NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS RECUBIERTAS DE AGAROSA MICROPOROSA PARA LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS Y ANTICUERPOS. CAPTURA RÁPIDA DE MICROORGANISMOS.
FRANCISCO ROJAS VEGA
Programa de doctorado en Microbiología Universidad Autónoma de Madrid Madrid, 2022
TESIS DOCTORAL
FRANCISCO ROJAS VEGA
NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS RECUBIERTAS DE AGAROSA MICROPOROSA PARA LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS Y ANTICUERPOS. CAPTURA RÁPIDA DE MICROORGANISMOS.
Memoria presentada para optar al grado de Doctor con mención industrial por la Universidad Autónoma de Madrid
DIRECTORES: JOSÉ MANUEL GUISÁN SEIJÁS / PILAR ARMISÉN GIL Instituto de Catálisis – CSIC / Agarose Bead Technologies S. L.
Programa de Doctorado en Microbiología Madrid, 2022
La presente Tesis Doctoral, es una Tesis Industrial cofinanciada por la Empresa Agarose Bead Technologies S.L - Programa de Ayudas para la realización de Doctorados Industriales en la Comunidad de Madrid (Orden 1921/2018)
Resumen
En los últimos años, está en auge la investigación con nanopartículas magnéticas. Debido a sus buenas propiedades fisicoquímicas y de biocompatibilidad, junto al hecho de que no son tóxicas, presentan multitud de aplicaciones en diversos campos de estudio como en química, medicina, física, biología, ciencia de materiales, industria… En esta Tesis se plantea la hipótesis de que nanopartículas magnéticas recubiertas de una capa de agarosa microporosa podrían ser soportes ideales para el diseño de inmunosensores.
Por un lado, se logró preparar nanopartículas magnéticas con propiedades casi ideales. En primer lugar, presentan una estructura final de la superficie perfectamente inerte para evitar la adsorción inespecífica de anticuerpos y proteínas sobre la superficie de las nanopartículas. En segundo lugar, están recubiertas de una capa de agarosa microporosa para que los anticuerpos se inmovilicen exclusivamente en la superficie de las nanopartículas y sirvan para reconocer células incapaces de penetrar en estructuras porosas. Por otro lado, constan de un tamaño lo suficientemente pequeño para que la superficie específica de las nanopartículas sea muy alta y sean capaces de inmovilizar una gran cantidad de enzima o anticuerpo por mg de nanopartícula. Además, no se produce sedimentación espontánea y son estables en suspensión manteniendo la atracción por imanes externos.
Por último, su superficie es fácilmente activable lo que permite desarrollar diferentes estrategias de inmovilización de enzimas y anticuerpos.
Por otra parte, se consiguió una activación muy sencilla de las nanopartículas asociada al proceso de entrecruzamiento de la agarosa con un agente bifuncional. Se logró preparar nanopartículas con una elevada densidad de grupos epóxido o grupos glioxil. Con estas nanopartículas se inmovilizaron enzimas y anticuerpos (tripsina, una alcohol deshidrogenasa como es la Tt27-HBDH y anticuerpos anti- peroxidasa) a pH 10 en presencia de acetilcisteína por inmovilización al azar por medio de las diferentes lisinas de la superficie de las proteínas.
Otros métodos de inmovilización a través de aminos terminales o de colas de histidina fueron también estudiados. Por último, estas nanopartículas también permiten el reconocimiento de trazas celulares de microorganismos como Escherichia coli.
Abstract
In recent years, research with magnetic nanoparticles has been on the rise. Due to their good physicochemical and biocompatibility, along with the fact that they are not toxic, they have a multitude of applications in different fields of study such as chemistry, medicine, physics, biology, materials science, industry. . . This Thesis hypothesizes that magnetic nanoparticles coated with a layer of microporous agarose could be ideal supports for the design of immunosensors.
On the one hand, it was possible to prepare magnetic nanoparticles with almost ideal properties. Firstly, they have a perfectly inert final surface structure to prevent non-specific adsorption of antibodies and proteins on the surface of the nanoparticles. Secondly, they are coated with a microporous surface of the agarose layer, so that the antibodies are immobilized exclusively on the surface of the nanoparticles and serve to recognize cells unable to penetrate the porous structures.
Furthermore, they are small enough so that the specific surface area of the nanoparticles is very high and they are capable of immobilizing a large amount of enzyme or antibody per mg of nanoparticle. In addition, no spontaneous sedimentation occurs and they are stable in suspension, maintaining the attraction by external magnets. Finally, their surface is easily activated, allowing the development of different enzyme and antibody immobilization strategies.
On the other hand, a very simple activation of the nanoparticles was achieved by cross-linking the agarose with a bifunctional agent.
Nanoparticles with a high density of epoxide groups or glyoxyl groups
were prepared. With these nanoparticles, enzymes and antibodies (trypsin, an alcohol dehydrogenase such as Tt27-HBDH and anti- peroxidase antibodies) were immobilized at pH 10 in the presence of acetylcysteine by random immobilization via the different lysines on the surface of the proteins. Other immobilization methods via terminal aminos or histidine tails were also studied. Finally, these nanoparticles also allow the recognition of cellular traces of microorganisms such as Escherichia coli.
Índice
Abreviaturas ... 1
1. Introducción ... 3
1.1. Inmunosensores ... 3
1.1.1. Inmunosensores tipo sándwich ... 5
1.2. Nanopartículas magnéticas ... 7
1.3. Recubrimiento de las nanopartículas magnéticas. Propiedades. ... 9
1.4. Agarosa microporosa y su activación ... 11
1.5. Química verde y biocatálisis ... 12
1.6. Inmovilización de enzimas y anticuerpos ... 14
1.6.1. Inmovilización mediante grupos quelato y aldehído ... 16
1.7. Inmovilización orientada de anticuerpos sobre agarosa ... 19
1.8. Detección de trazas de microorganismos ... 22
2. Objetivos ... 23
3. Materiales ... 25
4. Métodos ... 27
4.1. Formación de nanopartículas magnéticas de magnetita 10nm: coprecipitación ... 27
4.2. Formación de nanopartículas magnéticas de magnetita 24-30nm: precipitación oxidativa ... 27
4.3. Recubrimiento de las nanopartículas con agarosa ... 27
4.4. Cierre de los poros de la agarosa: secado y entrecruzamiento ... 31
4.5. Entrecruzamiento del gel de agarosa ... 34
4.6. Valoración de grupos gliceril: consumo de periodato de sodio ... 36
4.7. Formación de quelatos ... 36
4.8. Expresión y purificación de Tt27-HBDH de Thermus thermophilus .. 37
4.9. Determinación de la actividad enzimática de Tt27-HBDH ... 38
4.10. Determinación de la actividad enzimática de tripsina ... 39
4.11. Determinación de la actividad enzimática de HRP ... 39
4.12. Determinación de la concentración proteica ... 39
4.13. Determinación de la actividad enzimática de GFP y microscopía
láser confocal ... 40
4.14. Preparación de otros soportes ... 40
4.14.1. Preparación de agarosa glioxil ... 40
4.14.2. Preparación de agarosa monoamino-N-aminoetil (agarosa- MANAE) 41 4.14.3. Preparación de agarosa-epóxido ... 41
5. Resultados y discusión... 43
5.1. Inmovilización de anticuerpo anti-HRP sobre distintos soportes ... 43
5.2. Preparación de agarosa microporosa ... 47
5.3. Inmovilización de GFP ... 50
5.4. Síntesis de nanopartículas magnéticas de magnetita ... 53
5.4.1. Recubrimiento con agarosa... 53
5.5. Inmovilización de proteínas ... 56
5.5.1. Inmovilización de Tt27-HBDH ... 56
5.5.2. Inmovilización de tripsina ... 59
5.6. Inmovilización de anticuerpo anti-HRP ... 61
5.7. Captura de HRP por el anticuerpo inmovilizado ... 63
5.8. Síntesis de nuevas partículas magnéticas de magnetita ... 64
5.9. Estabilidad coloidal... 67
Esto demuestra, una vez más, que se dispone de unas nanopartículas con las que se puede trabajar en numerosas condiciones, y en concreto, en un amplio intervalo de valores de pH. ... 67
5.10. Inmovilización de Tt27-HBDH ... 68
5.11. Inmovilización de tripsina ... 69
5.12. Inmovilización de anticuerpo anti-HRP ... 71
5.13. Unión de HRP ... 72
5.14. Inmovilización de anticuerpos anti Escherichia coli ... 74
6. Conclusiones ... 79
7. Bibliografía ... 83
1
Abreviaturas
BCL – Esferas entrecruzadas (Beads crosslinked)
GFP – Proteína verde fluorescente (Green fluorescent protein) HRP – Peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase)
IDA – Ácido iminodiacético
MANAE – Monoamino-N-aminoetil MNP – Nanopartículas magnéticas
3
1. Introducción
1.1. Inmunosensores
Un biosensor se define como un dispositivo de análisis integrado por un componente biológico u otros materiales de reconocimiento que se asocian a un mecanismo para poder detectar cambios químicos, físicos, eléctricos, por la interacción entre el analito y el dispositivo (Turner y Newman, 1998). La medición se establece en base a la generación de señales de manera proporcional a la concentración de dicho analito en la reacción que tenga lugar (Nikhil et al., 2016). En cuanto al elemento biológico puede ser desde una célula, un receptor, un ácido nucleico, una enzima… En definitiva, se trata de que un componente (ligando) se inmovilice covalentemente sobre una matriz o un soporte y otro interactuante, que es el analito, se pase en disolución por el biosensor.
