UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA EN INGENIERÍA Y TECNOLOGÍA AVANZADA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
TESIS
“Síntesis y caracterización de puntos cuánticos semiconductores encapsulados en liposomas.”
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
MAESTRO EN TECNOLOGÍA AVANZADA
PRESENTA
Ing. Rebeca Jiménez Rodríguez
Directoras de Tesis:
Dra. Janna Douda Dra. Tetyana Kryshtab
Ciudad de México, junio de 2018
II
III
IV
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
CARTA CESIÓN DE DERECHOS
En la Ciudad de México el día 20 de junio del año 2018, la que suscribe Rebeca Jiménez Rodríguez alumna del Programa de Maestría en Tecnología Avanzada con número de registro B160006, adscrito a la Unidad Profesional de Ingeniería y Tecnologías Avanzadas, manifiesta que es autora intelectual del presente trabajo de Tesis bajo la dirección de la Dra. Janna Douda y Dra. Tetyana Kryshtab y cede los derechos del trabajo intitulado
“Síntesis y caracterización de puntos cuánticos semiconductores encapsulados en liposomas.” Al Instituto Politécnico Nacional para su difusión con fines académicos y de investigación.
Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas o datos del trabajo sin el permiso expreso del autor y/o director del trabajo. Este puede ser obtenido escribiendo a la siguiente dirección [email protected]. Si el permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento correspondiente y citar la fuente del mismo.
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Rebeca Jiménez Rodríguez
V
“En el medio del odio, me pareció que había dentro de mí, un amor invencible. En medio de las lágrimas, me pareció que había dentro de mí, una sonrisa invencible. En medio del caos, me pareció que había dentro de mí, una calma invencible.
Me di cuenta, a pesar de todo, que …
En medio del invierno, había dentro de mí un verano invencible. Y eso me hace feliz. Porque no importa lo duro que el mundo empuje en mi contra, dentro de mí hay algo más fuerte, algo mejor, empujando de vuelta.”
Albert Camus
VI
Agradecimientos
Al Instituto Politécnico Nacional por mi educación.
A los proyectos de investigación SIP-IPN 2016-2018.
A la Sección de Posgrado en Tecnología Avanzada de la UPIITA-IPN.
A mis asesoras, la doctora Janna Douda y la doctora Tetyana Kryshtab por su paciencia, tiempo y por el conocimiento que compartieron conmigo para realizar este trabajo.
A la M. en C. Alejandra García Sotelo, del departamento de Física del CINVESTAV Unidad Zacatenco.
Al doctor José Saúl Arias Cerón, de la SEES del CINVESTAV Unidad Zacatenco.
Al doctor César González Vargas, por sus conocimientos.
Al doctor Alejandro Vivas Hernández, por sus consejos y orientación.
Al apoyo y al cariño incondicional de Ana y de Pedro.
A mi familia.
VII
ABSTRACT
The semiconductor quantum dots of CdSe have been widely studied for use in biomedical applications as an alternative to the fluorescent proteins that are currently used for the detection of cancer cells or damaged tissue [1]. However, the useful time of these proteins is limited because when they are illuminated by a light source they are turned off and cannot be used for more than 20 minutes, reducing the efficiency of the detection by not allowing a detailed work [2].
In this thesis, quantum dots of CdSe nuclei of different sizes have been synthesized by the hot injection method for its subsequent encapsulation in liposomes. The quantum dots have a range of emission maxima between 507nm (2.44 eV) and 552nm (2.29 eV).
The liposomes were prepared with different phospholipids by the hydration method of lipid bilayer to encapsulate the quantum dots of different sizes obtained previously. The hybrids obtained in addition to the quantum dots and liposomes were studied by different techniques: photoluminescence (PL), X-ray diffraction (XRD), spectroscopy Raman, Infrared (IR) spectroscopy, and Transmission Electron Microscopy (TEM).
Keywords: Quantum Dots, liposomes, encapsulation, photoluminescence
VIII
RESUMEN
Los puntos cuánticos semiconductores de CdSe han sido ampliamente estudiados para su uso en aplicaciones biomédicas como alternativa a las proteínas fluorescentes que se utilizan en la actualidad para la detección de células cancerosas o tejido dañado [1]. Sin embargo, el tiempo útil de estas proteínas es limitado debido a que al ser iluminadas por una fuente de luz se apagan y no pueden ser utilizadas por un tiempo mayor a los 20 minutos reduciendo la eficiencia de la detección al no permitir un trabajo a detalle [2].
En esta tesis han sido sintetizados puntos cuánticos núcleo de CdSe de diferentes tamaños por el método de inyección en caliente para su posterior encapsulamiento en liposomas.
Los puntos cuánticos tienen un intervalo de máximos de emisión entre 507nm (2.44 eV) y 552nm (2.29 eV).
Los liposomas fueron preparados con diferentes fosfolípidos por el método de hidratación de bicapa lipídica para encapsular los puntos cuánticos de diferentes tamaños obtenidos anteriormente. Los híbridos obtenidos además de los puntos cuánticos y los liposomas fueron estudiados por diferentes técnicas: Fotoluminiscencia (PL), difracción de rayos X (DRX), espectroscopía de Raman, espectroscopía de Infrarrojo (IR), y Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM).
Palabras claves: puntos cuánticos, lipomas, encapsulamiento, fotoluminiscencia
IX
OBJETIVOS
Objetivo general
o Sintetizar y estudiar las propiedades de puntos cuánticos semiconductores de núcleo de CdSe de diferente tamaño antes y después del encapsulamiento en liposomas
Objetivos particulares:
o Sintetizar de los puntos cuánticos semiconductores, núcleos de CdSe de diferente tamaño.
o Preparar liposomas por el método de hidratación de bicapa lipídica.
o Encapsular de los puntos cuánticos en liposomas.
o Caracterizar los puntos cuánticos antes y después del encapsulamiento en liposomas por diferentes técnicas: Difracción de Rayos X (DRX), Fotoluminiscencia (PL), Espectroscopia Raman, Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM).
X
JUSTIFICACIÓN
Con una variedad de métodos de preparación, combinación de diferentes concentraciones y variedades de fosfolípidos, tanto de origen natural como artificial, es posible encapsular puntos cuánticos semiconductores para pruebas biológicas, obteniendo diferentes propiedades y características que se ajusten perfectamente a las necesidades de cada ensayo clínico, en pruebas in vitro y en algunos casos en pruebas in vivo. Siendo inertes y biocompatibles y con una gran capacidad de ser bioconjugados con otras moléculas o proteínas para propósitos específicos.
Las ventajas de utilizar este híbrido sobre las proteínas fluorescentes con una mayor estabilidad, emisión en el espectro visible además de evitar la respuesta del sistema inmune al estar compuestos por los fosfolípidos de los cuales está hecha la membrana celular.
XI
NOMENCLATURA
CCM: concentración micelar crítica.
FL: fotoluminiscencia.
FWHM: del inglés full-width at half-maximum, ancho medio a la mitad del máximo
GUV: del inglés giant unilammellar vesicles, vesículas unilamelares gigantes.
MLV: del inglés. multilamellar vesicles, vesículas multilamelares.
PA: ácido fosfatídico.
PC: fosfatidilcolina.
PE: fosfatidiletanolamina.
PG: fosfatidilglicerol.
PS: fosfatidilserina.
PSD: del inglés, particle size distribution, distribución de tamaño de partículas QD: del inglés quantum dots, punto cuántico.
REV: del inglés reverse phase evaporation method, método de evaporación de inversión de fase.
SPIONs: del inglés superparamagnetic iron oxide nanoparticles, nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro
SUV: del inglés small unilamellar vesicles, vesículas unilamelares pequeñas.
