HEMOSTASIA HEMOSTASIA

HEMOSTASIA

1

E

l sistema hemostático constituye, junto al sistema inflamatorio y el inmune, un relevante mecanismo de defensa del organismo. Es bien conocido que la hemorragia ha sido un elemento muy destacado desde los primeros vestigios de la civilización. Ya en las pinturas del paleolítico que adornan las cuevas de Altamira, el sangrado en los animales es una imagen habitual. Por otra parte, a lo largo de la historia ha existido un interés constante por aclarar los mecanismos responsables de la hemorragia. Este hecho contrasta con el escaso interés despertado por la trombosis durante siglos. Hoy en día, sin embargo, el estudio de la trombo-sis concita grandes esfuerzos al ser la mayor causa de mortalidad1_{. En definitiva, la forma de}

expresión clínica de una anomalía del sistema hemostático se manifiesta por situaciones muy distintas, como es la diátesis hemorrágica, o el evento de oclusión vascular tras la generación del trombo. Esas dos manifestaciones clínicas expresan el desequilibrio de uno

de los brazos de la balanza hemostática.

Como muchos otros aspectos de la medicina moderna, el verdadero conocimiento de los mecanismos reguladores del sistema hemostático comenzó a ser científicamente entendi-do a lo largo del siglo pasaentendi-do. Durante los últimos veinticinco años, se ha puesto en eviden-cia la tremenda complejidad del sistema, en el que participan de forma concomitante un amplio número de proteínas plasmáticas y elementos celulares. Precisamente esa comple-jidad ha sido incluso utilizada como argumento de discusión entre las corrientes filosóficas de los ¨creacionistas¨ frente a los ¨evolucionistas¨2_.

1.1

1.1

HEMOSTASIA:

FUNDAMENTOS

Y BASES FISIOLÓGICAS

Dr. Vicente Vicente

El estudio de la trombosis concita

grandes esfuerzos al ser la mayor

causa de mortalidad

1

ASPECTOS EVOLUTIVOS

El sistema hemostático más sencillo del que tenemos constancia es el del limulus (Figura 1), un ¨fósil vivo¨ de 500 millones de años de antigüedad3_{. Su sistema hemostático se circunscribe}

a sus células circulantes (hemocitos), cuya función es la de formar un tapón reforzado por una proteína gelatinosa conocida como coagulina, ante agresiones externas o en respuesta a una invasión de endotoxina. Un sistema tan simple, presenta ya algunas de las características pro-pias del sistema totalmente desarrollado de los vertebrados superiores.

A la izquierda, limulus o cangrejo de herradura. En la imagen de la derecha se observa su sencillo sistema circulatorio, que va a integrar a dos mecanismos de defensa del organismo, el sistema in-mune y el de coagulación.

FIGURA 1.

Por una parte, anuncia la cascada enzimática de la coagulación sanguínea (Figura 2), donde una proteína precursora de la coagulina, el coagulógeno, es sensible a una serín proteasa cono-cida como coagulasa, para dar lugar de forma inmediata a la formación del coágulo y prevenir la exanguinación. Por otra parte, la participación celular, el hemocito, que podemos imaginarlo como un antecesor de la plaqueta.

Representación de un hemocito de limulus. Ante la presencia de un determinado patógeno o agente externo, se produce una cascada enzimática a través de los factores B y C que activan la actividad de la coagulasa para generar coagulina (molécula gelatinosa) a partir de coagulógeno.

Factor C Factor B

Coagulasa (serinproteasa)

Coagulógeno Coagulina

Amebocito (Hemocito) Agresión de germen

Gram (-) FIGURA 2.

Se ha construido una posible ruta de evolución del sistema hemostático (Figura 3), cuyo me-canismo de ensamblaje, mediante la duplicación de genes y la combinación aleatoria de exones, tuvo lugar durante un corto periodo de unos 50 millones de años. Durante los siguientes 450 mi-llones de años el sistema hemostático solamente ha experimentado pequeñas modificaciones3_.

Estos datos explican el alto grado de homología entre las proteínas que forman parte del propio sistema de coagulación y las pequeñas diferencias observadas entre especies.

FIGURA 3.

EVOLUCIÓN DEL SISTEMA DE COAGULACIÓN SANGUÍNEA

Posible relación evolutiva del siste-ma hemostático en vertebrados a partir de un antecesor putativo co-mún con invertebrados. Datos mos-trados en años. INVERTEBRADOS 450x106 600 X 106 50 X 106 Peces Anfibios

Reptiles Pájaros Mamíferos

1800 X 106

3500 X 106

El sistema hemostático constituye un activo y dinámico mecanismo de defensa del or-ganismo con la función de mantener constantemente permeable la luz vascular, restable-cerla en caso de obstrucción por un fenómeno trombótico y de reparar la lesión en la pared del vaso para impedir una excesiva pérdida sanguínea. Las manifestaciones clínicas de su desequilibrio, como ya hemos indicado, serán la tendencia hemorrágica o la trombótica. El conocimiento de este sistema es todavía limitado, y si bien se van definiendo las bases para su entendimiento, estamos lejos de conseguir asimilar las íntimas y múltiples interacciones entre sus proteínas, agrupadas clásicamente como proteínas procoagulantes, anticoagulan-tes y fibrinolíticas, así como su relación con otros sistemas igualmente complejos como el inmune, inflamatorio, tumoral, etc. En definitiva, el equilibrio hemostático es sin duda alguna, un proceso complejo y dinámico4_.

Mantener la hemostasia equilibrada o generar la formación de un trombo requiere una serie de reacciones perfectamente coordinadas donde los protagonistas están localizados

en diferentes instancias, como son los receptores de membrana, agonistas o ligandos plas-máticos circulantes o bien liberados de las propias plaquetas o de otros elementos celulares (endotelio, monocitos, etc.), y una articulada transmisión de señales bidireccionales intrace-lulares, etc.5,6

A continuación abordamos los fundamentos y bases fisiológicas del papel que juegan to-dos estos protagonistas con sus consecuentes interacciones. Iniciaremos la descripción co-mentando los principales integrantes que participan en el llamado “componente celular” del sistema hemostático (plaquetas y endotelio vascular), y continuaremos por el componente plasmático de la coagulación (proteínas procoagulantes, anticoagulantes y del sistema fibri-nolítico), pero en ningún momento debemos olvidar que ambos componentes, plasmático y celular, actúan e interaccionan simultáneamente. Sin esta intensa contribución constante el sistema hemostático no podría ejercer su función.

El sistema hemostático constituye un

activo y dinámico mecanismo de defensa

del organismo con la función de mantener

constantemente permeable la luz vascular,

restablecerla en caso de obstrucción por

un fenómeno trombótico y de reparar la

lesión en la pared del vaso para impedir una

excesiva pérdida sanguínea

INTERACCIÓN PLAQUETA/PARED VASCULAR

La integridad vascular es un elemento crucial e indispensable para que se mantenga el equilibrio y no se active el sistema hemostático. La pérdida de la continuidad endotelial

pro-picia la exposición de una superficie claramente trombogénica, como es el subendotelio vas-cular, a elementos celulares de la sangre, especialmente plaquetas, iniciando la interacción plaqueta-subendotelio que es un mecanismo desencadenante de la formación del trombo. Es bien conocido que superficies extrañas, sirva de ejemplo los stents, situaciones de desendo-telización o roturas de placas de ateroma, dan lugar a un proceso de generación de trombo donde la activación plaquetaria juega un papel muy relevante. En otras situaciones trombogé-nicas, como es un cuadro séptico, se genera trombina, enzima que tiene capacidad de activar el endotelio vascular y ocasionar la pérdida de su integridad. Diferentes datos experimentales nos muestran que altas concentraciones de trombina son capaces de generar un potente es-tado protrombótico por alteración de la pared vascular, lo que viene a sumarse al efecto de la activación del sistema de coagulación que también tiene lugar.

Diálogo plaqueta-endotelio

En un adulto el número de plaquetas circulantes es de aproximadamente 1x1012 _y

man-tienen contacto con una superficie revestida de endotelio vascular de unos 1000 m2_{. Pese a}

este contacto con el endotelio, pues las plaquetas tienden a circular por las zonas periféricas vasculares, en condiciones normales no hay fenómenos de adhesión, activación y agregación plaquetaria. Las plaquetas en reposo mantienen una forma discoide, y solamente tras su

activación cambian drásticamente de forma. El hecho de que no exista activación se debe en

buena medida al efecto inhibidor de activación plaquetaria que genera el endotelio, pues sintetiza de forma continua prostaglandina I₂ y óxido nítrico y metaboliza los estimuladores fisiológicos de la activación plaquetaria, como ADP y trombina. La prostaglandina I₂ y el óxido nítrico son inhibidores fisiológicos de la agregación plaquetaria.

