pordentrodelospelosradicales,ladiferenciaciónyel des-arrollodelnóduloenlaplantadisparadospormoléculasdel rizobio,lainvasióndelosnódulosyladiferenciacióndelos rizobiosdentrodelosnódulosalasformascapacesde cata-lizarlafijacióndeN256.Lacomplejidaddeesteprocesose
debeaqueelrizobiodebeserestrictamentereconocidopor laplantacomounsimbiontenopatogénico,yaquelaplanta inviertemuchaenergíaeneldesarrollodelosnódulosysu posteriormantenimiento.Porello,laplantatambiénregula el número total de nódulos que se forman en su sistema radicalmediantelamonitorizacióndelaportequeaquellos realizanasunutriciónnitrogenada55,70,71.
Paraaprovecharlaalternativadelafijaciónsimbióticade N2enloscultivosdesojaseempleaninoculantes,producidos ycomercializadospormásde70empresasennuestropaís, loscuales sonformulados con rizobiosactivos capacesde asociarsecon laplanta.Lasespeciesmásutilizadasenlos inoculantesactuales sonB.japonicum yB.diazoefficiens, yanteriormenteseutilizótambiénB.elkanii.Enparticular, elINTArecomiendalacepaB.japonicumE109,laque,por lotanto,seincluyeenlamayoríadelosinoculantes66.
Lasojaeslaleguminosaconmayorsuperficiesembrada enArgentina, con20 millonesde hectáreas7.Eneste
cul-tivoseobservaunusogeneralizadodeinoculantes:enuna encuestarealizadaporelProyectoInoculardelINTAanivel nacional,el 94%delosproductoresconsultadosmanifestó usar«siempreocasisiempre»inoculantes,estaproporción llegóal100%enelcentrodeSantaFe,surdeEntreRíosyel NEA66.Sinembargo,tambiénesciertoquelarespuestaala
inoculaciónentérminosderendimientodelcultivodistade seróptima,ysi sesiguenutilizandoinoculantes,ello obe-deceprincipalmenteasumuybajocostoysimplicidadde aplicación,másqueaunresultadoconcretoyreproducible. Es indudable quela inoculación forma parte de cualquier metodologíade agriculturasustentable y,por lo tanto, el aumentodesueficienciaesunobjetivoensímismo.
Visto desde esta perspectiva,el problemano seagota en asegurar que los inoculantes contengan un alto título de células viables y con larga vida media, sino que ade-más resultaimportante asegurar que con su aplicación el cultivo de soja produzca una buena simbiosis en térmi-nos denodulación yfijación deN2. Estosaspectos suelen estar condicionadospordiversosfactores queactúan des-pués de la inoculación, entreellos el manejo del cultivo y factores ambientales bióticos y abióticos que influyen sobre la performance del inoculante durante la siembra y la nodulación. Por lo tanto, es interesante preguntar-nossi esposibleque enlaformulaciónylaaplicacióndel inoculantepuedancontemplarseestosfactores postinocula-ción.Larespuestaenmuchoscasosesquesí:porejemplo, pueden desarrollarse formulaciones o seleccionarse cepas para tolerar condiciones edafoclimáticas adversasa nivel local12,52,80, puede evaluarse la afinidad de ciertas cepas
pordeterminadasvariedades14,28,74,puedenformularse
ino-culantes combinados con otras especies procariotas para aprovecharpropiedadespromotorasdelcrecimientovegetal enlarizosfera45,etc.Noobstante,porrazonesdeespacio,
noseharáaquíunarevisióncompletadetodosestos aspec-tos,porloquemecentraréenlascondicionesquedebería reunirelinoculanteparasuperarunproblemadeorigen bio-lógicoconocidocomoelproblemadelacompeticiónparala nodulación.Dadoqueyaseharevisadoesteproblemaenuna publicaciónanterior63,melimitaréadescribirsusaspectos
relevantesparalaformulaciónyaplicacióndeinoculantes asemillasdesoja.
El
problema
de
la
competición
para
la
nodulación
Al ser la soja una planta oriunda del Lejano Oriente, en la mayoría de los suelos argentinos no existían rizobios noduladoresdeestaespecieantesdesuintroduccióncomo cultivoennuestropaís.Estomotivóquelasprimeras inocu-lacionesprodujerannotablesaumentosderendimiento en suelospobresennitrógeno,locualaúnsesigueobservando enciertaszonasmarginalesreciénincorporadasalcultivo. Sinembargo, lareiterada inoculación alo largo devarios a˜nosllevó alestablecimientodepoblacionesalóctonas de rizobios noduladores de soja en el suelo. Estas poblacio-nessufrieronluegocambiosgenéticosyhoylaspoblaciones alóctonasderizobiosnoduladoresdesojaposeenunagran diversidad genotípica, al punto que resulta difícil encon-trarlosgenotiposdelosinoculantesoriginales12,44,52.Estos
rizobiosdelapoblaciónalóctonadelsueloestánmuybien adaptadosa las condiciones edafoclimáticas localesenlo que respecta a, por ejemplo, pH, temperatura, estado hídrico o presencia de metales pesados o de glifosato12,
con lo cual suelenocupar la mayoría de losnódulos, aun cuando el cultivosehaya inoculado con uninoculante de buenacalidad42,52.
LafijacióndeN2deunaplantadependetantodela efi-cacia de cada nódulocomo del númerototal de nódulos. Silamayorpartedelosnódulosestáocupadaporrizobios dela población alóctona delsuelo, la tasa defijación de N2 de la planta estará determinada en gran medida por lacapacidad promediodefijar N2 que poseadicha pobla-ción,lacual,comoesesperable,engeneralesinferior(ya vecesmuyinferior)aladelacepaseleccionadaqueseusó parainocular.Así,sevieneobservandoquelosaumentosde rendimientopromedioenparcelasinoculadasconrespecto a parcelas sininocular nosuperan el 6 al10% (promedio demásde700ensayos desde1990hasta2007)66.Por otro
lado,enensayosdondesedeterminóelaportedelafijación simbióticadeN2a labiomasa delaparte aéreaenforma discriminadadelaportedelnitrógenodelsuelo,seobservó queun60-65%delnitrógenoprovinodelafijación simbió-ticadeN2,sinqueseobservarandiferenciasentreparcelas inoculadasysininocular66.Estosignificaquelainoculación
noestáaportandoareducirelusodelnitrógenodelsuelo, elqueconstituyeel35-40%delnitrógenoasimiladoporel cultivodesoja.
Dado que alrededor del 75% del nitrógeno adquirido porlaplantaseexportaalgrano,unaporciónsignificativa del nitrógeno del suelo es retirada durante la cosecha.