XII
TEM: del inglés transmition electron microscopy, microscopía electrónica de transmisión.
TOP: trioctilfosfina
TOPO: óxido de trioctilfosfina
ULV: del inglés unilamellar vesicles, vesículas unilamelares.
XIII
Contenido
Abstract ... VII Resumen ... VIII Objetivos ... IX Justificación ... X Nomenclatura ... XI
Introducción ... 1
Capítulo 1: Estado del arte ... 4
1.1 Puntos cuánticos ... 8
1.1.1 Propiedades ópticas ... 12
1.1.2 Confinamiento cuántico ... 14
1.2 Síntesis de puntos cuánticos ... 16
1.2.1 Nucleación ... 20
1.3 Liposomas ... 23
1.3.1 Fosfolípidos ... 25
1.3.2 Formación de los liposomas ... 27
1.3.3 Clasificación de los liposomas ... 30
1.3.4 Tamaño de los liposomas ... 31
1.3.5 Liposomas convencionales ... 32
1.3.6 Liposomas de circulación larga ... 33
1.3.7 Mecanismo de encapsulamiento ... 34
1.4 Preparación de liposomas ... 34
1.4.1 Método de evaporación de inversión de fase ... 35
1.4.2 Método por sonicación ... 35
1.4.3 Método por deshidratación y rehidratación de vesículas ... 36
1.5 Técnicas de caracterización ... 36
1.5.1 Espectroscopía de Fotoluminiscencia ... 36
1.5.2 Espectroscopía Ultravioleta/Visible ... 38
1.5.3 Espectroscopía de Raman ... 39
XIV
1.5.4 Difracción de rayos X ... 42
1.5.5 Microscopía electrónica de transmisión (TEM) ... 48
1.5.6 Espectroscopía infrarroja (IR) ... 51
Capítulo 2: Métodos y muestras ... 55
2.1 Síntesis de puntos cuánticos de CdSe ... 55
2.1.1 Precipitación de los puntos cuánticos ... 57
2.2 Preparación de liposomas por método de hidratación de bicapa lipídica ... 59
Capítulo 3: Resultados y discusiones ... 61
3.1 Espectroscopía de Fotoluminiscencia ... 61
3.2 Absorción UV-vis ... 72
3.3 Espectroscopía de Raman ... 77
3.4 Difracción de Rayos X ... 83
3.5 Espectroscopía Infrarroja (IR) ... 88
3.6 Microscopio electrónico de transmisión (TEM) ... 91
Conclusiones ... 92
Trabajos futuros... 94
Productos obtenidos ... 95
Referencias ... 99
Índice de Figuras ... 107
Índice de Tablas ... 113
1
INTRODUCCIÓN
Los puntos cuánticos semiconductores han sido intensamente estudiados como alternativos a las proteínas fluorescentes y a los tintes orgánicos debido principalmente a que su emisión es mucho más brillante, estables frente a la radiación luminosa (fotoestabilidad), además pueden ser iluminados por una sola fuente de luz, lo que permite que sean utilizados en ensayos biológicos con gran éxito.
Las aplicaciones de los puntos cuánticos en el área biológica van desde el etiquetado de moléculas, células y tejidos tanto en pruebas in vivo como in vitro, para la identificación de material genético; imágenes del sistema vascular de animales pequeños y como método auxiliar en el diagnóstico de enfermedades, solo por mencionar algunas.
De las familias de semiconductores investigadas hasta la fecha, los materiales de la familia II-VI (ZnO, ZnS, CdS, CdSe, CdTe) han demostrado ser una opción viable para su uso en aplicaciones biológicas y biomédicas. [1]
Debido a que estás nanopartículas serán usadas para aplicaciones biológicas requieren ser solubilizadas en agua para evitar su posible agregación y la toxicidad de los solventes orgánicos en los cuales están suspendidas.
Muchos estudios han trabajado en la funcionalización de un gran número de nanopartículas con gran potencial para su aplicación en el diagnóstico médico; algunos de
2
ellos con liposomas, micelas poliméricas o SPIONs (superparamagnetic iron oxide nanoparticles) [3].
Los primeros reportes sobre las propiedades de los puntos cuánticos son de la década de los 1980 sin una posible aplicación.
Smith et al., reporta desde 2006, [4], el uso de PEG como recubrimiento de los puntos cuánticos (núcleos) como protección de las propiedades ópticas ante los cambios de pH (pH 1-14). Algo que es de vital importancia cuando se trata de medios biológicos.
Destaca la importancia de la intensidad de emisión de los puntos cuánticos, su estabilidad y la posibilidad de utilizar en una misma muestra más de un solo tamaño y lograr monitorear muestras por periodos de tiempo prolongados. Todo lo anterior sería el principio del desarrollo de marcadores robustos para sistemas biológicos.
Sharma et al., [5], reportan el uso de nanopartículas de oro, silicio o puntos cuánticos en general, como medio para el desarrollo de técnicas no invasivas en el área de imagenología sumándose a las múltiples técnicas que actualmente se utilizan. Cabe destacar que estás técnicas presentan serias limitaciones cuando se trata del estudio de enfermedades a nivel molecular.
Estas técnicas han demostrado tener poca efectividad cuando se trata de cuantificar los primeros cambios bioquímicos en el cuerpo del paciente, el surgimiento del primer puñado de células cancerosas o del aumento de sustancias que determinan la aparición de dicha enfermedad en el cuerpo.
3
Estudios recientes han demostrado que los puntos cuánticos al ser funcionalizados ligándolos covalentemente con moléculas de reconocimiento biológico como lo son péptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos o pequeñas moléculas resultan ser excelentes etiquetas biológicas. Lo anterior ha sido desarrollado por Bailey et al., desde 2004 [1].
Los reportes de nanopartículas funcionalizadas para tratamientos terapéuticos en el caso del cáncer reporta el uso de liposomas como sistemas de encapsulamiento para resolver el problema de la solubilización de los puntos cuánticos además de utilizar la superficie de dichos sistemas para agregar moléculas que pueden servir en la identificación y el tratamiento de diversos tipos de cáncer [3].
Trabajos más recientes apuntan a la posibilidad de encapsular puntos cuánticos en polietilenimina para poder interactuar con células además de aumentar la intensidad emisión de los puntos cuánticos comparados con puntos cuánticos sin encapsular [6].
Midha et al., [7] menciona el uso de puntos cuánticos en pruebas con diferentes tejidos usados para identificar el mecanismo de invasión del cáncer al igual que la identificación de los microambientes de los tumores todo ello para lograr personalizar los tratamientos y mejorar significativamente su eficacia.
Trabajos más recientes apuntan a la posibilidad de encapsular puntos cuánticos en estructuras conocidas comúnmente como liposomas con el objetivo de lograr utilizarlos en ensayos clínicos eliminando considerablemente la respuesta antagónica del sistema inmunológico del huésped, además de reducir posibles la toxicidad de los elementos que constituyen a los puntos cuánticos, González Vargas et al, 2016 [8].
4
Capítulo 1: Estado del arte
Actualmente, la medicina moderna se sirve de técnicas, métodos y análisis, utilizados solos o en conjunto, para lograr la detección de enfermedades, resultando en cierta medida ineficaces para la detección temprana y específica de enfermedades como el cáncer, que presentan desde el inicio indicios o pequeños cambios apenas perceptibles (cambios a nivel molecular), que sirven como indicadores del tipo de enfermedad presente en el huésped.
