Paloma Fernández Freire
COMPUESTOS QUÍMICOS
Aplicación de un modelo celular para la evaluación
de la citotoxicidad de compuestos químicos
Memoria presentada por Paloma Fernández Freire para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas
por la Universidad Autónoma de Madrid
Trabajo dirigido por la Dra. Mª José Hazen de San Juan Profesora Titular del área de Biología celular
2008
La Dra. Mª José Hazen de San Juan, profesora titular del Departamento de Biología de la Universidad Autónoma de Madrid, certifica que Paloma Fernández Freire ha realizado el trabajo “Aplicación de un modelo celular para la evaluación de la citotoxicidad de compuestos químicos” bajo su dirección.
Madrid, marzo de 2008
Firmado:
Dra. Mª José Hazen
sayos in vitro aplicable a la evaluación del riesgo ecotóxico de sustancias y a la caracteri- zación de residuos. CICYT AMB99-0279.
- Desarrollo y optimización de una estrategia de ensayos in vitro para la evaluación toxico- lógica de mezclas de contaminantes ambien- tales. CICYT CTM2005-02135/TECNO.
- Evaluación in vitro del potencial citotóxico de mezclas dee contaminantes ambientales presentes en aguas de uso humano. UAM-CM CCG06-UAM/AMB-0186.
licenciado y doctor, y entonces, aunque no vuele, lo considerarán.”
Memorial del Convento, 1989.
Llevar a cabo esta tesis ha sido lo más complicado con lo que me he enfrentado hasta el momento, pero afor tunada- mente no lo he realizado sola. Hay mucha gente que ha par ticipado en distintos aspectos y a la que tengo mucho que agradecer.
La Dra. María José Hazen me acogió en su laboratorio y me dio la opor tunidad de realizar el trabajo de investigación que fue el inicio y origen de esta Tesis. Por esa opor tunidad y por confiar en mí para llevar a cabo su idea le estoy pro- fundamente agradecida.
También estoy agradecida al Depar tamento de Biología y, en especial al área de Citología e Histología de la Universidad Autónoma de Madrid, en la que he par ticipado como profesor ayudante durante estos años y me ha permitido llevar a cabo mi labor investigadora y docente. Me gustaría dejar constancia de un agradecimiento y recuerdo muy especial a Charo Armas que, desde que entré por primera vez en el pasillo de Citología e Histología, me hizo sentir siempre cómoda e integrada, mostrándose muy cercana y tratándome como una igual. La vida es muy injusta a veces.
Las personas que integran el Grupo de Toxicología Celular deberían ser, como poco, coautores de este trabajo. Sin ellos no habría sido posible, al menos tal y como ha sido. José Manuel Pérez Mar tín ha estado conmigo desde mis primeros pasos por esta facultad, apor tándome siempre su punto de vista, su apoyo y estando siempre dispuesto a explicarme pacientemente la utilidad de la estadística. Verónica Labrador Cantarero ha sido mi compañera y amiga dentro y fuera de la Universidad. Por el legado de dentro, sin el cual todo hubiera sido más difícil, y por las aventuras de fuera, que lo hacen todo más fácil, mil gracias. Ana Peropadre López ha seguido en primera persona mis andanzas diarias, en casa, fuera, trabajando, de vacaciones, apoyándome, creyendo en mí casi más que yo misma y dándome su cariño. Por tu entusiasmo y colaboración con la par te científica y ar tística de esta tesis, gracias mil. Con Óscar Herrero Felipe, además de haber compar tido “su ftalato”, he ganado un amigo de verdad. Gracias.
Pepa ha sido la responsable de que todo esto saliera y llegara a buen puer to. Espero haber estado a la altura de sus consejos e ideas brillantes, para compensar el estrés y los insomnios. Haber conseguido hacernos crecer y escucharnos pa- cientemente es una de las claves que, en mi caso, hacen verdad el proverbio de Confucio “encuentra un trabajo que ames, y no volverás a trabajar en tu vida”. Sin Pepa eso no hubiera sido posible.
Mi familia, de la que estoy muy orgullosa, me ha apoyado siempre sin reservas y quiero agradecerles a todos el cariño y los
cuidados, todos ellos imprescindibles. Mi padre, del que he heredado la curiosidad por abrirlo todo y mi inclinación a manejar
destornilladores y alicates, tan necesarias de vez en cuando en el laboratorio. Mi madre, que se ha desvivido porque yo pudiera
hacer “lo mio”, teniendo todo “lo otro” hecho, y con la que tengo el honor de compar tir lecturas y exposiciones. Mi abuela,
y maquetación de la tesis, y Mar, que siempre intentan sacarme de paseo y tienen las puer tas de su casa abier tas para mí. Mi Cuin ha compar tido conmigo todos los días de estudio, tanto diurnos como nocturnos, desde que empecé el instituto.
Ana María Pérez González ha estado conmigo desde que tengo memoria. Saber que está ahí siempre es un consue- lo…retomaremos nuestras aventuras para reírnos como se debe: boca arriba. Gracias también a Raquel Serantes Rodríguez por los cafés que han sido y serán, hasta que veamos a Migui conver tido en un hombrecito y más.
Me gustaría también agradecer a toda la gente que rodea el ambiente de trabajo para ofrecer siempre un respiro o unas risas. O lo que se tercie. Cukada, siempre con una sonrisa y un abrazo, dispuesta a todo; Charo y Fernando, parada obligatoria en los vaivenes madrileños; Santi y las horas pasadas en prácticas, incluyendo las previas, las listas, las notas y todos esos berenjenales; Bea y Óscar con los aires paleontológicos que nos alegran la comida; Laura o Biolaura o Pol, por la risa y la sonrisa siempre aseguradas; Lidia, con sus informaciones sobre lo distinto que es el mundo hospitalario; Merry, que continúa sorprendiéndonos con novedades novedosas; Sara, siempre tan atenta y detallista; Nargisse, Conchi y Montse, por las incursiones en el mundo de los geles y el contrapunto genético; Virginia, ¡es un placer hacer pedidos así!
Siempre que viajo al Sur (de Madrid) me han hecho sentir como en casa. Gracias a Esther (¡y Eva!) y a Iñaki, ese abogado siempre a mano. Y también a Iván, ese valenciano afincado en Madrid que me provee de las mejores naranjas de la ciudad.
Gracias también a la profesionalidad del personal de los servicios técnicos a los que he tenido que recurrir: Verónica Labrador del servicio de Microscopía Óptica y Confocal del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO);
Sylvia Gutierrez Erlandsson del servicio de Citometría y microscopía confocal del Centro Nacional de Biotecnología; y el
grupo de María Teresa Rejas del servicio de Microscopía Electrónica del CBMSO.