La integridad vascular es un elemento

crucial e indispensable para que se

mantenga el equilibrio y no se active el

sistema hemostático

Cuando hay una desendotelización o alteración de la pared vascular las plaquetas se ac-tivarán. En primer lugar tendrán un cambio de forma, adquirirán la capacidad de ser una

partícula “pegajosa”, con alta capacidad de adherirse a diferentes superficies y dar lugar a un espacio prohemostático-protrombótico. Estos cambios morfológicos y funcionales van a

estar regidos en un primer momento por la activación e interacción de diferentes glicopro-teínas de superficie plaquetaria, que ejercen su función como receptores de superficie

pla-quetaria (Figura 4). En el inicio del fenómeno de la adhesión plapla-quetaria participan diferentes mecanismos: reclutamiento y sobreexpresión de receptores, así como formación de nuevos epítopes plaquetarios debido a los cambios generados en esos receptores. Las reacciones moleculares indicadas ocasionan cambio de la forma discoide de la plaqueta en reposo a la aparición de múltiples pseudópodos (plaqueta activada) que precede al fenómeno de secre-ción plaquetaria, que a su vez cierra el círculo de la activasecre-ción aportando más sustancias que ejercen su función agonista sobre los receptores plaquetarios (Figura 5).

Interacción de los diferentes agonistas plasmáticos (ADP, epinefrina, fibrinógeno, trombina, factor von Willebrand, etc.) y los presentes en la matriz subendotelial (colágeno, factor von Willebrand, etc.)

PAR-1

Trombina

Colágeno

Trombina

ADP

Epinefrina

T xA

₂

PAR-4

P 2Y

₁

P 2Y

₁₂

TP

Señal

Fuera-Dentro

Señal

Dentro-Fuera

Fibrinógeno

FvW

FvW

GPVI

GPIb/IX/V

α 2

A

Gα q

Gα 12

Gα i

Gα q

Gα 12

_{Gα q}

_{Gα i}

Gα z

α

IIb

β

3

α

2

β

1

ß

Gα q

+

-Gα 12

FIGURA 4.

Principales receptores plaquetarios

Los principales receptores plaquetarios con función definida en la formación del trombo son: las glicoproteínas de membrana, algunas de ellas caracterizadas por repeticiones fre-cuentes de leucina en su secuencia de aminoácidos, la familia de las integrinas, los

recep-tores de inmunoglobulinas y, finalmente, los receprecep-tores para agonistas solubles, conocidos

como “ligandos autocrinos”.

FIGURA 5.

ACTIVACIÓN PLAQUETARIA

A) Las plaquetas circulan en sangre con una dis-posición “discoide”.

B) Cuando experimentan activación, sufren una drástica modificación generando pseudópodos y elongaciones que facilitan la interacción con otras plaquetas y células circulantes.

C) Como última fase, se extiende la plaqueta (spreading) en una amplia superficie donde se ha adherido y activado.

A

B

• Receptor rico en leucina: Complejo glicoproteíco Ib-IX-V (GPIb-IX-V)

Cuando la plaqueta en reposo entra en contacto con el subendotelio, se va a poner en

marcha de forma inmediata el fenómeno de adhesión plaquetaria al factor von Willebrand

(FvW) presente en el subendotelio, y de manera similar al colágeno presente en la matriz

subendotelial. La interacción con el FvW tiene lugar a través de un complejo glicoproteico rico en leucina, como es el receptor GPIb-IX-V, que corresponde al primer fenómeno que da lugar a la adhesión y depósito plaquetario sobre la superficie subendotelial. La glicoproteína GPIb-IX-V, presente con unas 25 000 copias en la membrana plaquetaria, se liga al FvW depositado en el subendotelio, y no al circulante en el plasma, pues el presente en la matriz subendo-telial al estar unido al colágeno ha experimentado un cambio conformacional que propicia la interacción FvW-GPIb-IX-V. El FvW, además del que está presente en el subendotelio, se al-macena en los cuerpos de Weibel-Palade, y en los gránulos alfa de las células endoteliales y plaquetas, y también se encuentra circulante en el plasma. El FvW liberado del endotelio es el que se deposita en el subendotelio vascular por la unión con el colágeno tipo I y II allí presen-te. La repercusión clínica del defecto de la interacción GPIb-IX-V y FvW es muy manifiesta y bien conocida. Pacientes con trastornos congénitos del complejo rico en leucina (síndrome de Bernard-Soulier, SBS) o del FvW presente en el subendotelio (enfermedad de von Willebrand) muestran importantes problemas hemorrágicos por un defecto en la adhesión plaquetaria.

Por otra parte, el complejo GPIb-IX-V mantiene una estrecha conexión con el citoesqueleto

plaquetario, lo que justifica que los pacientes con SBS muestren plaquetas de gran tamaño

(ma-crotrombocitopenia). La interacción FvW con GPIb-IX-V además de ser crucial para el fenómeno de adhesión plaquetaria también es capaz de trasmitir una señal intracelular que ocasiona flujo de calcio y activación de integrinas, aspecto clave en la propagación del fenómeno de adhesión y al inicio de la activación plaquetaria.

Estudios en los últimos años han aportado un papel más extenso a la función del complejo GPIb-IX-V, puesto que se ha comprobado su interacción con varias proteínas plasmáticas y con receptores de otras células. Se ha demostrado el papel que tiene el complejo en el des-plazamiento (rolling) de las plaquetas en el endotelio mediado por selectina P, así como en el control de la interacción plaqueta-neutrófilo.

La interacción FvW con GPIb-IX-V, además

de ser crucial para el fenómeno de adhesión

plaquetaria, también es capaz de trasmitir una

señal intracelular que ocasiona flujo de calcio

y activación de integrinas, aspecto clave en la

propagación del fenómeno de adhesión y al inicio

Además de lo indicado, el receptor GPIb-IX-V tiene alta afinidad por la trombina, esto puede facilitar la activación de la familia de los receptores activados por proteasa (PARs), especial-mente el PAR-1 y PAR-4, y que pueden tener una importante repercusión fisiológica en la ac-tivación del sistema hemostático. Finalmente, otra función relacionada al complejo GPIb-IX-V ha sido su capacidad de ligar proteínas de coagulación como los factores XI, XII, cininógeno de alto peso molecular, y también de actuar como correceptor del FVIIa. En definitiva, el

com-plejo rico en leucina queda involucrado en la generación de actividad procoagulante en la superficie plaquetaria, con generación de trombina y fibrina.

Como acabamos de indicar, el complejo GPIb-IX-V además de jugar un papel fundamental

en el mecanismo de adhesión plaquetaria (Figura 6), está involucrado en los fenómenos de

activación plaquetaria, migración celular (neutrófilos) sobre el endotelio y en la activación del sistema de la coagulación sanguínea.

ADP

GpIIb/IIIa

GpIb

TxA₂ TROMBINA Agregación plaquetaria

ENDOTELIO Colágeno _expuesto

ADHESIÓN FvW

Cuando se produce una lesión endotelial, los componentes de la matriz subendotelial quedan en contacto con los elementos formes de la sangre, en concreto con las plaquetas que circulan en la zona periférica de los vasos. De esta forma el factor von Willebrand subendotelial que se encuentra ligado al colágeno se unirá al complejo GPIb-IX-V. Esa interacción será suficiente para trasmitir una señal intraplaquetaria que facilite activación celular que conllevará la modificación conformacional de algunas glicoproteínas plaquetarias, como la GPIIb/IIIa, que será reconocida por sus ligandos plasmáticos (factor von Willebrand y fibrinógeno, especialmente) dando lugar a puentes interplaquetarios, secreción celular y en definitiva a la agregación plaquetaria. El primer estímulo también será un estímulo suficiente para exponer nuevos receptores de membrana que también facilitarán la potenciación de la agregación plaquetaria y la generación de trombina en la superficie celular, dando lugar a la formación del trombo.

FIGURA 6.