Cuando el elemento biológico que actúa como ligando es un anticuerpo entonces estos biosensores reciben el nombre de inmunosensores (Ocampo et al., 2007; Dupont, 2022). En este caso, los inmunosensores detectan la interacción que se establece entre el anticuerpo y su antígeno y tienen la ventaja de poder llevar a cabo la detección de manera continua y selectiva y dar resultados a tiempo real (Van Emon, 2011; Rosa et al., 2022). En los últimos años están cobrando mucha relevancia como herramientas de diagnóstico, detección de patógenos (Lazcka et al., 2007), control alimentario (Thakur, 2013), monitorización industrial (Meshram et al., 2018), entre otras muchas aplicaciones (Aydin et al., 2021).
4 Los anticuerpos son proteínas con capacidad de reconocer específicamente proteínas, péptidos, células, carbohidratos, etc. dentro de mezclas complejas. Estas estructuras reconocidas por los anticuerpos reciben, en general, el nombre de antígenos (Janeway, 2001; Al Qaraghuli et al., 2021).
Figura 1-1. Estructura general de un anticuerpo. (Fuente: www.inecol.mx) En cuanto a la estructura de los anticuerpos se pueden dividir en dos zonas o regiones: fragmento cristalizable y fragmento variable. La primera, comúnmente conocida como región Fc (por su nombre en inglés: crystallizable), es la misma para todos los anticuerpos que se obtienen de la misma fuente que suelen ser animales como ratón, cabra o conejo, entre otros. En cambio, esta región difiere en cada animal. La segunda, que se denomina región Fab (por su nombre en inglés:
antibody), consta de dos dominios idénticos en cada brazo del anticuerpo. Son las encargadas de reconocer a los antígenos y donde se establece la unión antígeno-anticuerpo. Cuando se ha de reconocer un antígeno, se suele establecer uniones con sitios concretos, de manera que estas regiones presentan variabilidad y son específicas para cada uno
5 de los antígenos (distintas proteínas, distintos microorganismos, etc.) Es esta última característica la que hace que esta región Fab sea la clave en el uso de anticuerpos como biosensores porque dentro de una compleja mezcla de células o de proteínas, va a reconocer solo a una de ellas (Reverbery, 2007; Schroeder y Cavacini, 2010; Chiu et al., 2019).
1.1.1. Inmunosensores tipo sándwich
La disponibilidad de inmunosensores va a posibilitar la implementación de inmunoensayos, los cuales pueden ser competitivos o no competitivos. Estos últimos utilizan concentraciones en exceso de los reactivos. Dentro de los inmunoensayos destacan los de inmunoabsorción ligados a enzimas, conocidos comúnmente como ELISA (acrónimo del inglés: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), en los cuales el marcaje es mediante una enzima. El subtipo que más se utiliza es el tipo sándwich por su gran sensibilidad (Cox et al., 2019; Alhajj y Farhana, 2022).
El procedimiento general es el siguiente (Osmekhina et al., 2010;
Shah y Maghsoudlou, 2016): un primer anticuerpo se fija sobre una superficie y va a ser el anticuerpo de captura. Este lleva a cabo la adsorción específica de un antígeno dentro de una mezcla compleja.
Después se lava y el antígeno capturado se cuantifica a través de un segundo anticuerpo que va a ser el anticuerpo de detección, que reconoce al mismo antígeno por un epítopo diferente. Este segundo anticuerpo debe proceder de una fuente animal distinta. A su vez, este anticuerpo será reconocido por un anticuerpo secundario que lleve
6 acoplada una enzima que cataliza la transformación de un sustrato, generando una señal detectable que puede ser cuantificada. Existen distintos métodos y alternativas:
Marcarlo con peroxidasa y medir la actividad de la enzima por técnicas espectrofotométricas o electroquímicas más sensibles (Nakane y Kawaoi, 1974). Requiere de un anticuerpo secundario.
Figura 1-2. Modelos de ELISA sandwich. Fuente:
https://www.antibody-creativebiolabs.com
Marcarlo con biotina y luego adsorber un complejo estreptavidina-peroxidasa (Guesdon et al., 1979). A continuación, se valora la actividad peroxidasa adsorbida al anticuerpo de detección. por la intensidad del color azul que se genere en la reacción de transformación realizada por la enzima (Gao et al; 2019). En este caso no se recurre a un anticuerpo secundario, sino que es el anticuerpo de detección quien lleva ya unida la biotina.
7 Figura 1-3. Ejemplo de un diseño de un ensayo ELISA tipo sándwich (Díaz
Maurino et al., 2019)
1.2. Nanopartículas magnéticas
Las nanopartículas son materiales que presentan un tamaño del orden de los nanómetros (10-9m). Debido a su forma, a su tamaño, a su superficie y a su composición presentan una gran versatilidad y son ideales para su uso en biomedicina, industria, producción de energía, entre otras aplicaciones (Gómez-Velasco et al., 2019). Como se ha comentado, para realizar el inmunoensayo se necesita una superficie donde anclar el primer anticuerpo, el de captura. Para ello, una de las mejores estructuras que se disponen son las nanopartículas magnéticas (en adelante, MNPs).
