CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
INFORME FINAL
“Evaluación química, nutricional y biológica de cinco especies de basidiomicetos para el diseño y formulación de un producto con aplicación
medicinal, cosmética y alimenticia”
PROYECTO FINDECYT/FODECYT 54-2017
Dra. Sully Margot Cruz Velásquez Investigador Principal
Guatemala, mayo 2020.
i AGRADECIMIENTOS
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –CONCYT-.
ii OTROS AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia por el aval institucional, la infraestructura brindada, materiales y equipo para la ejecución del proyecto. Al Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT), y Depto de Farmacognosia y Fitoquímica de la Escuela de Química Farmacéutica por brindar la infraestructura, materiales y apoyo del personal que colaboró para la ejecución del proyecto. Al Laboratorio de Productos Naturales Farmaya S.A. especialmente a Lic. Armando Cáceres por el apoyo, asesoría y colaboración brindada en el desarrollo de la investigación.
Al equipo de investigación por su compromiso, entrega y dedicación especialmente a Dra. Dora Elena Chang, Lic. Roberto Cáceres, Licda. Nereida Marroquín, Br. Libny Pernillo, Akassia Stefania Hengstenberg, Jaqueline Lourdes Alvarado Cárdenas.
iii ÍNDICE RESUMEN Página ABSTRACT PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN 1
I.2 PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA
1 I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General I.3.1.2 Específicos I.3.1.3 Hipótesis 4 I.4 METODOLOGIA
I.4.1 Las Variables
1.4.1.1 Variables dependientes 1.4.1.2 Variables
Independientes I.4.2 Indicadores
I.4.3 Estrategia Metodológica I.4.3.1 Población y Muestra I.4.4 El Método
I.4.5 La Técnica Estadística I.4.6 Los Instrumentos a utilizar I.4.7 Cronogramas 8 PARTE II MARCO TEÓRICO 20 PARTE III III. RESULTADOS 44
III.1 Discusión de Resultados 65
PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES 70 IV.2 RECOMENDACIONES 72 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 73 IV.4 ANEXOS 81 PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO 99
iv Índice de Tablas y Cuadros
Número Título de Tablas Página
1 Cronograma de actividades 25 2 Cronograma de desembolsos 26 1 Título de Cuadros Información de colecta 51 2 Determinación de humedad 52
3 Cenizas totales y cenizas ácido insoluble 53
4 Determinación de mejor disolvente 54
5 Rendimiento de extracto 54
6 Identificación de cumarinas en material y extracto seco 55 7 Identificación de taninos en material fúngico y extracto 56 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Identificacion de alcaloides en material fúngico y extracto Cromatografía en capa fina de alcaloides en material fúngico Identificación de saponinas en material fúngico
Cromatografía en capa fina de saponinas
Cromaografía en capa fina de flavonoides en extractos Identificación de azúcares por CCF
Identificación de estándares de azúcares por HPLC Detección de azúcares en extractos por HPLC Cuantificación de azúcares en extractos por HPLC Evaluación de la actividad antioxidante
Cuantificación de fenoles totales
Actividad antioxidante de base al poder reductor de hierro (FRAP)
Evaluación de la actividad antiureasa por CCF en extractos Porcentaje de rendimiento de aceite fijo
Composición nutricional de hongos Evaluación de la actividad antibacteriana Actividad citotóxica contra Artemia salina Análisis de oligoelementos en muestras secas
56 57 57 58 59 60 61 61 62 63 64 64 65 67 68 69 69 70 26 27
Propuesta de productos en base a hongo fresco
Propuesta de productos en base a hongo seco y extracto
71 72
v RESUMEN
Los basidiomicetos también conocidos como macromicetos se consideran una fuente importante de productos naturales biológicamente activos. Por lo que la evaluación de la actividad biológica, composición química y nutricional de especies que crecen en zonas de alto endemismo o se cultivan en diferentes áreas rurales es importante para establecer su potencial para propiciar su conservación y su mejor aprovechamiento.
Es por ello que se evaluó la antioxidante, antimicrobiana, enzimática y citotóxica, composición nutricional y química de cinco basidiomicetos y se desarrollaron productos a base de extractos y material fúngico con fines nutricionales. De acuerdo a los resultados se evidención el potencial antioxidante y valor nutricional de las especies. Se presentaron rendimientos de extracción muy promisorios hasta un 63.72% en extactos etanólicos y 28.18 % en extractos acuosos en Boletus edulis. Se determinó la presencia de alcaloides, saponinas, flavonoides, azúcares (trehalosa, glucose y fructosa) mediante ensayos macro y semimicro, cromatografía en capa fina y cromatografía líquida. Se demostró el valor nutricional por la presencia de fibra cruda (6.74-49.22%), proteína cruda (18.20-57.41%), carbohidratos (1.59-55.21%), minerales (7.08-20.97%), y grasas (1.09-6.44%). Se demostró la actividad antioxidante por tres diferentes métodos, la mayor actividad se presentó en Agaricus (DPPH CI 50 1.99 mg/mL, ABTS 5.82 mg/mL, FRAP 4.33 g Fe+2/g extracto) y B. edulis (DPPH 2.46 mg/mL, ABTS 4.87 mg/mL, FRAP 3.53 g Fe+2/g extracto), dicha actividad mostró relación con la presencia de fenoles totales. Por lo que se demuestra el potencial de los hongos a nivel nutricional para el fomento de la salud.