AIC Akaike’s information criterion Criterio de información de Akaike AIF Apoptosis inducing factor
Factor inductor de la apoptosis ANT Adenine nucleotide translator
Translocador de nucleotidos de adenina AO Acridine orange
Naranja de acridina
Apaf1 Apoptosis protease adaptator factor 1 Factor apoptótico adaptador de
proteasas 1
ARN Ácido ribonucleico ARNm ARN mensajero
ATCC American Type Culture Colection Colección Americana de Cultivos Tipo Atg Autophagy-related protein
Proteínas relacionadas con autofagia ATM DNA damage-inducible kinase Quinasa inducida por daño a DNA ATP Adenosine triphospate
Adenosin trifosfato
Bad Proteína proapoptótica de la familia Bcl-2 Bcl-2 B-cell lymphoma 2
Célula B de linfoma 2
Bcl-w Proteína de la familia Bcl-2 Bcl-xL Proteína antiapoptótica de la familia Bcl-2 BH Bcl-2 homology
Homología con Bcl-2
BHA tert-butil-4-hidroxianisol Bid Proteína proapoptótica de la familia Bcl-2 Bik Proteína proapoptótica de la familia Bcl-2 Bim Proteína proapoptótica de la familia Bcl-2 BiP Inmunoglobulin heavy chain binding
protein
Proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulinas
Bmf Proteína proapoptótica de la familia Bcl-2 Bok Proteína proapoptótica de la familia Bcl-2 cAMP Cyclic adenosine monophosphate Adenosin monofosfato cíclico CAS Chemical abstract service
Servicio de resúmenes químicos Caspasas Cysteinyl aspartate-specific proteinases Proteinasas específicas de cisteinil
aspartato
CCD Charge-coupled device
Dispositivo de cargas eléctricas CD95 Cluster of diferentiation 95 Cluster de diferenciación 95 CMR Carcinogenic, mutagenic or reproductive toxicity
para la reproducción
CPT Contenido de proteína total CTE Cadena transportadora de electrones mitocondrial
CypD Cyclophilin D Ciclofilina D DAG Diacylglycerol Diacilglicerol
DBC Dibucaina: 2 – butoxy – N - (2 – dietilaminoetil) – 4 - quinolincarbox amida hidrocloruro
DDT Dicloro – difenil – tricloroetano DEHP Diethylhexyl phthalate
Dietilhexil ftalato: bis – (2 – etilhexil) ftalato
Diablo Direct IAP binding protein with a low
pI
Proteína de unión directa a IAP con bajo pI
DMEM Dulbecco’s minimal essential Medium Medio mínimo esencial de Dulbecco DMSO Dimetilsulfóxido
Drp Dynamin related proteins
Proteínas relacionadas con dinamina DR3 Death receptor 3 Receptor de muerte 3 DR4 Death receptor 4 Receptor de muerte 4 DR5 Death receptor 5 Receptor de muerte 5 ECVAM European Center for the Validation of Alternative Methods
Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos
EDIT Evaluation-guided development of new In vitro test batteries
Desarrollo hacia la evaluación de nue vas baterías de ensayos in vitro EDTA Ethylene diamine tetracetic acid Ácido diamino etileno tetracético eIF2a eukaryotic initiation factor 2a factor iniciador eucariótico 2a EE.UU. Estados Unidos de América EINECS European inventory of existing chemical substances
Inventario europeo de compuestos químicos existentes
ELINCS European list of notified chemical substances
Lista europea de compuestos químicos noti ficados
EMEA European MEdicines Agency Agencia Europea del Medicamento EndoG Endonucleasa G
Degradación asociada al RE EROs Especies reactivas de oxígeno FAD Flavine adenine dinucleotide Dinucleótido de flavina y adenina FADD Fas-associating death domain-containing
protein
Proteína asociada a Fas que contiene un
dominio de muerte
Fis1 Proteína de fisión 1 GFP: Green fluorescent protein
Proteína fluorescente verde GRPs Glucose regulated proteins
Proteínas reguladas por glucosa GTP Guanosin triphosphate
Guanosina trifosfato hsp heat shock protein
proteínas de estrés térmico IAP Inhibitor of apoptosis protein Proteína inhibidora de apoptosis ICCVAM Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative
Methods
Comité Coordinador de la Interagencia sobre la Validación de Métodos Alternativos
ICHP Institute for Health and Consumer Protection
Instituto para la Salud y Protección del
Consumidor
IF Índice de fases IM Índice mitótico
INVITTOX In vitro techniques in toxicology Técnicas de toxicología in vitro IP3 Inositol 1,4,5-trisphosphate
Inositol 1,4,5-trifosfato
IP3R Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor Receptor de inositol 1,4,5-trifosfato IRE1 Protein-kinase and site -specific endoribonuclease
Proteinquinasa y endoribonucleasa especí fica de lugar
ISO International Organization for Standardization
Organización Internacional para la Estandarización
JRC Joint Research Center
Centro Común de Investigación JNK c-Jun N-terminal kinasa
Quinasa c-Jun N-terminal
LDH Lactato deshidrogenasa MAPK Mitogen activated protein kinase
MCSS Medio completo sin suero MEIC Multicentre evaluation of in vitro cytotoxicity
Evaluación multicentro de citotoxicidad in
vitro
MET Microscopía electrónica de transmisión Mtd ver Bok
MTT 3 – (4,5 – dimetiltiazolil – (2)) – 2, 5 – difenil – 2H – bromuro de tetrazolio NAD Nicotin adenina dinucleótido NADH Nicotin adenina dinucleótido reducido Noxa Proteína proapoptótica de la familia Bcl-2 NRU Neutral red uptake
Captación de rojo neutro
Omi/HtrA2 Omi stress-regulated endoprotease / high temperature requirement protein A2 Endoproteasa Omi regulada por estrés / proteína A2 de alta temperatura Opa1 Optic atrophy 1
Atrofia óptica 1 PBS Phosphate buffer saline Tampón fosfato salino
PBT Persistent, bioaccumulative and toxic Persistente, bioacumulable y tóxico PCP Pentachlorophenol
Pentaclorofenol
pdf portable document format
formato de documento portátil PDI Protein disulfide isomerasa
Disulfuro isomerasa proteínica PERK Protein kinase regulated by RNA-like ER
kinase
Protein quinasa regulada por ARN similar a
quinasa RE
PFOA Perfluorooctanoic acid Ácido perfluorooctanoico PIDD p-53 induced protein Proteína inducida por p-53 PKA Protein kinase A
Protein quinasa A
POP Persistent organic pollutants
Contaminantes orgánicos persistentes PPCPs Pharmaceuticals and personal care products Fármacos y compuestos de uso personal
PS Poliestireno
PTM Poro de transición de membrana
Puma Proteína proapoptótica de la familia Bcl-2 PVC Polyvinyl chloride
Cloruro de polivinilo
QSAR Quantitative structure/activity relationship Relaciones cuantitativas estructura/actividad
puestos químicos
RN Rojo neutro
Ro123 Rodamina 123
ROT Rotenona: (2R, 6aS, 12aS) – 1, 2 , 6, 6a, 12, 12a– hexahidro – 2 – isopropenil – 8, 9 – dimetoxicromeno [3, 4-b] furo (2, 3-h) cromen – 6 – ona
SAR Structure/activity relationship Relaciones estructura/actividad SMAC Second mitochondria-derived activator of
caspases
Segundo ativador de caspasas derivado de mitochondria
TIA-1 T – cell restricted intracellular antigen 1 Antígeno intracelular 1 restringido a células
T
TIAR TIA-1-related protein
Proteína relacionada con TIA-1 TNFR Tumor necrosis factor receptor
Receptor del factor tumoral de necrosis UPR Unfolded protein response