Por ejemplo, con un rendimiento modesto, de 2500kg por hectárea, se estarían retirando del suelo entre 54 y 61kg de nitrógeno por hectárea cada a˜no. Tal como se expresa en la investigación llevada a cabo por Piccinetti et al.66, esto ocurre en todas las zonas sojeras del país,
independientementedelascaracterísticasedafoclimáticas localeso de la calidad del manejo y la conservación del suelo, lo cual convierte al problema de la competición para la nodulación en un cuello de botella de carácter general.Porestemotivoconsideroquedebeencararseeste problema como prioritario en toda investigación sobre la mejoradelainoculación,yademás,quedebecontemplarse alahora deformular yaplicarel inoculante, auncuando seaesteunproblemaqueocurredespuésdelainoculación, einclusodespuésdelasiembra.Enotraspalabras,denada sirveposeerinoculantesmuybienformulados,delargavida mediaypreparadosconcepascuidadosamente selecciona-dassidespuésdescuidamossucompetitividadparanodular ynosencontramosconqueel90%delosnódulosterminan ocupadosporcepasdelapoblaciónalóctonadelsuelo42.
Elproblematieneotraaristaaúnmásacuciante.Como seha mencionado,en Argentina se siembran anualmente cercade20 millonesdehectáreasconsoja,peroelritmo de aumento de la superficie sembrada parece haberse amesetado desde la campa˜na 2009/20107. Dejando de
ladoposiblesaspectoseconómico-financieros,este amese-tamientopodría indicar que la ocupaciónde la superficie cultivableestá llegando al límite. Por lo tanto, cualquier incremento de la producción que pueda lograrse de aquí enadelante noserá por incorporación de máshectáreas, sinoporincrementosenla productividadporhectárea, lo cualimplicamayorextraccióndenutrientesporunidadde superficiedesuelo.Dichodeotromodo:sielmejoramiento vegetallogravariedadesdesojamásproductivasperonose mejoraenparalelolafijaciónsimbióticadeN2,latasade extraccióndenitrógenodelsueloysuconsecuente degra-daciónaumentarán.
Objetivos
de
la
inoculación
Lamaneramásusualdeinocularlasojaesmezclarlas semi-llasconelinoculanteinmediatamenteantesdelasiembra, arazónde3a4mldeinoculantelíquidoporkilogramode semilla.De esta manera, las semillas quedan recubiertas conelinoculante, aunqueladistribución delmismoentre lasdistintassemillassueleserheterogénea66.Estatécnica,
ademásdesersimple,esdeunagranpracticidad,yaqueno requierelaboresadicionalesdepreopostsiembra,tampoco requiereunequipamientoespecial enlasembradora. Asi-mismo,esadecuadapara tratamientosdepreinoculación, loscualesserealizan conequipos especialesmuchoantes delasiembra,asegurandounadistribuciónmáshomogénea delinoculante, ypara la incorporación del inoculante en eltratamiento profesionaldesemillas, que serealizacon equipamientoespecializadoeincluyeladosificaciónexacta deesteyotroscomponentesdepresiembra,como fungici-das,micronutrientesyestimuladoresdelagerminación,con locualpodríabrindárselealproductorunasemillatratada einoculada,listaparasembraryconladosisadecuadade cadacomponente.Enparticular,lapreinoculaciónyel tra-tamientoprofesional desemillasestánconsideradoscomo
Figura1 Etapasquepodríanlimitarlacompeticióndelosrizobiosinoculadosconlosdela poblaciónalóctonadelsuelo.Los rizobiosinoculados se representan enrosay los dela población alóctona delsuelo, enrojo. Los números encírculos indican lasetapasdelproceso.Etapa1:lassemillasconlosrizobiosadheridossesiembranenunsueloquecontiene rizobiosalóctonos distribuidosuniformementeenelperfil.Etapa2:luegodelainoculaciónylasiembraocurremortandadentrelosrizobiosinoculados. Etapa3:dependiendodelgradodeadhesiónirreversiblealcanzado,algunosrizobiossedesprendendelassuperficiesseminales mientrasqueotrosquedanadheridosalostegumentos.Lassemillasgerminanyloscotiledonesemergendelsuelollevandounidos losrizobiosadheridos irreversiblementealostegumentos;además,puedeocurrirmortandaddelosrizobiosliberadosal suelo. Etapa4:partedelosrizobiossobrevivientespuedentrasladarsepormovimientosactivosopasivoshastalaszonasinfectablesdelas raícesencrecimiento,mientrasquelosrizobiosdelapoblaciónalóctonanonecesitanhacerlopuestoqueyaestabandistribuidos enelperfildesuelo.
prácticasqueproveenladosisadecuadaacadasemilla,lo que evita las grandes variaciones dedosificación que son comunes en los tratamientos de inoculación manual. Sin embargo,losobjetivosdelainoculaciónnodebenlimitarse soloalrecubrimientodelassemillasconungrannúmerode rizobiosvivos,sinoque,comoseindicóanteriormente, tam-biéndebencontemplarqueunadecuadonúmeroderizobios vivoslleguenaponerseencontactoconlasraíces,las coloni-cenylasinfecten,enpresenciadeunapoblaciónalóctona derizobiosnoduladoresdesoja.Estopuedelograrse sise tomaenconsideraciónqueelnúmeroderizobiosinoculado porsemillaseatalqueequipareelnúmeroderizobios com-petidoresqueencontrarálafuturaraízendesarrollo,yque elestadofisiológico delosrizobiosinoculadosseatal que favorezcaunaadecuadacolonizaciónrizosféricayposterior infección.Estimoque, másalládelas condiciones locales (lascualesincluyen,obviamente,losgenotiposdelas pobla-cionesderizobiosnoduladoresdesojapresentes),estos2 aspectos,númeroy calidadfisiológicadelos rizobios ino-culados,sondecaráctergeneralydebenserconsiderados. Por lo tanto, es necesario poseer una estimación de cuál podríaserelnúmeroderizobiosadecuadoyprestar aten-ciónaquéestadofisiológicosedesealograrenelmomento delainfecciónradical.
Laspoblacionesalóctonasderizobiosnoduladoresdesoja son,ademásdevariadas,bastantedensas.Envariossuelos sehanregistradopoblacionesalóctonasdelordende105a 106derizobiosnoduladoresdesojaporgramodesuelo42,52.