vi ABSTRACT
Basidiomycetes also known as macromycetes are considered an important source of biologically active natural products. Therefore, the evaluation of the biological activity, chemical and nutritional composition of species that grow in areas of high endemism or are cultivated in different rural areas is important to establish their potential to promote their conservation and better use.
That is why the antioxidant, antimicrobial, enzymatic and cytotoxic, nutritional and chemical composition of five basidiomycetes was evaluated and products based on extracts and fungal material were developed for nutritional purposes. According to the results, the antioxidant potential and nutritional value of the species were evidenced. Very promising extraction yields were presented up to 63.72% in ethanolic extracts and 28.18% in aqueous extracts in Boletus edulis. The presence of alkaloids, saponins, flavonoids, sugars (trehalose, glucose and fructose) was determined by macro and semi-micro tests, thin layer chromatography and liquid chromatography. The nutritional value was demonstrated by the presence of crude fiber (6.74-49.22%), crude protein (18.20-57.41%), carbohydrates (1.59-55.21%), minerals (7.08-20.97%), and fats (1.09-6.44%). Antioxidant activity was demonstrated by three different methods, the highest activity was found in Agaricus (DPPH CI 50 1.99 mg / mL, ABTS 5.82 mg / mL, FRAP 4.33 g Fe + 2 / g extract) and B. edulis (DPPH 2.46 mg / mL, ABTS 4.87 mg / mL, FRAP 3.53 g Fe + 2 / g extract), said activity was related to the presence of total phenols. So the potential of mushrooms at the nutritional level for the promotion of health is demonstrated.
1 PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
La extraordinaria biodiversidad fúngica de la región latinoamericana y especialmente la región mesoamericana, y la reducida información técnica y científica existente sobre su caracterización, actividad biológica o composición química, hace necesario realizar estudios sobre dichos recursos naturales poco explotados.
Es conocido que ciertos componentes macromoleculares aislados de hongos superiores, tales como polisacáridos, glicoproteínas, ácidos nucleicos, etc., poseen actividad antitumoral, antimicrobiana y antioxidante relacionada con la activación que provocan dichas sustancias de la respuesta inmunológica. Los polisacáridos antitumorales producidos por basidiomicetos han ido recibiendo en los últimos años una creciente atención, apareciendo en la literatura reportes sobre la obtención de β-glucanos, polisacáridos antitumorales aislados a partir de hongos comestibles o medicinales tales como Grifola frondosa, Polyporus confluens, Hericium erinaceum, Lentinus edodes y Coriolus versicolor.
Los basidiomicetos fueron usados como alimento, medicamento, y ritualmente por los mayas desde tiempos inmemorables, encontrándose evidencias arqueológicas de sus uso como los famosos hongos piedra. Desde mediados del siglo pasado se evidenció el consumo tradicional de basidiomicetos por la población, demostrándose en estudios posteriores un difundido uso en la población rural, por lo que se le llama una cultura micofílica, que aunado a una amplia diversidad de especies presentes, hace de este un tema prioritario para la investigación de nuestra diversidad y el planteamiento de su aprovechamiento racional, ya que son muy pocos los estudios químicos y farmacológicos que validen su uso popular y propiedades atribuidas.
2
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes en Guatemala
Los hongos comestibles se conocen desde tiempos inmemoriales. Se estima que cerca de 7,000 especies poseen varios grados de comestibilidad, y más de 3,000 especies de 31 géneros se consideran como las principales comestibles (Chang & Miles, 2004).
Los análisis de la composición de los hongos cultivados han revelado que los hongos comestibles son ricos en proteínas y carbohidratos, moderados en fibra y cenizas, y bajos en grasas. Su valor energético es bajo, y son una buena fuente de aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. El potasio y el fósforo son dos elementos dominantes en la porción mineral. Los hongos contienen una porción sustancial de tiamina, riboflavina, niacina y de vitamina B2. En 100g de proteína cruda hay 32 a 48g de nueve aminoácidos esenciales. De estos, la lisina es la más abundante, mientras que las cantidades de triptófano y metionina son bajas (Chang & Miles, 2004).