• Integrinas plaquetarias

Los receptores plaquetarios que forman parte de la familia de las integrinas son requeridos

para una adhesión estable de las plaquetas a la pared del trombo, así como para el propio

crecimiento del mismo. La estructura de las integrinas se refleja por complejos heterodimé-ricos, cadenas alfa y beta, unidas de forma no covalente con localización transmembrana, con un corto tallo intracelular y uno largo extracelular. Un hecho común a las integrinas es que

para que adquieran su capacidad funcional necesitan un cambio conformacional.

- La integrina plaquetaria más relevante es _GPαIIbβ3, (conocida también como GPIIb/IIIa). Su presencia en la membrana plaquetaria sobrepasa las 80 000 copias. Hay un amplio número de proteínas que son los ligandos fisiológicos del complejo glicoproteico, como el fibri-nógeno, FvW plasmático, fibronectina, vitronectina y CD40L. La activación de la GPIIb/IIIa también se consigue con un buen número de agonistas solubles, como el ADP, epinefrina, tromboxano A₂ (TxA₂), trombina y colágeno. La unión con sus ligandos, en especial con el

FvW plasmático y fibrinógeno, es un elemento indispensable para se lleve adelante el fenómeno de la agregación plaquetaria. La ausencia del complejo GPIIb/IIIa

clínicamen-te se expresa por un cuadro hemorrágico grave, que es conocido como tromboasclínicamen-tenia de Glazmann. Precisamente, el papel crucial que tiene el complejo GPIIb/IIIa para que haya un adecuado funcionalismo plaquetario, explica que esa integrina se use como diana para terapia antiagregante, ejemplos son los fármacos como abciximab, eptifibatide y tirofibán. - La _{integrina GPα2β1}, (también conocida como GPIa/IIa), es un receptor que está presente

en la membrana plaquetaria entre 1500 y 4000 copias. Esta glicoproteína cuando se activa

liga a diferentes tipos de colágeno, y en la formación del trombo se ha visto que potencia la acción de adhesión plaquetaria ejercida por la GPIb-IX-VI y la GPVI.

En la superficie plaquetaria también están presentes otras integrinas, como la GPα2β1 y la

GPα6β1, capaces de ligar vitronectina y fibrinógeno la primera, y laminina la segunda. El papel

de ambas integrinas en el mecanismo de adhesión plaquetaria no parece ser muy relevante.

La ausencia del complejo GPIIb/IIIa

clínicamente se expresa por un cuadro

hemorrágico grave, que es conocido

como tromboastenia de Glazmann

• Familia de receptores de inmunoglobulinas y otros receptores adhesivos: GPIV y PECAM-1

La glicoproteína VI (GPVI) pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y es el

prin-cipal receptor del colágeno presente en la superficie plaquetaria. La deficiencia de GPVI

conlleva la existencia de un cuadro hemorrágico, aunque no muy intenso. Estudios in vivo como in vitro han mostrado que la GPVI es un receptor crucial para la formación del

trom-bo. El hecho de que la deficiencia de GPVI sea extremadamente rara justifica el poco avance

conseguido en el conocimiento detallado del papel que juega en la hemostasia humana. La GPVI CD36 se expresa en la superficie plaquetaria 10 000 a 25 000 copias, y también está presente en células mononucleares de sangre periférica, en macrófagos tisulares y células endoteliales. Entre otras funciones se le conoce como receptor de la trombospondina-1, y

también interacciona con lipoproteínas de baja densidad y otros lípidos. Su papel funcional

se circunscribe en la adhesión plaquetaria y también juega un papel en la generación del trombo, especialmente en situaciones donde existe dislipemia y estrés oxidativo.

Las moléculas de citoadhesión endotelial plaquetaria o receptores PECAM-1 participan ac-tivamente en la interacción en la adhesión celular plaqueta-endotelio. Adicionalmente hay datos experimentales que confirman que también PECAM-1 puede actuar como un regulador

negativo de la agregación plaquetaria.

La deficiencia de GPVI conlleva la

existencia de un cuadro hemorrágico,

aunque no muy intenso

• Receptores plaquetarios para agonistas solubles (ligandos solubles): ligando autocrinos

La activación plaquetaria puede inducirse por mediadores plasmáticos que se generan de diferentes matrices proteicas extracelulares. Esos mediadores, con propiedad activadora,

tienen una actividad transitoria, y la mayor parte se degradan o inactivan rápidamente.

Ejemplos de estas sustancias son los nucleótidos ADP y ATP (que se liberan al plasma de los gránulos densos plaquetarios), la serotonina, tromboxano A₂ y trombina, que se genera en la superficie plaquetaria. El TxA₂ es producido por la vía de la ciclooxigenasa plaquetaria (trom-boxano-sintetasa) tras el inicio de la activación plaquetaria.

Todos los agonistas solubles activan las plaquetas a través de la vía de proteínas G (GPCR).

• P₂Y₁₂: receptor del ADP que constituye una diana de primer orden en la terapia antiagregan-te en patología cardiovascular. Tiene un mecanismo de inhibición del receptor; un ejemplo son los fármacos: clopidogrel, prasugrel y ticagrelor que tienen una clara función inhibito-ria en la formación del trombo.

• P₂Y₁: otro receptor del ADP que se acopla a la vía de proteína Gq, y juega un papel predomi-nante en la respuesta inicial plaquetaria, a diferencia de P₂Y₁₂ que tiene su mayor actividad en fases más tardías.

Por otra parte, las plaquetas humanas tienen dos receptores para la trombina, el PAR-1 y el PAR-2. Su estimulación, especialmente de PAR-1, da lugar a una inducción muy potente de activación plaquetaria, en gran medida vehiculizada por la vía de la proteína G₄. Reciente-mente se ha abierto un nuevo campo de búsqueda de agentes de inhibición de la activación plaquetaria utilizando antagonistas de PAR-1.

La plaqueta cuenta con un receptor para el tromboxano A₂, que es inhibido por la ASS, y otro también para la serotonina, denominado receptor 5-HT_2A, que también se acopla a la vía de proteína G_q.

• Proteínas adhesivas

En numerosas ocasiones la formación del trombo se genera por la interacción plaquetaria con un vaso dañado. En esa interacción se desencadenan múltiples reacciones de forma concomi-tante, y a veces mediadas por un mismo estímulo que sigue distintas direcciones. Por una parte la plaqueta inicia su reacción con el fenómeno de adhesión que conlleva su activación inmedia-ta, que a su vez se potencia por la presencia de agonistas solubles. Las sustancias activadoras provienen en buena medida de las propias proteínas secretadas por la plaqueta, así como por enzimas activadas generadas en la activación del sistema de la coagulación, especialmente la trombina y otros factores de coagulación activados. Todo ello ocasiona el ambiente adecuado

para generar la formación del trombo que, en definitiva, es el producto de

adhesión/agrega-ción plaquetaria a la pared vascular, generaadhesión/agrega-ción de actividad procoagulante, y como paso final la generación de fibrina (Figura 7) que constituirá la “cimentación” del trombo.

La agregación plaquetaria es un elemento importante que contribuye de forma decisiva a la gene-ración de trombina in situ lo que da lugar a la formación del trombo. Los agregados plaquetarios se encuentran atrapados por redes de fibrina.

El trombo es el producto de adhesión/agregación

plaquetaria a la pared vascular, la generación de

fibrina que constituirá la “cimentación” del mismo

FIGURA 7.

Como ya indicamos previamente el FvW es una proteína con un especial protagonismo en el mecanismo de la formación del trombo. El FvW es una proteína constituida por múltiples subunidades, y cada subunidad contiene 2050 aminoácidos. Las subunidades están enlazadas por puentes disulfuro y dan lugar a grandes multímeros con una elevada masa molecular. El FvW que circula en una forma globular, y en situaciones de alta turbulencia adopta una disposición filamentosa o lineal adquiriendo una gran afinidad para ligarse al complejo GPIb-IX-V. Las grandes formas filamentosas tienen una actividad hemostáticamente mucho más

activa que las globulares, puesto que tienen posibilidad, a través de diferentes dominios de

su molécula, de interaccionar con plaquetas, endotelio y colágeno subendotelial. Deficiencias cuantitativas o cualitativas del FvW dan lugar a los diferentes tipos del trastorno hemorrágico conocido como enfermedad de von Willebrand.