Debido a su pequeño tamaño, presentan una elevada superficie específica, lo cual constituye una enorme ventaja, de manera que van a tener una gran capacidad para la inmovilización de anticuerpos y en una elevada cantidad (Holzinger et al., 2014). Además, pueden atraerse muy
8 fácilmente por medio de imanes externos, lo cual facilita el lavado de las mismas y que se puedan diseñar, desarrollar y poner en marcha procedimientos sencillos y consecutivos de captura, lavado, detección y cuantificación. En especial, el uso de estas MNPs está cobrando mucha fuerza en el desarrollo de kits de pruebas diagnósticas (Mahapatra y Chandra, 2020; Farinha et al., 2021). Propiedades como su biocompatibilidad, biodegradabilidad, solubilidad en agua junto a que no suponen problemas de toxicidad, y en particular, las MNPs de hierro, puesto que es un bioelemento muy abundante en los seres vivos (Gallo et al., 2013), les dota de gran interés para todo lo mencionado (Pinelli et al., 2020).
En vista de una optimización máxima de los procesos y experimentos donde se empleen, las MNPs ideales deben reunir una serie de condiciones y características:
No sedimentar por acción de la gravedad y mantenerse estables en suspensión. Ello implica que no se requieran sistemas de agitación para su uso rutinario. Es necesario que tengan un tamaño relativamente pequeño, lo que, a su vez, posibilita la inmovilización de mayores cantidades de anticuerpo por miligramo de nanopartícula magnética.
Atracción y atrapamiento rápidos por imanes externos de neodimio que permitan que puedan ser reusadas muchas veces (Yuksel et al., 2018). Se trata de favorecer los pasos de lavado y que los ensayos sean más fáciles. Esto se traduce en la necesidad de tener un tamaño pequeño pero lo suficientemente grande como para poder cumplir con dichas características y que sea práctica la utilización de las MNPs.
9
Estabilidad coloidal frente a distintos niveles de pH que impidan su agregación durante los procesos que tengan lugar sean de activación, inmovilización, ensayo, etc.
Fácil capacidad de activación para la inmovilización posterior de enzimas y anticuerpos.
Tener una superficie final lo más inerte posible de manera que se evite la adsorción inespecífica de los anticuerpos de detección y de las moléculas que los modifican para su cuantificación.
1.3. Recubrimiento de las nanopartículas magnéticas.
Propiedades.
El recubrimiento y funcionalización de las MNPs con polímeros, y en particular con agarosa, no solo no afecta a sus propiedades, sino que además las mejora notablemente (Akbarzadeh et al., 2012; Biju, 2014).
Constituye una herramienta fundamental al modificar considerablemente la estructura de la superficie de las nanopartículas a través de los enlaces de hidrógeno que se producen entre la agarosa y la nanopartícula (Abdolrahimi et al., 2021).
La agarosa es un polisacárido obtenido desde las algas marinas con una estructura bastante particular que permite una gelificación espontánea (Zucca et al., 2016). Es un polímero lineal que contiene dos monosacáridos que se repiten: β-D-galactosa y 3,6-anhidro-α-L- galactosa, unidos por enlaces glicosídicos β(1-4) y α(1-3). El primer enlace se establece en la dirección β-D-galactosa 3,6-anhidro-α-L-galactosa
10 formando el disacárido neoagarobiosa; el segundo enlace es el que se establece en dirección 3,6-anhidro-α-L-galactosa β-D-galactosa dando lugar al disacárido conocido como agarobiosa. En la siguiente figura se observa la estructura básica del polímero.
Figura 1-4. Estructura química básica de la agarosa (Zucca et al., 2016).
La agarosa en su fórmula de esferas es altamente porosa, es muy inerte tanto física como químicamente y bastante hidrofílica. Se trata de un material renovable, biocompatible y biodegradable. Todas estas cualidades hacen que sea un material adecuado para su uso en biomateriales (Deszczynski, 2003) y para la inmovilización de enzimas con un amplio espectro de métodos de derivatización y activación valiéndose de modificaciones a nivel químico en los grupos hidroxilo que presentan (Guisán, 1988; Guisán, 1997; Suárez, 2018; Xu, 2022). Recubrir las nanopartículas, por tanto, facilitaría su activación y podría contribuir a incrementar la estabilidad coloidal de las mismas.
Las nanopartículas al adquirir este revestimiento, quedan protegidas frente a la agregación natural que experimentarían por su magnetismo.
La situación ideal sería que el recubrimiento sea solo de nanopartículas
11 aisladas con una fina y delgada capa de agarosa para no aumentar demasiado el tamaño original de las nanopartículas.
Además, para que los anticuerpos se inmovilicen solo a nivel de la superficie, es necesario obtener una agarosa que sea microporosa. Solo así serán también accesibles a los microorganismos (o trazas) puesto que son incapaces de penetrar en la estructura de la agarosa macroporosa y no podrían ser reconocidos por anticuerpos inmovilizados dentro de los poros. Esto representará un punto muy relevante de la presente Tesis Doctoral.
Figura 1-5. Representación gráfica de la unidad de nanopartícula magnética recubierta de una capa fina de agarosa.
1.4. Agarosa microporosa y su activación
Para poder obtener una agarosa microporosa, hay que modificar su estructura original. Para ello, el uso de codisolventes polares podría ser la clave porque ayudan al colapso de la estructura porosa, pero habrá que desarrollar el método más efectivo para tal fin, realizando una serie de experimentos preliminares.
Además, cuando la nueva estructura se fije con un agente bifuncional, se formarán entrecruzamientos que fijarán la estructura microporosa al mismo tiempo que se establecerán modificaciones
12 unipuntuales que conduzcan a la generación de grupos epóxido. Algunos de estos grupos pueden hidrolizarse y generar grupos dioles durante el propio proceso de entrecruzamiento que ocurre en un medio muy alcalino.
Los grupos epóxidos sirven para formar quelatos metálicos y los dioles oxidados con periodato de sodio generan grupos aldehído, que presentan capacidad para reaccionar fácilmente con enzimas y anticuerpos. La concentración de estos grupos aldehído se puede incrementar hidrolizando los epóxidos en medio alcalino, obteniendo así una capa de agarosa altamente activada con dioles que se transforman en aldehídos por oxidación con periodato (Guisán, 1988). Todos los detalles se verán en la sección de métodos.
1.5. Química verde y biocatálisis
Alrededor de 1990, comienza a tomar protagonismo la idea o término de química verde entendida como química sostenible. Se trata de poner en práctica y en valor un nuevo modelo de llevar a cabo la química, centrando los esfuerzos en la reducción de la cantidad de residuos que se generan como consecuencia de los procesos químicos.
Para ello, la clave es un correcto aprovechamiento de los reactivos y materias primas que se emplean junto con la disminución drástica del uso de productos tóxicos (Horvatth, 2007; de Marco, 2019).
Se trata de optimizar el uso de la energía y la materia prima de manera eficiente, mejorar los procesos químicos haciéndolos menos contaminantes y disminuyendo la producción de residuos junto a una mejor gestión ambiental a la hora de su eliminación (Ganesh, 2021).
13 La industria química es exitosa, pero ha implicado tradicionalmente un gran coste a nivel medioambiental. El desafío que tienen los científicos es desarrollar nuevos productos, procesos y servicios que logren beneficios medioambientales y también a otros niveles como el socioeconómico. Por tanto, además de lo ya comentado, hay que extender la durabilidad y reciclabilidad de los productos de tal modo que se potencie la competitividad industrial de manera más limpia y ecológica (Clark y Macquarrie, 2002).