Estudios realizados: Se determinó la composición química (materia seca, proteína cruda, grasa cruda, carbohidratos totales y cenizas) y componentes no volátiles (azúcares solubles, aminoácidos libres, y 50-nucleótidos) de 10 populares especies de hongos silvestres comestibles (Agaricus campestris, Boletus edulis, Calocybe gambosa, Cantharellus cibarius, Cornucopioides Craterellus, clypeatum Entoloma, Flammulina velutipes, Macroleptiota procera, Morchella elata y Pleurotus ostreatus). Se encontró que todas las setas investigadas son fuentes de proteínas e hidratos de carbono totales. Además, el contenido de grasa fueron muy bajos y B. edulis (19,87 mg/g) mostró la mayor concentración de aminoácidos (Beluhan & Ranogajec, 2011).
Se determinó el contenido mineral fósforo (P), hierro (Fe), calcio (Ca), zinc (Zn), magnesio (Mg), potasio (K), sodio (Na), cobre (Cu) y manganeso (Mn) de treinta hongos comestibles silvestres de Turquía. El contenido de potasio se encontró que era más alto que las de los otros minerales en todas las setas. Las concentraciones de K, P y Cu estaban en concentraciones más altas en Suillus granulatus (Gençcelep, et al., 2009).
3 La composición antioxidante y propiedades de 18 setas portuguesas (Clitocybe alexandri, Glaucopus Cortinarius, hepatica Fistulina, Hydnum repandum, Hygrophoropsis aurantiaca, Hypholoma capnoides, Laccaria amethystina, Laccaria laccata, Lactarius aurantiacus, Lactarius salmonicolor, Lepista inversa, Lepista sordida, Mycena rosea, Russula delica, Russula vesca, Suillus collinitus, Suillus mediterraneensis, Tricholoma sulphureum) fueron evaluados, a fin de contribuir a la caracterización general de estos productos. Se evaluó la capacidad antioxidante reduciendo la potencia y la inhibición de la peroxidación de lípidos medida en soluciones de liposomas. Además, se determinó la composición de tocoferoles por HPLC-fluorescencia. Las setas analizadas contienen poderosos antioxidantes tales como fenoles (0.51-7,90 mg / g) y tocoferoles (0,02-8,04 lg / g). β-tocoferol fue el que se detectó en cantidades mayores. Todas las especies demostraron tener actividad antioxidante siendo más significativo para H. aurantiaca (Heleno, et al., 2010).
Se evaluó la actividad antioxidante in vitro y la actividad inhibitoria de acetilcolinesterasa (IACE) en Ganoderma lucidum, Schizophyllum commune, Hericium erinaceus, mostrando una alta capacidad antioxidante y compuestos fenólicos entre 6.19 a 63.51 mg equivalentes a ácido gálico/g y G. lucidum fue el que presentó mejor actividad como IACE (Abdullah, et al., 2011).
Se evaluó la actividad antioxidante de tres hongos de Portugal, Leucopaxillus giganteus, Sarcodon imbricatus y Agaricus arvensis, los extractos metanólicos mostraron capacidad antioxidante, L. giganteus presentó mayor contenido de compuestos fenólicos y mejor actividad con una concentración media mucho menor (Barros, et al., 2007). Se evaluó el contenido nutricional de diferentes especies de macromicetos encontrando un alto contenido de proteínas, bajo en grasa, alto contenido en compuestos fenólicos, polisacáridos y minerales como selenio, zinc, calcio, hierro, manganeso, cobre, sodio, potasio, calcio, evidenciando un alto potencial como alimento y medicamento (Diéz and Alvarez, 2001; Agrahar-Murugkar & Subbulakshmi, 2005; Barros et a., 2008, Trimmel & Kluthe, 1998).
Siete setas silvestres comestibles de consumo habitual en las colinas de Khasi de Meghalaya se analizaron para su contenido de seca materia, proteína cruda, grasa, fibra y cenizas junto con los minerales (Ca, P, Fe, Mn, Cu, Zn, Na, K, Mg y Se), ácido ascórbico y el perfil de
4 aminoácidos esenciales. El perfil de macronutrientes en general reveló que las setas eran ricas fuentes de proteína y tenía bajas cantidades de grasa. En general, la mayoría de los hongos estudiados tenían una buena cantidad de minerales, incluyendo minerales traza. En promedio, fenilalanina fue el aminoácido limitante (0,9 lg%), mientras que la mayor cantidad de CEA presente en los hongos estudió era leucina (704 lg%). Una porción de los hongos estudiados (250 g peso fresco) contenía un promedio de 6,12 g de proteína, 287 mg de calcio, 9,3 mg de hierro y 3,72 mg de zinc. Más importante es que tenían niveles bajos de grasa (0,712 g) y sodio (0,077 mg) (Agrahar-Murugkar & Subbulakshmi, 2005).