Deficiencias cuantitativas o cualitativas del FvW dan

lugar a los diferentes tipos del trastorno hemorrágico

conocido como enfermedad de von Willebrand

En el plasma contamos con un mecanismo de seguridad para que no exista una hiperacti-vidad de las formas de alto peso molecular del FvW, se trata de la proteasa ADAMTS-13. Esa proteasa, de origen hepático, rompe los grandes multímeros del FvW en formas más

pe-queñas con reducida actividad hemostática. Modificaciones de los niveles circulantes

plas-máticos de ADAMTS-13 tienen su expresión clínica, pues un incremento de la proteasa puede interferir la adhesión plaqueta-FvW, y conlleva un mayor riesgo hemorrágico, mientras que una clara disminución de ADAMTS-13, que acontece en diferentes microangiopatías, incre-menta la interacción con plaquetas y por tanto un mayor riesgo oclusivo.

El colágeno fibrilar tipo I y IV que forman parte de la matriz subendotelial son potentes

activadores plaquetarios interaccionando con los receptores plaquetarios GPVI y GPα2β1,

fa-voreciendo la generación y crecimiento del trombo.

Una de las proteínas con mayor presencia cuantitativa en el plasma es el fibrinógeno, y también está presente en los gránulos alfa plaquetarios y en megacariocitos. El fibrinógeno

participa de forma importante en la agregación plaquetaria estableciendo puentes inter-plaquetarios al ligarse a la integrina GPIIb/IIIa de plaquetas cercanas. La fibronectina y la

vitronectina también son ligandos de las integrinas plaquetarias y juegan un papel en la acti-vación plaquetaria. Clínicamente el defecto más relevante de estas proteínas adhesivas es la deficiencia de fibrinógeno, debido especialmente a la incapacidad de poderse generar fibrina, aspecto crucial para la formación de un trombo estable.

Otras dos proteínas con propiedades adhesivas y que tienen un papel bien definido en el diálogo plaqueta-pared vascular son la trombospondina-1 y la laminina.

• La trombospondina-1 se libera de los gránulos alfa y se liga a la GPIV, contribuyendo a la acti-vación plaquetaria. Adicionalmente, la trombospondina-1 participa en el control del tamaño de los multímeros de FvW, y tiene otras funciones vinculadas a la cicatrización de heridas y en el proceso de angiogénesis.

• La laminina, que tiene lugar su síntesis en la célula endotelial y se deposita en la matriz extrace-lular y membrana basal, queda expuesta a plaquetas tras la lesión vascular. Cuando esto sucede, la laminina interacciona con las plaquetas a través de la α6β1 y facilita la relación con la GPVI.

En este sentido, debemos considerar que la aplicación de reciente metodología de

proteó-mica, metabolómica o genómica están ayudando a conocer mejor la interacción

plaque-ta-plaqueta, plaqueta-endotelio y en definitiva la formación del trombo. De igual manera, se está produciendo un notable avance en el conocimiento de detalles de la relación plaquetas

y endotelio con monocitos, y con proteínas del sistema de la coagulación. Puede servir de

ejemplo el importante papel que se le va confiriendo en estas relaciones al factor tisular (FT), liberado por los monocitos y circulante en plasma con las micropartículas, que son captura-das por el trombo en formación interaccionando con la selectina P, que se expresa en super-ficie de plaquetas activadas, y con el PSGL-1 presente en las propias micropartículas.

En los últimos años va tomando protagonismo el papel del material extracelular nuclear

expulsado de neutrófilos, y presumiblemente de otras células, (NETs, Neutrophils Extracellu-lar Traps) como mecanismo de iniciación y progresión del crecimiento del trombo7_{. El material}

liberado, ADN y otras proteínas como histonas y serín-proteasas, han mostrado su capacidad

de activar el sistema de coagulación y las plaquetas. Estos hallazgos no solamente abren

nue-vas vías de estudio de los mecanismos de generación del trombo, sino que también se puede plantear una nueva vía sugerente de una potencial profilaxis y tratamiento de la trombosis.

En este apartado nos hemos centrado específicamente en los aspectos que, a nuestro en-tender, son los más relevantes en los fundamentos y bases fisiológicas de la conocida, durante años, como “hemostasia primaria”, si bien sería mejor definirla como el “compartimento celu-lar” del sistema hemostático, ya que el fenómeno de la hemostasia y generación de trombo no conoce de apartados independientes, sino concomitantes y sinérgicos.

Las reacciones “fisiológicas” están a su vez moduladas y aceleradas por circunstancias pa-tológicas muy relevantes, como puede ser la lesión aterosclerótica y la ruptura de placa.

La lesión aterosclerótica conlleva una combinación de daño endotelial, depósito extenso de material lipídico en la íntima, activación inmune/inflamatoria mantenida, proliferación de célu-las de músculo liso vascular, remodelamiento de la matriz extravascular y todo ello asociado con las posibles alteraciones reológicas en el flujo vascular que puede condicionar la limitación de la permeabilidad vascular. Obviamente, aunque no es objetivo de este capítulo abordar este importante asunto, debemos tener presente todos estos hechos pues tienen una alta influencia en el funcionamiento del sistema hemostático8_.

El hallazgo de todas las múltiples y complejas interacciones que modulan el diálogo de pla-quetas con el endotelio, entre las mismas plapla-quetas y con otros elementos celulares circulan-tes, están ayudando de forma notable a entender la patogénesis de los trastornos trombóticos y, de igual forma, a plantear una terapia antitrombótica más específica. Hemos comentado un buen listado de moléculas que participan activamente en la formación del trombo, pero no cabe duda que todavía quedan actores por identificar.

PRUEBAS FUNCIONALES PLAQUETARIAS

Podemos avanzar que las pruebas funcionales plaquetarias durante muchos años han ido más orientadas como herramienta de diagnóstico para trombopatías hereditarias o adquiri-das y para la identificación del riesgo de sangrado, que para discriminar el riesgo trombótico9_.

En este apartado veremos los ensayos tradicionalmente utilizados (Figura 8 A y B), separados en tres apartados: métodos globales, otros más específicos y finalmente los aplicados recien-temente como la tromboelastografía y pruebas similares.

Pruebas globales

Una prueba clásica utilizada para evaluar globalmente el buen funcionamiento plaquetario ha sido el tiempo de sangrado o tiempo de hemorragia (TH), pero es bien conocido que tiene importantes limitaciones. De hecho se considera una prueba pobremente reproducible, y no predice el riesgo de sangrado quirúrgico. Es una prueba que ya se encuentra en claro

retro-ceso de utilización.

El sistema PFA-100 (DadeBehring Inc., Deerfield, IL, EE.UU.) intenta simular lo que sucede en hemostasia primaria a alto flujo (Figura 8C). Pequeñas cantidades de sangre citratada se aspiran a un flujo de 5000-6000 s-1 a través de un capilar. La sangre llega a una membrana con una apertura central de 150 μm recubierta con colágeno-epinefrina o con colágeno-ADP. La adhesión y agregación plaquetaria causan la oclusión de la apertura. Los resultados se informan como tiempos de oclusión en segundos. Actualmente, se considera que este ensayo carece de la sensibilidad y especificidad requeridas para su uso rutinario como test de criba-do. Tampoco tiene un papel definitivo ni establecido en la evaluación del riesgo de sangrado en relación con la terapia antiplaquetaria, ya que la aspirina puede prolongar el tiempo de oclusión con colágeno-epinefrina, pero el ensayo es insensible a las tienopiridinas.

Pruebas específicas

El estudio de la agregación plaquetaria (Figura 8D) es el método de referencia y el más em-pleado en la identificación y diagnóstico de la disfunción plaquetaria. El tipo de anticoagulante utilizado en la extracción de la muestra, los agonistas y las concentraciones utilizadas, la con-centración de plaquetas y el tipo de agregómetro son variables que tienen influencia sobre la prueba. Por otra parte, también puede cambiar su interpretación el parámetro resultado elegi-do en la prueba: porcentaje de agregación máxima, tiempo de inicio de agregación o lag-phase, y la pendiente o velocidad de agregación. En definitiva, pese al tiempo transcurrido desde el inicio de la aplicación de la agregación plaquetaria, siguen existiendo bastante cuestiones rela-cionadas con su estandarización. Si bien se consiguen parámetros reproducibles y útiles para el diagnóstico de trombopatías hereditarias, su utilidad es más que cuestionable para la

detec-ción de hiperactivadetec-ción plaquetaria, y en definitiva para detectar riesgo trombótico.