A finales de la década de 1990 (Anastas y Warner, 1998) se publican los doce principios fundamentales de la química verde:
Prevenir formación de residuos
Economizar materiales
Menor toxicidad
Diseño eficaz y seguro
Reducir el de disolventes y otras sustancias auxiliares
Minimizar el consumo de la energía
Potenciar materias primas renovables
Menor derivatización innecesaria
Empleo de catalizadores
Biodegradabilidad
Seguimiento en tiempo real
Mayor seguridad química y ambiental
De todos ellos, lo que más nos concierne es el uso de los catalizadores, englobados dentro de la biocatálisis que cumple hasta 10 de estos principios. Por biocatálisis se entiende el empleo de catalizadores biológicos como pueden ser células y/o sus enzimas
14 aisladas destinado al incremento de la velocidad de una reacción química donde se generan compuestos de interés (Bommarius et al., 2011;
Hudlicky y Reed, 2009).
El principio en el que se asienta la biocatálisis es que las enzimas tienen gran especificidad por sus sustratos para actuar de forma natural, pero hay algunas enzimas con capacidad para reconocer y actuar sobre otros sustratos que no son naturales, lo cual permite que puedan provocarse ciertas biotransformaciones interesantes (Bornscheuer y Kazlauskas, 2004; Dias, 2019). Esto implica pues el uso de enzimas in vitro de manera más sostenible y limpia que cuando se usan por metodologías de la química tradicional.
1.6. Inmovilización de enzimas y anticuerpos
Como se ha expuesto, las enzimas son catalizadores con gran eficiencia y efectividad en numerosos procesos químicos gracias a su gran selectividad. Aumentan la celeridad de las reacciones donde participan y disminuyen el uso de tóxicos, así como los costes. Es por esto por lo que se han convertido en indispensables dentro de la industria de este campo.
Una de las técnicas o métodos industriales que más se llevan a cabo en una rutina de laboratorio es la inmovilización enzimática o proteica.
Esta técnica se puede definir como un proceso mediante el cual de manera reversible o irreversible se confina o localiza una enzima en una región concreta sobre algún medio, sustrato o soporte sólido que no sea soluble en el medio de reacción, generando otras formas compuestas
15 que siguen manteniendo las propiedades de la enzima junto con su actividad catalítica (Arroyo, 1998; Araña-Peña, 2021). A diferencia de las enzimas libres o solubles, las enzimas inmovilizadas son más fuertes y resistentes a cambios del ambiente, como en pH o en temperatura (Cherry y Fidantsef, 2003) y, además, pueden ser separadas de una mezcla de reacción y utilizadas en repetidos ciclos de reacción (Bernal et al., 2014), aunque dependerá del tipo de inmovilización y del soporte empleados (Liu, 2018). Esto se traducirá en un incremento en la eficiencia global del proceso (Yushkova, 2019).
El aumento del grado de estabilidad de las biomoléculas que confiere este proceso (Mateo et al., 2007) es debido a una serie de factores (Klibanov, 2001):
Estabilidad conformacional en las uniones multipuntuales que se establecen entre el soporte y la enzima, ganando resistencia frente a posibles desactivaciones tanto química como térmica.
Confieren protección contra proteasas
El microentorno enzima:soporte se ve sustancialmente modificado soportando un nuevo rango de condiciones.
Se evita que las moléculas agreguen.
Entre las distintas técnicas de inmovilización se encuentran según la interacción con el soporte: adsorción, unión covalente, atrapamiento, encapsulación o entrecruzamiento (Homaei et al., 2013; Yushkova, 2019).
16 Figura 1-6. Métodos de inmovilización enzimática tanto en soportes
orgánicos (imagen superior) o inorgánicos (imagen inferior).
La inmovilización covalente de la enzima, proteína, anticuerpo, etc.
al soporte permite que se mantenga estable durante todo el proceso y al quedar una unión irreversible, no se desprenderá la proteína y no se dará ningún tipo de contaminación. Cuando tiene lugar una reacción acuosa, se va a favorecer el desprendimiento de la proteína, de ahí la importancia de conseguir esa irreversibilidad en la unión. Además, ha de ser multipuntual para que dicha unión sea fuerte. Todo ello permite aumentar el espectro de los experimentos porque la enzima será estable en una mayor cantidad de medios y condiciones como pHs, temperaturas distintas… (López-Gallego et al., 2013; Fernández-Lorente et al., 2015).
1.6.1. Inmovilización mediante grupos quelato y aldehído
Los quelatos metálicos sirven para inmovilizar enzimas recombinantes conteniendo colas de poli histidina y también
17 anticuerpos, en concreto, por la base de su región Fc gracias a que presentan una zona muy rica en residuos de histidina (Liu et al., 2010;
Mateo et al., 2006; Xu et al., 2004).
El anticuerpo se fijará inicialmente por su región más rica en histidina sobre varios grupos quelato del soporte a pH neutro. La interacción tiene que ser multipuntual porque la unión entre una histidina y un grupo quelato es muy débil y, en concreto, con los quelatos de níquel se requieren varios residuos de histidina para establecer la interacción. Las histidinas dispersas por la región Fab no reaccionan mediante una interacción unipuntual. Los dos grupos amino terminales de la región Fab son los únicos aminos reactivos a pH neutro, pero reaccionan por unión simultánea de los dos residuos con dos grupos aldehído con extrema lentitud. De este modo, el anticuerpo quedará correctamente unido por la región Fc donde está la mayor densidad en histidinas (Batalla et al., 2012).
Cuando se dispone de soportes con grupos glioxil, la inmovilización va a producirse por la zona de la proteína más rica en grupos aminos primarios como los propios de las lisinas. Primero, se forman bases de Schiff (grupos imino) entre los aminos de la lisina y los aldehídos del soporte. Al ser la lisina un aminoácido muy reactivo cuando se encuentra desprotonado, hay que trabajar siempre con valores de pH superiores al pKa de sus grupos amino que es de 8.95-9.2 (según la fuente consultada) (Bünzli, 2009) para evitar así que reaccionen. Entonces, como esquema general (Figura 1-7), reaccionan primero los grupos aminos más reactivos que van orientando la proteína, después los de las lisinas dando lugar a que se generen bases de Schiff reversibles, y posteriormente, se reducen dichas bases para que sean irreversibles empleando NaBH4, que va a
18 permitir que se establezcan enlaces tipo amina secundaria. Además, también se logra que se reduzcan los aldehídos que habían quedado libres en el soporte a grupos hidroxilos (Guisán, 1988).
Figura 1-7. Inmovilización covalente multipuntual sobre glioxil-agarosa.
Los grupos aldehído sirven para inmovilizar a pH 10 (en ausencia de acetilcisteína, que es un estabilizante de bases de Schiff) proteínas y anticuerpos por sus regiones más ricas en lisina mediante inmovilización covalente multipuntual (Grazu et al., 2006). Esta inmovilización requiere una buena congruencia entre la superficie de la enzima y la superficie de la nanopartícula y eso no es siempre posible dada la baja congruencia entre la superficie de una nanopartícula pequeña y la superficie globular de una proteína.
Cuando los grupos aldehído intervienen con inmovilizaciones a pH 10 en presencia de acetilcisteína, reaccionan unipuntualmente con todas las lisinas del anticuerpo y por los grupos amino terminales. Este tipo de inmovilización va a ocasionar orientaciones muy diferentes siendo la mayoritaria la que se establece por la región más rica en residuos de lisina, similar a lo que ocurre en ausencia de acetilcisteína.
Estos grupos están muy cercanos a la superficie del soporte porque presentan un brazo espaciador muy corto (-O-CH2-CHO). Además, no presentan problemas de impedimentos estéricos para reacciones intramoleculares y las modificaciones químicas que inducen en las
19 enzimas son mínimos. Son ideales para diseñar soportes inertes e hidrofílicos (López- Gallego et al., 2020).