Las técnicas de diagnóstico de cáncer más comúnmente utilizadas en la práctica médica son imágenes médicas, biopsia de tejido y ensayos bionalalíticos en fluidos sanguíneos, las cuales son en la actualidad insuficientemente sensibles, y/o específicas para detectar muchos tipos de cáncer en estadios tempranos, y mucho menos lesiones precancerosas [4].
Con el objetivo de detectar enfermedades en los primeros estadios y lograr así comprender sus características particulares, actualmente se llevan a cabo ensayos clínicos con tintes de origen orgánico o proteínas fluorescentes como medio para lograr crear imágenes e identificar los cambios a nivel molecular, cambios en la bioquímica del huésped e incluso para identificar partes del código genético que con las pruebas comunes no es posible obtener.
Sin embargo, el uso de los tintes orgánicos se ve limitado debido a que al ser iluminados por un tiempo prolongado se reduce la intensidad de fluorescencia al no ser
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fotoestables debido a que la molécula en estado excitado ya sea singlete o triplete, experimenta un cambio estructural que en muchas ocasiones aniquila la habilidad de fluorescer convirtiéndose en una molécula fotoblanqueada Figura 1-1.
El fotoblanqueamiento, photobleaching, es el proceso mediante cual una molécula se vuelve no fluorescente. Esto puede ser causado por la fotólisis u otros mecanismos que rompen o abren los enlaces entre moléculas cercanas, siendo la fotooxidación la primera fase de muchos otros procesos [2].
Los tintes orgánicos en el estado excitado pueden degenerar en reacciones químicas o bioquímicas que dan lugar a la rápida degeneración y destrucción y por ende la perdida de la calidad de la imagen obtenida durante la medición. La excitación de estos tintes orgánicos requiere de fuentes de iluminación de varios ordenes de magnitud más intensas que la necesaria para la excitación de un solo fotón, lo que aumenta la probabilidad de degradación fotoquímica en un longevo estado triplete y la interacción de procesos ionizantes multi fotón [2].
En comparación con los tintes orgánicos y las proteínas fluorescentes, los puntos cuánticos son alrededor de 10-100 veces más estables contra el fotoblanqueamiento, y muestran un pico de emisión más estrecho y simétrico. [9] Además de poder ser excitados con una longitud de onda tan pequeña como su fluorescencia adicionada a que el espectro de emisión no presenta cola roja [10].
El intervalo de emisión de los puntos cuánticos varía dependiendo del tamaño y la composición, permitiendo ajustar su emisión a regiones donde las células no
6
autofluorescen, regiones conocidas como ventanas biologías cuya emisión esta entre 700- 900 nm. Los puntos cuánticos de CdSe emiten entre 450-650 nm, los de CdTe entre 500- 750 nm.
Figura 1-1 Pérdida de la intensidad de fluorescencia de tres pruebas, unido al ADN (DAPI, azul), mitocondria (Mito Tracker Red CMXRos, rojo) y filamento de actina (BODIPY-FL phallacidin, verde) en las células del endotelio de la arteria pulmonar bovina fija (BPAE). La excitación de dos fotones fue proporcionada por un Leica TCS SP2 AOBS microscopio confocal acoplado a un láser de zafiro titanio ajustable ultrarrápido Chameleon-XR (Coherent, Santa Clara, CA) a través del puerto IR. El ancho de pulso era aumentado a picosegundos desde 140 fs, 760 nm de longitud de onda, 20mW de potencia promedio en la entrada del cabezal de escaneo. La serie temporal se adquirió a una tasa de729ms por imagen cada 6 s. Las dimensiones de la imagen son 512 x 512 píxeles sobre 79,76 x 79,76 mm2. (Imágenes recogidas por Paolo Bianchini, LAMBS-MicroScoBio, Universidad de Génova, http://www.lambs.it) [2]
7
Dos estrategias generales han sido desarrolladas para dispersar los puntos cuánticos en soluciones buffer para uso biológico. En el primer acercamiento, la monocapa del ligando hidrofóbico en la superficie del punto cuántico se debe intercambiar por un ligando hidrofílico, pero este método tiende a causar una agregación de la partícula y un decremento en la eficiencia fluorescente. Alternativamente, los ligandos hidrofóbicos nativos pueden ser retenidos en la superficie del punto cuántico hecho soluble a través de la absorción de polímeros anfifílicos que contengan un segmento hidrofóbico (principalmente hidrocarburos) y un segmento hidrofílico (como polietilenglicol (PEG) o múltiples grupos carboxilos) [4].
Este método de encapsulamiento produce puntos cuánticos que pueden ser dispersados en soluciones acuosas y permanecer estables por largos períodos de tiempo debido a la bicapa hidrofóbica protectora que rodea a cada punto cuántico a través de las interacciones hidrofóbicas [9].
La tecnología de encapsulamiento en liposomas es un nuevo método encargado de encapsular numerosos materiales dentro de pequeñas formas llamadas liposomas; al estar compuestos de lípidos naturales o sintéticos resultan ser biológicamente inertes, biodegradables y con una baja toxicidad, además de que el contenido de los liposomas estará protegido contra la oxidación y la degradación [11].
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1.1 Puntos cuánticos
Los puntos cuánticos son partículas cristalinas con un diámetro entre 1-10 nm, compuestos de material semiconductor con un aproximado de entre 200-10 000 átomos, cuyas propiedades ópticas y electrónicas dependen fundamentalmente del tamaño de la partícula.
Este tipo de estructuras presentan confinamiento cuántico en tres dimensiones espaciales que en el material volumétrico no se presenta. También son conocidos como sistemas quasi-cero-dimensiones ya que los grados de libertad en el mismo son 0.
La partícula o punto cuántico es suficientemente pequeña para ser llamada un “átomo artificial” (a consecuencia de algunas similitudes en la estructura energética), caracterizado por un marcado estado energético discreto del electrón, y una longitud de onda de absorción y emisión para fotones definida. Hay suficientes átomos en esta partícula para validar el concepto de física del estado sólido, que incluye bandas de electrones, energía de banda prohibida, masa efectiva de electrón y hueco [12].
Debido a la estructura discreta de sus niveles energéticos y una mejorada relación superficie-volumen, energía de relajación y una recombinación dinámica, los puntos cuánticos son significativamente diferentes de los materiales en bulto [13].
Debido a su tamaño pequeño, muchas de las propiedades físicas y químicas están dominadas por la superficie y no por su volumen en bulto [10].
9
Tabla 1-1 Parámetros de los semiconductores más comunes. Fuente After Landholt-Boernstein 1982
Energía de banda prohibida
𝑬𝒈 (eV)
Excitón Rydberg 𝑹𝒚∗(meV)
Masa efectiva del
electrón 𝒎𝒆⁄𝒎𝟎
Masa efectiva del
hueco 𝒎𝒉⁄𝒎𝟎𝒂
Radio del excitón de
Bohr 𝒂𝑩 (nm)
GaAs 1.518 5 0.066
0.47(hh) 0.07(lh)
12.5
CdTe 1.60 0.1 0.4
CdSe 1.84 16 0.13
⊥0.45
∥1.1
4.9
CdS 2.583 29
⊥0.7
∥2.5
2.8
ZnSe 2.820 19 0.15
0.8(hh) 0.145(lh)
3.8
Ge* 0.744
⊥0.19
∥0.92
0.54(hh) 0.15(lh)
AgBr* 2.684 16 4.2
hh- heavy hole, lh- high hole * banda prohibida indirecta
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Sus densidades de estados consisten en una serie de picos definidos y sus propiedades físicas se parecen, en muchos aspectos a un átomo en una jaula, aunque con propiedades significativamente diferentes comparadas con los átomos reales [14]. Además, la naturaleza cristalina de estas partículas confiere una gran densidad de estados electrónicos, produciendo un gran coeficiente de extinción un amplio espectro de absorción que no están disponibles para los fluoróforos orgánicos [15].