Respuesta a proteínas mal plegadas US-EPA United States Environmental Protection
Agency
Agencia de Protección Medioambiental de los Estados Unidos
US-FDA United States Food and Drugs Administration
Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos VDAC Voltage – dependent anion channel Canal de aniones dependiente de voltaje vPvB very Persistent very Bioaccumulative muy persistente muy bioacumulable
1. El proyecto REACH. ... 4
• Registro. ... 5
• Ealuación. ... 7
• Autorización. ... 7
• Restricción. ... 8
2. Métodos alternatios. ... 8
2.1. Modelos celulares en los ensayos de toxicología...11
3. La mitocondria como diana intracelular de toxicidad. ... 15
3.1. Ultraestructura ...16
3.2. Fisiología ...18
3.3. Metabolismo ...20
3.4. Integración de señales: muerte celular ...23
Hipótesis de partida ... 31
Objetios ... 31
33 Material y Métodos Selección de Compuestos ... 33
Cultios Celulares ... 39
1. Líneas celulares establecidas. ...39
2. Infraestructura y material de cultios. ...40
3. Mantenimiento de los cultios. ...42
4. Tratamientos con los compuestos de referencia. ...43
Diseño del Protocolo Experimental ... 45
Proliferación... 50
1. Contenido de Proteína Total (CPT). ...50
Ensayo de Bradford ...50
Ensayo de Lowry ...51
2. Progresión del ciclo celular...53
Recuento de índice mitótico (IM) e índice de fases (IF) ...53
Análisis del ciclo mediante citometría de flujo ...54
Viabilidad ... 57
1. Marcadores metabólicos mitocondriales. ...57
Reducción del MTT ...57
2. Estado de las membranas celulares. ...58
Ensayo de exclusión de Azul Tripán ...58
Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) citosólica .60 Captación de Rojo Neutro ...61
Morfología ... 64
1. Morfología celular. ...65
1.1 Obseración de células in io ...65
Microscopía óptica de contraste de fase ...65
1.2. Obseración de células fijadas...65
Microscopía óptica de campo claro: Azul de Toluidina ...65
2. Morfología subcelular. ...66
2.1. Marcajes fluorescentes in io ...66
Retículo mitocondrial ...66
Compartimento endosomal ...67
2.2. Detecciones fluorescentes específicas ...68
Morfología nuclear ...69
Microfilamentos de actina ...70
2.3. Inmunodetecciones fluorescentes específicas ...71
Citocromo C ...72
Citoesqueleto de microtúbulos ...73
Huso mitótico ...75
3. Estudios ultraestructurales. ...80
Microscopía electrónica de transmisión (MET) ...80
Pruebas específicas ... 83
Relocalización del naranja de acridina ...83
Diclorofluoresceína diacetato ...84
Análisis Estadísticos ... 86
1. Análisis estadísticos generales. ...86
1.1. Puntos de significación. ...86
a) Más de dos grupos. ...86
b) Dos grupos. ...87
1.2. Análisis de regresión no lineal. ...87
2. Condiciones de los distintos ensayos. ...88
2.1. Cuantificaciones en lector de placas. ...88
2.2. Pérdida de adhesión. ...88
2.3. Índice mitótico. ...89
2.4. Morfología nuclear. ...89
a) Condensación y/o fragmentación de la cromatina. ...89
b) Multinucleación...90
2.5. Relocalización de naranja de acridina. ...90
Software ... 91
1. Análisis de datos. ...91
2. Tratamiento de imagen. ...91
3. Procesamiento de texto. ...92
4. Gestión de la bibliografía. ...92
93 Resultados
Primera Etapa ... 93 1. Proliferación y iabilidad. ... 93
1.1. Ensayos por compuesto. ...93 a) Butil hidroxianisol. ...93 b) Dibucaina. ...93 c) Ácido perfluorooctanoico. ...95 d) Dietilhexil ftalato. ...95 e) Pentaclorofenol. ...96 f) Rotenona. ...96
2. Comparación de las tres líneas celulares. ... 97 3. Morfología. ...104
3.1. Butil hidroxianisol ...104 3.2. Dibucaína. ... 106 3.3. Ácido perfluorooctanoico ...109 3.4. Dietilhexil ftalato ...111 3.5. Pentaclorofenol ...113 3.6. Rotenona ...114
Segunda Etapa ...118 1. Butil hidroxianisol. ...118
1.1. Estudio morfológico a lo largo del tiempo. ...119 a) 4 horas. ... 119 b) 9 horas. ... 121 c) 18 horas. ...121 d) Recuperación. ...121
b) Citometría de flujo. ...123 1.4. Estudio de morfología nuclear. ...123
2. Dibucaína. ...124
2.1. Estudio de las membranas celulares. ...124 a) Marcadores de iabilidad de membrana a lo largo del tiempo. ...124 b) Integridad de las membranas celulares a lo largo del tiempo. ...125 c) Morfología de compartimento endosomal y citoesqueleto. ...126 d) Ultraestructura. ...127 2.2. Estudio de adhesión...130 2.3. Estudios de morfología nuclear. ...130
3. Ácido perfluorooctanoico. ...131
3.1. Estudio del retículo mitocondrial. ...132 a) Morfología después de una exposición bree. ...132 b) Estrés oxidatio. ...132 3.2. Estudios de proliferación. ...133 a) Índice mitótico. ...133 b) Citometría de flujo. ...133 3.3. Estudios de muerte celular. ...134 a) Tinción con Hoechst 33258. ...134 b) Localización intracelular de citocromo C. ...134
4. Dietilhexil ftalato. ...135
4.1. Estudio del retículo mitocondrial. Estrés oxidatio. ...136 4.2. Estudio de proliferación. Índice mitótico. ...136 4.3. Estudio de la membrana plasmática. ...137 4.4. Estudios de morfología nuclear. ...138
4.6. Estudio de la respuesta a estrés del retículo endoplásmico. ...140
5. Pentaclorofenol. ...140
5.1. Integridad de la membrana plasmática. ...142 5.2. Estudio morfológico después de una exposición bree. ...142 a) Morfología en microscopía óptica. ...143 b) Ultraestructura. ...143 5.3. Estudios de proliferación. Índice mitótico. ...144 5.4. Estudios de adhesión. ...145 5.5. Estudios de morfología nuclear. ...145 5.6. Mecanismo de muerte celular. ...146 a) Permeabilización del compartimento endosomal. ...146 b) Localización de factores apoptogénicos. ...147
6. Rotenona. ...148
6.1. Estudio morfológico después de una exposición bree. ...148 6.2. Estudio de adhesión. ...150 6.3. Estudios de proliferación. ...150 a) Índice mitótico. ...150 b) Índice de fases. ...151 6.4. Estudio del huso mitótico. ...151 6.5. Estudio de la morfología nuclear. ...153
199 Referencias
219 Anexo
159 Discusión
Conclusiones ... 197
Figura 2 ...10 Figura 3 ...15 Figura 4 ...17 Figura 5 ...17 Figura 6 ...19 Figura 7 ...21 Figura 8. ...25 Figura 9 ...34 Figura 10 ...35 Figura 11 ...39 Figura 12 ...41 Figura 13 ...44 Figura 14 ...46 Figura 15 ...53 Figura 16...54 Figura 17 ...57 Figura 18...59 Figura 19 ...60 Figura 20 ...62 Figura 21...64 Figura 22 ...65 Figura 24 ...67 Figura 23 ...67 Figura 25 ...69 Figura 26 ...70 Figura 27 ...72 Figura 28 ...83 Figura 29 ...87 Figura 30 ...94 Figura 31...102 Figura 32 ...105 Figura 33 ... 107 Figura 34 ... 110 Figura 35 ... 112 Figura 36 ... 115 Figura 37 ... 117 Figura 38 ... 119 Figura 39 ...120 Figura 40 ...120