En caso de inmovilizar por grupos aldehído a pH 8.5 y en presencia de acetilcisteína, reaccionan fundamentalmente con los aminos terminales que tienen un pKa de 7.5 mientras que las lisinas no van a reaccionar. Estos aminos terminales están situados en la región Fab del anticuerpo y, por tanto, esta orientación tendría consecuencias negativas para el reconocimiento de antígenos, sobre todo cuando la superficie del soporte sea muy congruente con el anticuerpo (por ejemplo, como en los geles de agarosa). Sin embargo, cuando la superficie no es muy congruente (como en las MNPs), esta orientación puede tener interés.
1.7. Inmovilización orientada de anticuerpos sobre agarosa
Se estudiará la inmovilización de anticuerpos anti-peroxidasa (anti- HRP) para ver cuál es la mejor orientación. Inicialmente se emplearán geles de agarosa y anticuerpos anti-HRP siendo la HRP capaz de penetrar en la estructura porosa de la agarosa.
Figura 1-8. Regiones del anticuerpo y residuos predominantes.
20 En la Figura 1-8, se representan las regiones más significativas para la inmovilización de anticuerpo sobre geles de agarosa. Por un lado, las lisinas representadas en color azul están distribuidas por toda la superficie y la región más rica podría estar próxima a la base de la región Fc, que es donde interesa que se establezca la reacción de inmovilización orientada del anticuerpo. Otra zona muy interesante es la región rica en histidinas (color marrón rosado) que se encuentra también al fondo de la región Fc. Los aminos terminales (no mostrados en la imagen) se encuentran en las regiones Fab y, por tanto, no interesa que reaccionen.
Utilizando geles de agarosa como modelo, se estudiarán los diferentes métodos de inmovilización de anticuerpos anti-HRP para ver la mejor orientación para una posterior captura óptima de HRP. No se puede tener inmovilizado al completo un anticuerpo si luego no es capaz de capturar HRP en un buen porcentaje.
Respecto a las MNPs, los geles de agarosa tienen una mejor congruencia con la superficie de las proteínas, como se ha comentado, y posibilitan conocer las orientaciones más adecuadas para la detección de los antígenos. Quizás no todos los protocolos que sean válidos para los geles de agarosa sean reproducibles sobre MNPs. En general, las uniones covalentes multipuntuales son ahora mucho más complejas debido a la baja congruencia geométrica existente entre la superficie de las nanopartículas pequeñas y la superficie de las proteínas. También son menores los impedimentos estéricos para el reconocimiento de antígenos.
A continuación, se puede observar las distintas orientaciones o disposiciones que puede adoptar un anticuerpo cuando se adhiere al soporte (Quaglio et al; 2020) mediante inmovilización orientada (sobre
21 su región Fc) o mediante inmovilización al azar donde la unión puede establecerse por la región Fab (head-on), por el fondo de la región Fc (end-on), por un lateral quedando perpendicular (side on) o bien, quedar en paralelo al soporte en posición horizontal (lying on).
Figura 1-9. Orientaciones posibles de un anticuerpo frente a un proceso de inmovilización sobre soporte (Quaglio et al; 2020).
Una inmovilización orientada de los anticuerpos en los soportes es determinante y fundamental para una maximización de resultados en los biosensores que se diseñen sea en términos de reducción de tiempo, o en optimización de carga máxima que se puede detectar (Kausaite- Minkstimiene et al., 2010; Tajima et al., 2011; Liu y Yu, 2016; Shen et al., 2017).
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1.8. Detección de trazas de microorganismos
La detección rápida de trazas de microorganismos es de gran importancia tanto en tecnología e industria de alimentos, como a nivel medioambiental y sanitario. Un buen método para ello es el empleo de biosensores (Yoo y Lee, 2016; Nayak, 2009). En algunas especies más relevantes sobre todo en cuestiones de alimentación y procesado, su investigación y desarrollo está extendiéndose como en el caso de Escherichia coli (Subramanian et al; 2006; Tokarskyy y Marshall, 2008;
Malvano et al; 2018) o Salmonella (Oh et al., 2004; Melo et al., 2016; Silva et al., 2019) y también en Legionella, que puede contaminar circuitos de agua (Manera et al., 2013; Laribi et al., 2019), etc. En este sentido, los inmunosensores y en especial, aquellos con una buena orientación de los anticuerpos pueden ser de gran utilidad para acelerar procesos de control. Todo esto se traduciría en un mejor rendimiento a nivel industrial en cuanto a reducción de los tiempos necesarios para análisis de control sanitario y alimentación y, por tanto, mayor celeridad a la hora de completar todo el ciclo de producción y distribución del alimento (Ronkainen et al., 2010; Peraile et al., 2018).
En esta Tesis, ante los problemas seguridad de laboratorio que implica el manejo y trabajo con microorganismos patógenos, se plantea la detección de trazas de E. coli no patógenas utilizando biosensores de tipo sándwich.
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2. Objetivos
El objetivo principal de esta Tesis Doctoral consiste en desarrollar nuevas metodologías y estrategias que permitan diseñar inmunosensores que puedan capturar trazas de microorganismos con rapidez, de manera que se aceleren los procesos en los que puedan tener aplicación.
Para poder llegar a cumplir este objetivo principal, se divide el estudio en procesos y objetivos secundarios:
La preparación de MNPs óptimas para la inmovilización de enzimas y anticuerpos. Para ello, se propone el recubrimiento de las mismas con una capa de agarosa lo más fina y microporosa posible.
La caracterización de las mejores nanopartículas de acuerdo a las siguientes propiedades:
o Conseguir que tengan una superficie inerte que evite la adsorción inespecífica de anticuerpos y proteínas sobre la superficie de las MNPs.
o Una estructura microporosa para que los anticuerpos se inmovilicen únicamente en la superficie de las nanopartículas y sirvan para reconocer células incapaces de penetrar en estructuras porosas.
o Encontrar el tamaño ideal para que las MNP no sedimenten espontáneamente y se mantengan estables en suspensión, pero al mismo tiempo se atraigan con rapidez sobre imanes externos.
24 o Disponer de una superficie fácilmente activable para desarrollar diferentes estrategias de inmovilización de enzimas y anticuerpos.
Se estudiará la activación de la capa de agarosa y se estudiarán diferentes estrategias para poder llevar a cabo inmovilización de enzimas (tripsina, Tt27-HBDH) y anticuerpos anti-peroxidasa.
Se diseñará un inmunosensor para la detección de trazas de células de Escherichia coli.
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3. Materiales
Soportes
Agarosa liofilizada, 6% B y 10% B – Manufacturada en laboratorios de Agarose Bead Technologies S. L. (Madrid, España), empresa financiadora de esta Tesis Doctoral
Proveedor Enzimas
Generosamente donada por el profesor Dionisio Ureña (Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Madrid, España)
GFP (Green fluorescent protein)
Generosamente donada por el Profesor José Berenguer (Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Madrid, España)
Tt27-HBDH de Thermus
thermophilus
Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, EEUU)
Tripsina, albúmina de suero bovino (BSA), peroxidasa de rábano
Proveedor Cofactores
Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, EEUU)
Nicotinamida adenina dinucleótido (forma reducida) NADH
Proveedor Productos químicos Thermo Scientific (Rockford, Il,
EEUU)
BCA protein assay kit
Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, EEUU)
Borohidruro de sodio (NaBH4) Periodato de sodio (NaIO4) Ácido iminodiacético (IDA)
26 Cloruro de níquel (II)
Membranas de diálisis Panreac (Barcelona, España) Hidróxido de sodio (NaOH)
Yoduro de potasio (KI)
Hidrógeno carbonato de sodio, tampón bicarbonato (NaHCO3) Honeywell Fluka (Seelze,
Germany)
Fosfato de sodio monobásico monohidrato
Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU) Solución 30%
acrilamida/bisacrilamida Solución de bisacrilamida 2%
Anticuerpo anti Escherichia coli (cabra)
Anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado con HRP (conejo)
Anticuerpo anti Escherichia coli (conejo)
GE Healthcare (Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)
Marcadores de peso molecular para electroforesis de 14-97 kDa
Proveedor Sustratos
Alfa Aesar (Karlsruhe, Alemania)
Acetoacetato de etilo
Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, EEUU)
BAPNA (Nα-Benzoyl-DL-arginine p- nitroanilide hydrochloride)
*Los disolventes y el agente bifuncional utilizados no se incluyen por motivos de confidencialidad con la empresa.