Estudios en Guatemala: La producción total de hongos comestibles en Guatemala ha sido estimada en 132,104 kg por año, incluyendo A. bisporus y A. bitorquis (51.9%), L. edodes (25.7%), y Pleurotus spp. (22.4%) (De León, 2003).
En los años 2004-2005 se ejecutó el primer proyecto de hongos en las zonas tropicales del país: Análisis de la Distribución y Composición de la subclase Himenomicetes (Macrohongos) dentro de las Clases Vegetales propuestas para la zona de influencia del parque Nacional Laguna Lachúa Cobán, Alta Verapaz (Proyecto AGROCYT -016-2004). En este periodo se colectó un total de 2,652 especímenes, pertenecientes a 546 morfo especies, reportando 31 especies y 10 géneros nuevos para el país.
Quezada (2005) realizó un análisis de la diversidad y distribución de macrohongos del ordenes Agaricales y Aphylloporales, en relación con los paisajes antropogénicos en la zona de influencia del Parque Nacional Laguna Lachúa, Cobán, Alta Verapaz en el cual concluyó que las familias del orden Agaricales que presentan una mayor disminución de morfoespecies debido a los cambios antropogénicos en los microhabitats de la zona de influencia son: Tricholomataceae, Entolomataceae, Lepiotaceae y Agaricacea. Los géneros Panaeolus, Coprinus, Psilocybe (Agaricales) y Pycnoporus y Schizophyllum comune (Aphylloporales) también son considerados indicadores de áreas perturbabas, ya que es común encontrarlas en las clases vegetales cultivo, Guamil 1, Guamil 2, Potreo y Potrero y Potrero Enguamilado (Quezada, 2005)
5 López (2009), realizó un estudio sobre la distribución de Macrohongos (Agaricomycetes) en remanentes de bosque de la zona de influencia del Parque Nacional Laguna Lachuá, Cobán Alta Verapaz. En el cual concluyó que los órdenes más abundantes en los remanentes de bosque son Agaricales y Polyporales, de los que las familias más abundantes son: Tricholomataceae con un 48.82% y Polyporaceae con 7.06% (Quezada et al., 2009).
Se evaluó la composición de nutrientes y el contenido de fenoles totales, flavonoides y vitamina C en el hongo Agrocybe cylindracea recolectado en cuatro lugares diferentes del departamento de San Marcos, Guatemala: Aldea Santa Irene, Aldea Santa Rita y Cantón Tojchiná, del municipio de San Antonio Sacatepéquez, y el caserío Monterrey, Aldea Santa Teresa, del municipio de San Pedro Sacatepéquez. El análisis proximal de la muestra de Agrocybe cylindracea mostró que el hongo contiene, en porcentaje calculado sobre la muestra seca, 19.23% de proteína, 14.57% de fibra cruda, 1.24% de grasa cruda, 10.97% de ceniza y 41.29% de carbohidratos totales (Pinagel, 2009).
Se realizó el estudio de seis especies de hongos comestibles Armillariella polymyces, Boletus edulis, Cantharelus lateritius, Neolentinus ponderosus, Lactarius deliciosus y Amanita garabitoana, la actividad antimicrobiana, larvicida y citotóxica fue pobre en las seis especies a excepción de Amanita garabitoana (extracto acuoso) quien mostró actividad contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli. El hongo A. polymyces mostró actividad inhibitoria sobre el sistema de complemento con una CI50 de 1.37 μg/mL y el extracto acuoso de B. edulis fue el único que mostró actividad estimuladora de la linfoproliferación a una concentración efectiva mínima (CEM) de 125 μg/mL (Paz, et al., 2011).
Se realizó la determinación de actividad antioxidante de extractos acuosos y etanólicos obtenidos de las especies de basidiomicetos comestibles: Agaricus aff. bisporus (J.E. Lange) Imbach, Agaricus brunnescens Peck, Armillariella polymyces (Pers.) Singer & Clémençon, Amanita garabitoana Tulloss, Halling & G.M. Muell., Boletus edulis Bull., Cantharellus lateritius (Berk.) Singer, Laccaria amethystina (Huds.) Cooke, Lactarius deliciosus (L.) Gray, Neolentinus ponderosus (O.K.Mill.) Redhead & Ginns, Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. Se
6 determinó por medio de todas la técnicas (cualitativa y cuantitativas) que todas las especies presentan alguna actividad antioxidante. Los extractos acuosos mostraron mayor actividad antioxidante que los extractos etanólicos en todas las técnicas cuantitativas utilizadas. La especie que mostró mayor actividad antioxidante tanto en su extracto acuoso como etanólico fue B. edulis (Belloso, et al., 2012).