Figura 42 ...122 Figura 43 ...123 Figura 44 ...123 Figura 45 ...125 Figura 46 ...126 Figura 47 ...126 Figura 48 ...127 Figura 49 ...128 Figura 50 ...129 Figura 51 ...130 Figura 52 ... 131 Figura 53 ...132 Figura 54 ...132 Figura 55 ...133 Figura 55 ...133 Figura 57 ...134 Figura 58 ...135 Figura 59 ...136 Figura 60 ... 137 Figura 61 ... 137 Figura 62 ...138 Figura 63 ...138 Figura 64 ...139 Figura 65 ... 141 Figura 66 ... 142 Figura 67 ... 143 Figura 68 ...144 Figura 69 ...144 Figura 71... 145 Figura 70 ... 145 Figura 72 ... 146 Figura 73 ... 147 Figura 74 ... 149 Figura 75 ...150 Figura 76 ... 151 Figura 77 ...152 Figura 78 ...153 Figura 79 ...154
Í ndice de t AblAs
Tabla I ... 35 Tabla II ... 40 Tabla III ... 43 Tabla IV ... 43 Tabla V ... 98 Tabla VI ... 99 Tabla VII... 100 Tabla VIII ... 101 Tabla IX ... 101 Tabla X ... 103 Tabla XI ... 103 Tabla XII ...151
E
l medio ambiente se encuentra sometido a una creciente presión antropogé- nica, debida en gran medida a la liberación de compuestos químicos a nues- tro entorno. De este modo, cada vez es mayor el número de sustancias de diversa índole que aparecen como contaminantes en sistemas naturales. Dos de los grupos que más preocupación vienen generando en los últimos años son los compuestos or- gánicos persistentes (COPs) y los fármacos y productos de consumo e higiene perso- nal (PPCPs), que se encuentran presentes en aguas superficiales de todo el mundo.La exposición masiva a estos compuestos no sólo del medio ambiente, sino de las poblaciones humanas en general, suscitó la necesidad de revisar las normativas vigen- tes. Este proceso culminó en 2007 con la entrada en vigor de una nueva legislación en el ámbito de la Unión Europea, conocida como REACH y relativa al registro, evaluación, autorización y restricción de las sustancias y preparados químicos. En ella, la obligación de evaluar el riesgo tóxico de los mismos es responsabilidad de las empresas productoras o importadoras y no de las instituciones públicas. Además, entre sus principales objetivos se encuentra el fomento de los ensayos alternativos a la experimentación animal, lo que supone una ocasión única para el desarrollo de nuevas estrategias metodológicas para la evaluación toxicológica de todo tipo de productos químicos.
Los cultivos celulares resultan de particular interés entre las distintas aplicaciones experimentales disponibles, contando con una amplia variedad de metodologías apli- cables a la evaluación toxicológica. A pesar de que los estudios de citotoxicidad son una aproximación reduccionista a los ensayos de toxicidad aguda in vivo, suponen el mejor grado de compromiso entre la obtención de información relevante sobre el mecanismo de acción tóxica y el empleo de métodos alternativos a la experimenta- ción animal.
En esta línea, la presente tesis propone una estrategia celular de ensayos integrada que analiza parámetros complementarios de proliferación, viabilidad y morfología, para conocer el grado de toxicidad, mecanismo de acción y respuesta celular de los compuestos estudiados, aproximando la Biología celular a la Toxicología mediante sistemas in vitro sencillos y fácilmente reproducibles.
Para evaluar la validez del sistema propuesto, se han seleccionado seis compuestos de distinta naturaleza química pero que comparten un punto común de interacción con las células: la capacidad de interferir con las mitocondrias. Se trata de los PPCPs butil hidroxianisol y dibucaína; los plastificantes industriales ácido perfluorooctanoi- co y dietilhexil ftalato; y los biocidas pentaclorofenol y rotenona. Además, el análisis se ha llevado a cabo en paralelo en tres líneas celulares de distinto origen (Vero, HeLa y 3T3), con la intención de comparar su aplicabilidad y el grado de sensibilidad ante la presencia de las sustancias seleccionadas.
grado de sensibilidad más alto. Esta circunstancia, junto con otras características pro- pias de esta línea celular, nos llevaron a seleccionarla como modelo para desarrollar los protocolos necesarios para determinar en detalle el mecanismo de acción tóxica de cada uno de los compuestos.
Los resultados así obtenidos permiten establecer las dianas celulares específicas para las sustancias estudiadas que, sorprendentemente, no se reducen exclusivamen- te a la disfunción mitocondrial. Dado que el modelo analiza de manera sistemática las principales dianas celulares susceptibles de sufrir alteraciones ante la acción de xenobióticos, nuestro estudio establece el mecanismo de acción tóxico para cada uno de los compuestos estudiados, resaltando la importancia de la realización de pruebas morfológicas.
De este modo, sólo en el caso del ácido perflurooctanoico la mitocondria se mantie- ne como única diana intracelular responsable del efecto tóxico observado, mientras que en la exposición a butil hidroxianisol se detecta también un importante efecto sobre la estabilidad de las membranas. Por el contrario, las dianas celulares preferen- tes de la dibucaína y el pentaclorofenol son los lisosomas; mientras que después del tratamiento con rotenona se altera el citoesqueleto y el dietilhexil ftalato afecta a distintos procesos celulares.
En conjunto, podemos concluir que mediante el modelo celular propuesto hemos podido establecer un mecanismo de acción concreto para cada uno de los compues- tos evaluados, independientemente de su naturaleza química. El buen funcionamien- to del modelo queda patente al haber sido capaz de identificar alteraciones y efectos nocivos muy distintos, dado el carácter tan diverso de los mecanismos de acción tóxica subyacentes a los compuestos seleccionados.
I NTRODUCCIÓ N
E
l medio ambiente se encuentra sometido a una creciente presión antropogénica, debida en gran medida a la liberación de compuestos químicos a nuestro entorno. Esta presión se incrementó de manera exponencial con el desarrollo de la agricultura intensiva, la industrialización y el aumento en los trans- portes, paralelamente a la progresión económica y el bienestar social. De este modo, cada vez es mayor el número de sustancias de muy diversa composición, estructura y origen, que aparecen en la naturaleza en forma de contaminantes ambientales.Entre ellas encontramos compuestos industriales, plaguicidas, aditivos alimentarios, compuestos farmacéuticos, detergentes y cosméticos, además de un gran número de subproductos y deshechos. Su entrada al medio ambiente se puede producir directa- mente en la atmósfera (evaporación), litosfera (adsorción), hidrosfera (disolución) y/
o biosfera (absorción, inhalación o ingestión). Una vez en contacto con el medio na- tural, los compuestos sufren una serie de transformaciones dependientes de factores físicos, abióticos y biológicos, los cuales van a determinar su redistribución en el eco- sistema y grado de contaminación (Repetto y col., 2006). La población general puede entrar en contacto con estas sustancias en el momento de su fabricación, a través de su utilización y distribución o durante el proceso de degradación medioambiental.