En un intento de solventar esos problemas, se han desarrollado métodos de “point of care”, más estandarizados y sencillos (Figura 8E). Veamos algunos de ellos:

• El ensayo rápido de funcionalidad plaquetaria (RPFA; VerifyNowAccumetrics, San Diego, CA) es un test que valora la agregación en sangre total de pequeñas esferas de poliestireno recubiertas de fibrinógeno en respuesta a un agonista, TRAP o ADP. Se comercializa como método de detección de resistencia a la aspirina y al clopidogrel, bien correlacionado con los ensayos de agregación y es sensible en la determinación de los efectos del bloqueo de GPIIb/IIIa, pero no puede emplearse para valorar otros aspectos de la hemostasia primaria. En definitiva, aunque es un test ampliamente probado no existe un consenso generalizado para su uso en las situaciones previamente comentadas.

• Platelet Works (Helena Laboratories, Beaumont, TX) también es un ensayo que analiza la agregación plaquetaria en sangre total, comparando los recuentos plaquetarios antes y tras la agregación con ADP o colágeno. También parece existir una buena correlación entre Platelet Works y la agregación convencional. Al igual que otras pruebas ya comentadas, se ha empleado para la detección de resistencia a la terapia antiplaquetaria, pero no ha podido ser validado convenientemente.

• El ensayo ImpactCone and Plate(let) Analyzer (CPA) (DiaMed, Israel) emplea sangre total que se expone a un flujo uniforme en una cubeta sobre la que gira un cono a gran velocidad, analizándose la adhesión plaquetaria a la superficie de la cubeta y la altura de los trombos. Este ensayo es sencillo de usar, y emplea condiciones de flujo fisiológicamente relevantes, siendo capaz de monitorizar el antagonismo de GPIIb/IIIa, al igual que aspirina y

clopi-dogrel. Sin embargo, son necesarios estudios adicionales que determinen su papel en el

A) Recuento y morfología plaquetaria; B) Estudio del tiempo de hemorragia (hoy ya en desuso por

su falta de reproducibilidad y aportación clínica); C) Sistema PFA-100 intenta simular lo que sucede en hemostasia primaria a alto flujo; D) Agregación plaquetaria utilizando diferentes agonistas (ADP, epinefrina, colágeno, trombina, tromboxano, etc.); E) Citometría de flujo que aporta información de la presencia de receptores específicos en la membrana plaquetaria.

A

C D

E

B

FIGURA 8.

LAS HERRAMIENTAS CLÁSICAS PARA EVALUAR LA NORMALIDAD DE LA “HEMOSTASIA PRIMARIA”

Tromboelastografía y similares

La tromboelastografía ya fue utilizada hace varias décadas y cuantifica en sangre total, la

fuerza y estabilidad de un trombo formado por la interacción de plaquetas, factores de coa-gulación, inhibidores y proteínas fibrinolíticas. Analiza tanto propiedades bioquímicas

(for-mación del trombo y disolución), como mecánicas. En determinados lugares, especialmente en el ambiente de anestesia y quirúrgico, se aplica la tromboelastografía para predicción del sangrado perioperatorio durante el bypass cardiopulmonar, monitorización de la hiper- o hipo-coagulabilidad tras cirugía general y la monitorización de agentes farmacológicos que afecten a la coagulación (heparina, HBPM, FVIIa), a las plaquetas (inhibidores de GPIIb/IIIa, aspirina) o a la fibrinólisis (aprotinina, estreptoquinasa). Hay varias modalidades de aparatos en tromboe-lastografía.

El tromboelastógrafo TEG (Haemoscope) mide la fuerza elástica (rigidez) de un trombo que se forma en el interior de un contenedor oscilante, mediante cambios en la fuerza de torsión que se trasmite a un sensor.

El ROTEG® _{(Pentapharm) es similar al anterior, excepto que un sistema óptico mide las}

os-cilaciones de un sensor en un contenedor estático, y la formación del coágulo se acelera por el uso de ácido elágico o factor tisular.

El Sonoclot® _{(Sienco) mide las propiedades viscoelásticas de la formación del trombo y su}

retracción mediante impedancia a un sensor en vibración.

El PAS (Platelet Analysis System, Hemodyne) mide la fuerza de contracción plaquetaria (di-nas) de un trombo formado entre dos superficies, estando la superior conectada a un trans-ductor.

Habiendo revisado previamente los diferentes procedimientos de estudio del funcionalismo plaquetario y su papel en la generación del trombo, en términos generales, podemos indicar que aún no disponemos de buenas herramientas que nos ayuden a establecer el riesgo

trombótico o controlar con precisión el efecto de los fármacos antiagregantes.

A continuación abordaremos el estudio del componente plasmático de la coagulación, que acompaña a la activación del componente celular y da lugar a que se lleven adelante las fun-ciones que tiene encomendadas el sistema hemostático.

COMPONENTE PLASMÁTICO DE LA COAGULACIÓN

Tal como hemos indicado, el sistema hemostático tiene tres funciones fundamentales:

ce-rrar un vaso dañado, mantener la sangre en un estado fluido y retirar los coágulos una vez restaurada la integridad vascular. En los años sesenta se describe un modelo enzimático

para explicar el proceso de la coagulación sanguínea, que recibió el nombre de cascada de

la coagulación sanguínea, el cual estaba compuesto por una vía denominada intrínseca, otra

extrínseca y una vía final común para ambos caminos de activación. Una amplia mayoría de los factores de la coagulación son proenzimas que se convierten en enzimas activas gracias a su interacción con otros factores previamente activados, dando lugar a una reacción en cade-na. El objeto final de esta cascada enzimática es la activación de la protrombina (factor II) y su paso a trombina, que ocasionará el paso de fibrinógeno (proteína soluble) a fibrina10_.

El estudio de la coagulación in vitro definió dos vías de activación de la coagulación, la vía extrínseca y la intrínseca.

• La vía extrínseca se activa al añadir al plasma un extracto de cerebro animal (tromboplas-tina tisular).

• Por otra parte, se observó que la sangre recogida en un tubo de cristal se coagulaba por sim-ple contacto con su pared, y a ese proceso enzimático se denominó vía intrínseca. La fase de activación inicial, en este caso con el vidrio o con otras superficies, se conoce como fase de contacto de la coagulación sanguínea. Sin embargo, hoy sabemos que las llamadas vías

intrínseca y extrínseca no funcionan de forma independiente in vivo, sino que sus

meca-nismos están íntimamente imbricados y podemos indicar que durante años ha sido utilizado este esquema como una forma académica para describir un complejo sistema como es el de la coagulación sanguínea. Hay que indicar, que pese a que estos esquemas se consideran lejanas de la realidad fisiológica, se siguen manteniendo por su utilidad para la exploración in vitro del sistema de la coagulación sanguínea.

Como hemos visto antes, una vez que se daña el vaso, las plaquetas sufren el proceso de adhe-sión, activación y agregación. A su vez, el factor tisular subendotelial expuesto al fluido sanguí-neo genera trazas de trombina, la cual actuará activando diferentes factores de la coagulación. La activación del sistema de la coagulación estará facilitado también por las propias plaquetas, y se irá haciendo de forma exponencial, hasta conseguir un trombo estable de fibrina10_.

El objeto final de esta cascada enzimática

es la activación de la protrombina y su

paso a trombina, que ocasionará el paso de

fibrinógeno (proteína soluble) a fibrina

10

Factores de la coagulación

El sistema de la coagulación está formado por una serie de proteínas plasmáticas deno-minadas factores de la coagulación.

La mayoría son proteínas que circulan en la sangre como zimógenos inactivos, los cuales se activan y transforman en enzimas con actividad serín-proteasa, es decir, con potencial pro-teolítico. Otros factores no tienen actividad proteolítica y actúan como cofactores, facilitando la eficacia de la reacción enzimática.

Nomenclatura de los factores de coagulación

• La designación de los factores de coagulación por un número romano indica el orden de descubrimiento de la proteína, no debiéndolo confundir con su cronología de participa-ción en la secuencia de la reacparticipa-ción enzimática. Por ejemplo, el factor III corresponde al FT y el factor IV se identifica con iones de calcio, esenciales para la progresión de la cas-cada del sistema de coagulación. Aunque, el factor VI entra en juego antes, esta proteína fue confirmada tiempo después.