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación
Los hongos han sido utilizados como alimento y medicina tradicional desde épocas prehispánicas e incorporados en la dieta de diversos grupos étnicos (Guzmán, 2008b). Los hongos comestibles poseen altos contenidos de proteínas, carbohidratos y vitaminas, y bajos en grasas (Colak et al., 2009). Actualmente, el interés de los hongos comestibles ha crecido significadamente debido a que han demostrado propiedades nutrimentales y medicinales que han sido utilizadas en tratamientos terapéuticos (Barros et al., 2008).
Adicionalmente, los hongos comestibles son considerados un recurso forestal no maderable ya que contribuyen a la conservación de bosques, y forman parte de la estructura y funcionamiento de los mismos, estando entonces vinculados a la prestación de servicios forestales, tales como: recreación, captura de agua y carbono, conservación de la biodiversidad y ecoturismo (Pilz y Molina, 2002).
Sin embargo, pocos son los trabajos realizados sobre la importancia de los hongos comestibles en la medicina moderna y su potencial en cosmética o biotecnológico a través de la producción de bioinoculantes de árboles forestales. Por ello, el objetivo de este trabajo es identificar especies de hongos comestibles comercializados en Guatemala con potencial medicinal, económico y biotecnológico, como preámbulo del uso de un recurso forestal no maderable que puede incorporarse en el desarrollo sustentable en las comunidades rurales y proponer un producto para darle valor agregado.
7 I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General
Evaluar la actividad biológica, composición nutricional y química de cinco macromicetos para su aprovechamiento y conservación en el desarrollo como posibles alimentos funcionales, nutraceúticos, productos medicinales y cosméticos.
I.3.1.2 Específicos
Caracterizar cinco basidiomicetos mediante estudios fitoquímicos para determinar su potencial medicinal en base a los metabolitos primarios y secundarios detectados.
Evaluar la actividad biológica de cinco basidiomicetos mediante técnicas in vitro como posibles agentes antioxidantes, antimicrobianos, antiureasa y citotóxicos para el desarrollo de productos medicinales y cosméticos.
Determinar la composición nutricional de cinco especies de basidiomicetos para seleccionar la especie más promisoria en el desarrollo de un producto con fines nutricionales, medicinales o cosméticos.
Diseñar y formular un producto en base a las especies de basidiomicetos más promisorios para su aplicación y posible comercialización.
Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el campo de su competencia la información obtenida de la investigación.
8 I.3.2 Hipótesis
Al menos una de las especies de basidiomicetos presentan actividad biológica interesante para la propuesta de un producto.
I.4 METODOLOGIA I.4.1 Localización
El proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales, en el Edificio T-10 laboratorio 106, ciudad Universitaria zona 12, ciudad de Gutemala.
Las colectas se realizaron en cuatro departamentos de Guatemala los cuales fueron: San Marcos, Chimaltenango, Alta Verapaz y Sacatepéquez
I.4.2 Las Variables
I.4.2.1 Variables dependientes Actividad biológica Tamizaje fitoquímico
I.4.2.2 Variables Independientes Extractos
I.4.3 Indicadores
Extracción: rendimientos de extractos Actividad antioxidante: Inhibición de radical
Tamizaje fitoquímico: presencia o ausencia de metabolitos Cuantificación de flavonoides y fenoles totales
Análisis de minerales y azúcares Análisis proximal
Citotoxicidad
Actividad antibacteriana Actividad antitirosinasa
9 I.4.4 Estrategia Metodológica
I.4.4.1 Población y Muestra
Selección de las especies: Mediante criterios etnomicológicos y ecológicos (abundancia relativa de una especie determinada), se seleccionaron cinco macromicetos que se distribuyen en mercados locales o se cultivan en áreas rurales (Boletus edulis, Agaricus brunnescens, Amanita caesarea complex, Cantharellus lateritus, Armillaria polymyces y Ganoderma lucidum), los cuales en estudios anteriores mostraron la mejor actividad biológica para continuar con estudios de caracterización, explorar otras actividades y proponer un producto.
I.4.5 El Método
La obtención y colecta del material se llevó a cabo en los lugares donde se encuentre en mayor abundancia el basidiomiceto seleccionado y donde se comercializa o cultiva. El material fue identificado por los especialistas de la Escuela de Biología y Química Biológica de la USAC. Se obtuvo una muestra representativa de cuando menos 250-500 g de material de los cuales se llevó a cabo la extracción y pruebas de laboratorio (estudio fitoquímico y ensayos biológicos).
Procesamiento y embalaje de las muestras: Las muestras fueron procesadas conforme a técnicas convencionales de secado y molienda. El almacenamiento, embalaje y transporte se realizó conforme a los principios botánicos aceptados.