La preocupación por la polución del medio ambiente se inició como consecuen- cia del desarrollo de la agricultura intensiva. La aplicación de nuevas técnicas agrí- colas, diseñadas para obtener el máximo rendimiento, provocó la dispersión en el medio ambiente de multitud de contaminantes, algunos de ellos extremadamente tóxicos y hoy afortunadamente prohibidos. La toma de conciencia por parte de la población de esta situación alarmante se produjo de manera muy paulatina en los países desarrollados, y aun hoy en día es prácticamente inexistente en aquellos con menor grado de desarrollo.
Las primeras llamadas de atención respecto al uso abusivo de pesticidas, biocidas y fertilizantes empezaron en EE.UU. en la década de los 60. El ejemplo paradigmático es el del DDT (dicloro – difenil – tricloroetano), que saltó a la luz gracias al libro de Rachel Carson La Primavera Silenciosa (1962) y culminó años después con la prohi- bición del uso de este compuesto.
Los EE.UU. fueron los primeros en establecer leyes que pretendían el control y regu- lación del uso de distintos compuestos, principalmente los pesticidas y biocidas en general. De este modo, en 1970 se crea la Agencia de Protección Medioambiental de los EE.UU. (US-EPA), fruto en gran medida de la “revolución verde” surgida a partir del libro de Rachel Carson. Desde su constitución, la EPA ha sido un organismo de referencia en lo que a legislación medioambiental se refiere, y espejo de la Unión Europea para el desarrollo de sus propias normativas medioambientales.
Durante los últimos treinta años se ha vigilado casi exclusivamente el impacto sobre la salud y el medio ambiente de los contaminantes derivados de los residuos industriales. Las emisiones de gases y vertidos son la vía más directa y evidente de la entrada de productos químicos a nuestro entorno, pero existen otras vías indirectas menos evidentes que también suponen un riesgo para la salud pública. Un ejemplo actual lo tenemos en los plásticos y sus derivados, componentes de muchos objetos cotidianos, que se liberan de manera lenta y dispersa al medio y suponen un peligro ecotoxicológico de difícil evaluación.
Otro tipo de contaminantes lo constituyen unas sustancias con una importante repercusión en la sociedad debido a sus efectos sobre la salud de las poblaciones hu- manas: los productos farmacéuticos y cosméticos. Entre los ejemplos más dramáticos de sus efectos tóxicos encontramos la talidomida, para combatir las nauseas en las mujeres embarazadas, y la comercialización de Lash – Lure, un producto derivado del alquitrán de hulla para teñir las pestañas. El primero provocó en los años 50 y 60 malformaciones en las extremidades de los fetos cuyas madres habían tomado el fármaco en las primeras semanas de desarrollo (unos 100.000 casos) y el segundo provocó en los años 30 la ceguera total a una mujer tras su aplicación.
A pesar de la distinta magnitud de sus efectos y de no haberse producido por expo- sición ambiental, ambos casos tuvieron consecuencias importantes. La comerciali- zación de Lash – Lure puso de manifiesto en EE.UU. la necesidad de establecer una regulación sobre los productos cosméticos, y la consiguiente implantación en 1944 por la US – FDA (United States Food and Drug Administration) del test de Draize para determinar la irritación que producen los compuestos químicos, mediante su aplicación directa sobre los ojos de conejos (Abbott, 2005). Por su parte, la talidomi- da supuso una catástrofe sanitaria que evidenció la necesidad de realizar un estudio completo de los efectos de un fármaco previos a su comercialización, incentivándo- se la creación de leyes y regulaciones específicas que exigían estudios de toxicidad previos.
La detección de este tipo de sustancias como contaminantes ambientales llegó más adelante, poniéndose de manifiesto en un trabajo pionero publicado por Daughton y Ternes (1999) en el cual el conjunto de fármacos (tanto de uso humano como veterinario) y los productos de higiene personal se engloban bajo las siglas PPCPs (Pharmaceuticals and Personal Care Products). El uso y control de este tipo de com- puestos se sigue encontrando hoy en día muy por debajo de los niveles de regulación y/o legislación existentes para otros tipos de contaminantes más clásicos (Daughton y Ternes, 1999), a pesar del gran interés ecotoxicológico que han suscitado.
Los aditivos alimentarios son otro grupo de contaminantes relacionados en cierto modo con los PPCPs, ya que en algunos casos se emplean también en la industria cosmética. Según la nomenclatura de la Unión Europea, los aditivos alimentarios se encuentran clasificadas principalmente en colorantes, conservantes, antioxidantes,
nuada de alimentos tratados, ya sean precocinados o no, favorece la bioacumulación de estas sustancias, existiendo indicios sobre el potencial tóxico de algunas de ellas.
La visión antropocéntrica de la realidad que nos rodea ha incentivado el desarro- llo de estudios toxicológicos acerca de los posibles efectos de los contaminantes am- bientales sobre el ser humano. Pero hay que tener en cuenta que una gran cantidad de estos compuestos termina incorporándose al medio ambiente, bien directamente, bien tras haber sufrido una serie de transformaciones metabólicas dentro de los or- ganismos. Por tanto, resultan de especial interés los efectos que estos compuestos, algunos, como los fármacos, diseñados específicamente para actuar sobre el hombre, pueden tener sobre organismos no diana y, como consecuencia, sobre el funciona- miento del ecosistema.
Resulta por tanto evidente que la presencia de un número creciente de conta- minantes ambientales hace necesaria la existencia de una estricta regulación sobre los compuestos químicos con potencial riesgo tóxico. Estas normativas han de ser preventivas, evitando situaciones como las acontecidas con el amianto, el benceno y el DDT, cuyos efectos nocivos (cáncer, leucemia y problemas de reproducción en las aves respectivamente) se conocieron tras su empleo en grandes cantidades, cuando el daño era ya inevitable (CCE, 2001).
Diversos estudios han puesto de manifiesto la magnitud del problema y la necesidad de tomar medidas urgentemente. Como ejemplo, el caso de los análisis de sangre realizados a los ministros de medio ambiente de los países de la Unión Europea en 2004, en los cuales se detecto la presencia de 55 compuestos químicos, algunos prohibidos en la UE (WWF, 2004), remarcando la exposición inconsciente a la que todos estamos sometidos.
Actualmente se comercializan más de 100.000 compuestos químicos y se intro- ducen cada año unos 2.000 más. Mientras, faltan datos toxicológicos sobre un 86%
de los productos denominados de elevada producción (>1000 t/año), se desconocen detalles sobre uso y exposición y los procesos de evaluación de riesgo son extrema- damente lentos (IHCP, 2005).
Esta situación se explica porque la legislación europea, hasta 2006, establecía una clara distinción en cuanto al tratamiento para los compuestos químicos “existentes”
y los “nuevos”. En el caso de los existentes, más de 100.000 sustancias comerciali- zadas antes de 1981 e incluidas en el Inventario Europeo de Sustancias Existentes (EINECS), no se necesitó ningún tipo de ensayo para continuar con su uso, circuns- tancia que sí se exigía a los nuevos compuestos introducidos después de 1981 en el mercado, unas 3000 sustancias englobadas en la Lista Europea de Nuevas Sustancias Químicas (ELINCS). Asimismo, tampoco se solicitaba información sobre la exposi- ción y el uso al que se destinaban las sustancias, solamente sobre su importación y/o
producción. Por último, dado que las autoridades públicas eran las únicas responsa- bles de realizar la evaluación de riesgo, el desarrollo de este tipo de estudios era muy lento, habiéndose aplicado únicamente a 141 productos químicos de alto volumen desde 1993 (EC, 2003).