• Cuando queremos representar la forma activada de un factor, a la derecha del número romano se coloca una “a”, por ejemplo el factor X activo lo identificamos como FXa. • La mayor parte de los factores de coagulación han sido descubiertos al caracterizar su

responsabilidad funcional de una diátesis hemorrágica congénita concreta.

A continuación enumeramos los factores con actividad proteolítica y aquellos con función

favorecedora (cofactores) de la reacción enzimática del sistema de la coagulación sanguínea.

• Enzimas proteolíticas (serín-proteasas): son las proteínas que circulan como precursores enzimáticos (zimógenos) y se transforman en enzimas activas durante la coagulación. A este grupo pertenecen la calicreína y los factores II, VII, IX, X, XI y XII, así como la proteína C, si bien esta última es un inhibidor o anticoagulante natural como veremos más adelante. • Cofactores: son necesarios para formar complejos con las enzimas y así fijarlas en la

su-perficie celular, así como acelerar la reacción enzimática. En este grupo se incluyen: el cininógeno de alto peso molecular, el FT, los fosfolípidos, el factor VIII y el V y la proteína S, también esta última con función inhibidora.

• Otras proteínas. Hay otros dos factores que intervienen directamente en las formación y es-tabilización del depósito de fibrina, como son el fibrinógeno y el factor XIII.

La mayor parte de los factores se sintetizan en el hígado, y algunos necesitan la presencia de la vitamina K para su normal constitución. Éstos son llamados factores vitamina K depen-dientes, y corresponden a los factores II, VII, IX y el X, y también lo son las proteínas inhibidoras

C y S. La misión de la vitamina K es intervenir en la adición de grupos carboxilo a los

extre-mos aminoterminal del ácido glutámico presente en estas proteínas, para originar residuos gamma-carboxiglutámicos (Gla). Los residuos Gla son fundamentales para que esas proteínas

se unan a los iones calcio y a los fosfolípidos,y de esta forma permitir que se lleve adelante el proceso coagulativo13_{. Ese proceso enzimático es la base de la terapia con antivitaminas K, pues}

las cumarinas (warfarina o el acenocumarol) inhiben la función de la vitamina K epóxido reduc-tasa (Figura 9).

La vitamina K participa en el proceso de gamma-carboxilación de los factores de coagulación. Los fár-macos antivitamina K o cumarínicos actúan a nivel de la recuperación de la vitamina K activa, desde la forma vitamina K epóxido, para el siguiente proceso de carboxilación.

Residuo Gla

a. glutámico

CUMARINICOS

FACTORES II, VII, IX Y X, PROTEÍNAS C Y S

Gamma-glutamil-carboxilasa

Epóxido-reductasas

Quinona-reductasas

VITAMINA K ACTIVA

QUINONA

EPÓXIDO

Residuo Gla

a. carboxiglutámico

FIGURA 9. METABOLISMO DE LA VITAMINA K

Sistema de la coagulación

Como veremos a continuación, el inicio de la cascada de la coagulación por el FT unido al

factor VII es esencial para el mantenimiento de la hemostasia fisiológica, sin embargo la

ex-presión inadecuada de FT (por ejemplo en una placa aterosclerótica) puede provocar trombosis. Por el contrario, la fase de contacto de la vía intrínseca, en concreto el papel de los factores XI y XII parecen tener un papel menor en mantener una hemostasia normal, pero cada vez hay más datos que apuntan que pueden modular la génesis del mecanismo trombótico10-12.

Una visión más reciente del sistema de la coagulación sanguínea lo divide en tres fases o

periodos: fase de iniciación, periodo de amplificación y fase de propagación, con una

participa-ción mixta de elementos celulares, especialmente de las plaquetas y el endotelio, y proteínas plasmáticas. Dado que participan conjuntamente la activación del sistema enzimático y la inte-racción con elementos celulares, especialmente las plaquetas, se ha reconocido a este sistema como modelo celular de la coagulación sanguínea10.

Dado que participan conjuntamente la

activación del sistema enzimático y la

interacción con elementos celulares,

especialmente las plaquetas, se ha

reconocido a este sistema como modelo

celular de la coagulación sanguínea

10

• Fase de iniciación

Sería en buena medida equivalente a la vía extrínseca clásica. Se inicia cuando el vaso se

rompe y las células subendoteliales, como las células musculares lisas o los fibroblastos, se exponen al torrente sanguíneo. Estas células expresan FT, el cual es clave para el inicio de la coagulación12_{. En condiciones normales el endotelio y los monocitos no expresan FT, pero}

pueden hacerlo en respuesta al daño endotelial o a la presencia de estímulos inflamatorios como toxinas, citoquinas, etc. El FT se une al factor VII provocando su proteólisis y activación, transformándose en factor VII activado (FVIIa). El complejo FT/FVIIa ejerce una acción proteo-lítica sobre los factores IX y X transformándolos en proteínas activas (FIXa y FXa). En la super-ficie celular el FXa se une al cofactor FVa y forma el complejo protrombinasa para catalizar el paso de protrombina (factor II) en trombina (Figura 10)12_.

Fase de iniciación del proceso de coagulación. Ante un estímulo, FT se une al factor VII y lo activa, FVIIa provoca la activación secuencial de FXa y FIXa. FXa unido a FVa forman el complejo protombinasa que cataliza la síntesis de trombina.

ESTÍMULO

PROTROMBINA

FT

Xa

IX

VIIa

FT

TROMBINA

Cel. con FT

VIIa

IXa

X

FIGURA 10.

• Fase de amplificación

Las trazas de trombina formadas en la fase anterior, van a ser capaces de activar las pla-quetas adheridas y convertir el factor V en FVa así como el factor VIII en FVIIIa (Figura 11).

El primero va a favorecer la activación del complejo protrombinasa, mientras que el FVIIIa actúa como cofactor para que el FIXa induzca la generación de más cantidad de FXa. Además, la trombina es capaz de convertir el factor XI en FXIa.

Fase de amplificación. La trombina producida en la fase anterior, es capaz de activar el resto de factores de la coagulación e incluso contribuir a una mayor activación plaquetaria, por activación del factor XI.

PLAQUETA

XIa

IXa

Va

VIIIa

IX

V

FvW-VIII

ESTÍMULO PROTROMBINA FT Xa IX VIIa FT TROMBINA Cel. con FT VIIa IXa X FIGURA 11. INICIO Y AMPLIFICACIÓN

• Fase de propagación

Esta fase ocurre en superficies con fosfolípidos procoagulantes expuestos, como por ejemplo las

membranas de plaquetas activadas (Figura 12). El FXIa convierte el factor IX en FIXa el cual se une

al FVIIIa, ambos junto a los fosfolípidos de la superficie celular forman el complejo tenasa, que ca-taliza el paso de factor X en FXa, el cual unido al FVa producen suficiente cantidad de trombina para formar grandes cantidades de fibrina. El último paso es la activación del factor XIII por la trombina. El FXIIIa cataliza la formación de enlaces covalentes entre las cadenas de fibrina dando lugar a un trombo de fibrina polimerizado y estable.

El fibrinógeno es una proteína dimérica formada por tres pares de cadenas polipéptídicas: alfa, beta y gamma, que están unidas entre sí por puentes disulfuro. La trombina actúa sobre el ex-tremo amino terminal de las cadenas alfa y beta rompiéndolas y liberando dos péptidos de bajo peso molecular, denominados fibrinopéptido A y B. Así la molécula de fibrinógeno se trasforma en monómeros de fibrina que polimerizan de forma instantánea. Sobre el polímero de fibrina actúa el FXIIIa, catalizando la formación de enlaces amida entre residuos de glutamina y lisina de las moléculas de fibrina para darles estabilidad.

Por tanto la fibrino-formación tiene tres etapas:

1) acción de la trombina sobre el fibrinógeno, generando los fibrinopéptidos A y B y monó-meros de fibrina

2) polimerización espontánea de los monómeros de fibrina

3) estabilización del coágulo de fibrina gracias a la formación de enlaces covalentes entre los monómeros de fibrina por acción de una transglutaminasa, el factor XIIIa

Fase de propagación. Esta ocurre en superficies que contienen fosfolípidos procoagulantes, como por ejemplo las plaquetas activadas. El FXIa convierte el factor IX en FIXa el cual se une al FVIIIa, ambos junto a los fosfolípidos de la superficie celular forman el complejo tenasa, catalizando el paso de factor X en FXa, el cual unido al FVa producen suficiente cantidad de trombina para formar grandes cantida-des de fibrina.

