INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

(1)

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

“DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS

INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL

MEZCAL TAMAULIPECO”

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

PRESENTA:

Biól. JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

(2)

(3)

(4)

El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de

Biotecnología Industrial del Centro de Biotecnología

Genómica del Instituto Politécnico Nacional, bajo la

dirección de la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona.

(5)

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ÍNDICE

ABREVIATURAS _________________________________________________________ VI

DEDICATORIA _________________________________________________________ VII

AGRADECIMIENTOS ____________________________________________________ VIII

RESUMEN _______________________________________________________________ IX

ABSTRACT _______________________________________________________________ X

1. INTRODUCCIÓN ________________________________________________________ 1

2. ANTECEDENTES ________________________________________________________ 2

2.1. Bioquímica y biología del proceso de fermentación del vino ____________________ 2

2.2. Las sucesiones microbianas en el vino y sus técnicas de estudio _________________ 5

2.2.1. Electroforesis en gel de campos pulsados ________________________________ 7

2.2.2. Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt) ___________________________ 8

2.2.3. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción del ADN (RFLP) __ 8

2.2.4. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) __________ 8

2.2.5. Hibridación fluorescente in situ (FISH) _________________________________ 9

2.3. El proceso de elaboración del mezcal y tequila ______________________________ 11

2.3.1. El jimado ________________________________________________________ 11

2.3.2. Cocción _________________________________________________________ 11

2.3.3. Molienda: obtención del mosto _______________________________________ 12

2.3.4. Fermentación _____________________________________________________ 13

2.3.5. Destilación _______________________________________________________ 13

3. JUSTIFICACIÓN ________________________________________________________ 15

4. HIPÓTESIS ____________________________________________________________ 16

5. OBJETIVO GENERAL ___________________________________________________ 16

6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS _______________________________________________ 16

7. MATERIALES Y MÉTODOS ______________________________________________ 17

7.1. Levaduras ___________________________________________________________ 17

7.1.1. Conservación de las levaduras en glicerol ______________________________ 17

7.2. Extracción de ADN de las levaduras ______________________________________ 18

7.2.1. Identificación molecular de las levaduras _______________________________ 18

7.2.2. Secuenciación de la región 26S e ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg _______________ 20

7.3. Cálculo de los índices de diversidad de la fermentación del mezcal ______________ 21

7.4. Fermentaciones modelo en medio de mosto ________________________________ 22

(6)

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

II

JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

7.4.1. Medios de cultivo _________________________________________________ 22

7.4.2. Preparación del medio de mosto de agave ______________________________ 22

7.4.3. Cuantificación de azucares reductores por DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) ___ 23

7.4.4. Cuantificación de la biomasa por peso seco _____________________________ 24

7.5. Análisis estadístico ___________________________________________________ 25

7.6. Cuantificación de azúcares consumidos y etanol producido por HPLC ___________ 25

7.7. Determinación de la diversidad genética de las levaduras por rep-PCR ___________ 26

8. RESULTADOS _________________________________________________________ 28

8.1. Caracterización morfológica de los aislamientos ____________________________ 28

8.2. Identificación molecular de las levaduras __________________________________ 29

8.2.1. Diversidad de especies durante la fermentación del mezcal _________________ 34

8.3. Fermentaciones en medio de mosto de Agave _______________________________ 35

8.3.1. Consumo de azúcares reductores _____________________________________ 35

8.3.2. Crecimiento de las levaduras en mostos de Agave ________________________ 36

8.3.3. Análisis del consumo especifico de azúcares reductores ___________________ 36

8.4. Capacidad fermentativa de los aislamientos ________________________________ 39

8.5. Diversidad genética de levaduras por rep-PCR ______________________________ 42

8.5.1. Diversidad genética y productividad de etanol ___________________________ 46

9. DISCUSIÓN ____________________________________________________________ 48

9.1. Caracterización morfológica y molecular __________________________________ 48

9.2. Diversidad fenotípica __________________________________________________ 51

9.3. Diversidad genética y productividad ______________________________________ 51

10. CONCLUSIONES ______________________________________________________ 54

11. RECOMENDACIONES _________________________________________________ 55

12. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________________________ 56

13. APÉNDICE ___________________________________________________________ 60

14. GLOSARIO __________________________________________________________ 101

(7)

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Lista de figuras

Figura 1. Rutas metabólicas aerobias y anaerobias de la degradación de la glucosa y su excresión como etanol,

glicerol y acetato en Saccharomyces cerevisiae. __________________________________________ 3

Figura 2. La figura muestra la recolección de las piñas y su posterior raspado o jimado de las partes que le dan

un sabor desagradable al mezcal. _____________________________________________________ 11

Figura 3. Horno de cocción en el suelo de las piñas de agave _______________________________________ 12

Figura 4. Trapiche rústico con el cual se muelen las piñas de agave __________________________________ 13

Figura 5. Tanque de fermentación rústico en Tamaulipas __________________________________________ 13

Figura 6. Destilador rustico utilizado para destilar el mosto fermentado. ______________________________ 14

Figura 7. Ubicación geográfica del Ejido El Palmar lugar donde se colectaron las levaduras con la que se llevo a

cabo este trabajo. _________________________________________________________________ 17

Figura 8. Esquema de la región ribosomal que involucra los genes 18S, 5.8S y 26S, además de las regiones no

codificantes ITS1 e ITS2 y la localización de los oligonucleotidos utilizados en este trabajo. ______ 19

Figura 9. Amplificación por PCR de la región 26S M. marcador de peso molecular, muestras 1-16 levaduras

con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo. ___________ 20

Figura 10. Productos de PCR de la región ITS1-5.8-ITS2 M. marcador de peso molecular, muestras 1-13

levaduras con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo. ___ 20

Figura 11. Curva de calibración para fructosa ___________________________________________________ 24

Figura 12. Curvas de calibracion para HPLC ____________________________________________________ 26

Figura 13. Microfotografías digitales de levaduras con su principal diferencia utilizada en este trabajo para

clasificarlas morfológicamente. A) Saccharomyces cerevisiae (redonda) y B) Pichia kluyveri

(ovalada). Objetivo 100X. __________________________________________________________ 29

Figura 14. Árbol de distancias obtenido de la región 26S de ADNr generado en el programa MEGA 4 utilizando

el metodo Neighbor Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum

Composite Likelihood y un re-muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del

GenBank fue utilizada como grupo de salida. ___________________________________________ 32

Figura 15. Árbol de distancias génicas generado de la región ITS1-5.8S-ITS2 con el método Neighbor Joining.