Las diversas normativas de la antigua legislación europea determinaban el tipo de estudio que se debía realizar para cada compuesto, basándose en su nivel de pro- ducción. Así, para aquellos entre 1 y 100 toneladas al año, se necesitan ensayos de toxicidad aguda en peces, dafnia, algas, bacterias, degradación, absorción/deserción y biodegradabilidad (Directiva 67/548/CEE, Directiva 93/67/EEC).
En el caso de los plaguicidas, la mayoría de los países europeos requieren ensayos agudos y crónicos en pez, dafnia, algas y organismos del sedimento, además de en pájaros, mamíferos, abejas y otras especies silvestres, y dependiendo del caso, estudios de campo, mesocosmos y microcosmos (Shaw y Chadwick, 1995). En cuanto a los fármacos, la unión europea desarrolló recientemente una guía para la evaluación de riesgo medioambiental de productos medicinales para uso humano. En ella se pro- pone una estrategia de análisis escalonada que incluye en una segunda fase estudios de toxicidad a largo plazo en peces, dafnia, algas y microorganismos, desestimando los estudios a corto plazo al asumirse una exposición continua del medio acuático a través de las plantas de tratamiento de residuos (EMEA, 2005). Hay algunas sus- tancias especialmente problemáticas, como los alteradores endocrinos, sobre las que se han de realizar estudios toxicológicos independientemente de sus características físico-químicas, es decir, de la primera fase del proceso.
1. El proyecto REACH.
La baja eficacia de todas estas normativas llevó a la Unión Europea a revisar el sistema y, fruto de esa revisión, en el año 2001 se presentó un nuevo concepto de norma para la regulación de las sustancias y preparados químicos: el Libro Blanco
“Estrategia para la futura política en materia de sustancias y preparados químicos”
(CCE, 2001). Mediante esta propuesta se establecen distintas actuaciones según el volumen de producción o importación de los compuestos químicos y se fijan una se- rie de objetivos para desarrollar esta política, centrados en proteger a los ciudadanos y al medio ambiente, mantener la industria química europea y fomentar los ensayos sin animales.
La Comunidad Europea ha mantenido estos objetivos para la elaboración de una nueva legislación bastante estricta sobre la producción y transporte de sustancias químicas. La nueva normativa, aprobada en diciembre de 2006 (EC, 2006a), entró en vigor el 1 de junio de 2007 y va a suponer un cambio radical en el modo de control y valoración del riesgo de este tipo de compuestos (EC, 2003; CEU, 2005).
Authorisation of Chemicals) y supone la existencia de un único sistema de regula- ción tanto para los compuestos nuevos como para los existentes, estableciéndose dis- tintos niveles de exigencia en cuanto a ensayos según las cantidades producidas o im- portadas de cada compuesto o preparado químico. Una de las principales novedades reside en que la responsabilidad sobre la información toxicológica de las sustancias y preparados químicos recae en la propia industria, garantizando que únicamente se produzcan y/o comercialicen aquellos productos que no resulten peligrosos. Del mismo modo, las empresas deben de facilitar la información necesaria a los usuarios industriales y a los formuladores.
El sistema REACH se fundamenta en tres elementos principales según la can- tidad media producida o importada al año: registro para cantidades superiores a 1 tonelada; evaluación para sustancias cuyo volumen de producción o importación sea superior a 100 toneladas o aquellas en las que existan dudas sobre su toxicidad y, por último, autorización para usos concretos de aquellas sustancias catalogadas como muy peligrosas. Su aplicación mejorará y facilitará el acceso por parte de todos (incluidos consumidores) a las fichas de datos de los compuestos químicos y evitará la repetición de ensayos, especialmente aquellos realizados con vertebrados.
Todos los aspectos técnicos, administrativos y científicos del sistema se coordinarán en una nueva Agencia Europea de Compuestos Químicos con sede en Helsinki.
Desde ella se controlarán las distintas fases del REACH, basándose en el principio de cautela (EC, 2003). En la figura 1 se resumen los puntos principales del REACH, explicados brevemente a continuación:
• Registro.
Mediante este proceso se centralizará en una base de datos la información básica proporcionada por las empresas, relativa a todas las sustancias nuevas y existen- tes producidas en cantidades superiores a 1 tonelada (unas 30.000). En un 80%
de los casos el registro será suficiente para permitir la comercialización o impor- tación de la sustancia.
El productor o importador notificará a la autoridad competente su intención de producir o importar una sustancia y presentará un expediente con la información exigida por la legislación. Para sustancias producidas en cantidades superiores a 1 tonelada, habrá que presentar un dossier técnico incluyendo la identidad y propiedades de la sustancia, usos, propuesta de clasificación y etiquetado, ficha de datos de seguridad y propuesta de medidas de gestión de riesgo. La informa- ción concreta necesaria dependerá de la toxicidad potencial de cada compuesto.
Además, según se va incrementando la cantidad de la sustancia se requiere un mayor número de ensayos y pruebas toxicológicas. Para aquellas sustancias pro- ducidas o importadas en más de 10 toneladas, será necesario incluir un informe de seguridad química mediante el cual se documentan, entre otros, los riesgos,
Figura 1 Esquema de los principales puntos de la legislación de la Unión Europea sobre compuestos químicos, conocida como REACH. Modificado de la Comisión Europea http://ec.europa.eu/environment/chemicals/background/flowchart_reach.pdf
tóxica.
Las empresas serán las responsables de recopilar toda la información, realizando ellas mismas los ensayos pertinentes para aquellos datos no disponibles en la literatura.
Una vez recibido el expediente, la autoridad competente (la Agencia Europea de Compuestos Químicos) le adjudica un número de registro y efectúa controles aleatorios para detectar propiedades que susciten preocupaciones concretas.
• Evaluación.
La información registrada de todas las sustancias producidas en cantidades su- periores a 100 toneladas (unas 5000, el 15%) y también sustancias peligrosas a priori producidas en cantidades inferiores, serán sometidas a este proceso. Las autoridades efectuarán la evaluación y elaborarán programas de ensayo adapta- dos específicamente a las sustancias y centrados en los efectos de la exposición a largo plazo (cáncer, efectos sobre la reproducción, etc.). Según el volumen de pro- ducción/importación y la supuesta toxicidad, el número de ensayos toxicológicos requeridos aumentará: toxicidad aguda para sustancias de 10 a 100 toneladas, ensayos de toxicidad subcrónica para aquellas entre 100 y 1000 toneladas y estu- dios de toxicidad repetida y carcinogenicidad para las de más de 1000 toneladas.
La evaluación se llevará a cabo según una lista priorizada a partir de los datos de riesgo, de exposición y de volumen de producción.
• Autorización.
Aquellas sustancias cuyas propiedades sean peligrosas y susciten gran preocupa- ción necesitarán ser autorizadas para un uso bien definido antes de su empleo.
El proceso de autorización tendrá en cuenta si los riesgos son despreciables para un uso en concreto o si es aceptable este uso teniendo en cuenta las ventajas so- cioeconómicas, la inexistencia de otros productos más seguros y las medidas para minimizar los riesgos para la salud humana y el medio ambiente. Se fomentará la sustitución de sustancias peligrosas por otras que lo sean menos, siempre que se disponga de alternativas que resulten satisfactorias. Se calcula que afectará a unas 1400 sustancias (el 5% de las registradas) que sean carcinogénicas, muta- génicas o tóxicas para la reproducción (CMR) y contaminantes orgánicos persis- tentes (POP). Mediante una investigación adicional se establecerán criterios de identificación de sustancias persistentes, bioacumulables y tóxicas (PBT) y muy persistentes, muy bioacumulables (vPvB). En cuanto a los alteradores endocrinos, la mayor parte de ellos se encuentran sujetos al proceso de autorización bajo el sistema REACH.