Figura 1-2 (A) Estados energéticos electrónicos de un semiconductor en la transición desde moléculas discretas hasta cristales nanométricos y cristales en bulto. El deslizamiento azul denota ocupado el estado basal del electrón. (B) Comparación de un punto cuántico coloidal y como una isla, un punto cuántico epitaxial autoensamblado depositado en un sustrato cristalino. (C) Espectro de absorción (arriba) y fluorescencia (más abajo) de un cristal semiconductor de CdSe mostrando confinamiento cuántico y tamaño ajustable. AU= unidades arbitrarias. [15]
11
Los puntos cuánticos presentan electrones y huecos confinados en tres dimensiones dentro el radio del excitón de Bohr del material a temperatura ambiente, se caracterizan por las excepcionales propiedades ópticas, como un amplio espectro de absorción y una banda de emisión definida además de fotoluminiscencia de tamaño ajustable en el intervalo del espectro visible [16].
El espectro de excitación y emisión de los puntos cuánticos es favorable para la detección biológica. Por ejemplo, su amplio espectro de excitación y su estrecho espectro de emisión ayuda a reducir la superposición de espectros, lo que mejora la posibilidad de distinguir simultáneamente múltiples fluoróforos. Además, el amplio espectro de excitación facilita el uso de una sola longitud de onda de excitación para puntos cuánticos de diferentes colores Figura 1-3. Esta propiedad coloca a los puntos cuánticos en ventaja sobre los tintes orgánicos, que tienen una estrecha excitación y un amplio espectro de emisión [5].
12
Figura 1-3 Ajuste de la longitud de onda de la emisión cambiando en tamaño y la composición de los puntos cuánticos. (A) Emisión de los puntos cuánticos de CdSe debe ajustarse a cualquier espectro dentro del visible (450650 nm) seleccionando el tamaño de la partícula entre 2 y 7.5 nm. El tamaño relativo de estas partículas de composición constante es esquemáticamente mostrado abajo del espectro de fluorescencia. (B) Mientras se mantenga constante el tamaño de la partícula (5nm de diámetro) y una variación en la composición de la aleación ternaria CdSexTe1-x, el máximo de la emisión puede ser ajustado en cualquier longitud de onda entre 610 y 800 nm. La longitud de onda emitida por estas aleaciones es más grande que las aleaciones binarias debido a la relación no linear entre la composición y la energía de banda prohibida. [1]
1.1.1 Propiedades ópticas
En los semiconductores volumétricos la superposición de los orbitales atómicos da lugar a la formación de las bandas de conducción y de valencia separadas por la energía de banda prohibida
Un electrón asciende desde la banda de valencia hacia la largamente vacía banda de conducción. Esto crea una vacancia positiva “hueco” en la banda de valencia. La separación espacial (radio de Bohr) del par electrón-hueco (“excitón”) es comúnmente del
13
orden de 1-10nm para la mayoría y el confinamiento cuántico crece cuando una de las dimensiones del objeto es del orden del radio del excitón de Bohr. De este modo el excitón está confinado en una manera similar al a una partícula en la caja dando lugar a una banda prohibida finita y niveles energéticos discretos Está separación depende del número de “átomos” unidos juntos para formar la banda y, de ese modo, es una función del tamaño del nanocristalito. Excitón y emisión dependen del tamaño del nanocristalito [5].
Figura 1-4 Dependencia del tamaño en las propiedades ópticas de los puntos cuánticos de seleniuro de cadmio dispersos en cloroformo, ilustrando el confinamiento cuántico y el tamaño ajustable de la emisión de fluorescencia. (A) Imagen de la fluorescencia de cuatro viales de puntos cuánticos monodispersos con tamaños en un rango entre 2.2 nm a 7.3 nm de diámetro. Esta imagen fue obtenida con iluminación ultravioleta. (B) Espectro de fluorescencia de estas cuatro muestras. El ancho de la banda de emisión (23- 26 nm FWHM o full-width at half-maximum) indicando la estrecha distribución de partícula. (C) Espectro de absorción de estas cuatro muestras de puntos cuánticos. Observe que los espectros de absorción son muy anchos, permitiendo un amplio rango de longitudes de onda para la excitación. Ambas intensidades de absorción y emisión están graficadas en unidades arbitrarias (AU). [9]
14
1.1.2 Confinamiento cuántico
El efecto del confinamiento cuántico aparece en los puntos cuánticos cuando sus tamaños son comparables con el radio del excitón de Bohr. En puntos cuánticos semiconductores la consecuencia más importante del confinamiento cuántico es la aparición de los niveles localizados de los electrones y los huecos, incrementando la energía de la banda prohibida y, como resultado, un desplazamiento a energías más altas de absorción entre banda o transiciones luminiscentes. Este efecto está asociado con el incremento de la probabilidad de transiciones ópticas, además.
El fenómeno del efecto del tamaño cuántico está gobernado por la relación entre los parámetros de longitud: 𝑎, 𝑎𝐵𝑒, 𝑎𝐵ℎ,𝑎𝐵 :
𝑎𝐵𝑒= ℏ2𝜀
𝑚𝑒∗𝑒2 , ( 1-1)
𝑎𝐵ℎ= ℏ2𝜀
𝑚ℎ∗𝑒2 ( 1-2)
𝑎𝑏 =ℏ2𝜀 𝜇𝑒2
( 1-3)
donde 𝑎𝐵𝑒, 𝑎𝐵ℎ, 𝑎𝐵 son el radio de Bohr del electrón, del hueco y del excitón respectivamente, 𝑒 es la carga del electrón, 𝑚𝑒∗ y 𝑚ℎ∗ son las masas efectivas del electrón y
15
del hueco para semiconductores con permeabilidad 𝜀 y 𝜇 es la masa reducida del electrón-hueco 𝜇−1= 𝑚𝑒∗−1+ 𝑚ℎ∗−1. [17]
1.1.2.1 Confinamiento fuerte
El caso del confinamiento fuerte tiene como regla, 𝑎 ≪ 𝑎𝐵
En esta condición el electrón y el hueco confinado no tienen estados límites correspondientes al excitón del hidrógeno y su energía cinética debido a que el confinamiento es más grande que el valor de 𝑅𝑦 (energía del excitón de Rydberg en semiconductores en bulto: 𝑅𝑦 = 𝜇𝑒4
2𝜀2ℏ2 = 13.606 𝑒𝑉 𝜇
𝑚0𝜀2)
En el caso del régimen de confinamiento fuerte del electrón y el hueco
( 𝑎 ≪ 𝑎𝐵𝑒, 𝑎𝐵 y 𝑎 ≪ 𝑎𝐵ℎ), el término de Coulomb puede considerarse pequeño e ignorarse. Para esta suposición el electrón y el hueco son considerados como partículas independientes. La energía de este conjunto de transiciones ópticas permitido para estos estados con el mismo número cuántico principal (∆𝑛 = 0) y orbital (∆𝑙 = 0), sea expresado como:
𝐸𝑛𝑙 = 𝐸𝑔+ℏ2𝑋𝑛𝑙2 2𝜇𝑎2
( 1-4)
donde 𝑋𝑛𝑙 son las raíces de las funciones esféricas de Bessel. [17]
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Por esta razón, los puntos cuánticos en el límite del confinamiento fuerte son algunas veces referidos como átomos artificiales o hiperátomos en cuanto los puntos cuánticos exhiben espectros ópticos discretos controlados por el tamaño (por el número de átomos, por ejemplo), mientras que un átomo tiene un espectro discreto controlado por el número de núcleos [18].