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4. Métodos
4.1. Formación de nanopartículas magnéticas de magnetita 10nm: coprecipitación
Este método consta de dos pasos para sintetizar nanopartículas de óxido de hierro y su posterior recubrimiento. En el primer paso, las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizaron según el protocolo de coprecipitación descrito por Massart (1981). La síntesis comienza mezclando disoluciones de cloruros de hierro en medio básico. Tras varias reacciones y procesos de lavado y decantación se obtienen las nanopartículas. Los detalles del proceso se eliminan al tratarse de una Tesis Industrial.
4.2. Formación de nanopartículas magnéticas de magnetita 24-30nm: precipitación oxidativa
La síntesis de este nuevo tipo de MNPs se lleva a cabo partiendo de soluciones de Fe(II) en medio básico, pero al ser una Tesis Industrial, los detalles específicos no se describen (Vergés et al., 2008; Luengo, 2016).
4.3. Recubrimiento de las nanopartículas con agarosa
Para determinar cómo obtener un mejor recubrimiento, se realizaron distintas pruebas con distintos tipos de agarosa. Las más utilizadas en
28 nuestro laboratorio son 4% B, 6% B y 10% B conservadas en etanol que posteriormente se lavan con agua destilada para eliminar cualquier resto del disolvente y así poder trabajar con el soporte sólido. Pero desde Agarose Bead Technologies se nos facilitaron otros cuatro modelos en formato liofilizado directamente que variaban en factores como el contenido en sulfato, la fuerza de gel, el punto de gelificación o el punto de fusión. Por la manera de llevarse a cabo la disolución y el proceso en sí durante el recubrimiento, se optó por un modelo determinado que sí se disolvía correctamente y no quedaba con grumos (demasiado grandes en algunos modelos incluso). Dicho modelo y sus características más específicas no se mencionan por tratarse de una Tesis Industrial.
En protocolos previos de recubrimiento de nanopartículas con agarosa (Acebrón et al., 2016) siempre se había utilizado la misma proporción de agarosa que de nanopartículas puesto que no era importante tener agregados más grandes o pequeños, simplemente tener la muestra de MNPs recubiertas.
Pero, en esta Tesis, se busca obtener que solo una nanopartícula (o dos o tres) se recubra por agarosa constituyendo unidades independientes que no agreguen, permitiendo amplificar y potenciar cientos de veces la superficie disponible para la correcta inmovilización orientada de los anticuerpos. Por este motivo, se probaron diferentes proporciones de nanopartículas con agarosa y además se añadió un agente reductor, en busca del objetivo deseado. En la siguiente tabla se recogen las distintas situaciones:
29 mg de NP mg de agarosa mg agente reductor
5 5 5
2 5 5
1 5 5
5 1 5
Tabla 1. Distintas proporciones de MNPs y agarosa utilizadas en el estudio del mejor recubrimiento con agarosa.
Para analizar la eficacia de cada una de estas variaciones, sí se recurre a un análisis más detallado, el cual se puede conseguir gracias a las imágenes obtenidas por microscopía electrónica de transmisión. En esta Tesis, se utilizó un microscopio JEOL 1010 (operando a 100 KV). Las imágenes se tomaron con una cámara digital acoplada Gatan Erlangshen ES1000W a varias magnificaciones.
Como se pretende obtener nanopartículas aisladas y no obtener aglomerados, se incorporó en el análisis una técnica conocida como spray drying. Una vez que la muestra está preparada, se prepara una dilución y se hace pasar por un pistón conectado a una bombona de argón. Se optimizaron los siguientes parámetros: presión, número de pulsos del pistón, distancia del pistón a la rejilla… La muestra se deja caer sobre las rejillas donde se deposita la muestra, las cuales deben ser rejillas de carbono sin agujeros para que las nanopartículas no se cuelen entre medias. En algunas de las situaciones planteadas, se producían cambios notables en el color de las nanopartículas indicando que el material de las mismas ya no sería magnetita. Y además en la última fase del proceso, la diálisis, las membranas se desintegraban. Todas las muestras con agente reductor se vieron afectadas, con lo cual se repitió el experimento sin añadir el agente reductor. La mejor proporción para nuestro se determina en la sección de resultados (5.4).
30 Con independencia del procedimiento utilizado en la generación de las MNPs, una vez sintetizadas, se necesita recubrirlas con una capa de agarosa (Figura 4-1). Por un lado, se prepara una disolución de nanopartículas y otra de agarosa, ambas en medio básico. Ahora, la disolución con las nanopartículas se va añadiendo gota a gota sobre la disolución de agarosa. Este proceso se lleva a cabo en un baño ultrasónico termorregulado. Esta mezcla se sonica durante un tiempo determinado a 25○C. Transcurrido este tiempo, se somete la muestra a una diálisis extensiva durante 48 h con agitación (Massart, 1981). Se trabaja con pH muy básico cercano a 14 por la presencia de un medio muy básico y hay que intentar reducirlo al pH adecuado por razones de estabilidad.
Figura 4-1. Esquema del procedimiento de recubrimiento con agarosa de MNPs.
31 El paso de la sonicación es clave y uno de los más extensos, con lo que también se probaron distintos tiempos de sonicación (x, y, z, t) para intentar reducir las 6 h estipuladas en el protocolo de referencia. En los tres primeros tiempos se obtenía una mezcla muy inestable que sedimentaba con gran rapidez –incluso inmediatamente en el caso de x, con lo cual tras el estudio se fijó mantener la sonicación durante el tiempo t que fue el óptimo por permitir la obtención de una dispersión coloidal bastante estable y semejante a la obtenida con el tiempo de 6h.
Si se quiere sintetizar una mayor cantidad de nanopartículas aumentamos proporcionalmente las cantidades, pero considerando que el proceso ofrece mejores resultados si se trabaja con volúmenes más pequeños. Es muy importante la refrigeración y mantener el baño a temperatura constante puesto que aumentos de temperatura pueden dañar las nanopartículas e incluso cambiar la constitución de las mismas transformándose en otros minerales.
4.4. Cierre de los poros de la agarosa: secado y entrecruzamiento
Se necesita reducir el tamaño de las esferas de agarosa, y para ello, hay que cerrar los típicos poros que presentan en su estructura disminuyendo su diámetro por medio de tratamientos de secado.
En resumen, el procedimiento consiste en lavar la agarosa con disoluciones que contienen concentraciones crecientes de codisolventes polares (A, B, C y D) hasta terminar con el codisolvente puro y a distintas temperaturas entre 25○C y 100○C. Se trata de encontrar el método que
32 colapse más la estructura y permita la mayor reducción posible del tamaño.