Los usos que no susciten preocupación (laboratorios de investigación o usos industriales controlados) podrán quedar exentos de forma general del proceso de autorización, teniendo en cuenta que siempre se fomentará el principio de cautela.
• Restricción.
Este proceso permitirá establecer medidas para reducir el riesgo que suponen ciertas sustancias o preparados químicos mediante restricciones a su producción y/o comercialización, en función de los datos disponibles.
La puesta en marcha de esta ley, aun habiendo quedado fuera las sustancias cuyo volumen de producción/importación es menor de 1 tonelada al año, afecta a unos 30.000 compuestos, presentando muchas dificultades en cuanto a costes, número de animales necesarios para llevar a cabo los ensayos y velocidad del proceso. Hasta su implantación completa se necesitará un plazo de transición de unos 11 años para integrar en el sistema la gran cantidad de sustancias existentes en el mercado actual (CCE, 2001; EC, 2006b). Por tanto, se establecerá una lista de prioridad según la cual aquellas producidas en cantidades mayores serán las primeras en registrarse, aunque se permitirá que las sustancias preocupantes producidas en cantidades menores se puedan priorizar.
2. Métodos alternatios.
La nueva normativa supone una ocasión única para el desarrollo de nuevas téc- nicas, mejores y más eficaces que los ensayos toxicológicos convencionales. Entre los principales objetivos de la nueva regulación se encuentra la promoción de los métodos alternativos a la experimentación animal para la evaluación tóxica (van der Jagt y col., 2004; EC, 2006b). Esta circunstancia, junto con la necesidad de poner a disposición de las empresas ensayos más baratos, favorecerá el desarrollo y uso de los métodos alternativos (Louekari, 2004; Hengsteler y col., 2006).
En esta línea de actuación, el sistema REACH sitúa el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (ECVAM) como piedra angular para el desa- rrollo de nuevas metodologías. Se trata de un centro creado en 1991 y actualmente englobado en el Centro Común de Investigación (JRC), más concretamente en el Instituto para la Salud y Protección del Consumidor (IHCP) en Ispra, Italia. Este cen- tro es el organismo encargado de desarrollar el concepto de las tres erres: Reducción, Refinamiento y Reemplazo, definido por Russell y Burch (1959), incentivando nue- vas aproximaciones experimentales a los estudios de toxicidad.
La creación del ECVAM supuso un buen punto de partida para fomentar el desarro- llo de los métodos alternativos, entendiéndose como tales “todos los procedimientos que pueden reemplazar completamente la necesidad de experimentación animal, reducir el número de animales requeridos, o disminuir el dolor o el estrés que sufren los animales” (Smyth, 1978). Aun así, la validación de métodos alternativos es un proceso len- to y limitante al que, además, se han otorgado escasos recursos hasta hace poco.
Requiere la participación de distintos laboratorios independientes que ratifiquen la reproducibilidad, fiabilidad y representabilidad de los ensayos a validar, así como la
independientes (Repetto, 1995). En la mayor parte de los casos, los ensayos que se realizan habitualmente con animales no han pasado por un proceso de este tipo, y se emplean aun habiéndose encontrado dificultades para extrapolar sus resultados a humanos (Balls y col., 1995; Louekari, 2004; Bhogal y col., 2005).
El conjunto de técnicas agrupadas bajo el término métodos alternativos puede subdividirse según distintas aproximaciones experimentales:
• Métodos de refinamiento. Mejora en las condiciones de vida de los animales de experimentación y en la eficacia de los métodos aplicados.
• Métodos de reducción. Disminución del número de animales empleados en los ensayos.
Diseño experimental adecuado.
Estudios estadísticos apropiados.
Harmonización internacional de los protocolos.
Análisis apropiado de los resultados obtenidos.
• Métodos de reemplazo. Sustitución de ensayos llevados a cabo con animales por otros que aporten resultados comparables.
Mejora de uso de la información sobre experimentos ya realizados con animales, evitando las repeticiones innecesarias.
Aproximación por analogía (read – across).
Métodos in silico: (Q)SAR (relaciones cuantitativas estructura – activi- dad), toxicocinética, toxicodinámica y modelización de procesos bio- químicos, fisiológicos, farmacológicos, toxicológicos y de sistemas de comportamiento.
Genómica, proteómica y metabonómica.
Empleo de organismos con menor sensibilidad y/o no protegidos por la legislación, incluyendo invertebrados, plantas y microorganismos.
Uso de vertebrados en estadíos tempranos de desarrollo.
Métodos in vitro: fracciones subcelulares, láminas de tejidos, órganos per- fundidos, explantes, reagregados celulares, micromasas, cultivos prima- rios, líneas celulares (monocapas, suspensiones celulares, monocultivos y/o cocultivos) y cultivos organotípicos en tres dimensiones.
Estudios en humanos, incluyendo el uso de voluntarios y epidemiología.
Dada la variedad de ensayos disponibles, uno de los mayores retos de la nueva legislación es desarrollar un conjunto de estrategias que ofrezcan la información su- ficiente manteniendo el espíritu general establecido por el REACH. Por este motivo las instituciones europeas, con el IHCP a la cabeza, pretenden desarrollar estrategias integradoras de evaluación de riesgo inteligentes, que permitan acelerar el proceso
de evaluación de riesgo a la vez que reducir los costes y los ensayos realizados con animales (Combes y Balls, 2005; IHCP, 2005; Hengsteler y col., 2006).
En este tipo de estrategias (figura 2) se encontraría representado el espíritu de los métodos alternativos y las tres erres. El proceso se inicia antes de la experimentación, recopilando toda la información existente sobre el compuesto en cuestión, tanto sobre sus características físico-químicas, como sobre pruebas toxicológicas ya realiza- das. Posteriormente, en la fase experimental, los estudios comenzarían con métodos
Figura 2
Esquema de una estrategia integrada de ensayos inteligentes. Modificada de Boghal y col.
(2005).
exposición (Louekari, 2004). Una vez analizados correctamente los datos para ob- tener toda la información posible, se emplearán para diseñar escrupulosamente los ensayos in vivo, siempre y cuando éstos fueran inevitables, minimizando el número de animales a emplear y el daño y/o estrés para los mismos (Repetto y col., 2006).
Aunque se han logrado avances muy significativos en casi todas estas aproxima- ciones experimentales, el ámbito de los ensayos in vitro se ha constituido como una de las opciones más interesantes. Su aportación es muy relevante, facilitando además la elaboración de perfiles toxicológicos y estudios sobre toxicidad específica y meca- nismos de acción (Eisenbrand y col., 2002). En cuanto a la potencial extrapolación a humanos, las baterías de ensayos in vitro combinadas con modelos toxicocinéticos basados en fisiología son más útiles y tienen mayor poder de predicción que los en- sayos clásicos en roedores (Barratt y col., 1995; Louekari, 2004).