PLAQUETA

ACTIVADA

PROTROMBINA

FIBRINÓGENO

TROMBINA

FIBRINA

FIBRINA

ESTABLE

Va

_IXa

VIIIa

Xa

XIIIa

X

XIII

FIGURA 12. PROPAGACIÓN

• Fase de contacto

Según el modelo de coagulación vigente (Figura 13), la activación del factor XII y XI (fase de contacto) tan solo actuaría en la fase de amplificación11_.

Estudios con ratones han demostrado que a la vez que se activa el factor VII también lo hace la fase de contacto. Estos modelos animales han demostrado que mientras la fase de contac-to no juega ningún papel en la hemostasia, los pacientes o animales con deficiencia de FXII no sangran, y sin embargo si desarrollan trombosis.

Tres son los activadores que se han descrito capaces activar la fase de contacto: el coláge-no, los polifosfatos presentes en la superficie plaquetar y el ADN plasmático y NETS7_{. El FXIIa}

activaría a la precalicreína en calicreína, la cual unida al cininógeno de alto peso molecular, sería capaz de activar al factor XI11_.

La activación del FXII y FXI por todos esos elementos parece justificar el papel que juega

la vía de contacto promoviendo trombosis, y como su papel en la hemostasia parece ser

mínimo, se convierten en una atractiva diana terapéutica. Recientemente se ha publicado un ensayo donde un oligonucleótido anti-factor XI es efectivo reduciendo el riesgo de tromboem-bolismo venoso tras cirugía ortopédica sin incrementar el riesgo hemorrágico14_.

Por otro lado,la calicreína es capaz de inducir la liberación de bradiquinina que induce a la célula endotelial a liberar activador tisular del plasminógeno (que como veremos a continua-ción participa en el proceso fibrinolítico), formar superóxido y generar óxido nítrico con efecto vasodilatador.

Se muestra dónde actúan cada una de las proteínas anticoagulantes en relación con las distintas fases del proceso coagulatitvo.

IX X II Xa IIa IXa FT VIIa INICIACIÓN XI IX VIII Va XIa

IIa

IXa VIIIa Va Activación plaquetaria AMPLIFICACIÓN X II Xa IIa IXa VIIIa PROPAGACIÓN Xa Va TFPI PCa-PS AT Bloquea la iniciación y el principio de amplificación Bloquea la amplificación Bloquea la propagación INHIBICIÓN FIGURA 13.

REGULACIÓN DE LA COAGULACIÓN

Mecanismos reguladores de la coagulación

Existen dos mecanismos que regulan el proceso de la coagulación10_:

• Los inhibidores de las serín-proteasas: inhiben los factores activados. Estos son: la anti-trombina, el cofactor II de la heparina, el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), el inhi-bidor de la proteína C activada, el inhiinhi-bidor de C1-esterasa o α1-antitripsina.

- TFPI: proteasa inhibidora tipo Kunitz que juega un papel fundamental al inicio del proce-so de la coagulación12_{. Circula en plasma unido a lipoproteínas y un 20% de forma libre.}

Ante la agresión a un vaso se libera tanto de las plaquetas como del endotelio. La hepari-na también incrementa su concentración en plasma. Actúa de dos maneras, inhibiendo

directamente el FXa o actuando sobre el complejo FT/FVIIa/FXa. Recientemente se ha

descrito que la proteína S actúa como cofactor del TFPI en su inhibición del FXa.

- Antitrombina: principal inhibidor de la trombina y del FXa, aunque también es capaz de inhibir los factores IXa, XIa, XIIa, calicreína y plasmina, así como al FVIIa unido al FT. Su ac-tividad se incrementa mil veces en presencia de heparina. In vivo, esta función la cumplen los proteoglicanos tipo heparina (dermatán sulfato, heparán sulfato y condroitín sulfato) presentes en el endotelio vascular y necesarios para el reconocimiento de la antitrom-bina. La antitrombina presenta una estructura tridimensional donde el centro reactivo se encuentra parcialmente integrado en la molécula circulante. Además, se identifica una zona de unión a un pentasacárido presente en la heparina y a glucosaminoglicanos vasculares. Precisamente, la unión de la heparina a la antitrombina provoca un

cam-bio conformacional en la serpina, que libera completamente el centro reactivo. Este

cambio tiene importantes consecuencias funcionales, dado que la capacidad inhibitoria de esta conformación es 1000 veces superior a la de la molécula sin heparina. Pero no es este el único cambio conformacional que experimenta la antitrombina. La unión a las

proteasas que inhibe, conduce a la ruptura del centro reactivo de la antitrombina. Ese

es un proceso clave en el funcionamiento inhibitorio de la serpina que inactiva a la pro-teasa, y forma el casi indisociable complejo proteasa-serpina.

• Los reguladores de los cofactores, como es el sistema de la proteína C (proteína C, S y trombomodulina) que regula al FVa y FVIIIa.

- Sistema de la proteína C: desempeña un papel esencial en la regulación del proceso

de la coagulación sanguínea. La activación de la proteína C conduce a la inactivación de

los cofactores de la coagulación activados Va y VIIIa, que son esenciales para mantener la formación de trombina.

El sistema de la proteína C se activa cuando la trombina, se une a la trombomodulina sobre la superficie endotelial. La activación de la proteína C por el complejo trombi-na-trombomodulina es potenciada mediante la unión a su receptor específico, el re-ceptor endotelial de la proteína C (EPCR). La proteína C activada (PCa) unida a la forma soluble del EPCR no tiene propiedades anticoagulantes, lo que sugiere que la PCa debe disociarse del EPCR para poder exhibir su función anticoagulante. Una vez tiene lugar esta disociación, la PCa se une a la proteína S sobre la superficie de la célula

endote-lial o de la membrana plaquetaria, e inactiva proteolíticamente a los cofactores de la coagulación Va y VIIIa.

Sistema fibrinolítico

El sistema hemostático cuenta con un mecanismo de defensa final (Figura 14), como es la eliminación del trombo una vez constituido, después de la reparación del vaso. El principal

agente encargado de eliminar el trombo es una enzima proteolítica llamada plasmina. Su

precursor, el plasminógeno, se une a la fibrina y al activador tisular del plasminógeno (t-PA). Este complejo lleva a la transformación de la proenzima en su forma activa. La plasmina, en unión a la fibrina, no solo es capaz de romper la red polimérica de esta, sino que también ac-túa sobre el fibrinógeno y otros factores de la coagulación. Al actuar sobre la fibrina libera los productos de degradación de la fibrina, entre los cuales se encuentra el dímero D. El dímero D consiste en dos dominios D procedentes de dos monómeros de fibrina que han sido unidos covalentemente por el FXIIIa.

La plasmina está regulada por las células endoteliales que secretan dos serin-proteasas activadoras del plasminógeno, t-PA y el activador del plasminógeno tipo urokinasa, junto con dos inhibidores (PAI-1 y PAI-2). Además, la plasmina se inhibe por la α2-antiplasmina, la cual

actúa rápidamente una vez la plasmina se activa en plasma. La α2-antiplasmina se produce

en el hígado y es también secretada por las plaquetas.

Finalmente, existe una proenzima de una carboxipeptidasa-Β llamada inhibidor de la fibrinó-lisis activable por trombina o TAFI, que actúa sobre el complejo trombina-trombomodulina

y actúa inhibiendo la fibrinólisis, ya que el trombo parcialmente digerido puede ser estímulo

para la activación de más moléculas de plasminógeno. El FXIIIa facilita la unión de TAFI a la fi-brina, evitando que el recién formado coágulo de fibrina sea degradado prematuramente.

FX Protrombina Trombina Fibrinógeno Agregación plaquetaria Plasminogeno t-Pa Plasmina Productos de degradación de la fibrina Factor tisular FVIIa + + + Complejo protrombínico PAI-1

α

-2-AP TAFI + + -TROMBO Fibrina FIGURA 14.

REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DEL PROCESO FIBRINOLÍTICO

FXa FVa

La cascada de reacciones del proceso fibrinolítico se encuentra regulada de forma positiva y negativa por otras moléculas.