La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum Composite Likelihood y un

re-muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del GenBank fue utilizada como

grupo de salida. ___________________________________________________________________ 33

Figura 16. Consumo de azucares reductores en el mosto después de 60 horas (A) Saccharomyces cerevisiae

(S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia kluyvery

(P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.). ___ 35

Figura 17. Biomasa producida por cada levadura en el mosto de agave. A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.); B)

Kluyveromyces marxianus (K.m.); C) Torulaspora delbrueckii (T.d.); D) Pichia kluyvery (P.k.); E)

Clavispora lusitaniae (C.l.); F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m.) y (P.g.). __________ 37

(8)

IV

Figura 18. Consumo especifico obtenida a las 60 horas por cada una de las levaduras. (A) Saccharomyces

cerevisiae (S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia

kluyvery (P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m.,

P.g.). ___________________________________________________________________________ 38

Figura 19. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo S. cerevisiae _________ 42

Figura 20. Dendrograma obtenido de la matriz de ausencia presencia de bandas del rep-PCR de las levaduras

Saccharomyces cerevisiae utilizando el programa Statistica y el método de distancias euclidianas. __ 43

Figura 21. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo K. marxianus y T.

delbrueckii. ______________________________________________________________________ 44

Figura 22. Dendrograma obtenido de la matriz de ausencia presencia de bandas del rep-PCR de las levaduras

Kluyveromyces marxianus y Torulaspora delbrueckii utilizando el programa Statistica y el método de

distancias euclidianas. _____________________________________________________________ 45

Figura 23. Comparación de la diversidad genética y la producción específica de etanol de las levaduras probadas

en este trabajo. S.c. (Saccharomyces cerevisiae). _________________________________________ 46

Figura 24. Comparación de la diversidad genética y la producción de etanol de las levaduras Kluyveromyces

(9)

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Lista de cuadros

Cuadro 1. Levaduras y bacterias que han sido identificadas de mostos de Vitis vinifera y de Agave spp. _____ 10

Cuadro 2. Concentración de fructosa y curva de calibración obtenida para el método del DNS _____________ 23

Cuadro 3. Origen y características del mostos de mezcal (ejido “El Palmar” Tamaulipas) y de las levaduras

aisladas en diferentes etapas del proceso. _______________________________________________ 28

Cuadro 4. Levaduras identificadas por secuenciación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 y 26S de los mostos de

mezcal tamaulipeco utilizando el programa BLAST del NCBI. _____________________________ 30

Cuadro 5. Caracterización de la diversidad ecológica por etapas de la fermentación del mezcal de San Carlos

(Tamaulipas) mediante su la riqueza de especies (S), el índice de diversidad de Shannon (H), y la

diversidad (D) y dominancia (D´) de Simpson. __________________________________________ 34

Cuadro 6. ANOVA del consumo especifico de azúcar ____________________________________________ 39

Cuadro 7. Consumo de azucares y producción de etanol de cada uno de los aislamientos obtenidos por HPLC. 40

Lista del apéndice

APÉNDICE 1. Aislamientos de levaduras con su clave de identificación y el número de carril en el que se

encuentra en el gel de agarosa de la PCR. ______________________________________________ 61

APÉNDICE 2. Análisis de varianza del consumo específico de azúcares. _____________________________ 62

APÉNDICE 3. Imágenes de las levaduras utilizadas en este estudio divididas en dos grupos las que tienen

células redondas y las de células ovaladas, objetivo 100 X _________________________________ 63

APÉNDICE 4. Secuencias obtenidas por secuenciación y secuencias de referencia utilizadas para la elaboración

(10)

VI

ABREVIATURAS

g

Microgramos

L

Microlitro

M

Micromolar

A

260

Absorbancia a 260 nm

A

280

Absorbancia a 280 nm

ADNg

Ácido desoxiribonucléico genómico

AFLPs

Polimorfismos de la Longitud de los Fragmentos Amplificados.

dNTP

Deoxinucleótidotrifosfato

DO

Densidad óptica (nm)

EDTA

Ácido etilendiaminotetracético

mg

Miligramos

mL

Mililitro

mM

Milimolar

NH

4

OAc

Acetato de amonio

nm

Nanómetros

ºC

Grados centígrados

pb

Pares de bases

PCR

Reacción en cadena de la polimerasa

PDA

Agar papa dextrosa

rpm

Revoluciones por minuto

Taq

ADN polimerasa de Thermus aquaticus.

(11)

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

DEDICATORIA

A mis padres María Guadalupe Mireles Berlanga y Pedro Arratia Arratia que siempre han

estado conmigo en las buenas y en las malas por darme la vida, su amor y sobre todo su apoyo

incondicional ya que la mejor forma de agradecerles todo lo que me han dado es con mis

logros profesionales.

Y especialmente para la Dra. Paty quien creyó en mí y por estar siempre ayudándome en cada

etapa de mi tesis por su apoyo y por no permitirme desistir en los momentos más difíciles

Gracias.

(12)

VIII

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona por su asesoría para llevar a cabo este proyecto y

por creer en mí.

A mi comité revisor de tesis la M.C. María Antonia Cruz Hernández, el Dr. José Alberto

Narváez Zapata, Dr. Netzahualcoyotl Mayek Pérez y el M.C. Víctor Moreno por sus críticas

constructivas que hicieron en cada presentación de avances.

A la M.C. Amanda Alejandra Oliva Hernández por su ayuda durante el desarrollo del trabajo

de laboratorio.

A todos mis compañeros de laboratorio Isabel, Erika, Paco, Salvador, Eliseo, Samantha,

Amanda, Elizabeth y Leandro por su amistad y compañía que siempre tuve durante mi

estancia en el laboratorio.

A la generación 2007-2009 por su amistad y apoyo durante estos dos años y por compartir su

compañerismo y amistad siempre.

Al maestro Víctor e Israel del área de servicios por su apoyo en el uso del HPLC y por su

ayuda durante la secuenciación de las muestras.

Y a todas las personas que de alguna manera directa o indirectamente contribuyeron al

desarrollo de este trabajo.

Finalmente, se agradece el apoyo económico del CONACyT, por la Beca de Estudios

otorgada, así como al Instituto Politécnico Nacional por la Beca Tesis otorgada, para la

terminación del presente trabajo. Los insumos y la movilidad fueron apoyados por los

proyectos CONACyT Básica2006-57576, y los proyectos SIP2008-0597 y SIP2009-0613,

junto con el complemento de beca (PIFI) asociada a estos proyectos del Instituto Politécnico

Nacional.

(13)

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

RESUMEN

El mezcal es una bebida artesanal de México con denominación de origen. A pesar de que esta

bebida tiene una importancia económica para los estados donde se elabora, hace falta realizar

más investigaciones acerca de la micoflora involucrada en la fermentación. Las levaduras son

las responsables de la fermentación de los mostos de Agave, es decir gracias a ellas la

fructosa, obtenida de la hidrólisis de la inulina al cocerse la piña de esta planta, es

transformada en etanol y otros compuestos que le dan sabor, y si bien existen varios trabajos

en la literatura que analizan la fermentación del mosto de Agave tequilana Weber var azul

(para producir tequila), son muy pocos los resultados reportados para otras especies de Agave.