Sepodría suponer que una plántulade sojaque posee el
primerpardehojasjuvenilescompletamentedesarrollado tieneunaraízprincipalyde4a8raícessecundarias,cada unadelas cualesposeeundiámetroaproximadode1mm yunlargodeunos10cm.Esteseríaelsistemaradicalque deberíasercolonizado e invadidoporlosrizobiosdel ino-culanteparalograrunabuenanodulacióntemprana,quees laqueaportalamayortasadefijacióndeN2.Medianteun cálculoteóricoquenoincluyeelvolumenderaízaportado porlospelosradicales,elsistemaradicalestaríaconstituido por7cilindrosde0,5mmderadiopor10cmdelargocada uno.Elvolumenacumuladodeestos7cilindrossería enton-cesde0,55cm3,yconsiderandounadensidadaparentedel suelo de1,3g/cm3,elestablecimientodeesasraíces des-plazaría0,71gdesuelo(enpesofresco).Esdecirquecon las densidades de rizobiosalóctonos mencionadas, la ino-culación debería posicionar auna población del ordende 7×104-7×105 rizobiospor raízen estas primeras etapas delcrecimientodelaplántula,comoparatenerunnúmero de rizobios inoculados equivalente al número de rizobios competidores de la población del suelo. Con respecto al estadofisiológicodeseable, lametodologíadeinoculación debegarantizarquelosrizobios:1)seadhieranalas semi-llas; 2) sobrevivanallí hastadespués dela siembra; 3)se liberendelassemillasunavez sembradasysobrevivanen elsuelohastalagerminación,4)ysetrasladenenelsuelo hastalasraícesencrecimientoycolonicenrápidamentela rizosferaenlazonainfectable(fig.1).Estasaccionessonel prerrequisitoparaquepuedanpenetrarlospelosradicales antesdequemadureneinvadirasílosnódulosenformación.
Alaluzdelosresultadosdescriptosenlasección prece-dente,sededucequelatécnicadelainoculaciónnecesita sustancialesmejoras parasuperarlacompetición ejercida porlosrizobiosdelapoblaciónalóctonadelsuelodurante lasetapasmencionadas,conelfindeponersuficiente can-tidaddelosrizobiosinoculadosencontactocon lasraíces paracolonizarlaseinfectarlasalnivelrequerido.Paraello esnecesarioresolvervariosinterrogantesquepermanecen comounvacíoenelconocimientoenloquerespectaala efi-caciadelainoculacióndesemillasdeleguminosas(ydesoja enparticular), interrogantes que, curiosamente ypese al enormenúmerodepublicacionesexistente,aúnpersisten. Acontinuación,planteodichosinterrogantesypropongolas líneasexperimentalesque,amijuicio,seríanecesario abor-darparaavanzarensuelucidación.
Adhesión
de
los
rizobios
a
las
superficies
de
las
semillas
Esteesunodelosaspectosenlosque,sibienhasidomuy investigado en diversas especies de bacterias y plantas, prácticamentesecarecederesultadosgeneradosen siste-massemejantesalarealidaddelainoculaciónensemillas. En efecto, el protocolo usual para las investigaciones de adhesión de bacterias a semillas (u otras superficies) consiste en una esterilización superficial de las semillas ----casisiempreconhipocloritodesodioyalcohol,seguidode varioslavadosconaguaestéril----,yluegolainmersióndelas semillasenunasuspensiónquecontienelasbacteriascuya adhesiónsequieremedir,lascualesgeneralmenteprovienen decultivosenfasedecrecimientoexponencial.Finalmente, se lava para eliminar las bacterias débilmente adheridas ysecuentaelremanente,firmementeadheridoala superfi-cieseminal.Aveces,inclusolassemillassedejangerminar antes de realizar el ensayo de adhesión17,23,35,54,61,77,84,90.
Esteprotocolocontrastaconlaprácticadelainoculaciónen semillas entres aspectosesenciales: a) seusan bacterias enfasedecrecimientoexponencialenvezdebacteriasen fase estacionaria, como las que se encuentran en un inoculante líquido; b) seusan semillas mojadas y aveces completamenteembebidasenvezdelassemillassecas, lis-tasparaalmacenarosembrar,yc)seusaungranvolumende inóculo, que usualmente excede varias veces el volumen de la semilla, en vez del peque˜no volumen usado en la prácticadelainoculación.Además,esfrecuentequeenlos ensayos deadhesiónlas semillas permanezcan sumergidas durantealgunashoras enlasuspensióndebacterias antes deserlavadasenvezdedejarsesecaralaire,comoenla práctica de la inoculación. Por lo tanto, las conclusiones querese˜naréacontinuación,obtenidasenlosmencionados trabajos,debentomarseconcautelaalahorade extrapo-larlasalainoculaciónsobresemillas afindeponderarlas característicasfisiológicasdelinóculo.
Laadhesiónbacterianatantoasemillascomoaraíces,y tambiénasuperficiesabióticas,esunprocesoquerequiere varias horas y consta de dos etapas: una primera etapa de adhesión reversible y una segunda etapa de adhesión irreversible18,72,76. Si bien no está claro hasta qué punto
estasetapassonsucesivasocoexistendurantecierto inter-valo, parece ser que laadhesión reversible es rápida (de 2a4h),mientrasquelairreversiblerequiereuncontacto
prolongadodelosrizobioscon lasemilla(alrededorde12 h).Estoindicaríaqueauncuandolassemillasseinoculeny sesiembren enseguida,eltiempo quetranscurre desdela inoculaciónhastaquelassemillasgerminanpermitiríaque ocurralaadhesiónirreversible.Sinembargo,elporcentaje derizobiosquelleganaadherirsedeestamanerapuedeser bajo.Sehaestimadoquesolodel10al15%delascélulas deuncultivodeB.diazoefficienssoncapacesdeadherirse alasraícesdesoja,ydeellas,menosdeunacuartaparte lleganamanifestarlaadhesiónirreversible85.
Enotros estudiosllevadosacaboporlaReddeControl deCalidaddeInoculantes(REDCAI)paradeterminarlas con-dicionesderecuentodeviablessobresemillasinoculadas, sehapropuestocomoparámetroelfactorderecuperación (FR),quemideelporcentajedecélulasviablesrecuperadas delas semillasconrespectoalacantidad inoculadaluego de 10 min desde la inoculación60. Si bien no es
estricta-menteunamedidadelaadhesión,elmétododeinoculación yrecuentoesmásparecido alaprácticadelainoculación ensemillas quelas metodologíasdescritasanteriormente. El resultado promedio del FR obtenido por seis laborato-rios de la REDCAI empleando B. japonicum y semillas de sojafue12±10%60,locualescongruenteconelresultado
mencionadoconanterioridad.
Estudiosconmutanteshanindicadoqueentrelas adhe-sinasresponsablesdelaadhesiónreversibleseencuentran lospolisacáridosdesuperficieylosflagelos,mientrasquela adhesiónirreversiblepareceestarmediada porfibrillasde celulosa18,72,76. Además, se ha reportado la participación
decationescomoCa2+,Mg2+yFe3+yunnúmerode estructu-rasextracelularesyproteínas,entreellasfimbriasylectinas tantovegetalescomobacterianas,aunqueenesteaspecto noexisteun patróngeneralizable a todaslas especiesde rizobios. El estado de crecimiento del inóculo también desempe˜naunpapel:lasbacteriasenfaseestacionariason lasmenoscapacespararealizarlaadhesión30,38,39,88.