6.7.3 Extracción: Del material vegetal a trabajar se obtuvieron extractos, siguiendo el método de extracción por percolación y concentración por rotaevaporador. Se realizó la extracción con un disolvente polar (agua y/o etanol), de acuerdo a protocolos establecidos de acuerdo a la actividad a evaluar.
6.7.4 Caracterización Química:
10 El tamizaje (screening) fitoquímico es una de las etapas iniciales de la investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los principales grupos de constituyentes químicos presentes en una planta y a partir de allí, orientar la extracción y/o fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés. Consiste en la extracción de la planta con disolventes apropiados y la aplicación de reacciones de coloración y análisis por cromatografía en capa fina. Debe permitir la evaluación rápida, con reacciones sensibles, reproducibles y de bajo costo.
Investigación de alcaloides:
Ensayos macro y semimicro: Se pesó 1 g de material vegetal. Se agregaron 2 gotas de solución de hidróxido de amonio al 10% (p/v), luego se añadió 25 mL de metanol a 60°C. Se filtró con papel filtro Whatman 1 y acidificó el filtrado con ácido clorhídrico 2 N. La solución resultante se dividió en 4 tubos y evaluó de la siguiente manera:
Tubo 1: Se agregó 5 gotas del reactivo de Mayer’s. (Color blanco a crema). Tubo 2: 5 gotas del reactivo de Dragendorff. (Color rojo a naranja). Tubo 3: 5 gotas del reactivo de Wagner. (Color marrón). Tubo 4: testigo. Se utilizó como estándar soluciones al 1% de atropina y papaverina. Se observó durante 2 horas la existencia de precipitados, turbidez o precipitación de complejos en los tubos.
Cromatografía en capa fina: Se pesó 1 g de material vegetal seco y molido, se agregó 1 mL de hidróxido de amonio al 10% (p/v) y se extrajo con 5 mL de metanol. Se colocó en baño maría a 60°C durante 5 minutos. Se filtró y concentró. Se aplicó en una placa de silica gel 60 F254, utilizando como estándar una solución de atropina y papaverina al 1 % en metanol (10 μL). Fase móvil: tolueno-acetato de etilo-dietilamina (70:20:10); acetato de etilo-metanol-agua (100:13.5:10), cloroformo- dietilamina (90:10); acetona-agua-amonio concentrado (90:7:3) Detección: Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, UV 365 nm algunos fluorescen azul o amarillo. Reactivo de Dragendorff: zonas cafés o naranjas en vis, los colores no son estables.
11 Investigación de flavonoides y antocianinas:
Ensayos macro y semimicro: Se extrajo 3 g de material vegetal pulverizado con 10 mL de etanol al 80 %, se filtró y concentró. Se enfrió a temperatura ambiente y se trituró el residuo con 15 mL de éter de petróleo hasta que la extracción fue incolora. Se disolvió el residuo con 30 mL de etanol al 80 %, se filtró y se dividió en 5 tubos:
Tubo 1: Se agregó 0.5 mL de ácido sulfúrico concentrado. Tubo 2: 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10 % (p/v). Tubo 3: 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado y se calentó en baño de maría por 5 minutos (prueba para leucoantocianinas). Tubo 4: magnesio metálico y 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado. Tubo 5: álcali a un extracto acuoso. Tubo 6: solución de ácido bórico en anhídrido acético. Tubo 7: testigo.
Se evaluaron las reacciones, cambios de color y/o formación de precipitado comparados con el testigo. Desarrollo inmediato de color flavonas y flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles (rojo a magenta), flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul), isoflavonas (amarillo); isoflavononas, chalconas y auronas no dan coloración.
Cromatografía en capa fina: Se extrajó 1 g de material vegetal seco pulverizado con 10 mL de metanol por 5 minutos en baño de maría a 60°C. Se filtró la solución y se aplicó sobre las cromatoplacas de silica gel 60 F254. Como estándar se utilizó una solución de flavonoides al 0.05 % en metanol (10 μL). (Quercetina, rutina, ácido clorogénico, hiperósido). Fase móvil: acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-agua (100:11:11:27), n-butanol-ácido acético-agua (40:10:50); acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-etilmetilcetona-agua (50:7:3:30:10) Detección: Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, zonas azules o amarillas. UV 365 nm, dependiendo la estructura fluorescen amarillo, azul o verde. Reactivo de Productos Naturales (NP/PEG). Fluorescencia intensa en UV-365 nm. Solución 1: solución metanólica al 1 % de difenilboriloxietilamina (NP). Solución 2: solución etanólica al 5 % de polietilenglicol 4000 (PEG).