En este trabajo se estudió la micoflora presente durante la fermentación de una mezcalera

tamaulipeca, y se obtuvieron 51 aislamientos, pertenecientes a 9 especies diferentes de

levaduras colectadas en diversas etapas de la fermentación, y se caracterizaron por su

capacidad de consumo de azúcares y producción de etanol a 15 aislamientos de

Saccharomyces cerevisiae, 12 de Kluyveromyces marxianus, 5 de Torulaspora delbrueckii, 6

de Pichia kluyveri, 4 de P. guillermondii, 2 de P. mexicana, 5 de Clavispora lusitaniae, 1 de

Candida parasilopsis y 1 de Zygosaccharomyces bailii. De manera relevante, todos los

aislamientos fueron capaces de producir etanol en concentraciones variables, no solamente S.

cerevisiae, lo cual indica que todas contribuyen a la fermentación alcohólica. El análisis

global genómico mediante la técnica rep-PCR permitió obtener patrones diferenciales de

bandeo inter e intra especies, y si bien no fue posible determinar a priori las características

productivas de un aislamiento basado en su perfil rep-PCR, sin embargo sí pueden ser

utilizado como un sistema de identificación y etiquetamiento molecular de los aislamientos,

que pudiera ser utilizado en el seguimiento de cada uno durante la fermentación, para verificar

que la población deseada se encuentra presente en el proceso. Este trabajo constituye el primer

reporte de caracterización global molecular y productiva de las levaduras involucradas en la

producción del mezcal tamaulipeco.

(14)

X

ABSTRACT

Mezcal is a mexican artisan liquor with denomination of origin and very unique organoleptic

characteristics. Despite the economic importance of this industry, there is a lack of of

information concerning the micoflora involved in mezcal fermentation. The yeast are

responsible for the fermentation of Agave must, converting the sugars obtained from the

thermal hydrolysis of inulin present in the “piña” (Agave stalk) to ethanol and other

compounds that confer the mezcal its unique flavor. There are several reports concerning the

characterization of must of Agave tequilana Weber var Azul (to obtain tequila), but very few

with other Agave species. In this work the fermentation of a tamaulipeca mezcalera was

sampled, and 51 isolates were obtained, belonging to 9 different species from all stages of the

fermentation, and they were molecularly identified and characterized in terms of consumption

of sugars and ethanol production. Fifteen isolates were identified as Saccharomyces

cerevisiae, 12 of Kluyveromyces marxianus, 5 of Torulaspora delbrueckii, 6 of Pichia

kluyveri, 4 of P. guillermondii, 2 of P. mexicana, 5 of Clavispora lusitaniae, one of Candida

parasilopsis and one of Zygosaccharomyces bailii. All isolates were able to produce ethanol

in variable concentration, not only S. cerevisiae, which meant that all were contributing to the

alcoholic fermentation. The global genomic analysis performed by rep-PCR allowed us to

obtain differential patterns that were inter and intraspecific, although it was not possible to

predict the productive behavior of the isolates by this analysis, nonetheless this technique can

be used for fingerprinting of the isolates and to track their presence during the fermentation.

This work is to our knowledge the first report of global molecular and productive

characterization of all the yeast involved in the production of Tamaulipas´ mezcal.

(15)

1. INTRODUCCIÓN

Las bebidas elaboradas mediante la fermentación alcohólica han sido producidas por el

hombre desde hace miles del años, acompañando el proceso de construcción de las

civilizaciones. En la actualidad su consumo genera una importante fuente de divisas para

los países que las producen. Entre las bebidas alcohólicas más importantes se tiene a la

cerveza, el vino y las bebidas destiladas como el whisky, el ron y el tequila. La cerveza es

elaborada a partir de la fermentación de cereales malteados, mientras que el vino, mezcal y

tequila son producidos por la fermentación del jugo de frutas y agave, respectivamente. La

destilación de bebidas malteadas producen el whiskey, el vino destilado produce el brandy,

la destilación de melazas de caña de azúcar fermentadas producen el ron y la destilación del

fermentado de cereales y bayas de enebro producen la ginebra. En cualquiera de los casos,

la etapa más importante en la producción de estas bebidas es la fermentación, proceso en el

cual los azucares son transformados en etanol por levaduras principalmente de la especie

Saccharomyces cerevisiae. Esta se encuentra involucrada en todas las etapas de

fermentación desde el inicio de esta hasta su terminación, siendo la más tolerante a altas

concentraciones de etanol. El tequila y el mezcal se elaboran por fermentación alcohólica

utilizando levaduras capaces de realizar la biotransformación de la glucosa a etanol y

bióxido de carbono. En México existen diferentes especies de Agave con los cuales se

elaboran bebidas alcohólicas , tales como el Agave tequilana con el cual se elabora el

tequila, Agave salmiana y Agave angustifolia con los que se elabora el mezcal, el Agave

maximiliana con el que se elabora el sotol, además de que existen otras especies como el

Dacilirium con el cual se elabora la raicilla. El proceso de elaboración del mezcal es

rudimentario y generalmente se realiza en cinco etapas: jimado, cocción, molienda,

fermentación y destilación. A pesar de que México por denominación de origen es el único

productor de mezcal y tequila, la mayoría de las investigaciones a cerca de las levaduras

involucradas en la fermentación de estas bebidas son en el tequila aunque los dos son

elaborados bajo los mismos principios, por lo que existe una escasa información de las

levaduras que participan en la fermentación del mezcal de Tamaulipas, en especial de

aquellas que le dan sus características organolépticas distintivas.

(16)

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. ANTECEDENTES

Dada la importancia que las bebidas fermentadas presentan tanto desde el punto de vista

científico como económico, y debido al papel fundamental que juegan las levaduras y

bacterias en éste proceso, a continuación se presentan los aspectos biológicos más

importantes relacionados con la bebida alcohólica más estudiada: el vino, y la información

existente del producto más emblemático de nuestro país: el tequila. Para ello en la presente

revisión se analizan los siguientes aspectos: la bioquímica y la biología de la fermentación

alcohólica del vino; las sucesiones microbianas durante la fermentación alcohólica y su

metodología de estudio, y el proceso de elaboración del tequila y del mezcal.

2.1. Bioquímica y biología del proceso de fermentación del vino

La fermentación alcohólica por definición es el proceso bioquímico de extracción de

energía en el cual compuestos orgánicos sirven tanto de donador (piruvato) como aceptor

(NAD

+

) de electrones, teniendo como productos el etanol y bióxido de carbono.