La consecuencia más importante del fenómeno del confinamiento cuántico en los puntos cuánticos es la apariencia de niveles localizados de energía de los electrones y huecos, incrementando el nivel de energía de la banda prohibida y de las transiciones entre las bandas de absorción y luminiscencia.
1.2 Síntesis de puntos cuánticos
En las pasadas décadas una variedad de procedimientos ha sido desarrollada para obtener puntos cuánticos del grupo II-VI de alta calidad. Una alternativa para alcanzar nanoestructuras con confinamiento en tres dimensiones es utilizar síntesis química, basada en el control homogéneo de la nucleación, lo que permite preparaciones de nanoestructuras en el régimen entre 1-10nm [13].
Los métodos para obtener diferentes tamaños y formas fueron reportados por primera vez por Alivisatos et al. [19], mencionando que se pueden obtener barras, cabezas de flecha, tipo lágrimas y tetrápodos con solo variar las condiciones de la síntesis,
17
temperatura y surfactantes, dando oportunidad de desarrollar diferentes estructuras para diferentes aplicaciones.
La síntesis coloidal de nanopartículas fue introducida en 1993 por Murray et al. [20], usando medios orgánicos y precursores organometálicos. Los elementos esenciales de este procedimiento involucran la combinación de un precursor metálico u organometálico (zinc, cadmio o especies de mercurio) con su correspondiente precursor calcógeno (sulfuro, selenio o especies de telurio) en un solvente coordinante a altas temperaturas [1]. Este método de síntesis en caliente produce puntos cuánticos altamente cristalinos [5].
Las suspensiones coloidales de puntos cuánticos son comúnmente sintetizadas a través de la introducción de precursores de semiconductores bajo condiciones que termodinámicamente favorecen el crecimiento del cristal, en presencia de agentes enlazantes de semiconductores, cuya función es el control cinético del crecimiento del cristal y mantener su tamaño dentro del régimen del confinamiento cuántico [9] como se muestra en la Figura 1-5.
Las muestras obtenidas utilizando este procedimiento muestran una gran calidad de monodispersidad (PSD< 5%), excelente cristalinidad, y son casi libres de defectos estructurales. Sin embargo, la ganancia de la fluorescencia vacila alrededor del ~10% [1].
18
Figura 1-5 Síntesis coloidal de nanocristales. (a) Típico sistema. El surfactante en un matraz de tres bocas es calentado en una atmosfera de Ar. La temperatura es medida con un termómetro en la solución y la solución es mezclada con un agitador que está colocado por debajo de la mantilla de calentamiento alrededor del matraz. Los precursores son inyectados rápidamente con una jeringa. (b) Representación esquemática de un nanocristal. La superficie de cada partícula compuesta de un patrón de CdSe es cubierta con una capa de moléculas surfactantes, como es TOPO. (c) Imagen en alta resolución de TEM de un nanocristal de CdSe. Cada punto corresponde a una columna de átomos en un patrón de CdSe. La capa de TOPO no es visible debido al bajo contraste. El diámetro del nanocristal es de cerca de 5 nm. (d) Nanocristales coloidales de CdSe disueltos en tolueno. Cada vial contiene nanocristales de CdSe de diferentes tamaños, es un rango desde 2 nm hasta 6 nm. Todas las soluciones fueron excitadas con una lámpara UV y fue tomada una fotografía de su emisión. El nanocristal de menor tamaño (2 nm) emite en verde y el de mayor tamaño emite en rojo. [10]
19
En una típica síntesis de puntos cuánticos de CdSe, un precursor de selenio a temperatura ambiente (comúnmente trioctilfosfina-seleniuro o tributilfosfina-seleniuro) es inyectado rápidamente dentro de una solución caliente (~300 ℃) que contiene un precursor de cadmio (dimetil cadmio u oleato de cadmio) y un ligando de coordinación (oxido de trioctilfosfina o hexadecilamina) bajo condiciones inertes (atmosfera de nitrógeno o argón). Los precursores de cadmio y selenio reaccionan rápidamente a temperaturas altas, formando núcleos de nanocristales de CdSe. Los ligandos coordinantes enlazan los átomos metálicos a la superficie de los nanocristales crecientes, estabilizándolos en una solución coloidal, controlando el índice de crecimiento. La inyección de la solución fría rápidamente reduce la temperatura de la mezcla reactante causando el cese de la nucleación. Los residuos de los precursores de cadmio y selenio entonces pueden crecer sobre los núcleos existentes una tasa más lenta a temperaturas más bajas (240 − 270 ℃). Una vez que los puntos cuánticos han alcanzado el tamaño deseado y la longitud de onda de emisión, la reacción debe ser enfriada a temperatura ambiente para detener el crecimiento [9].
El proceso de nucleación se realiza después de la descomposición térmica de los reactivos precursores y la sobresaturación de los formados “monómeros” lo que es relevante para la generación de núcleos. La concentración de los monómeros entonces está por debajo el valor crítico para la nucleación, como resultado, las partículas existentes solo crecerán sin la formación de nuevos núcleos [16].
20
La obtención de puntos cuánticos de gran calidad requiere el uso de solventes que sean estables a altas temperaturas y que actúen como moléculas surfactantes para estabilizar la superficie de los puntos cuánticos y prevenir la agregación de las partículas.
El uso del óxido de trioctilfosfina (TOPO), es común debido a su punto de ebullición alto y su habilidad para combinar metal y elementos calcógenos. Se utiliza junto con otros surfactantes o co-solventes como son trioctilfosfina (TOP), hexadecilamina o ácido estérico [1].
El surfactante cubre el crecimiento de los cristalitos y previene su agregación, además de limitar la disolución de los nanocristales más pequeños en favor de los más grandes, este proceso es conocido como Oswald ripening [5].
1.2.1 Nucleación
La teoría de nucleación y crecimiento propuesta por La Mer et al. [21], desarrolla el mecanismo de formación de los coloides o nanocristales desde un medio homogéneo y sobresaturado. Este mecanismo sugerido como la síntesis de un coloide debe ser diseñado de manera que la concentración incremente rápidamente, elevándose sobre la saturación de la concentración por un periodo breve. En ese momento ocurre un corto estallido de nucleación con la formación de un largo número de núcleos en un pequeño espacio de tiempo. Estas partículas crecen rápidamente y llegan a la concentración por debajo de los niveles de nucleación mientras permite el crecimiento de las partículas más allá de una
21
tasa determinada por el escalón más lento en el proceso de crecimiento, de ese modo separando por tiempo la nucleación del crecimiento [22].
El proceso de nucleación y crecimiento a través del mecanismo de La Mer se representa esquemáticamente por medio de un simple diagrama, y puede ser divido en tres simples partes:
I. Un rápido incremento en la concentración de los monómeros en solución.
II. El monómero experimenta una “explosión de nucleación” lo que reduce significativamente la concentración de monómero libre en solución. La tasa de está nucleación es descrita como “efectivamente infinita” y después de este punto, la nucleación decrece considerablemente debido a la baja concentración de monómeros después de este punto.
III. Siguiendo la nucleación, el crecimiento ocurre bajo el control de la difusión del monómero a través de la solución [23].
Las tres etapas pueden observarse en la Figura 1-6.
22
Figura 1-6 Representación de la concentración del sulfuro molecularmente disuelto antes y despúes de la nucleación como función del tiempo [21].