EXPLORACIÓN DE LA FASE PLASMÁTICA DE LA COAGULACIÓN

Para la realización de la mayoría de las pruebas de coagulación se necesita la obtención de plas-ma citratado (citrato trisódico a una concentración 0,129M) pobre en plaquetas. La obtención de la muestra se hace en tubos precargados con citrato sódico que se deben centrifugar a una velocidad de 3000 g durante 15 minutos en frío. La muestra debe ser procesada antes de las 4 horas, si se mantiene a 4-6 ºC o antes de las 2 horas si se mantiene a temperatura ambiente.

La visión académica de la coagulación en una fase intrínseca, extrínseca y común, es útil para la exploración de los tiempos de coagulación y de los factores que de ellos dependen15_.

Tiempo de protrombina

Se utiliza para evaluar la vía extrínseca de la coagulación y la vía común, lo cual implica la nor-malidad de los factores II, V, VII, X y fibrinógeno. Se obtiene tras añadir tromboplastina tisular al plas-ma, que aporta factor tisular y fosfolípidos necesarios para iniciar el proceso coagulativo junto con el calcio. Se expresa en segundos, razón normalizada o ratio (tiempo de protrombina del paciente/ tiempo de protrombina control) y como actividad (ratio x 100). Es normal una ratio de 0,8-1,2.

Una de las aplicaciones más importantes del tiempo de protrombina es la monitorización de los

fármacos anti-vitamina K. El control biológico de los fármacos anti-vitamina debe realizarse con el

tiempo de protrombina, expresando su resultado mediante la razón internacional normalizada, más conocida como INR. Para estandarizar el resultado y que el grado de anticoagulación de un paciente sea homogéneo en todos los laboratorios independientemente del reactivo que se use, en 1981 la OMS relacionó todas las tromboplastinas del mercado con tres tromboplastinas estándares prepa-radas por la propia OMS para ello utilizó un índice de sensibilidad internacional (ISI).

• El ISI corresponde a la pendiente de la recta de regresión que relaciona el resultado obtenido con cualquier tromboplastina frente a la de referencia, que se considera

• La OMS a partir de ese momento recomendaba usar tromboplastinas con ISI<1,5.

• Actualmente se utilizan tromboplastinas recombinantes cuyo ISI es aproximadamente 1.

INR= (TP paciente/TP normal)ISI

La mayoría de los pacientes anticoagulados deben mantener el INR entre 2,0-3,0, salvo los pacien-tes de muy alto riesgo cuyo INR debe estar entre 2,5-3,5 o incluso entre 3,0 y 4,0.

El control de INR puede realizarse mediante:

- Venopunción. Obtención de una muestra de plasma citratado y realización de la prueba en un coagulómetro automatizado.

- Punción capilar. Permite la determinación inmediata del INR tras obtención de sangre total por punción o microcorte en el pulpejo del dedo en un coagulómetro portátil. Utiliza una trom-boplastina con un ISI en torno a 1.

La cuantificación de cada uno de los factores, se hace mezclando la muestra del paciente con un plasma carente del factor a estudiar. La actividad obtenida será por tanto la actividad del fac-tor presente en el plasma a estudio.

Tiempo de tromboplastina parcial activada

Explora la fase de contacto o vía intrínseca, y su normalidad implica valores normales de los factores XII, XI, IX, X, VIII, V, II y fibrinógeno. Se obtiene tras activar la vía de contacto con

caolín, sílice micronizado o ácido elágico y añadiendo fosfolípidos y calcio (Figura 15). Se expre-sa mediante segundos y una razón normalizada. Es normal una ratio de 0,8-1,2.

El TTPA se prolonga ante fármacos con actividad anti-IIa, como es la heparina no

frac-cionada. De hecho se utiliza para su monitorización, debiendo estar la ratio entre 1,5-2,5.

También por tanto se alarga ante otros fármacos anti-IIa como son las hirudinas o el dabiga-trán. La determinación de los factores de la vía intrínseca, también se realiza con un plasma carente del factor a estudiar, para que así la actividad obtenida corresponda al factor presente en la muestra a estudio. Tromboplastina (FT+Ca2+₎ + Plasma paciente ALARGAMIENTO DE TP

Déficit de factores II, V, VII ó X

• Congénitos (hace falta tan solo un 5-10% para la hemostasia)

• Alargamiento aislado: déficit de FVII • Adquirido: déficit de vitamina K, hepatopatía.

• Paciente anticoagulado con dicumarínicos

SISTEMA EXTRÍNSECO TP

FII - FV - FVII - FX

VIIa / factor tisular Ca2+ _PL

Ca2+ _PL

Va

X Xa X

Protrombina TROMBINA

Se obtiene tras añadir tromboplastina tisular al plasma, que aporta factor tisular y fosfolípidos nece-sarios para iniciar el proceso coagulativo junto con el calcio. Se expresa en segundos, razón norma-lizada o ratio (tiempo de protrombina del paciente/tiempo de protrombina control) y como actividad (ratio x 100). Es normal una ratio de 0,8-1,2. Se utiliza para evaluar la vía extrínseca de la coagulación y la vía común, lo cual implica la normalidad de los factores II, V, VII y X. Se resume las principales causas de su alargamiento.

FIGURA 15.

Tiempo de trombina

Se obtiene al añadir trombina al plasma. Es extraordinariamente sensible a la presencia de fármacos anti-IIa. Existe una variedad del mismo, que es el tiempo de reptilase, donde la

trombina es sustituida por un veneno de serpiente que es insensible a heparina, por tanto ante la presencia de esta no se alarga el tiempo (Figura 16).

Para la determinación de la actividad anticoagulante del dabigatrán, se ha creado un tiempo de trombina diluido, donde mediante una curva de calibración pueden extrapolarse los tiempos obtenidos a la concentración del fármaco.

Tiempo de ecarina

Otra prueba derivada del tiempo de trombina, es el tiempo de ecarina. Esta prueba está basada en añadir un activador obtenido de serpiente que transforma la protrombina en

meizotrombi-na, un precursor lábil de trombina. Ambos compuestos son inhibidos por dabigatrán,

prolon-gando el tiempo de coagulación. Existe una correlación lineal entre la prolongación del tiempo de ecarina y la concentración de dabigatrán de la muestra.

Explora la fase de contacto o vía intrínseca, y su normalidad implica valores normales de los factores XII, XI, IX y VIII. Se obtiene tras activar la vía de contacto con caolín, sílice micronizado o ácido elágico y añadiendo fosfolípidos y calcio. Se expresa mediante segundos y una razón normalizada. Es normal

Ca++ + Activador & fosfolipidos + Plasma paciente ALARGAMIENTO DE TTPA • La causa más frecuente: MALA EXTRACCIÓN DE LA

MUESTRA POR CONTAMINACIÓN CON HEPARINA

• Déficit factorial

• Presencia de inhibidor. (A lúpico) • Otros: - Leucocitosis extremas - Sindrome hiperviscosidad (Waldeström) - Antibióticos (cefalosporinas) - Poliglobulias SISTEMA INTRÍNSECO TTPa

FVIII - FIX - FXI - FXII

Ca2 _{+ PL} Va VIIIa IX XI XII Ca2+ PK, HMWK IXa XIa XIIa Protrombina TROMBINA X Xa X FIGURA 16.

Determinación de fibrinógeno

Se realiza por el método von Clauss, que se basa en añadir un exceso de trombina a un plasma diluido, de tal forma que el tiempo de coagulación obtenido está en relación lineal

con la concentración de fibrinógeno.

Determinación del dímero D

La prueba de referencia y más exacta es la determinación del dímero D mediante ELISA o enzimo-inmuno ensayo. Sin embargo, esta es una técnica larga que no permite una

res-puesta rápida del laboratorio. Por tanto, se han buscado técnicas automatizadas. Desde hace años venimos utilizando técnicas basadas en aglutinación con látex. Consiste en enfrentar el

plasma del paciente a micropartículas de látex unidas a un anticuerpo frente al dímero D.

La unión del dímero D del plasma a su anticuerpo provoca una aglutinación de las partículas de látex y un cambio en la turbidez del plasma.

Actividad anti-Xa

Su determinación se realiza por cuantificación de actividad enzimática mediante métodos

cromogénicos. En ella se aporta el factor Xa y se mide la actividad Xa residual no inhibida por el complejo heparina/antitrombina de la muestra. Es útil para el control de tratamiento

con heparina de bajo peso molecular (HBPM). Esta misma técnica se emplea para el control