Detodas maneras, nodebería preferirse una adhesión demasiado fuerte de los rizobios a las semillas luego de lainoculación,yenabsoluto deberíafavorecerse la adhe-siónirreversible.Laideadelainoculaciónesquelasemilla actúesimplemente como «medio de transporte» para los rizobios,pero estosdeberíanliberarsealsuelotanpronto comolasemillaessembradaparacomenzarelprocesode colonizacióndelarizosfera.Delocontrario,yaquelasoja es una planta de germinación epigea, los rizobios adhe-ridos en forma irreversible a la superficie seminal serían llevados fuera del suelo por los cotiledones, que suelen emerger con los tegumentos aún adheridos. Lamentable-mente, pocos estudios se centraron en los factores que permiten a los rizobios liberarse de las superficies semi-nales,y tampoco hay estudios comparativos acercade la eficienciaparalacolonizaciónrizosféricaporpartede rizo-biosinoculadosensemillasdeplantasdegerminaciónepigea ohipogea.
Supervivencia
de
los
rizobios
sobre
las
semillas
Losrizobiosposeenunabajatasadesupervivenciasobrelas semillas,lacualdepende,entreotrosfactores,delaedad delinóculo,delaeventualpresenciadecontaminantesyel
tipodeaquellos,ydelgradodesequedaddelasemilla20.Se
hadescriptoqueexistendosfasesdemortandad:una pri-merafasebastanterápida,delordende4h,dondemuere la mayor parte de los rizobios inoculados,y unasegunda fasededecaimientomáslento,queusualmenteseestabiliza alrededordelas24h59.Así,ensemillasdesojainoculadas
conB.diazoefficiensmuere el 75% delosrizobiosdentro delas primeras2 hluegode lainoculación, el 90% luego de24hyel 95%luegode48h80.Observacionessimilares
serealizaronenBradyrhizobiumsp.aplicadoasemillasde lupino73.EnB.japonicumsehaobservadounatasade
super-vivenciadeentre5y10%alas24ha30◦C;lasupervivencia puedeaumentarsisedisminuyelatemperaturade almace-najeoseutilizanprotectorescomosacarosaocarboximetil celulosa59.Seha informadoqueatiemposmáslargos,del
ordendesemanas,lasupervivenciasereduceentreun70y 90%delvalorqueteníaalas24h21.Asimismo,seha
obser-vadoqueen24hseincrementalacantidaddebacteriasen estadoviableperonocultivable,locualesimportante,ya queseha correlacionadoel númerodenódulosproducido conlacantidaddebacteriascultivables49.
Lascausasporlascualessedaestamortandadparecen circunscribirseprincipalmente a la desecación que sufren losrizobios luego de la inoculación y, en menor medida, a los contaminantes y a la acción de sustancias tóxicas tantoprovenientesdelassemillas,comoagregadasdurante la inoculación20. Además, si las condiciones de
almace-namiento no son adecuadas, la alta temperatura puede tambiéninfluir negativamente enla supervivencia, y ello se debe, en parte, al efecto de la temperatura sobre la desecación21,59. La desecación induce una serie de
res-puestas en B.diazoefficiens, entre ellas la biosíntesisde trehalosa,depolisacáridosextracelulares,depiliyde enzi-mas relacionadas con los mecanismos de reparación del ADN15.Sinembargo,latoleranciadeestaespeciealas
con-diciones de desecación imperantes en la superficie de la semillaesbajaysecreequeaestoobedecelamayorparte delatasademortandad49,59,80.
Paraaliviarestosefectossehanrealizadovarias investi-gacionescondiversas sustanciasque podríanactuarcomo protectores. Con respecto a la desecación, se han pro-badosustanciascapacesdereteneragua comolapolivinil pirrolidona, la goma arábiga o los mismos exopolisacári-dosbacterianos;tambiénsehanensayadoosmoprotectores comolatrehalosa,lasacarosaolamaltosa,osustanciaspara elencapsulamiento,comoalginatoociertoscoloides20.En
todosloscasossehaobservadounamejoradela supervi-vencia,aunqueesta varíacon lasustanciaylaespeciede rizobio,ynosellegaaunaproteccióntotal.Laidentidadde lassustanciastóxicasproducidasporlassemillas,asícomo susmecanismos deacción,son menosconocidos y, porlo tanto,las pruebasrealizadassonmásempíricas.Entre las sustanciastóxicas mejor caracterizadasse encuentran los polifenolesysehareportadounbuenefectoprotectordel caseinatodesodioodepotasio20.
Elefectonegativodelatemperaturaobviamenteseevita cuidandolascondicionesdealmacenaje.Sinembargo,dicho efectoresultadifícildeevitardurantelasiembra,momento enquelasemillapuedeentrarencontactoconunsueloa alta temperaturasuperficial o quedar expuesta al solpor unos momentos. En todosestos casos, los protectoresde ladesecaciónpuedendesempe˜narunpapeltambiénfrente
alatemperatura,aunquesehareportadoquelosrizobios aguantanmáselcalorsecoqueelhúmedo87.
Finalmente,debetenerseencuentaquela superviven-cia de los rizobios inoculados a las semillas puede verse amenazadacuandoademásdelinoculanteseagreganotras sustancias, tales como fungicidas, insecticidas, micronu-trientesoestimuladoresdelagerminación.Nosiempreestas sustancias resultan inocuas.Por ejemplo, losfungicidase insecticidaspuedentenerciertogradodetoxicidadparalos rizobios, o los micronutrientes y estimuladores del creci-mientopuedencontenermetalespesadostóxicos24.Entodos
estoscasos,lassustanciasensípuedenserdebajatoxicidad perolasconcentracionesquesealcanzanenlasuperficiede lasemillaeníntimocontactoconlosrizobiospuedenserlo suficientementealtascomoparaque,aunconunabaja toxi-cidad,ladosis resulteletalamedianoplazo.Esteaspecto esparticularmenterelevanteparalassemillaspreinoculadas yparaeltratamientoprofesionaldesemillas,todolocual requieredeunamayorinvestigaciónparadescartarestetipo deefectostóxicossobrelosrizobios.
En particular, debería consensuarse un protocolo para medir lasupervivenciadelosrizobiossobrelas semillas a lo largo del tiempo desde lainoculación, ycon él probar cadaunadelasvariablesmencionadas.Existenpropuestas a este respecto. Una de ellas consiste en evaluar la cul-tivabilidada travésdemétodos simplescomoel recuento enplacaadistintostiempos,paraestablecerlacinéticade aparicióndecoloniaso lamedida delporcentajede colo-niasmayoresde0,95mmluegode8díasdecultivoa30◦C enmedio YM,yaque estasmedidaspodríancorrelacionar conlacapacidaddenodulacióndelinoculante49.Otra
pro-puesta se basa enextraer las bacterias de las semillas y realizar el recuento de viables enun medio YM selectivo suplementadoconvancomicinaypentacloronitrobenceno59.