Los requerimientos para la monodispersidad, como es evidente en el diagrama de La Mer, son una alta tasa de nucleación dando lugar a la explosión de formación de núcleos en un corto periodo, una tasa inicial rápida del crecimiento de estos núcleos para reducir rápidamente la concentración muy por debajo de la concentración de nucleación y un eventual ritmo lento de crecimiento dando lugar a un periodo largo de crecimiento comparado con el periodo de nucleación [22].
Para una solución que no está inicialmente en equilibrio termodinámico, un mecanismo que permite la formación de partículas más grandes al costo de las más pequeñas reduce la energía superficial, lo que juega un rol importante en el crecimiento de las partículas.
23
1.3 Liposomas
Debido a la habilidad de los liposomas para acarrear una amplia variedad de sustancias, su versatilidad estructural y la naturaleza innocua de sus componentes, los liposomas han sido estudiados por diferentes situaciones terapéuticas [24].
Fueron reportados por primera vez por Alec D. Bangham en los tempranos 1960 mientras realizaba una investigación acerca de las estructuras esféricas que se forman cunado los fosfolípidos entran en contacto con el agua [25]. Debido a sus componentes, inicialmente fueron utilizados como modelos de la membrana celular.
Son vesículas concéntricas esféricas de dimensiones coloidales que se forman a partir de fosfolípidos, naturales, semisintéticos o sintéticos no tóxicos, que exhiben propiedades anfifílicas en un medio acuoso. Están compuestos de una o varias capas lipídicas conteniendo una fase polar al interior y al exterior de la vesícula y una fase no polar entre las capas de lípidos.
Las bicapas lipídicas pueden estar constituidas por colesterol y/o por ácidos grasos, los cuales determinaran rigidez, fluidez, carga, permeabilidad, y estabilidad del liposoma. Su estructura esférica se obtiene de manera espontánea mediante autoensamble con una distribución de tamaño no homogéneo.
Su estabilidad depende de la temperatura, las condiciones mediante las cuales fue hecha la preparación, la concentración de los componentes y las condiciones de almacenamiento. La estabilidad física depende el tamaño, la distribución de tamaño,
24
morfología y la retención del contenido para el cual fue diseñado el liposoma. La estabilidad química está relacionada con la oxidación e hidrolisis, al igual que la degradación del contenido [25].
El comportamiento de los liposomas in vitro e in vivo depende fuertemente del tamaño, la rigidez de las bicapas lipídicas carga y morfología [24].
La carga del liposoma juega un papel importante en el uso para el cual ha sido diseñado, ya que pueden tener carga positiva negativa o neutra dependiendo de los aditivos utilizados durante la preparación [26].
La preparación de liposomas sin carga y recubiertas con polímeros hidrofílicos no iónicos, tales con el polietilenglicol (PEG), resulta en vesículas estables que muestran bajos niveles de interacciones no específicas y de agregación, producto de las barreras estéricas que previenen la proximidad y el contacto [27].
Los liposomas están compuestos de fosfolípidos, que se autoensamblan para formar esferas de bicapas lipídicas y un núcleo acuoso dentro de las bicapas. Los fosfolípidos son anfifílicos por naturaleza, dando como resultando esferas polares en soluciones acuosas debido al efecto hidrofóbico de las cadenas de acilo hidrofóbicas con el medio acuoso circundante. Esta es una formación termodinámicamente favorable mejorada por enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals y otras interacciones electrostáticas [26].
Gracias a la presencia de un centro acuoso y a las capas lipídicas los liposomas pueden incorporar tanto moléculas hidrofílicas como lipofílicas [26].
25
1.3.1 Fosfolípidos
Los fosfolípidos que constituyen a los liposomas son moléculas anfifílicas que consisten en colas no polares, hidrofóbicas y cabezas polares, hidrofílicas.
Estos fosfolípidos se forman generalmente, a partir del enlace éster de dos cadenas hidrocarbonadas con la molécula del glicerol (“glicerolípidos”), o también pueden estar constituidos por la unidad hidrofóbica ceramida (“esfingolípidos”). Esta parte hidrofóbica se une a una cabeza polar hidrofílica que puede contener grupo fosfato (“fosfolípidos”) o algunas unidades azúcares (“glicolípidos”).
Los lípidos anfifílicos son muy poco solubles en agua como monómeros, con una baja concentración micelar crítica (CCM), oscilando entre 10-8 y 10-12 M, magnitud que depende de la longitud de las cadenas hidrocarbonadas presentes en sus estructuras [27], debido a esto los fosfolípidos son disueltos en solventes orgánicos para posteriormente ser evaporados o extraídos, según sea el caso, dependiendo del método de preparación requerido.
Una variedad de estructuras de fosfolípidos puede obtenerse combinando los grupos de las cabezas polares (por ejemplo, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol (PG) y ácido fosfatídico (PA)) con varias cadenas de ácidos grasos como láurico, mirístico, palmítico, estérico y oleico [25] como se muestra en la Figura 1-7.
26
Figura 1-7 Estructura de un fosfolípido. [28]
Las colas hidrofóbicas están compuestas de dos cadenas de ácidos grasos que contienen entre 10 y 24 átomos de carbono y desde 0 hasta 6 enlaces dobles en cada cadena. El final de la molécula es polar y está compuesto de un ácido fosfórico unido a una molécula soluble en agua [29].
Los fosfolípidos más comúnmente utilizados son los obtenidos del huevo y de la lecitina de soya debido a su origen natural y a su bajo costo, además de una gran variedad de fosfolípidos preparados por métodos semisintéticos o sintéticos.
27
1.3.2 Formación de los liposomas
La formación de vesículas liposomales es un proceso de autoensamble que se realiza en dos pasos, primero las moléculas anfifílicas forman bicapas, después, como segundo paso, se cierran las bicapas y forman vesículas [30].
La naturaleza anfifílica de las moléculas que componen a los fosfolípidos causan la formación de bicapas ante la presencia de agua. Cuando los fosfolípidos son expuestos a agua, las colas de ácidos grasos (Figura 1-8) se alinean unas con otras, excluyendo al agua de sus dominios hidrofóbicos en el proceso. A la inversa, las cabezas de los grupos polares se orientan ellas mismas a la fase acuosa, permitiendo la configuración de bicapa [29].
Figura 1-8 Representación esquemática de un fosfolípido u otro lípido de membrana. El grupo de cabeza polar es hidrofílico, y las colas de hidrocarburo son hidrofóbicas o lipofílicas. Los ácidos grasos en las colas están saturados (S) o insaturados (U); los primeros regularmente están fijos al carbono 1 del glicerol, y los segundos al carbono 2. Note el acomodamiento en la cola del ácido graso insaturado (U), que es importante para conferir incremento de la fluidez de membrana. [31]
28
La gran diferencia de la energía libre entre el medio acuoso y el hidrofóbico promueven la formación de estructuras de bicapa con el propósito de lograr el nivel energético más bajo. Las estructuras de bicapa no existen sin la presencia del agua, porque es el agua la que promueve la fuerza impulsora de las moléculas lipídicas para adoptar la configuración de bicapa [29].
El factor determinante para el autoensamblado de estas estructuras anfifílicas es el tamaño de la porción hidrofóbica en comparación a la parte hidrofílica. Esto determina la curvatura de la interface hidrofóbica-hidrofílica [30].
Las cabezas hidrofílicas de los lípidos en las bicapas están sujetas dentro de interacciones entre ellas, con el medio acuosos que las rodea y con otras bicapas cercanas, mientras que se restringe a permanecer en la bicapa. Estas interacciones son independientes, pero combinan su influencia en la estructura de la bicapa [32].
I. Repulsión estérica. Una fuerza intensa actúa cuando las moléculas están cerca o en contacto. Depende solo del tamaño de la molécula o del grupo molecular que está involucrado [32].