C

6

H

12

O

6

2 CH

3

CH

2

OH + 2 CO

2

+ 2 ATP + ∆

El alcohol etílico (etanol, C

2

H

5

OH) es producido por microorganismos (levaduras y

bacterias) durante un proceso que no requiere la participación del oxígeno (anaerobio). Este

etanol es la base de la producción de bebidas alcohólicas complejas, sin embargo, también

tiene usos como solvente industrial y como aditivo para la gasolina, entre otros. Dicha

fermentación comienza con el transporte de azúcares a través de la membrana y su

metabolización por la vía glucolítica (Embden-Meyerhof-Parnas principalmente). Las

levaduras son principalmente los microorganismos involucrados en la producción de etanol,

estos son anaerobios facultativos, lo que significa que pueden vivir sin oxigeno; cuando hay

oxigeno lo utilizan para oxidar la glucosa completamente y de esa manera obtener ATP

(respiración). En condiciones anaerobias ellas pueden transforman la glucosa en acido

pirúvico siguiendo la secuencia de reacciones que conlleva la glucólisis, como se muestra

en la figura 1.

(17)

Figura 1. Rutas metabólicas aerobias y anaerobias de la degradación de la glucosa y su excresión como

etanol, glicerol y acetato en Saccharomyces cerevisiae.

El segundo mayor producto derivado de la fermentación alcohólica producido por S.

cerevisiae es el glicerol. Esta molécula es sintetizada a partir de la dihidroxiacetona fosfato,

un intermediario de la glucólisis. Este compuesto es reducido por la enzima Gdp

GLUCOSA GLUCOSA 6-P FRUCTOSA 6-P GLICERALDEHIDO 3-P DIHIDROXIACETONA-P GLICEROL 3-P GLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO PIRUVATO OXALACETATO ACETALDEHIDO ETANOL PIRUVATO ACETATO SERINA GLICINA TREONINA ACETATO ACETIL-CoA ALANINA BIOMASA BIOMASA BIOMASA ALANINA BIOMASA BIOMASA BIOMASA PENTOSA 5-P BIOMASA MEDIO CITOSOL α-KETOGLUTARATO SUCCINATO OXALACETATO MALATO MITOCONDRIA ACETIL-CoA

(18)

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

(dependiente de NAD-glicerol 3-fosfato deshidrogenasa) a glicerol 3-fosfato el cual es

desfosforilado por la enzima Gpp (dependiente de NAD-glicerol 3-fosfato fosfatasa) a

glicerol el cual puede ser usado por la levadura como fuente de carbono y energía, así como

para proteger a la célula contra altas temperaturas, estrés oxidativo y estrés hiperosmotico

acumulándose intracelularmente en células que son expuestas a decreciente actividad de

agua extracelular. (Folch-Mallol et al., 2004).

Las bebidas alcohólicas son elaboradas por bioconversión o biotransformación de la

glucosa en etanol (fermentación), proceso que es llevado a cabo mediante una serie de

reacciones químicas realizadas por levaduras y bacterias específicas como parte de su

metabolismo de producción de energía, cuyo rendimiento varía según el microorganismo

involucrado y sus capacidades metabólicas específicas, como por ejemplo el trabajo

realizado por Sánchez et al., (2005) quienes compararon la secuencia glucolítica de

Debaryomyces hansenii y S. cerevisiae, observando que S. cerevisiae produjo

aproximadamente cuatro veces mas etanol que D. hansenii. La relación entre el consumo de

glucosa y la producción de etanol fue casi 3 veces más alta que en D. hansenii.

La fermentación del jugo de uva (mejor conocido como mosto) es realizada por una serie

de interacciones entre microorganismos en los cuales están involucradas bacterias,

levaduras, hongos e incluso virus, y éstas determinan el perfil ecológico de la producción y

tiene influencias positivas o negativas en el sabor del vino. La producción de etanol durante

la fermentación es principalmente llevada a cabo por la levadura Saccharomyces cerevisiae,

la cual se encuentra de manera natural en los mostos de uva (Fleet et al., 1984), y juega un

papel central debido a sus capacidades metabólicas en el proceso de fermentación de

mostos (Zagorc et al., 2001).

Las levaduras generalmente se originan de la micoflora epifítica natural de las uvas, de la

flora asociada con la superficie de los equipos de vinería y los cultivos iniciadores que son

añadidos. Los hongos filamentosos se encuentran en la producción del vino en varias etapas

durante la serie de operaciones, y su principal impacto más importante tiene lugar durante

(19)

el cultivo, ya que pueden causar la pudrición de la cosecha, especialmente la provocada por

Botrytis cinerea (Fleet, 2003).

Un importante fenómeno ocurre con algunas cepas de levaduras, las cuales secretan

proteínas o glicoproteínas tóxicas que son letales para cepas sensibles de diferentes

especies, por lo que se han denominado levaduras killer ó zimocidas (Zagorc et al., 2001).

La actividad killer ha sido encontrada en los géneros Saccharomyces, Candida,

Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Willopsis y

Zygosaccharomyces y han sido aisladas de muchos nichos ambientales como lagos, ríos,

frutas y vegetales así como de la fermentación de varios alimentos y bebidas. El interés

ecológico en este tipo de levaduras deriva debido a que cuando están presentes pueden

dominar el proceso de fermentación, cuando poseen características enológicas positivas

pueden ser usadas como inoculo inicial y producir una bebida de excelente calidad.

En un estudio del vino realizado por Versavaud et al. (1995) en cuanto a la diversidad

genética de S. cerevisiae, los autores concluyen que la fermentación espontánea es iniciada

por algunas especies tales como: Kloeckera apiculata, Candida famata, Rhodotorula sp.,

Metschnikowia pulcherrima y Saccharomyces cerevisise y que esta última se encuentra

presente en todas las etapas de fermentación desde el inicio hasta el final de esta. Los

autores detectaron 14 cepas killer de las cuales solamente 4 cepas fueron resistentes a la

toxina K2, y 10 fueron sensibles, mientras que las cepas asociadas fueron neutrales. La

cepa predominante fue S. cerevisiae y era del tipo killer 2 con la asociación de cepas que

generalmente eran neutrales y algunas sensibles.

2.2. Las sucesiones microbianas en el vino y sus técnicas de estudio

La calidad final del vino es determinada por toda esta gama de microorganismos los cuales

están presentes en diferentes cantidades en los mostos y que se desarrollan durante la

fermentación, determinando en gran medida la cantidad y tipos de las muchas substancias

que contribuyen en el olor, color y sabor característico de esta bebida (Fleet et al., 1984).