2.1. Modelos celulares en los ensayos de toxicología
Un caso particular dentro de los ensayos in vitro es el empleo de cultivos celula- res, tanto primarios como líneas celulares establecidas. A priori, los cultivos primarios parecen más apropiados para realizar ensayos de toxicidad, puesto que conservan la mayor parte de sus características metabólicas y funcionales de origen. Sin embargo, al igual que sucede dentro de un organismo, su tiempo de vida está limitado. Por este motivo, las líneas celulares establecidas se presentan como un modelo alternativo atractivo que permite un crecimiento ilimitado del cultivo a pesar de perder algunas características propias del tejido de origen por un proceso de desdiferenciación que afecta fundamentalmente al metabolismo secundario.
Además, su fácil mantenimiento y manipulación, junto con el control preciso de todas las condiciones de crecimiento del cultivo (temperatura, pH, humedad, compo- sición del medio de cultivo, concentración de droga y tiempo de exposición) posibi- litan la obtención de resultados muy reproducibles.
La adaptación de las técnicas de cultivos celulares al campo de la toxicología no es una práctica novedosa ya que lleva utilizándose de manera más o menos extensiva desde los años 80 (Zucco y col., 2004). Esta larga trayectoria hace posible que hoy en día contemos con una amplia variedad de metodologías que se pueden aplicar a distintos tipos de estudios toxicológicos.
Los estudios llevados a cabo en sistemas celulares o de citotoxicidad suponen una aproximación reduccionista a los ensayos de toxicidad aguda in vivo, de tal modo que la unidad toxicológica de estudio es la célula en lugar del organismo. De este modo, los efectos tóxicos que se producirían en un animal completo se transforman en alte- raciones de las funciones celulares básicas (Walum, 1998). Es importante señalar que cada vez son más numerosos los estudios que muestran una buena correlación entre
pruebas de citotoxicidad basal y valores de toxicidad aguda clásicos, es decir, deter- minados con estudios in vivo (Walum, 1998; ECVAM, 2002). Así, los valores de EC50 (concentración que produce el 50% del efecto observado, incluyendo la inhibición del cultivo – IC50) se correlacionan bastante bien con los datos de LD50 (dosis que produce la muerte del 50% de los individuos) para roedores y humanos (Clemedson y col., 2000; Gennari y col., 2004).
Este tipo de estudios no se centra exclusivamente en casos extremos, sino que per- miten conseguir información sobre la actividad biológica de un compuesto y, si es posible, dilucidar su mecanismo de acción. Generalmente se emplean para establecer el perfil toxicológico de los compuestos, incluyendo sus efectos de dependencia de dosis, y suelen ofrecer más información que cualquier otro ensayo de toxicidad indi- vidual (Walum, 1998; Eisenbrand y col., 2002).
Actualmente, de los 21 ensayos toxicológicos in vitro validados por la ECVAM, tres de ellos analizan parámetros sobre cultivos celulares: el ensayo de incorporación de rojo neutro en 3T3 (ECVAM, 1997), el ensayo sobre células madre embionarias (ECVAM, 2001) y el ensayo de micronúcleos in vitro (ECVAM, 2006). El desarrollo de este tipo de ensayos es un proceso largo y que ha de superar múltiples controles hasta su va- lidación, incluyendo estudios conjuntos entre laboratorios de distintos países. Como ejemplos más destacados de este tipo de iniciativas podemos citar los proyectos MEIC (Multicentre Evaluation of In Vitro Cytotoxicity) y EDIT (Evaluation – guided Development of New In Vitro Test Batteries) cuyas conclusiones generales apoyan la idea de que la mayor parte de los compuestos químicos ejercen sus efectos tóxicos en humanos a través de mecanismos generales de citotoxicidad (Seibert y col., 1996).
Entendemos por citotoxicidad aquellos efectos adversos o interferencias con es- tructuras y/o propiedades esenciales para supervivencia, proliferación y/o función celular (Walum, 1998). Entre todas las dianas de citotoxicidad posibles, algunas son más susceptibles que otras y, por tanto, han de monitorizarse adecuadamente en este tipo de estudios. Se trata de estructuras presentes en todos los tipos celulares y que participan en las funciones vitales de las células, de tal modo que su alteración puede provocar graves consecuencias.
El citoesqueleto es una de ellas, dado que microtúbulos y microfilamentos participan en funciones principales como arquitectura celular, adhesión, transporte citoplasmá- tico de vesículas y orgánulos y división celular. Junto con él, la membrana plasmática constituye otra de las dianas principales, dado que es el primer punto de interacción de cualquier xenobiótico y su integridad resulta fundamental para la homeostasis celular. El sistema de endomembranas formado por el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi participa en procesos vitales de síntesis de proteínas y lípidos, así como en el control de la endo y exocitosis. Se encuentra muy relacionado con el compartimento endosomal, encargado de procesos de reciclaje de orgánulos y diges- tión enzimática. La última diana citoplasmática a destacar son las mitocondrias, que
tanto metabólicas como de señalización.
La existencia de estas dianas prioritarias queda recogida en las directrices redacta- das por distintos organismos internacionales para la adecuada evaluación de la cito- toxicidad aguda (ICCVAM, 2001a, 2001b; ECVAM, 2002; ICCVAM, 2003). En todas ellas se propone un estudio escalonado en el cual, una vez elegidos adecuadamente el tipo celular y el tiempo de exposición, se han de emplear métodos que analicen pro- cesos tales como la integridad de membranas, citoesqueleto, metabolismo, síntesis y degradación ó liberación de constituyentes celulares o productos, regulación iónica y división celular (Seibert y col., 1996; ECVAM, 2002; ICCVAM, 2003).
Según el esquema que proponen, en primer lugar se ha de evaluar la inhibición de la proliferación del cultivo, valorando a continuación la viabilidad celular, primero me- diante marcadores metabólicos y después por marcadores de membrana. Siguiendo estas indicaciones, los últimos parámetros a evaluar serían aquellos relacionados con los procesos de diferenciación celular, ya sea funcional o morfológica (ICCVAM, 2003).
Los procesos citotóxicos pueden ser de tres clases, atendiendo al tipo de efectos que se detecten. La citotoxicidad basal es la forma más fundamental de toxicidad celular, implicando la alteración de al menos uno de los procesos o estructuras ante- riormente mencionados, y cuya sensibilidad es similar en tipos celulares de distinto origen.
La citotoxicidad selectiva refleja un daño organoespecífico, dado que algún tipo celu- lar diferenciado es más sensible a los efectos del compuesto tóxico que otros, como consecuencia de procesos de biotransformación, unión específica a receptores o me- canismos específicos de incorporación.
La toxicidad específica de función celular afecta a funciones intercelulares que no tienen por qué ser vitales para las células, pero sí para el organismo completo, como por ejemplo la producción y/o liberación de hormonas u otras moléculas de señalización.
La mayoría de compuestos químicos reflejan su toxicidad a nivel basal, mientras que sólo un reducido número de sustancias son tóxicas por interferencia con fun- ciones celulares organoespecíficas o extracelulares (Walum, 1998). Esta circunstancia sitúa a la citotoxicidad basal como punto esencial para la interpretación de los efectos específicos en las potenciales dianas celulares y tisulares del compuesto (Seibert y col., 1996).
A la vista de todos estos factores, resulta evidente que para realizar un estudio toxicológico con cultivos celulares se ha de diseñar una batería de ensayos capaz de