Los autoresrealizaronunajuste delafunciónbifásicadel decaimiento de la supervivencia de los rizobios sobrelas semillasypropusieronunparámetrodesupervivencia rela-tivaestimadaaltiempoenelcualseestabilizaelporcentaje debacteriassobrevivientes59.
Liberación
de
los
rizobios
al
suelo
Estaetapanodebeconsiderarsecomodisociadadela ino-culación, yaque esla etapa previaa laformación delos nódulos y es donde se inicia la competencia directa de losrizobiosconlosotrosmicroorganismosdelsuelo,entre ellos,otrascepasderizobioscapacesdenodularlamisma planta.Sinembargo,setratadeunáreadevacanciasobre laquedeberíatrabajarsemásparalograrmejorasenla tec-nologíadelainoculación.Algunaspreguntasbásicasaúnno respondidasacercadelafacilidadconquelasbacteriasse liberandelasuperficieseminalunavezqueentranen con-tactoconelsuelosonsidichaliberacióndependedeltipo deadhesinasintervinientes;sipodríatenerrelaciónconel estadofisiológicoinducidoenlabacteriaporlas condicio-nesdecrecimientodelinóculo;silosprotectores,adhesivos, plaguicidasyotroscomponentesqueseagreganenlasemilla preinoculadadesempe˜nanunpapel,cuáleslainfluenciade lascaracterísticasdelsuelo(p.ej.,sucontenidohídrico),si laliberaciónrequierequelasbacteriasadquieranunestado planctónicoosipuedemejorarseporselecciónartificial.
Si suponemos que el estado adherido a la superficie seminal es similar al estado sésil que se encuentra for-mando biopelículas, el tipo de adhesinas intervinientes puedeinfluirsobrelareversibilidaddelaadhesión.Así,la liberacióndelosrizobiosdesdelassemillasdebería reque-rirsudiferenciaciónalestadoplanctónico,enelquepueden nadar79.Losestadossésilyplanctónicosedistinguenentre
síporlaexpresióndeciertoscomponentesdesuperficie;los másnotoriosson,lasadhesinasylospolisacáridosde superfi-cie,quesonmásabundantesenelestadosésil,ylosflagelos, queseexpresanenelestadoplanctónicoyestánausentesen elestadosésil.Porlotanto,lascondicionesdecrecimiento del inóculo podrían condicionar el estado de los rizobios sobrelas semillas, yaque sesabe queestasinfluyen, por ejemplo,sobreeltipodeadhesinasproducidas16,76,sobrela
cantidaddepolisacáridosextracelulares40,62,68,69 osobrela
síntesisdeflagelos2,13.Porotraparte,elcontenidohídricoy
demateriaorgánicadelsuelodeberíacondicionaralmenos enparte latendenciadelosrizobiosdelabiopelícula for-madasobrelassemillas apasaral estadonatatorio79,con
locuallas condicionesedáficasalmomentodelasiembra podríanserclaves.
Si bien el tema de la transición entre estados sésil y planctónicoreciénempiezaaestudiarseenBradyrhizobium, existe abundante información en otras bacterias (como Escherichia coli, Salmonella, Caulobacter crescentus, Vibrio, Pseudomonas y Bacillus) que indica que dicha transiciónestáreguladaenformacoordinada46,50.Los
deter-minantes ambientales que inducen estos cambios no se conocenbien,peropareceserquetantoelniveldehumedad delambientecomolapresenciadesustanciasdedeshecho enlasbiopelículasmaduraspodríanserresponsablesdeque sedisparelatransicióndelestadodebiopelículaal planc-tónico.Loquesíha sidobiencaracterizadoesel segundo mensajeroqueanivelintracelularactúacomo intermedia-rioentrelase˜nalambientalyeldesencadenamientodela respuesta de transición de unestado a otro. Se trata de unnucleótidomodificadollamadodiguanilatocíclico (c-di-GMP),cuyonivelintracelulardependedelaacciónconjunta dediguanilatociclasasquecatalizansusíntesisy fosfodies-terasasquecatalizansudegradación89.
Dentrodelacélulaexistenmúltiplesdiguanilatociclasas yfosfodiesterasas,ysecreequesuacciónmodificalos nive-lesdec-di-GMPenformalocalizada.Asuvez,el nivelde c-di-GMPmodificadeformaalostéricalaactividadde cier-tasproteínasvinculadasconlaexpresióngénica26,yenlos
casosenloscualeslosgenesestánrelacionadosconla movi-lidadolaformacióndebiopelículas,sehaconcluidoque,de modogeneral,altosnivelesdec-di-GMPdisparanla expre-sióndegenesrequeridosparalaformacióndebiopelículas yparalaeyeccióndelosflageloseinhibenlaexpresiónde genesrequeridosparalasíntesisdeflagelos,mientrasque bajosnivelesdec-di-GMPtienenelefectocontrario9,89.En
B.subtilis,además, se ha descripto uncircuito regulato-rioconsistenteenunconmutadorepigenéticoquemantiene unabiestabilidadentreelestadomóvilyelsésil11.Seríade
interésestudiarestasactividadesenrizobios,paraversise puedelograracelerarelprocesodeliberacióndelos rizo-biosdelas semillas unavezque estasentranencontacto conelsuelo.
Másalládeconocereldetallemoleculardelprocesode liberacióndelosrizobiosdesdeunabiopelícula,laselección
recurrenteesunprocedimiento quepodríautilizarsepara obtenercepasmáspropensasaliberarsecuandolasemilla inoculada entra en contacto con el suelo. Este procedi-mientoyafue utilizado conéxito para obtenercepas con movilidadaumentada1,ysibiensedesconocenlosdetalles
moleculares que condujeron al aumento de movilidad, existelaventajadequealnohabersidomanipuladas gené-ticamente,estasbacterias seleccionadaspuedenliberarse almedioambientesinelriesgoqueentra˜naunorganismo genéticamente modificado. Un posible método podría ser sembrar semillas inoculadas en peque˜nas bandejas con sueloestérilyalcabodeuncortotiempopreestablecido, recuperarlosrizobiosliberados,cultivarlosyreinocularlos pararepetirelciclodemododeirseleccionandoaquellas bacteriasqueseliberenmásrápidamentedelassemillas.