(20)

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Tradicionalmente la elaboración del vino es realizada de forma espontánea por las

levaduras presentes en las uvas y en los tanques o quipo de vinería. Por lo general las

especies de Hanseniaspora (y su anamorfo Kloeckera), Metschnikowia, Pichia y Candida

crecen durante las etapas tempranas de fermentación, pero comienzan a perecer conforme

progresa la fermentación y comienza a aparece en mayor proporción la especie S.

cerevisiae. Esta levadura no es predominante en la micoflora epifitica de la uva, ya que

generalmente se encuentra en concentraciones de 10 a 100 CFU/gr. Sin embargo, conforme

la fermentación avanza, aparece en mayor proporción y se incrementa hasta llegar al final

del proceso como prácticamente la única levadura presente en forma activa (Fleet, 2003).

Generalmente las cepas de Hanseniaspora (Kloeckera), Candida y Metschnikowia inician

la fermentación y éstas se originan de las uvas. Algunas veces las especies Pichia,

Issatchenkia y Kluyveromyces pueden tener crecimiento en estas etapas y llegan a alcanzar

hasta 10

6

o 10

7

CFU/ml a la mitad de la fermentación, pero empiezan a declinar hasta

morir, durante este tiempo S. cerevisiae se vuelve predominante (10

7

-10

8

CFU/ml) y

continua la fermentación hasta que esta termina (Fleet, 2003).

La producción de etanol por S. cerevisiae es considerado el factor que gobierna el

crecimiento microbiano e influencia a las especies no-Saccharomycetaceas durante la

fermentación. Por lo general las especies Hanseniaspora (Kloeckera), Candida,

Metschnikowia, Pichia, Issatchenkia y Kluyveromyces se encuentran en el jugo y no son

tolerantes al etanol cuando este supera 5 a 7 % , lo cual explica que declinen y mueran

conforme avanza la fermentación, poco después de iniciada la etapa exponencial del

proceso (Fleet, 2003).

Las levaduras nativas son requeridas para la producción del vino en específicos ambientes

característicos de cada región (Araujo et al., 1998). Los autores concluyen que las especies

de S. cerevisiae y S. rouxii son las especies que prevalecen durante la fermentación del vino

en el estado de Zulia (Venezuela).

(21)

Las presencia de bacterias también tienen influencias positivas (y negativas, dependiendo

de las especies presentes) en la producción de bebidas alcohólicas. Estas contribuciones

pueden ser moderadas por interacciones con levaduras. Los dos grupos principales de

bacterias que son importantes en la microbiología del vino son las bacterias acidolácticas y

las bacterias acidoacéticas (Fleet, 2003). Dentro de las bacterias acidolácticas los géneros

Lactobacillus y Pediococcus son las más relevantes y junto con Oenococcus oeni conducen

la fermentación maloláctica. Mientras que entre las bacterias acidoacéticas se encuentran

Acetobacter aceti, Pasteurianus y Gluconobacter oxidans. Esta fermentación es siempre

negativa dentro del proceso de producción de vino.

La fermentación maloláctica es la segunda fermentación más importante que ocurre en

muchos vinos generalmente de 2 a 3 semanas después de la terminación de la fermentación

alcohólica. La principal bacteria responsable de esta fermentación es O. oeni, durante esta

fermentación funciona para incrementar la acidez del vino por transformación del acido

málico en acido láctico aumentando el sabor y complejidad del vino (Fleet, 2003).

La mayoría de los estudios para identificar las especies de levaduras que aparecen en el

proceso de fermentación generalmente están basados en la morfología comparativa,

cultivos e identificación utilizando algunos criterios bioquímicos, la fisiología y la genética

convencional de estas especies pero estas técnicas son tardadas y generalmente solo se

puede identificar hasta el nivel de género. Es por eso que en algunos estudios se han

utilizado técnicas basadas en el ADN.

Las principales técnicas empleadas para identificar levaduras de la fermentación se

describen a continuación, haciendo énfasis en su utilización en vino y tequila.

2.2.1. Electroforesis en gel de campos pulsados

La metodología de campos pulsados permite analizar el ADN genómico de levaduras para

diferenciar en una misma especie, si los microorganismos analizados son iguales (clones) o

no (policlonales). La técnica consiste en una variación de la electroforesis hecha en un gel

de agarosa, en donde la orientación del campo eléctrico a través del gel se cambia

(22)

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

periódicamente, en vez de mantenerse constante. Esto permite que fragmentos grandes de

ADN se separen por tamaño, en forma efectiva. Esta técnica fue usada por Versavaud et al.

(1995) para identificar la diversidad genética de cepas nativas de S. cerevisiae.

2.2.2. Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt)

Esta técnica está basada en el contenido de G+C existente en el ADN nuclear (ADNn) en

comparación con el del ADN mitocondrial, el ADNn tiene aproximadamente un 40% de

contenido de G+C mientras que el ADNmt tiene solamente el 20 % por lo tanto, si se

utilizan enzimas de corte específico para regiones ricas en G+C puede separarse debido a

que el ADNn sería cortado en pequeños fragmentos no detectables en el gel de agarosa

mientras que el ADNmt produciría fragmentos de mayor tamaño detectables en el gel de

agarosa. En un estudio realizado por Sabate et al. (1998) se analizó la diversidad de cepas

de S. cerevisiae en la fermentación de vino usando esta técnica, y encontraron una gran

diversidad de cepas nativas de S. cerevisiae. Concluyen que S. cerevisiae es la

predominante durante la fermentación sin embargo en algunos otros estudios tienden a

confundirla y clasificarla incorrectamente como S. bayanus.

2.2.3. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción del ADN

(RFLP)

La técnica de RFLP se basa en el polimorfismo del ADN cuando es digerido con enzimas

de restricción, lo cual visualizado en un gel de electroforesis, produce un patrón de bandas

polimórficas de diferentes tamaños. Debido a que los cortes generados con estas enzimas

difieren entre un organismo y otro por la distancia entre el sitio de corte, Zagorc et al.

(2001), usaron esta técnica para identificar levaduras zimocidas (killer) de aislamientos de

levaduras de vino.

2.2.4. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP)

Esta técnica combina el uso de la PCR y los RFLP, y consiste en cortar el ADN con dos

enzimas de restricción, una de corte frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los

fragmentos se les ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas usadas,

(23)

se amplifica por PCR probando diferentes combinaciones de complementariedad del

oligonucleótido con el sitio de restricción, con lo cual se puede disminuir o aumentar el

número de bandas amplificadas y comparar su polimorfismo generado. Una ventaja

especial de esta técnica es que es capaz de generar muchos marcadores moleculares en una

sola reacción, por lo que deben visualizarse en un gel de poliacrilamida de alta resolución.

Esta técnica fue usada para comparar las levaduras del genero Saccharomyces de mostos de

agave (Flores-Berrios et al., 2005). Los autores encontraron cuatro diferentes especies de

este género (S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, y S. paradoxus) y el agrupamiento de

los aislamientos de acuerdo al proceso de donde fueron aisladas.