II. Interacciones electrostáticas. La carga de las cabezas polares, iónicas o zwitteriónicas son objeto de interacciones mutuas, interacciones con iones o contraiones in la fase acuosa e interacciones con el momento dipolar asociado con las moléculas de agua [32].
Sin la agitación adecuada solo algunos liposomas se formarían. Con el objetivo de producir liposomas, las bicapas lipídicas formadas a partir de las interacciones de los
29
fosfolípidos con el agua deben curvarse, para lo que se requiere de algún tipo de energía (ultrasonido, extrusión, etc.) que debe disiparse dentro del sistema para formar las vesículas. Después de que los liposomas se han formado son coloides no estables que se agregan lentamente y se fusionan en una gran estructura lamelar de gran radio que eventualmente liberará el líquido contenido [33].
30
1.3.3 Clasificación de los liposomas
Los liposomas se clasifican según su tamaño, número de capas, composición y método de preparación como se muestra en la Tabla 1-2.
Tabla 1-2 Clasificación de los liposomas [26]
BASADOS EN LA LAMELARIDAD Y EL TAMAÑO
BASADO EN LA COMPOSICIÓN
VESÍCULAS UNILAMELARES PEQUEÑAS (SUV); 20-100NM
Liposomas convencionales
Liposomas de larga circulación
VESÍCULAS UNILAMELARES GIGANTES (GUV); >1000NM
Liposomas catiónicos
VESÍCULAS OLIGOLAMELARES (OLV); 100- 1000NM
Liposomas estimulo-sensitivos (pH, temperatura, campos magnéticos) VESÍCULAS MULTILAMELARES (MLV);
>500NM
Inmuno-liposomas
31
1.3.4 Tamaño de los liposomas
Atendiendo a las características estructurales los liposomas, en particular al número de bicapas y al tamaño, los liposomas se pueden clasificar en vesículas multilamelares (del inglés. multilamellar vesicles MLV, 0.1-10µm) o unilamelares (del inglés unilamellar vesicles, ULV), estas últimas pueden ser de diámetro pequeño (del inglés small unilamellar vesicles SUV, 100-500nm) o gigantes (del inglés giant unilamellar vesicles GUV, ≥ 1µm) [27].
En los liposomas unilamelares, las vesículas esféricas tienen una sola bicapa de fosfolípidos encapsulando la solución acuosa. En los liposomas multilamelares, las vesículas tienen una estructura de cebolla. Múltiples vesículas unilamelares se formarán dentro de otras con un tamaño más pequeño, formando una estructura multilamelar de esferas concéntricas de fosfolípidos separadas por capas de agua como podemos observar en la Figura 1-9 [11].
32
1.3.5 Liposomas convencionales
Los liposomas típicamente compuestos por solo un fosfolípido (neutro y/o cargado negativamente) y/o colesterol son conocidos como liposomas convencionales. Está familia de structuras vesiculares está basada en capas lipídicas rodeadas por compartimientos
Figura 1-9 La gran variedad de morfologías de las construcciones de las bicapas lipídicas. [58]
33
acuosos; comúnmente caracterizados por su corto tiempo de circulación en la sangre (un par de horas en promedio) [24].
1.3.6 Liposomas de circulación larga
El uso de liposomas en medios biológicos requiere evitar a toda costa su eliminación del torrente sanguíneo como resultado de la acción del sistema inmunológico, siendo esta una de sus mayores limitaciones.
Por esta razón, los liposomas estabilizados estéricamente fueron introducidos en la década de 1970 con el objetivo de evadir la detección del sistema inmunológico y evitar su pronta eliminación; pueden permanecer en el flujo sanguíneo un tiempo medio de más de dos días comparados con las escasas horas que permanecen los liposomas convencionales en el torrente.
Los mejores resultados obtenidos de estos liposomas han sido los estabilizados utilizando polietilenglicol debido a que forma enlaces covalentes con los fosfolípidos que conforman la estructura del liposoma.
Lasic et al., sugiere que la presencia de barreras estéricas reduce la adhesión y absorción de componentes en la sangre como son inmunoglobulina, algunas proteínas, moléculas similares y componentes de las células [34].
34
1.3.7 Mecanismo de encapsulamiento
Los liposomas son sistemas muy útiles para el encapsulamiento de moléculas hidrofílicas (en el centro acuoso) y lipofílicas o hidrofóbicas (en la bicapa lipídica) [26].
El método de preparación de los liposomas juega un papel determinante en la eficiencia del encapsulado, ya que depende en gran medida del tamaño del liposoma el volumen que podrá incorporar en el interior acuoso.
En el método clásico de hidratación de película delgada, las moléculas hidrofóbicas son embebidas rápidamente en la bicapa lipídica mientras los liposomas se están autoensamblando [26].
1.4 Preparación de liposomas
Los liposomas obtenidos utilizando solo fosfolípidos resultan ser usualmente poco rígidos, debido principalmente a la baja temperatura de transición de fase, y/o a la insaturación de las cadenas de alquinos grasos, las cuales causan imperfecciones en el empaquetamiento de las bicapas [25]. Sin embargo, la combinación de diferentes fosfolípidos permite liposomas más permeables y con una mayor retención en las regiones acuosas.
35
1.4.1 Método de evaporación de inversión de fase
El método de evaporación de inversión de fase (REV, del inglés reverse phase evaporation method), basado en la rápida inyección de una solución acuosa en una fase orgánica que contiene los lípidos, rinde vesículas en la suspensión acuosa con 0.1 a 10 µm de diámetro y una capacidad de encapsular de hasta 50%. Los pasos fundamentales de este método son: la sonicación, que resulta en una emulsión “agua-en-aceite”, seguida por un secado parcial a un gel semisólido que es finalmente, convertido en una suspensión concentrada de vesículas mediante agitación vigorosa [27].
1.4.2 Método por sonicación
La preparación de liposomas por sonicación es uno de los métodos más utilizados para la obtención de SUV (small unilamellar vesicles). En este método se inicia con la preparación de MLV los cuales son sonicados, ya sea por una sonda de metal, comúnmente titanio, bajo atmosfera inerte o por en una tina de ultrasonido.
Liposomas pequeños unilamelares (SUV) son preparaciones cristalinas que consisten en simples bicapas de fosfolípidos rodeados de espacios acuosos. Los SUV son esferas con un radio mínimo de 20 nm hasta 100 nm. La característica más importante de este tipo de liposomas es su población homogénea además de ser el tipo de liposomas más preparado por el método de sonicación, ya sea usando sonda o en tina [25].
36
1.4.3 Método por deshidratación y rehidratación de vesículas
El procedimiento basado en la deshidratación y rehidratación de vesículas (DRV) desarrollado por Kirby y Gregoriadis es simple, emplea condiciones suaves y produce vesículas con una levada eficiencia de encapsulación para una amplia variedad de moléculas. Este procedimiento permite que la producción sea escalable mezclando una solución acuosa del compuesto a encapsular con una suspensión de LUV o SUV “vacíos”.
Las etapas de congelación-secado y rehidratación inducen fusión entre membranas adyacentes y el soluto queda atrapado en las vesículas MLV formadas (0.1 a 20 µm de diámetro y hasta un 80% de encapsulación) [27].
1.5 Técnicas de caracterización
1.5.1 Espectroscopía de Fotoluminiscencia
Cuando la luz con suficiente energía incide sobre un material, fotones son absorbidos y excitaciones electrónicas son creadas. Eventualmente, los electrones excitaciones regresaran a su estado basal. Si la relajación radiativa ocurre, la luz emitida es llamada fotoluminiscencia. [35]
La fotoluminiscencia es la emisión espontánea de luz proveniente de un material bajo excitación óptica. [35]
37
Cuando un par electrón-hueco se recombina, emite un fotón que tiene una longitud de onda característico del material y del proceso radiativo particular.