12 Investigación de cumarinas:
Ensayos macro y semimicro: Se midió 5 mL de extracto vegetal metanólico, se agregó 1 mL de agua destilada hirviendo. Con un capilar se aplicaron 2 manchas en papel filtro. A una mancha se agregó 1 gota de hidróxido de potasio 0.5N, y se observó bajo luz UV de 365 nm (fluorescencia azul o verde: positivo). Cromatografía en capa fina: A 1 g de material vegetal se adicionó 10 mL de metanol y calentó 30 minutos en baño de maría. Se filtró y evaporó hasta 1 mL. Se aplicó 20 μL en una cromatoplaca de sílica gel 60 F254, se utilizó como estándar canela en metanol al 1 %, umbeliferona, ácido p-cumárico, cumarina.). Fase móvil: tolueno-acetato de etilo (93:7); tolueno-éter (1:1 saturado con 10% de ácido acético, 50 mL de tolueno y 50 mL de éter son mezclados durante 5 min con 50 mL de ácido acético al 10%, se filtró y se descartó la fase de abajo, y la mezcla de tolueno-éter). Detección: Sin tratamiento químico UV 254nm fluorescencia. UV 365 nm todas las cumarinas muestras una intensa fluorescencia azul o verde- azul. Solución etanólica de hidróxido de potasio al 5 o 10%. UV-365 nm fluorescencia azul o verde.
6.7.5 Evaluación de la actividad antioxidante:
Método de por cromatografía en capa fina para evaluar la actividad atrapadora de radicales por DPPH: Se aplicó 10 μL de muestra y 5 μL del estándar antioxidante terc-butilhidroquinona (TBHQ) en una placa cromatográfica de silica gel 60F254. Se colocó la placa en una cámara de vidrio saturada previamente con acetato de etilo:ácido acético:ácido fórmico:agua (100:11:11:26). Se secó y asperjó con DPPH (1mg/mL en metanol). Resultados: Si los extractos presentan actividad antioxidante se observa la decoloración del DPPH en las bandas respectivas.
Método colorimétrico: DPPH es un radical libre utilizado para evaluar la actividad atrapadora de radicales de un compuesto o extracto vegetal (Ravishankara et al., 2002). Se preparó una serie de cuatro tubos de reacción por ensayo. Al primer tubo que es el blanco del control se le agregó 1 mL de una solución tampón de acetato y 2 mL de metanol. Al segundo tubo control, se le agregó 1 mL de tampón de acetato, 1.5 mL de metanol y 0.5 mL de solución metanólica de DPPH (0.0219 % p/v). Al tercer tubo, blanco del ensayo, se le agregó 1 mL de tampón de acetato, 1.4 mL de metanol, 0.1 mL de extracto de la muestra y 0.5 mL de solución de DPPH. Al cuarto tubo,
13 ensayo, se le agregó 1 mL de tampón de acetato, 1.4 mL de metanol, 0.1 mL del extracto y 0.5 mL de solución de DPPH. Se realizó la lectura de la absorbancia en un espectrofotómetro (517 nm) contra el blanco respectivo. Se calculó el portentaje de disminución de la abs causado por el extracto (Abs b control–Abs e)/Abs control * 100 = % dis Abs. Se graficó la concentración del extracto (eje x) vrs % dis Abs (eje y). Se interpola el valor de CI50. La actividad antioxidante se expresa en términos de la concentración de inhibición al 50% (CI50) que es la concentración del extracto requerida para disminuir un 50% la absorbancia de DPPH (Lima, 2003).
Determinación del Poder Reductor de Hierro: Se disolvió 20mg de extracto metanólico y/o diclorometanico en 1ml de metanol. Se disolvió 15μg de ácido ascórbico en 1ml de agua destilada. Se mezcló 1ml del extracto, 1mL de tampón de fosfato (0.2M, pH 6.6) y 1mL de ferrocianuro de potasio (1%). Se incubó 20min a 50°C. A la mezcla reaccionante, se adicionó 1mL de ácido tricloroacético (10% p/v). Se centrifugó a 3000 rpm (10 min). Se mezcló 1.5mL del sobrenadante de la solución, 1.5mL de agua destilada y 0.375mL de cloruro férrico (0.1%). Se midió la absorbancia a 700nm Cálculos: ((Abs control-Abs Mx)/Abs control)*100 (Kosem & Moongkarndi, 2007).