2.2.5. Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Con esta técnica se pueden analizar células o tejidos completos, para la cual son

primeramente fijados e hibridados con sondas específicas para los genes 18S o 28S del

ADNr marcadas con algún fluorocromo. Posteriormente las células marcadas pueden verse

a un microscopio óptico de fluorescencia. Con este método y gracias a que las células

completas se hibridan se evitan artefactos generados por sesgos en la extracción de ADN,

amplificación por PCR y clonación. Xufre et al. (2006) utilizaron esta técnica para analizar

poblaciones dinámicas de levaduras en mostos de uva a nivel laboratorio. En su estudio

muestran la identificación exacta mediante esta técnica de las especies presentes en la

fermentación y concluyen que las especies Candida stellata, Torulaspora delbrueckii y

Kluyveromyces spp. Deben también ser tomadas en cuentas como inóculos iniciales ya que

tienen influencias positivas en el sabor del vino.

En el cuadro 1 se muestran a las principales levaduras y bacterias que han sido identificadas

en los mostos de uva y de agave con las diferentes técnicas moleculares descritas

anteriormente. En el se presentan las diferentes etapas de fermentación en el cual aparecen

estas especies y como al transcurrir el tiempo y pasar las diferentes fases de fermentación la

mayoría de las especies que se encuentran en los mostos desaparecen permaneciendo

solamente las mas aptas a altas concentraciones de etanol.

(24)

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Cuadro 1. Levaduras y bacterias que han sido identificadas de mostos de Vitis vinifera y de Agave spp.

Microorganismo

Tipo de mosto Etapa de fermentación

Fermentación

maloláctica Autor Uva Agave Exponencial

temprana Exponencial tardía Estacionaria

Kloeckera

XXX

XX

X

Ø

1,3,7,11,13

Torulopsis stellata

XXX

XX

X

Ø

1 Saccharomyces

cerevisiae

X

XX

XXX

Ø

1,2,3,4,5,6,

7,8,9,10,11

,12,13

S. bayanus

Ø

X

XX

Ø

8,9

S. pastorianus

Ø

X

XX

Ø

9 S. paradoxus

Ø

X

XX

Ø

9 S. rouxii

X

Ø

X

XX

Ø

4 Hanseniaspora

XXX

Ø

X

Ø

3,6,10

Metschnikowia

XXX

Ø

X

Ø

3,7

Torulaspora

XX

X

Ø

10,12

Candida sp

XXX

X

Ø

3,6,7,10,11

,13,12

Rhodotorula

XX

X

Ø

7,12

Cryptococcus

XX

Ø

X

Ø

6 Pichia

XXX

X

Ø

3,6,10

Willopsis

XX

Ø

X

Ø

6 Kluyveromyces

XXX

X

Ø

3,6,10,12

Debaryomyces

XXX

X

Ø

6,12

Zygosaccharomyces

XX

Ø

X

Ø

6 Issatchenkia

XX

X

Ø

3,12

Lactobacillus

X

Ø

X

XX

XXX

3 Pediococcus

X

Ø

X

XX

XXX

3 Oenococcus

X

Ø

X

XX

XXX

3 Acetobacter

X

Ø

X

XX

XXX

3 Gluconobacter

X

Ø

X

XX

XXX

3 Ø. Ausente, X. Escaso, XX. Moderado, XXX. Abundante.

Tomado de:

1

Fleet et al., (1984),

2

Zagorc et al,. (2001),

3

Fleet (2003),

4

Araujo et al., (1998),

5

Sánchez et al.,

(2005),

6

Versavaud et al., (1995),

7

Cronwright et al., (2002),

8

Sabate et al., (1998),

9

Flores-Berrios et al.,

(2005),

10

Xufre et al., (2006),

11

Arrizon et al., (2006),

12

Jacques et al., (2006),

13

Fiore et al., (2005).

Otra técnica rápida que ha sido usada recientemente es el polimorfismo en la conformación

de cadena sencilla (SSCP) la cual ha mostrado ser una técnica muy poderosa logrando

encontrar diferencias en especies las cuales tiene un cambio en un solo nucleótido. Esta

técnica puede ser usada con fragmentos relativamente cortos de aproximadamente 200 pb

(Qui-Ming et al., 2008), y permite encontrar diferencias en algunas especies de

Saccharomyces y Candida debido a la migración de fragmentos amplificados de la región

(25)

2.3. El proceso de elaboración del mezcal y tequila

El mezcal y el tequila son bebidas alcohólicas elaboradas en México por fermentación y

destilación del jugo de algunas plantas de Agave tales como A. salmiana, A. angustifolia, A.

tequilana y A. potatorum (Flores et al., 2005). El mezcal es una bebida alcohólica regional

obtenida por destilación y fermentación de mostos preparados directa y originalmente con

los azucares extraídos de las piñas maduras del Agave, las cuales son previamente cocidas

para hidrolizar los azúcares, y son sometidas a fermentación alcohólica, con inóculos

espontáneos o comerciales de levaduras. Generalmente el proceso es dividido en cinco

diferentes fases: el jimado, el cocimiento de la piña, la extracción del mosto, la

fermentación y la destilación.

2.3.1. El jimado

En esta etapa es en la cual se cortan las pencas (Fig. 2) para dejar solo la piña, la cual

después es rasurada para eliminar la raíz y todo lo que le pueda dar sabor desagradable al

mezcal. Una vez obtenida la piña se lleva al horno de cocción.

Figura 2. La figura muestra la recolección de las piñas y su posterior raspado o jimado de las partes que le

dan un sabor desagradable al mezcal.

2.3.2. Cocción

La cocción se lleva a cabo para hidrolizar o transformar la inulina, el principal polisacárido

presente en la piña de las plantas de agave. La inulina es convertida en azúcares libres,

principalmente fructosa, para su posterior fermentación (Mancilla y Margalli 2002). A la

(26)

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

reacción que ocurre durante el calentamiento de las piñas de agave se le denomina reacción

de Maillard, y es un conjunto de reacciones químicas que se producen entre las proteínas y

azúcares reductores cuando este se calienta aunque no sea a altas temperaturas. Los

productos mayoritarios de estas reacciones son moléculas cíclicas y poli cíclicas, que

aportan sabor y aroma al mezcal y tequila. La cocción se realiza en un horno construido a

partir de un agujero cavado en la tierra (Fig. 3) y recubierto con piedras al rojo vivo

después de haber colocado en su fondo las piñas, ó en autoclaves industriales.

Figura 3. Horno de cocción en el suelo de las piñas de agave

2.3.3. Molienda: obtención del mosto

La molienda tiene como finalidad hacer que los monosacáridos obtenidos en la cocción

estén más disponibles a la acción microbiana, así como a la captación de microorganismos

del medio para favorecer la fermentación. La molienda se lleva a cabo generalmente

utilizando un “trapiche” (Fig. 4). Este esta hecho de madera con 2 troncos unidos

simulando los engranes, y dos troncos largos amarrados que son jalados por dos caballos.