Una vez que los rizobios se liberaron de las semillas, debensobrevivirenelsuelohastaquelassemillasgerminan. Enesteperíododebenenfrentarfactorestalescomolaalta temperatura,comúnenlaépocadesiembradelasoja,la desecaciónenlacapasuperficialdelsuelo,elataquede pre-dadores,lapresenciadeantibióticosnaturalesylaradiación ultravioleta(siestáncercadelasuperficie),paralosqueson másvulnerablesenelestadoplanctónicoqueenelestadode biopelícula79.Paraconocerlosdeterminantesdela
super-vivenciaduranteeste períodoserequeriríanmedicionesa campoo en microcosmos con suelo noestéril empleando semillasinoculadasconmutantesyconinóculosendistintos estadosfisiológicos,realizandorecuentosdeviablesentrela siembraylagerminaciónadistintastemperaturasyniveles dehumedad.Sibienestosaspectosnopuedencontrolarse atravésdelaformulacióndelinoculanteylatecnologíade aplicación,seríaimportante poseer unabuenaestimación dela magnitud de lamortandad delos rizobiosliberados alsueloendistintascondicionesedafoclimáticas,conelfin decalibrarmejorelnúmeroderizobioscultivablesquees necesarioasegurarporsemillaconlainoculación.
Colonización
rizosférica
temprana
y
movilidad
en
el
suelo
Luegodehaberseliberadoenelsuelo,losrizobiosinicianel procesodecolonizaciónrizosférica.Este procesodepende devariosfactores,tantoambientalescomodelabacteria,y hasidoobjetoderevisionesrecientes3,19,34,43,45,65.Elproceso
decolonizaciónrizosféricasuele sermuylargoenrelación conelprocesodeinfeccióntempranadelas raíces,porlo cualnodebeconsiderarsecomounaetapapreviadela infec-ción. Antes bien, ambos procesos son simultáneos ypara losfinesdelanálisisquepropongoaquíestimoconveniente enfocarmeenlosmediosporloscualeslosrizobiospueden iniciarlacolonizaciónrizosféricallegandodesdelasemilla inoculadaalsitiodeinfección,paraluegotratardeestimar cuálpodríaserlaproporcióndelosrizobiosinoculadosque efectivamentelogranunainfecciónexitosa.
Enplantasqueseinfectanporhilosdeinfección,como lasoja,las infecciones solo puedenocurrir enunaregión acotadadelaraíz,conocidacomolaregióndelospelos radi-calesemergentes6.Estoesasíporqueeleventoprevioala
formacióndelhilodeinfeccióneselcaracterísticoenrulado delpeloradical,queatrapalosrizobiosenunaespeciede bolsillo,desdeelcualcomienzanadisociarlaparedcelular
delapuntadelpeloradicalproduciendounainvaginaciónde aquella;esallípordondeunacélularizobianainiciala infec-ción.Unavezquelainfecciónseinició,laprogeniedeesa célulavainvaginandolaparedcelularhaciaelinteriordel peloradical yasíavanzahasta las capascorticalesy sub-corticales,dondeinvadiráelnóduloendesarrollo25,48.Este
procesorequiereque elpelo radical estéen activo creci-mientopolar,dadoqueesasícomoseproduceelenrulado (porcrecimientodiferencialaunoyotroladodeltuboque constituyeelpelo)ylainvaginacióndelaparedcelular64,91.
Lospelosradicalesenactivocrecimientoseencuentranen lazonadelospelosradicalesemergentes,cercanaalapunta dela raíz,yseha estimadoqueesaregiónpermaneceen dichoestado durante unas 5-6 h, luego de las cuales los pelosradicales yamaduraron ydejande serinfectables6.
Considerandoademásquelaraízavanzaaunos2,5mmpor hora,sededuceque el desplazamiento delosrizobios en sentidoverticaldesdeelsitiodondesedepositólasemilla para«perseguir» las zonas depelos radicales emergentes conformeestassehundenenelsuelodeberíaser significa-tivo.
Las bacterias pueden desplazarse en el suelo de dos maneras:pormovimientopasivo,llevadasporelmovimiento delaguaoporlamesofauna,obienpormovimiento autopro-pulsadoporflagelosopili.EnelcasodeB.diazoefficiens, seha podidoevidenciar elmovimiento impulsado por fla-gelostanto ensuelo como envermiculita inundada2,13. El
movimientoimpulsadopor flagelosasuvez puede ocurrir enelsenodeunlíquidoy,enesecaso,setratadenatación oswimming,osobresuperficieshúmedas,encuyocasose tratadeverbenearoswarming10,27.Esteúltimomovimiento
noparecetenerimportanciaensuelos13,porlocualmevoy
areferiralmovimientodenatación.
La natación bacteriana es en general muy rápida yse observacomocarreras máso menosrectilíneas, interrum-pidasporbruscos cambiosdedirecciónotumbos,tras los cualesseretomanlascarrerasenotradirección53(fig.2A).
Apesardeaparentarserunmovimientoalazar,setratade unmovimientoorientado,yaqueladuracióndelas carre-ras manteniendo la dirección se incrementa conforme la bacteriaseacercaaunquimioatrayente,como,por ejem-plo,unafuentedenutrientes,oseacortasilabacteriase acercaaunquimiorrepelente,como,porejemplo, sustan-ciaspotencialmente tóxicas (fig. 2B). Esto sucedeporque laduracióndelas carrerasestá gobernadaporunsistema conocidocomoquimiotaxis,medianteelcuallasbacterias percibengradientesdeconcentracióndequimioatrayentes oquimiorrepelentes,aloscualesrespondenmodificandoel sentidoolavelocidadderotacióndelosflagelos,estoeslo quellevaaloscambiosdedirección4,8,29,75.
Se hanrealizado muchos estudios dela movilidad yla quimiotaxisdevariasespeciesderizobios,pero desafortu-nadamentelamayoría deellosemplearonmedios líquidos homogéneosyhaymuypocosestudiosrealizadosenmedios porosos o suelo2,13,31,37,47,51. Los medios líquidos
homogé-neosylosporososdifierenenaspectosclave.Enlosmedios líquidoshomogéneos,ladifusióndesustanciasatrayenteso repelentesesrápida;sinembargo,losmedios porosos tie-nencanalestortuososque,segúnsudiámetroyelcontenido dehumedaddelmedio,puedenconteneraguaoaire,conlo cualladifusióntantodebacteriascomodesustancias atra-yentesorepelentesocurreaunatasamuchomenor32,36,57,83.
Figura 2 Movilidad y quimiotaxis. A) El movimiento típico deunabacteriaconstadecarreras(flechas)interrumpidaspor bruscoscambiosdedirecciónotumbos.Durantelascarreras,el flagelogiraenunsentido(círculosconflechas);lostumbosse producenporcambiosdelsentidoodelavelocidadderotación delflagelo.B)Enpresenciadeunquimioatrayente,disminuyela frecuenciadetumbosysealargalalongituddelascarreras,lo queseconocecomoquimiotaxispositiva.C)Enunmedioporoso comoelsuelo,puedesermásimportantelacapacidadde cam-biardedirecciónquelaquimiotaxispositivapararecorreruna ciertadistancianeta.