Después de experimentar con los distintos disolventes, algunas condiciones se descartaron desde el inicio porque la disolución no era factible. La agarosa se quedaba con demasiados grumos a altas temperaturas y a altas concentraciones, con lo cual no eran métodos prácticos ni buenos, aunque pudieran colapsar los poros. A la vista de las imágenes que proporcionó el microscopio óptico, el disolvente D era el disolvente que ofrecía una mejor capacidad de disminución del tamaño de los poros, consiguiendo que la mayoría de esferas quedaran en unos 30-40 nm de diámetro y manteniendo su forma (imágenes mostradas en la sección de resultados 5.2).
Explicado un poco más en detalle, se pone en contacto la muestra con disoluciones del disolvente D en agua en concentraciones crecientes (siempre en la relación de volúmenes optimizada). Después de 30 minutos, se elimina el disolvente D anterior y se añade la nueva disolución otros 30 minutos, excepto en la disolución de 100% que se mantiene durante 2h. Todo ello se realiza a temperatura ambiente y en agitación constante en rodillos.
Para introducir un grado todavía mayor del cierre de los poros y el colapso de la agarosa, seguidamente del proceso de secado y sin dejar que la agarosa rehidrate, se continua con un proceso de entrecruzamiento con un agente bifuncional, que termina de fijar la estructura modificada. También esto fue analizado al microscopio electrónico y se observó cómo las esferas quedaban en unos 25-30 nm de diámetro (imágenes mostradas en la sección de resultados 5.2).
33 En dicho procedimiento las nanopartículas que ya están secadas con el disolvente D se añaden en proporción 1:50 (1 g) con una disolución de etanol al 50% en agua (50 ml). Además, esta disolución contiene NaOH 1M y NaBH4 a 10 mg/ml. Toda la mezcla se agita durante 5 minutos a 60○C y a continuación, se añaden 4 ml de agente bifuncional y se mantiene en agitación durante 2 h a 50○C (Guisán et al., 2004; Mateo et al., 2013).
Como en el caso del secado, también se realizaron pruebas en distintas condiciones tanto de temperaturas (de 25○C a 100○C) como de concentraciones hasta un 70%.
Si bien no se puede lograr el supuesto ideal de tener todos los poros absolutamente cerrados por completo, sí se consigue tener una agarosa con estructura microporosa, constituyendo un importante avance en este sentido, pues no se ha trabajado antes sobre soportes de agarosa que no sea porosa.
Como se ha comentado, no todas las MNPs tienen el mismo diámetro puesto que obtendremos una distribución de tamaños. Los agregados más grandes que se formen se corresponderán con muchas MNPs que no serían de interés. Estos agregados deben ser descartados para así tener solo la fracción más estable, que no sedimente y con diámetros de MNP más pequeños. Esto se puede conseguir simplemente por procesos de sedimentación, rescatando la fracción que no precipite.
Si el objetivo final de la presente Tesis es conseguir la inmovilización de trazas de células de microorganismos, estas no penetran en los poros de la agarosa al ser más grandes que el tamaño del poro. De esta manera, si hubiera quedado la tradicional estructura porosa, los anticuerpos se
34 inmovilizan tanto en la superficie de la agarosa como dentro de los poros, siendo este último grupo incapaz de captar las células por las razones comentadas. No se dispondría, por tanto, de un biosensor eficaz y se desperdiciaría gran cantidad de anticuerpo en el proceso.
4.5. Entrecruzamiento del gel de agarosa
Con este tratamiento se pretende obtener un soporte que presente una rigidez mayor. El agente bifuncional empleado consta de unos grupos reactivos que al interaccionar con las fibras de la agarosa (en concreto, entrecruzando dos hidroxilos de distintas cadenas de agarosa) conceden una gran resistencia mecánica al soporte. En esta reacción se generan grupos epóxidos que terminan abriéndose produciendo grupos gliceril al tratarse de un medio básico (en presencia de NaOH). Se obtienen unos 12.5 μmol de grupos gliceril /ml de gel.
Por tanto, si se activa la agarosa con el agente bifuncional se generan grupos epóxidos que son válidos para la inmovilización de ligandos, y grupos gliceril que se convierten en grupos glioxil (mediante oxidación con periodato de sodio), óptimos para inmovilizar enzimas mediante uniones covalentes y multipuntuales. Se obtiene después de la oxidación unos 60-85 μmol de grupos glioxil / ml de gel frente a los 12.5 μmol iniciales. Por diferencia entre los μmol consumidos tras la activación/hidrólisis y los μmol iniciales se obtienen unos 47.5-72.5 μmol de epóxidos (correspondencia con los grupos epóxidos que por apertura generarán nuevos dioles).
Es decir, con el propio entrecruzamiento ya se obtienen grupos gliceriles, pero si se provoca la apertura de los grupos epóxidos
35 aumentamos aún más los grupos gliceriles hasta 5 o 6 veces más. Para ello, se dejan las partículas en agitación durante 12 h (tratamiento overnight) en el mismo medio donde se lleva a cabo el entrecruzamiento, es decir, una disolución de disolvente D en agua al 50% con NaOH 1 M y agente reductor en la concentración óptima, a temperatura ambiente y sin la presencia de del agente bifuncional (para evitar que se vuelvan a generar grupos epóxidos). Después de este tratamiento, se sigue con la oxidación de los grupos con periodato de sodio.
Un tratamiento alternativo, cuyo funcionamiento se ha demostrado en agarosa, consiste en una hidrólisis (durante 2 o 3 h) con H2SO4 de las partículas ya entrecruzadas y posterior oxidación con NaI04. Este tratamiento resultó no ser tan efectivo sobre la agarosa que ya se encuentra recubriendo a las nanopartículas, puesto que quedaban unos 40 μmol de grupos glioxil / ml de gel. Por tanto, se optó por el tratamiento con overnight.
Figura 4-2. Valoración de los grupos gliceril introducidos en la activación (adaptación de Guisán, 1988).
36
4.6. Valoración de grupos gliceril: consumo de periodato de sodio
Mediante esta técnica denominada yodimetría se valora el consumo de gliceriles según consuman periodato de sodio (NaIO4). Queriendo introducir unos 100 μmol glioxil / ml de gel, se añade NaIO4 0.1 M y se agita en palas durante 2 h para que oxide. A continuación, se prepara en una cubeta 1 ml de KI al 10% y 1 ml de disolución saturada de NaHCO3 a pH 8.5. Después se añaden 40 μl de NaIO4 diluido 1:10 y se analiza el consumo de midiendo a una longitud de onda de 410 nm. Se establece un cociente entre el consumo de NaIO4 al inicio y al final del tiempo de oxidación según la fórmula:
(𝐴𝑏𝑠 𝑁𝑎𝐼𝑂4 − 𝐴𝑏𝑠 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)
(𝐴𝑏𝑠 𝑁𝑎𝐼𝑂4) 𝑥 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑖𝑙𝑒𝑠 /𝑔𝑒𝑙 𝑜𝑓𝑟𝑒𝑐𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑎𝑙 𝑠𝑜𝑝𝑜𝑟𝑡𝑒
= 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑖𝑙𝑒𝑠/𝑚𝑙 𝑔𝑒𝑙 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜𝑠
4.7. Formación de quelatos
Además de disponer de agarosa-glioxil, también se activó la agarosa con quelatos metálicos. Una vez que las nanopartículas estaban entrecruzadas, se funcionalizan con grupos epóxidos. Para ello, se ponen en contacto las nanopartículas (en proporción 1:10) con una disolución de NaHCO3 0.1 M conteniendo IDA 0.5 M a pH 11. El tiempo es de 2 h porque se había determinado previamente en los experimentos con la agarosa que los resultados eran buenos con esta duración.