A temperatura ambiente no hay ocupación de los estados electrónicos cerca de parte inferior de la banda de conducción y los estados huecos cerca de la parte superior de la banda de valencia. Por lo tanto, los pares electrones-huecos pueden recombinar para emitir fotones en un rango de energías produciendo una banda ancha en lugar de una forma de pico. [36]
Para los materiales de banda directa la parte más baja de la banda de conducción coincide con el máximo de la banda de valencia Figura 1-10.
Figura 1-10 Diagrama esquemático del proceso de luminiscencia en un semiconductor con banda prohibida directa. El sombreado indica que los estados están ocupados por electrones. Los estados llenos en la parte más baja de la banda de conducción y los estados vacíos. [37]
38
La espectroscopía de fotoluminiscencia es una prueba selectiva y extremadamente sensible de los estados electrónicos discretos. La intensidad de la señal de fotoluminiscencia proporciona información de la calidad de la superficie y de las interfases.
Esta técnica también es muy útil para determinar concentraciones de impurezas, identificar defectos y medir la banda prohibida de los semiconductores. [36]
El espectro de fotoluminiscencia proporciona la transición de las energías, lo que puede ser usado para determinar los niveles energéticos electrónicos. [35]
1.5.2 Espectroscopía Ultravioleta/Visible
La radiación ultravioleta es radiación electromagnética de longitud de onda más corta que la luz visible, pero más larga que los Rayos X. El rango típico de la longitud de onda del UV es 10-300 nm. El UV es invisible para el ojo humano [38].
1.5.2.1 Espectro de UV-Vis
Para las sustancias que tienen absorbancia UV/Vis, deben de ser capaces de ser
“excitadas” a saltar a un estado energético más alto (llamado “estado excitado”) desde su estado base. En otras palabras, las sustancias deben tener un estado excitado. Los iones
39
de metales de transición tienen dichos estados excitados que muestran bandas de absorción en el rango de la luz visible (400-700 nm). Para compuestos orgánicos, una variedad de energías de absorción es posible, depende de la naturaleza de los enlaces dentro del material [38].
1.5.3 Espectroscopía de Raman
La espectroscopía de Raman tiene sus orígenes en la polarización electrónica causada por la luz ultravioleta, visible, e IR-cercano. Si una molécula es irradiada por una luz monocromática de frecuencia 𝑣 (laser), entonces, debido a la polarización inducida en la molécula por este haz incidente, la frecuencia de la luz 𝑣 (“dispersión de Rayleigh”) así como esa frecuencia 𝑣 ± 𝑣𝑖 (“dispersión de Raman”) es dispersado donde 𝑣𝑖 representa una frecuencia de vibración de la molécula. De ese modo, el espectro de Raman está representado como desplazamiento desde la frecuencia incidente en la región ultravioleta, visible, y el IR-cercano [39].
Está espectroscopía usa una sola frecuencia de radiación para irradiar la muestra y es esa radiación dispersada desde la molécula una unidad vibracional de energía diferente del haz incidente, lo cual es detectado. La luz interactúa con la molécula y polariza la nube de electrones alrededor del núcleo para formar un estado de corto tiempo llamado
“estado virtual”. Este estado no es estable y el fotón es rápidamente re-radiado. En la Figura 1-11 muestra los procesos básicos que ocurren para una vibración [40].
40
Figura 1-11 Diagrama de los procesos de dispersión de Rayleigh y dispersión de Raman. El estado vibracional de energía más baja m es mostrado a los pies con estados de incremento de energía por encima de el. La menor energía (flecha hacia arriba) y la energía dispersada (flecha hacia abajo) tienen mucha más energía que la energía de una vibración. [40]
Puesto que los estados virtuales no son estados reales de la molécula, pero son creados cuando el láser interactúa con los electrones y causa polarización, la energía de estos estados es determinada por la frecuencia de la fuente de luz usada. El proceso de la dispersión Raman desde el estado vibracional base m de lugar a la absorción de energía por la molécula y esto promueve un estado vibracional excitado de energía más alta (n).
Esto se llama dispersión de Stokes. Sin embargo debido a la energía termal, algunas moléculas pueden estar presentes en un estado excitado como es n en la Figura 1-11. La dispersión desde este estado hacia el estado base m es llamado dispersión anti-Stokes e involucra transferencia de energía hacia el fotón dispersado.
Comparado con la dispersión de Stokes, la dispersión anti-Stokes será débil y será aún más débil cuando la frecuencia de vibración incrementa debido al decremento de la población de estados vibracionales excitados.
41
Considere a onda de luz de frecuencia 𝑣 con un campo eléctrico de intensidad 𝐸.
Puesto que 𝐸 fluctúa a la frecuencia 𝑣, podemos escribir
𝐸 = 𝐸0cos 2𝜋𝑣𝑡 ( 1-5)
Si una molécula diatómica es irradiada por esta luz el momento dipolar 𝑃 está dado por
𝑃 = 𝛼𝐸 = 𝛼𝐸0cos 2𝜋𝑣𝑡 ( 1-6)
es inducido. Aquí la 𝛼 es una constante de proporcionalidad llamada constante de polarizabilidad, definida como
𝛼 = 𝛼0 + (𝜕𝛼
𝜕𝑞)
0
𝑞 ( 1-7)
Aquí, 𝛼0 es la polarizabilidad en la posición de equilibrio, 𝑞 es el desplazamiento del núcleo, (𝜕𝛼𝜕𝑞)
0es la función de cambio de 𝛼 con respecto de al cambio en 𝑞, evaluado en la posición de equilibrio.
𝑃 = 𝛼0𝐸0cos 2𝜋𝑣𝑡 +1 2(𝜕𝛼
𝜕𝑞)
0
𝑞0𝐸0{cos[2𝜋(𝑣 + 𝑣𝑖)𝑡] + cos[2𝜋(𝑣 − 𝑣𝑖)𝑡]} ( 1-8)
De acuerdo con la teoría clásica, el primer término describe un dipolo oscilante que irradia luz a una frecuencia 𝑣 (dispersión de Rayleigh). El segundo término da a la dispersión de Raman las frecuencias 𝑣 + 𝑣𝑖 (anti-Stokes) y 𝑣 − 𝑣𝑖 (Stokes). Si (𝜕𝛼
𝜕𝑞)
0es cero
42
la vibración no es activa en Raman, a menos que la polarizabilidad cambie durante la vibración [39].
1.5.3.1 Absorción
Cuando la luz interactúa con la materia, los fotones de los cuales está constituida la luz pueden ser absorbidos o dispersados, o pueden no interactuar con la materia y pasar a través de ella. Si la energía de un fotón incidente corresponde a la energía de la banda prohibida entre el estado basal de una molécula y un estado excitado, el fotón puede ser absorbido y la molécula asciende a un estado excitado mucho más energético [40].
1.5.3.2 Dispersión
Los fotones dispersados pueden ser observados colectando la luz en el ángulo del haz de luz incidente y siempre que no haya absorción desde ninguna transición electrónica las cuales tiene energías similares a las de la luz incidente, la eficiencia incrementa con en una cuarta potencia la potencia de la frecuencia de la luz incidente [40].
1.5.4 Difracción de rayos X
Los rayos X son radiación electromagnética con un intervalo de longitud de onda de 0.01- 100 Å, correspondiendo al intervalo de frecuencias de 30 PHz-300 EHz.