Si consideramos que un poro capilar del suelo capaz de retener agua a capacidad de campo posee un diá-metro de hasta unos 50m y que la velocidad con que B. diazoefficiens se desplaza por natación es de unos 30m/s33,podemosestimarqueestabacteriaescapazde
recorrer de lado a lado un poro semejante en algo más deunsegundo.Sinembargo,estaespeciecambiade direc-cióncadaaproximadamente0,60s(Quelasetal.,resultados nopublicados),esdecir,quepodríarecorrer enuna direc-ciónrectilíneaaproximadamenteunterciodeldiámetrodel poro antes de cambiar de dirección. La quimiotaxis posi-tiva hacia ciertos solutos,como podríanser los exudados desemillaoderaíz,aumentaeltiempotranscurridoentre cambios de dirección haciendo que el desplazamiento de labacteriaseamásrectilíneo4.Estetiempoentrecambios
dedirecciónpodríaincrementarsehasta 3o4s,loque le permitiríaalabacteriarecorrerunos90a120mantesde cambiardedirección.Peroelloexcedeeldiámetrodelporo aproximadamentealdoble. Siconsideramosquela tortuo-sidaddelsueloestalqueloscanalescambiandedirección en una distancia aproximada de undiámetro de poro, se observaquelaquimiotaxispositivaenunsuelonoseríatan determinantecomo síloseríalacapacidaddecambiar de direcciónparaacompa˜narlatortuosidaddelmedio(fig.2C). Se requieren más investigaciones para dilucidar este
importante aspecto de la distribución de los rizobios en el suelo, enparticular, estudios dela nataciónenmedios tortuosos.
Detodasmaneras,sehanrealizadodiversasmediciones dela velocidadcon querizobioscomo B.diazoefficiensu otrasbacteriascomoPseudomonassedesplazanenelsuelo acapacidaddecampo.Losresultadosindicanvelocidades dedispersióndealosumo1-5mm/h(0,3-1,4m/s),locual se˜nalaunavezmásladificultadqueposeenestasbacterias paradesplazarse enese medio tortuoso5,13,78,84. Dadoque
estavelocidadesdelmismoordenquelavelocidadde elon-gacióndelaraíz6,cuyazonadepelosradicalesemergentes
sealejacontinuamentedelassemillasinoculadas,parecería que,auncuandolosrizobiosnohayanllegadoaformaruna biopelículamadura ysepuedan liberarrápidamentedela superficiedelasemillaantesdequeestagermine,su velo-cidaddenataciónlesalcanzaríaapenasparaacompa˜narla elongaciónde la raíz. Esto dejaríaun tiempo muyexiguo para que losrizobios se adhierana la superficie del pelo radicalyproduzcansuenrulado,antesdequeelpelo radi-calmadure.Porlotanto,laautopropulsióndelosrizobios mediantesusistemademovilidadyquimiotaxispodríaser de utilidad soloen distanciascortas, como, porejemplo, paraposicionarseenpelos inmadurosunavezquela zona delospelosradicalesemergenteshasidocolonizada.
Para la colonización de la rizosfera (que incluye a los pelosradicalesemergentes),losrizobiosdebendesplazarse muchomásrápidamenteyestolopuedenhacernadandopor losmacroporossielsueloestáanegado(p.ej.,duranteuna lluvia),omediantedesplazamientospasivosllevadosporlas corrientesdepercolaciónoadheridosasuperficiesde meso-fauna,comonematodes,lombricesoinsectos2,31,47.Estoes
congruenteconresultadosque muestranque mutantesno móvilestantoderizobioscomodePseudomonascolonizanla rizosferaconsimilareficienciaquelostipossilvestres móvi-lesen sueloso medios porosos acapacidad decampo2,84.
Sinembargo,este tipodedesplazamientopasivonoposee orientaciónhacialossitiosinfectablesdelasraíces,los cua-lessolopodríanseralcanzadosalazar.
Conclusión
Enlosapartadosanterioresheconsideradolasetapas prin-cipalesdelainoculacióndelassemillasylassituadasentre ellayeliniciodelanodulación,yheanalizadolosaspectos quepodríandeterminarcuellosdebotellaentreunaetapa yotra.Estosaspectospodríancondensarseenuna estima-cióncomolaquepropongoacontinuación(véasetambién lafigura1):
Ninf=Ninox(padh−pteg)xpsupxplibxpgerxpcorxppre Donde:
Ninf:númeroderizobioscapacesdeiniciarinfeccionesen lospelosradicalesemergentes.
Nino:númeroderizobiosinoculadosenlasemilla. padh:proporcióndelosrizobiosinoculadosquese adhie-renalassemillas.
pteg:proporcióndelosrizobiosadheridosquesonllevados fueradelsuelosobrelostegumentos.
psup:proporcióndelosrizobiossobrevivientessobrelas semillasalmomentodelasiembra.
plib:proporcióndelosrizobiosquesonliberadosalsuelo desdelassemillasluegodelasiembra.
pger:proporcióndelosrizobiosquesobrevivenenelsuelo entrelasiembraylagerminación.
pcor:proporcióndelosrizobiosquepormovimientos auto-propulsadosopasivossoncapacesdealcanzarycolonizarla superficiedelaraíz.
ppre:proporcióndelaraízconpelosradicalesemergentes (zonainfectable).
Solounospocosdeestosparámetrosphansido cuanti-ficados,yaunparalosquesílohansido,enmuchoscasos hayqueredise˜narlosexperimentosdemodotalque repro-duzcanlascondicionesnaturalesodeprácticaagronómica, como, por ejemplo, la movilidad autopropulsada en sue-losy la adhesión a semillas evaluada con protocolos que contemplenlascondicionesdeinoculación.Noobstante,la informacióndisponible permiterealizar unaserie de esti-macionescomoparatenerunaideadelvalordeseabledela variableNinoparaalcanzarundadovalordelavariableNinf. padh:sehase˜naladoqueenexperimentosrealizadosen suspensión líquida, la proporción de rizobios capaces de adherirsearaícesosemillasesdeaproximadamenteel 10-15%,yenlasestimacionesdelFRrealizadasporREDCAIel promediofue12%.Porlotanto,parauncálculooptimista, consideropadh=0,15.
pteg:noexisteinformaciónalrespecto,conlocual,para hacer un cálculo conservador supongo que, del total de adhesión,un10%derizobiospresentaadhesiónfirmeyotro 10% adicional permanece con adhesión reversible en los tegumentoscuandoloscotiledonesemergendelsuelo, tota-lizandoasíun20%delosrizobiosinicialmenteadheridos.Por lotanto:pteg=0,03.
psup:losdatosdelaliteraturaindicanqueenelmomento dela siembrael porcentajede supervivencia esde entre el 1 y el 10%. Permítaseme suponer que con protectores adecuadospuedealcanzarseellímitesuperior,conlocual psup=0,1.