En versiones industrializadas, molinos de martillo o de tornillo sinfín realizan la extracción

del mosto.

(27)

Figura 4. Trapiche rústico con el cual se muelen las piñas de agave

2.3.4. Fermentación

Es el proceso en el que las levaduras transforman los monosacáridos del Agave en etanol

por medio de la fermentación alcohólica. Esta operación se lleva a cabo en tinas abiertas, de

madera (Fig. 5) durante un tiempo aproximado de ocho a diez días, tomando en

consideración la temperatura ambiente. Puede usarse como inóculo el remanente de la

fermentación anterior que se deja en el fondo, o inocular con cepas de levaduras

comerciales.

Figura 5. Tanque de fermentación rústico en Tamaulipas

2.3.5. Destilación

En esta operación se efectúa la separación del alcohol del resto del mosto fermentado

aprovechando para ello sus diferentes puntos de ebullición. El etanol, debido a su estructura

(28)

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

molecular, tiene un punto de ebullición más bajo que el agua (78.5

o

C a nivel del mar), por

lo tanto, se separa de ésta al alcanzar esta temperatura. El dispositivo utilizado para la

destilación tradicional es el alambique (Fig. 6) Este equipo está conformado por cuatro

elementos fabricados en cobre debido a su alta conductividad térmica, de tal forma que

facilita la transferencia de calor calentándose y enfriándose fácilmente alcanzando así la

temperatura apropiada de separación. En versiones industriales, se puede utilizar una torre

de platos. Durante la destilación también se separan otros compuestos volátiles tales como

el acetaldehído, etil acetato, metanol, n-propanol, isobutanol, alcohol amílico y alcoholes

superiores (Arrizon et al., 2006).

Figura 6. Destilador rustico utilizado para destilar el mosto fermentado.

Todas estas etapas determinarán la calidad final del producto a obtener, sin embargo, se

sabe que las más importantes son la fermentación y la destilación.

(29)

3. JUSTIFICACIÓN

Las levaduras son las responsables de la fermentación de los mostos de Agave, es decir

gracias a ellas la fructosa que se encuentra en la piña de esta planta es transformada en

etanol y otros compuestos que le dan sabor al mezcal y al tequila, sin embargo las mayoría

de las investigaciones que se han realizado acerca de las bebidas alcohólicas que se

elaboran en México son sobre el tequila y esta información no puede ser extrapolada al

mezcal ya que no utilizan las mismas plantas de Agave.

México por denominación de origen es el único productor de mezcal el cual tiene una

importancia económica para los estados donde se elabora, además de ser una bebida típica

artesanal del país por lo que hace falta realizar más investigaciones acerca de las levaduras

que se encuentran involucradas en la fermentación del mezcal.

En Tamaulipas el mezcal se elabora en los municipios de San Carlos, Jiménez, Bustamante,

Palmillas, Miquihuana, Méndez, San Nicolás, Jaumave y Cruillas este deja importantes

ganancias económicas para los productores. Como en todos los productos de producción

bebidas alcohólicas, la levadura S. cerevisiae es la mas importante durante el proceso de

fermentación, de ahí la importancia de aislar levaduras con una alta productividad de

etanol que podrían ser utilizadas como inoculo inicial para producir un mezcal con

excelente calidad ayudando a los productores a competir mejor en el mercado. En este

trabajo se propone realizar una caracterización genética de levaduras aisladas durante la

fase exponencial de producción de mezcal, y determinar si existe una relación entre los

niveles de productividad de etanol y el perfil genético determinado a nivel genómico.

(30)

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. HIPÓTESIS

La productividad de etanol de una población de levaduras está relacionada con su

diversidad genética.

5. OBJETIVO GENERAL

Caracterizar genética y productivamente a las levaduras involucradas en la fermentación

del mezcal.

6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar genéticamente y caracterizar morfológicamente a las levaduras presentes

en los mostos de mezcal tamaulipeco.

Caracterizar la productividad alcohólica de las levaduras.

Caracterizar la diversidad genética de las levaduras mediante una técnica de análisis

global de su ADN.

(31)

7. MATERIALES Y MÉTODOS

7.1. Levaduras

Las levaduras utilizadas en este trabajo pertenecen a la colección del Laboratorio de

Biotecnología Industrial y fueron aisladas de fermentaciones de la vinata en el ejido “El

Palmar” en el municipio de San Nicolás Tamaulipas donde se produce el mezcal. La

imagen de satélite (Fig. 7) muestra la localización de dicha vinata.

Figura 7. Ubicación geográfica del Ejido El Palmar lugar donde se colectaron las levaduras con la que se

llevo a cabo este trabajo.

Un total de 51 aislamientos fueron obtenidos los cuales fueron primeramente caracterizados

de acuerdo a la forma de la célula separándolas de esta manera en dos grupos: morfología

redonda u ovalada (Cuadro 2) y las cuales fueron aisladas de diferentes etapas de la

fermentación, la cual fue caracterizada por la concentración de azúcares presentes en el

momento del muestreo, con lo cual les fue asignada una clave.

7.1.1. Conservación de las levaduras en glicerol

Todas los aislamientos fueron crecidos hasta la mitad de la fase exponencial en caldo YPF,

y se diluyó con glicerol estéril hasta una concentración final de glicerol del 86%, y

almacenadas a -70 °C.

(32)

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7.2. Extracción de ADN de las levaduras

Las cepas se cultivaron en medio YPDA (Extracto de levadura 5 g L

-1

; peptona 3 g L

-1

;

glucosa 20 g L

-1

; agar 20 g L-1) y se colocaron en el agitador orbital durante 18 horas a 30

°C y 250 rpm. Se utilizó el protocolo de extracción de ADN propuesto por Raeder y Broda

(1985) con las siguientes modificaciones: Se colocaron de 40 a 50 mg de la muestra de

levaduras en tubos eppendorf estériles y se sumergieron en nitrógeno líquido por 20

minutos, posteriormente se maceraron con un pistilo estéril. Se agregó 500 µl de solución

amortiguadora de extracción (200 mM de Tris HCl pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM de

EDTA y 0.5% de SDS) y se incubó por 10 minutos, posteriormente se añadieron 500 µl de

fenol-cloroformo mezclando en vortex por 5 minutos y se centrifugó a 13,000 rpm durante

30 minutos. La fase acuosa fue transferida a otro tubo adicionando 400 µl de cloroformo

frío mezclando durante un minuto seguido de centrifugación a 13,000 rpm por 5 minutos y

transfiriendo a un nuevo tubo, adicionando 8 µl de RNAsa e incubando a 37 °C,

posteriormente se adicionan 500 µl de isopropanol frío mezclando por inversión ligera e

incubando a -20 °C por 15 minutos y centrifugando por 5 minutos a 13,000 rpm, el

sobrenadante fue desechado y se agregaron 500 µl de etanol al 70% mezclando por

inversión y centrifugando, de igual manera el sobrenadante fue desechado y el tubo fue

colocado boca abajo en papel secante para que se evaporara el etanol durante

aproximadamente 30 minutos. La pastilla fue re suspendida en 50 µl de agua estéril. El

ADN obtenido fue visualizado en un gel de agarosa al 1.0% teñido con SyberGold™ 10X.