37 Posteriormente, se descarta el sobrenadante y se vuelve a poner en contacto las nanopartículas en proporción 1:10 con una disolución de NiSO4 30 mg/ml y NaCl 0.5 M durante 1 h en agitación en palas (Guisán, 1988).
Estos quelatos permiten inmovilización a pH 7 pero no proporcionaban buenos resultados a pH 8.5 y pH 10, que son los valores de pH que se necesita para inmovilizar los anticuerpos. Por esto, se decidió centrar el esfuerzo en trabajar con la agarosa activada con grupos glioxil.
4.8. Expresión y purificación de Tt27-HBDH de Thermus thermophilus
El gen TTC0898 que codifica para la proteína Tt27-HBDH (alcohol deshidrogenasa) se clona en un plásmido pET22b para expresarse de manera recombinante en el organismo E. coli BL21 (DE3). La expresión se realiza en el medio de autoinducción ZY suplementado con ampicilina 0.1 mg/ml a una temperatura de 37○C durante 16 h. El pellet de células se recolecta tras centrifugar a 4000 rpm durante 30 minutos y luego se resuspende en tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 7. Esta suspensión se lisa en un sonicador durante 15 minutos con ciclos ON/OFF de 10 segundos a una amplitud del 20% en un baño de agua y hielo. A continuación, el lisado se centrifuga a 14000 rpm 30 minutos. El sobrenadante se somete a un choque térmico a 70○C durante 30 minutos para agregar las proteínas de E. coli y se centrifuga nuevamente otros 30 minutos a 14000 rpm. Por último, se realiza una diálisis frente a fosfato
38 de sodio 25 mM. Se analiza la pureza de la enzima por SDS-PAGE y su concentración se mide con el kit BCA de Pierce® (Kim et al., 2014;
Takenoya et al., 2018; Haywood et al., 1988).
Figura 4-3. Columna de cromatografía de afinidad empleada en la purificación de proteína.
En esta purificación la proteína tiene que someterse a cromatografía de afinidad en columna, la cual tiene dentro como soporte agarosa funcionalizada y activada con grupos epóxido y con níquel. Esta proteína tiene colas de histidina. Como el proceso ocurre en tampón fosfato con NaCl e imidazol, este compite con la histidina y va a permitir que vayan eluyendo las distintas fracciones hasta obtener la fracción de nuestra proteína purificada que luego se somete a una electroforesis en gel de poliacrilamida.
4.9. Determinación de la actividad enzimática de Tt27-HBDH La actividad de esta proteína se puede determinar en función del consumo de NADH durante 2 minutos medido a 340 nm en el
39 espectrofotómetro. Se establece la reacción de reducción usando como sustrato acetoacetato etilo 0.2 M y NADH 0.25 mM en tampón fosfato de sodio 0.1 M a pH 7 a una temperatura de 65○C (Rocha et al., 2009).
4.10. Determinación de la actividad enzimática de tripsina
La actividad de la tripsina se determina empleando BAPNA 0.2 mM como sustrato en tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 7 en presencia de un 30% de etanol. Se mide la absorbancia a 410 nm a 25○C (Echeverría, 2014).
4.11. Determinación de la actividad enzimática de HRP
La actividad enzimática de HRP se determina monitorizando la oxidación del sustrato (ABTS) a su catión (ABTS+) usando H2O2 como reactivo oxidante. Se mezcla ABTS 1mM y H2O2 1 mM en tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6 mezclado con la enzima para tener la mezcla de reacción. Se mide el incremento de absorbancia a 420 nm medido a 25○C (Yang, 2017).
4.12. Determinación de la concentración proteica
Para medir concentraciones de proteínas y de anticuerpos se utilizó el método BCA (basado en el ácido bicinconínico), usando un kit comercial de la casa Thermo Scientific y el protocolo que el fabricante recomienda (www.piercenet.com) utilizando siempre un blanco a partir
40 de BSA. Se obtuvieron los valores de absorbancia a una longitud de onda de 562 nm (Walker, 2009).
4.13. Determinación de la actividad enzimática de GFP y microscopía láser confocal
Se analiza la caída de absorbancia a una longitud de onda de 487 nm con medida a punto fijo cada 10 minutos (Shinoda et al., 2018). Se añaden unos 4 mg de GFP por cada mg de partícula.
Para el estudio de imágenes por microscopía láser confocal, se empleó un microscopio LSM710 (Zeiss) compuesto por un microscopio invertido de luz transmitida y epifluorescenia Observer.Z1 acoplado a un sistema confocal espectral. El programa de adquisición y análisis de imagen que maneja es Zen 2.3 SP1. La observación se realizó con el objetivo de 40x, un zoom de 0.7, laser de 488 y el resto de condiciones estándar. Se realizó en el Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols.
4.14. Preparación de otros soportes
Los estudios preliminares de esta Tesis se realizaron con agarosa sin nanopartículas, de manera que se prepararon distintos soportes de agarosa activada con distintos grupos.
4.14.1. Preparación de agarosa glioxil
Se preparó agarosa activada con grupos glioxil por esterificación de agarosa 6 BCL con glicidol y oxidación completa adicional de la gliceril- agarosa resultante con NaI04 como se había descrito previamente (Guisán, 1988).
41 4.14.2. Preparación de agarosa monoamino-N-aminoetil (agarosa-
MANAE)
La agarosa se activó con aminos primarios con un pKa muy bajo, tal y como se describió previamente (Bolívar et al., 2010).
4.14.3. Preparación de agarosa-epóxido
Esta síntesis se lleva a cabo en varias etapas. En la primera, 105 g de agarosa se resuspenden en una disolución que contiene 160 ml de acetona, 440 ml de agua destilada, 2 g de NaBH4 y 17,6 g de NaOH. Este proceso hay que hacerlo en hielo y muy lentamente para evitar la formación de grumos. Después, se añaden 110 ml de epiclorhidrina también muy poco a poco y en frío. Por último, se deja agitar en palas durante 16 h a temperatura ambiente.
En la siguiente etapa se disuelven 12 g de la agarosa preparada en 120 ml de disolución de NaHCO3 0.1 M e IDA 0.5 M a pH 11. Se deja agitando en palas a temperatura ambiente durante los tiempos que se consideren, en este caso: 2 h, 4 h, 8 h y 24 h.
Para concluir, se resuspenden estos soportes en una disolución con NiSO4 30 mg/ml y NaCl 0.5 M durante 1 h más.
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5. Resultados y discusión
5.1. Inmovilización de anticuerpo anti-HRP sobre distintos soportes
Se quiere encontrar el soporte que mejor permita inmovilizar anticuerpos. El anticuerpo de elección fue un anticuerpo modelo contra HRP. Cada soporte se funcionaliza con distintos grupos químicos, se prueban a distintos pHs, a distintos tiempos…
A continuación, se detalla cómo estos distintos soportes pueden producir mayor grado de inmovilización de anticuerpo y, por tanto, mayor captura de HRP.
Como ya se ha comentado, la inmovilización sobre soporte agarosa- glioxil (aldehídos) a pH 8.5 involucra los grupos amino terminales de la región constante del anticuerpo. Si tiene lugar a pH 10, son los residuos de lisina de la zona terminal del anticuerpo los que participan en el proceso. Cuando se trabaja con soportes con quelatos metálicos (epóxidos) la reacción se establece a pH 7 y la unión se produce también por los grupos amino terminales. De igual modo ocurre cuando es un soporte de MANAE.
La unión del anticuerpo anti-HRP sobre los distintos soportes (preparación explicada en métodos) proporciona los siguientes mg de anticuerpo por cada g de soporte.