plib:tampocoexistendatosalrespecto,demodoquepara haceruncálculoconservadorsupongoqueel90%delos rizo-biossonliberadosentrelasiembraylagerminación,conlo cualestimoplib=0,9.
pger:tampocohaydatosalrespecto.Parahacerun cál-culooptimistasupongoquela tasadesupervivenciaenel sueloesmuyaltay,porlotanto,pger=1,0.
pcor: este aspecto tampoco ha sido estudiado lo sufi-ciente. Para estimar este parámetro considero que los rizobiosquealcanzanlazonadelospelosradicales emer-gentes lo suficientemente rápido como para iniciar la colonizaciónde laszonas infectableslohacenpor despla-zamientopasivo(aguadepercolación,mesofauna).Sieste eselcaso,dichodesplazamientonoseríadirigidoy,porlo tanto, ocurriríahomogéneamente enuna semiesfera cen-tradaenlasemilla.Siconsideramosraícesdeunalongitud de10cm(véasemásarriba),el volumende lasemiesfera seríadeunos2×103cm3.Segúnloscálculosrealizadosmás arriba,elvolumentotaldedichasraícesseríade0,55cm3, conlocuallaproporcióndevolumendelasemiesfera ocu-padoporraícessería2,75×10−4,yestaseríalaproporción derizobios que alcanzaríalas raícesal azar,de donde el valordepcor=2,75×10−4.
ppre:estaproporciónseconoceyesenpromedioel20% delaraíz,conlocualppre=0,2.
Segúnestasestimaciones,Ninf=Nino x(5,9×10−7).Este resultado se ajusta a la observación de que bastan 10-100rizobiosporgramodesueloparacompetireficazmente conuninoculanteaplicadoensemillas82.Además,la
esti-mación está dominada por el parámetro pcor, que es 2 a 3 órdenes de magnitud más bajo que los otros, lo cual guardarelación con el hallazgo deque la posición de los rizobiosenelsustratodeenraizamientoesdeterminantede lacompetitividad paranodular41, yque rizobiosno
móvi-lescompiteneficazmenteconla cepasalvaje móvilenun sustratoacapacidaddecampo2.Porlotanto,si,como
indi-quémásarriba,sedeseaequipararelnúmerodebacterias capacesde iniciarla infección con el número de rizobios competidoresdelsuelo,deberíaobtenerseunNinfdeentre 1,4×104 a 1,4×105 rizobios porzona infectable de raíz, yel inóculoinicial debería ser, por lo tanto, entre2,4× 1010 a2,4×1011 rizobiosporsemilla.Evidentemente,este rangoestálejosdeloalcanzableactualmenteporla inocu-laciónensemillasyaunporel tratamientoprofesionalde semillas,peropodríareducirsea4,9×104a4,9×105 rizo-biosinoculadosporsemillasi losrizobiosseduplicaran al menosunavez enel sueloluegodeliberarsedelas semi-llas. Este rangode valores esfácilmente alcanzable si se consideraunainoculaciónde3-4mlporkilogramode semi-llaconuninoculantequecontengadelordende1×109a1× 1010rizobiosvivospormililitro.Enlamayoríadeloscasos, coninoculantesdebuenacalidadencuantoatítulo,se con-sideraquesobrelasemillaseestablecenaproximadamente 8,0×104 rizobiospor semilla,de acuerdo tambiéncon la reglamentacióny los marbetes de los inoculantes comer-ciales. Este valor es fácilmente alcanzable con el rango antedichosiseconsiderapadh=0,15.Porsupuesto,los cál-culosqueherealizadoson muyestimativosyademáshay suelosdondelaspoblacionescompetidorasestáncercadel límiteinferiordedensidadpoblacional.Además,la estima-cióndepcorconsideraquelosrizobiossemuevendeforma pasivaisotrópicamentedesdelasemilla,peropodríaserque auncuandoelmovimientofuerapasivo,existaalguna direc-ciónpreferencial(p.ej.,queelmovimientoimpulsadopor elagua de percolacióntenga unadirecciónpredominante ensentido vertical descendente). Detodos modos, consi-deroqueunNinode4,9×105rizobiosinoculadosporsemilla podríaasegurarunabuenacompetitividadparanodularbajo diversascircunstancias,incluyendoelrégimendelluviasyla densidaddelapoblaciónalóctonacompetidora.Estevalor deNinosípuedeseralcanzadoconuninoculantelíquidoque contengadelordende109rizobiosvivospormililitro,pero deberíanasegurarselascondicionesfisiológicasenel inocu-lantecomoparaqueladuplicaciónenelsueloocurraenun tiemporazonable.Podríaargüirse queesto efectivamente sucededebidoal conocidoefectorizosférico, responsable de que las poblaciones bacterianas aumenten de manera significativaenlarizosferadebidoalaexudaciónde nutrien-tesdesdelaraíz86.Sinembargo,nuevamentedebetenerse
encuentaeltiemporequeridoparaqueeste efectotenga lugar:laraízdebehabercrecidoyexudadonutrientesantes dequesemanifiesteelefectorizosférico, yconsiderando quenosestamos refiriendoarizobiosqueprovienendela semillaydebenrealizarunainfeccióntemprana,este fenó-menonopodría ocurrirantesde quela zonade lospelos
emergentes haya madurado. Por otro lado,si losrizobios debenmoversemediantesusflagelos,necesariamentevan aencontrarseenestadoplanctónico,elcualesmuchomás susceptibledeserafectadoporpredadoresysustancias anti-bacterianas queel estadode biopelícula. Esoreduciría el tama˜nodelapoblaciónmóvil.Así,nohaycertezadequela poblaciónderizobiosinoculadospodráduplicarseantesde iniciarlainfeccióndelasraíces.
Porlotanto,quedanse˜naladaslasáreasdondeami cri-terioserequieremayorinvestigaciónydesarrolloconelfin delograrelNinfadecuado.Estasserían,principalmente,la adhesiónreversibleylasupervivenciadelosrizobiossobre lassemillas,laliberacióndelosrizobiosluegodelasiembra yladispersión,supervivenciaymultiplicacióndelosrizobios enelsuelo.
Responsabilidades
éticas
Proteccióndepersonasy animales.El autordeclara que paraestainvestigaciónnosehanrealizadoexperimentosen sereshumanosnienanimales.
Confidencialidaddelosdatos.Elautordeclaraqueeneste artículonoaparecendatosdepacientes.
Derecho a laprivacidady consentimiento informado.El autor declara que en este artículo no aparecendatos de pacientes.
Conflicto
de
intereses
Elautordeclaranotenerningúnconflictodeintereses.
Agradecimientos
ElautoresinvestigadorindependientedelCONICETy profe-soradjuntodelaFacultaddeCienciasExactas,Universidad NacionaldeLaPlata.Eltrabajodelautoresfinanciadopor laANPCyTyelCONICET.
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