7.2.1. Identificación molecular de las levaduras

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue utilizada para

amplificar regiones utilizadas para identificar a nivel de especie a las levaduras utilizadas

en este trabajo. En Saccharomyces cerevisiae como en todos los hongos existen cuatro

regiones de ADNr (5S, 5.8S, 18S y 26S) y están agrupados en arreglos de cabeza a cola

formando un grupo sencillo que se ubica en el cromosoma 12. Los genes 18S y 26S se

encuentran separados por los espaciadores internos (ITS) (Fig. 8) los cuales no son

secuencias codificantes excepto por los genes pequeños 5S y 5.8S (Montrocher et al. 1998).

(33)

Figura 8. Esquema de la región ribosomal elaborado con la secuencia Saccharomyces cerevisiae

(EU649672) que involucra las regiones 18S (SSrDNA), 5.8S y 26S (LSrDNA), además de las regiones no

codificantes ITS1 e ITS2, la localización de los oligonucleótidos utilizados en este trabajo y el tamaño de los

fragmentos esperados.

La amplificación por PCR de estas regiones mostró una similaridad en el tamaño de las

bandas que para la región 26S las cuales fueron de aproximadamente 800 pb mientras que

en el caso de la región ITS mostró más diferencias encontrando bandas que iban desde 500

hasta 800 pb (Fig. 9 y 10).

Se amplificó la región 26S y la ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg utilizando los oligonucleótidos

reportados por White et al., (1990): NL1 (5’ GCATTCAATAAGCGGAGGAAAAG 3’) y

NL4 (5’ GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3’) para la región 26S y los oligonucleótidos ITS1

(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’) e ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’) para

la región ITS1-5.8S-ITS2. La reacción se llevó a cabo en un termociclador (Perkin Elmer

GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems). Las reacciones se realizaron en un

volumen final de 25 μl, utilizando 1 μl del ADN, 2.5 μl de Buffer 10X, 0.75 μl de cloruro

de magnesio de 25 mM, 0.2 μl de dNTPs 10 mM, 1 μl de cada uno de iniciadores 5 μM y

0.2 μl de la enzima Taq DNA polimerasa 5 U/5μl y completando el volumen a 25 μl con

agua milliQ estéril. El programa que se utilizó consistió de 1 ciclo de desnaturalización por

5 min a 94ºC y 35 ciclos de 30 seg a 94ºC, 30 seg a 59 ºC para ITS o 63 ºC para 26S y 1

min a 72ºC. Finalmente se dio un paso de extensión final a 10 min a 72ºC. Posteriormente

los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% mezclando 5 μl del

producto de PCR con 3 μl de SyberGold™ y depositándolos en el gel el cual se corrió en

una cámara de electroforesis de la marca Bio-Rad a 100V por 30 min. De igual manera los

productos de PCR fueron visualizado en un gel de agarosa al 1.0% teñido con SyberGold™

10X, grabando la imagen del gel en el programa Kodak digital ScienceTM 1D (Figs. 8 y 9).

Los productos de PCR fueron purificados con el Kit comercial Wizard SV and PCR clean

(34)

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

las regiones amplificadas se muestra a continuación donde además se puede observar el

tamaño del fragmento obtenido el cual para la región 26S fue de aproximadamente 800 pb,

mientras que para la región ITS1-5.8S-ITS2 fue de entre 300 y 700 pb.

Figura 9. Amplificación por PCR de la región 26S M. marcador de peso molecular, muestras 1-16 levaduras

con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo.

Figura 10. Productos de PCR de la región ITS1-5.8-ITS2 M. marcador de peso molecular, muestras 1-13

levaduras con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo.

7.2.2. Secuenciación de la región 26S e ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg

Los fragmentos amplificados por PCR una vez que ya habían sido purificados se procedió a

su secuenciación utilizando el secuenciador automático de capilar ABI Prism (Applied

800pb

700pb

300pb

700pb

300pb

(35)

Biosystem

Modelo

3130)

con

los

siguientes

oligonucleótidos:

NL1

(5’GCATTCAATAAGCGGAGGAAAAG3’) forward para la región 26S, y el ITS1

(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’) forward para la región ITS. Las reacciones de

secuenciación se realizaron como sigue. Los productos de PCR purificados fueron

nuevamente amplificados utilizando la siguiente reacción: 4 μl de Buffer big dye v 3.1 5X,

1 μl de iniciador, 4 μl de Big dye v 3.1 ready mix, 2 μl del producto de PCR, 9 μl de agua

esteril milliq para un volumen final de 20 μl. Las condiciones de PCR fueron 1 ciclo de 96

°C por 1 minuto, seguido de 25 ciclos a 96 °C 10 segundos, 59 °C para los ITS o 63 °C

para los 26S y 60 °C durante 4 min. Posteriormente la reacción de secuenciación fue

purificada adicionando 2 μl de EDTA 125mM, 2 μl de NaOAC 3M pH 5.2 y 50 μl de

etanol absoluto Merck mezclando suavemente e incubando a -20 °C durante 20 minutos y

centrifugando a 14000 rpm por 15 minutos a 4 °C, se hizo un segundo lavado con 70 μl de

etanol al 70% mezclando, incubando y centrifugando como en el paso anterior, secando la

pastilla utilizando un termo-mixer (Eppendorf) durante aproximadamente 30 minutos,

posteriormente fueron secuenciadas en el Área de Biotecnología del CBG.

Una vez obtenidas las secuencias, estas se alinearon en la base de datos BLAST del NCBI

para su comparación e identificación, se seleccionaron las secuencias de referencia con las

cuales tenían similitud, posteriormente se elaboraron los árboles de distancias génicas con

las dos regiones usando el método Neighbor-Joining Saitou et al (1987) con un bootstrap

de 1000 replicas, la distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum

Composite Likelihood, también se estimo la divergencia evolutiva entre secuencias usando

el método Maximum Composite Likelihood dato no mostrado, todo este análisis

filogenético fue elaborado en el programa MEGA4 (Tamura et al., 2007).

7.3. Cálculo de los índices de diversidad de la fermentación del mezcal

Para conocer la diversidad de las especies y poblaciones involucradas en la fermentación

del mezcal, se calcularon los índices de diversidad y dominancia de Simpson, así como el

índice de Shannon, de acuerdo a las siguientes fórmulas:

Índice de dominancia de Simpson