Decoloración del radical catiónico del reactivo ácido 2,2’-azinobis-(acido-3- etilbenzotiazolina -6-sulfónico) ABTS. El procedimiento se basó en lo descrito por Re et al. (1999) y Vasco, Ruales & Kamal-Eldin, (2008) con algunas modificaciones. Se preparó el catión ABTS+ con la mezcla de la solución ABTS (7mM) y la solución de persulfato de potasio (2.45mM) con 18h previas de incubación. Luego se diluyó en etanol al 95% (1:30) a manera de obtener una absorbancia (Abs) de (0.70 ± 0.2) en una lectura en el espectrofotómetro a 734nm. La solución de trabajo se incubó durante 30 min a temperatura de 30°C. La dilución del extracto (3µL) se mezcló con 3mL de la solución de trabajo de ABTS. Se leyó la Abs en el espectofotómetro a 734nm en el minuto 1, 4 y 6 de la misma muestra de extracto. Se calculó el % Inh de la Abs por medio de la ecuación (1). Se interpretó según el valor de CI50, es decir, la concentración del extracto requerida para disminuir un 50% la absorbancia de ABTS. Los resultados se expresaron en TEAC (actividad antioxidante equivalente a Trolox), ya que representa la concentración de solución de Trolox que tiene la misma capacidad antioxidante que el extracto.
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Cuantificación de fenoles totales: Se realizó según la metodología de Lima (2003) con algunas variantes, utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu. Se preparó una curva patrón con 4mL de ácido gálico disuelto en agua (1:10) en concentraciones de 0.625-6.25mg/mL. Se agregó un blanco con 4.0mL de agua, 0.4mL de reactivo de Folin-Ciocalteu y 0.8mL de Na2CO3 al 10%. Se prepararon dos tubos de muestra del extracto, en el primer tubo se agregó 3.95mL de agua, 0.4mL de reactivo de Folin-Ciocalteu, 0.8mL de Na2CO3 al 10% y 50µL de muestra; al segundo tubo se agregó 3.90mL de agua, 0.4mL de reactivo Folin-Ciocalteu, 0.8mL de Na2CO3 al 10% y 100µL de muestra. Los tubos de reacción se agitaron en un vortex durante 30 seg, se calentaron de 90-100°C por 1 min. y se enfriaron. Se realizó la lectura en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 765nm. La cantidad de fenoles totales se expresó como µg equivalentes de ácido gálico por mg de extracto.
Análisis de Minerales: Se realizó una digestión con ácido sulfúrico y ácido nítrico y se calentó hasta que su contenido se torna de color negro. Posteriormente se realizó la digestión con ácido perclórico. Se realizó la lectura de las muestras en un espectrofotómetro de absorción atómica. Como control y aseguramiento de la calidad de la técnica se prepararon soluciones estándares de 1 ug/ml de los minerales a analizar a partir de una solución patrón de 100 ug/ml para construir una curva de calibración del equipo (Valenzuela, 2008).
Azúcares solubles en agua (Mono-, Oligo-, y Polisacáridos): Son de importancia por su actividad inmunomoduladora reportada en diversos géneros de hongos. Se realizó una hidrólisis ácida con TFA 2M a 100°C por 10 h. El producto, evaporado a temperatura ambiente, se disolvió con agua y se aplicó en la cromatoplaca y se reveló con nitrato de plata para detectar las manchas de carbohidratos o bandas (Waksmundzka-Hajnos, 2008)
Composición de Azúcares por medio de HPLC: El polvo seco (1.0g) se extrajo con 40mL de etanol al 80% por 30 min. La suspensión resultante se centrifugó a 15,000g por 10 min. El sobrenadante se concentró a 60°C a presión reducida y se desengrasó tres veces con éter etílico. Luego se concentró a 40°C, los residuos sólidos se disolvieron con agua para dar un volumen
15 final de 5mL. Los azúcares solubles se determinaron utilizando HPLC, con una fase móvil de acetonitrilo:agua 7:3 (v/v) a un flujo de 1.25mL/min. Los resultados se expresaron en g/100g del peso seco, calculados como la normalización interna del área del pico. La identificación de los azúcares se realizó comparando los tiempos de retención relativos de las muestras con los de los estándares de diferentes azúcares (Barros et al, 2008,)
Análisis de Proteínas: Se redujo el tamaño de partícula utilizando un mesh-20. Las muestras para el análisis deben de ser homogéneas. No se requiere ninguna otra preparación especial.
Digestión: Se colocó la muestra (exactamente pesada) en un matraz Kjeldahl. Se añadió ácido sulfúrico (2.5mL) y la mezcla catalizadora (1.0g). Sulfato de amonio no volátil se forma de la reacción del nitrógeno con el ácido sulfúrico.
Neutralización y Destilación: El digerido se diluyó con agua. Un álcali que contiene tiosulfato de sodio se agregó para neutralizar el ácido sulfúrico. El amoniaco formado se destiló a una solución de ácido bórico que contiene los indicadores azul de metileno y rojo de metilo (AOAC Method 991)
6.7.6 Determinación de la bioactividad:
Ensayo contra Artemia salina (camarón salino): La A. salina es un crustáceo cuyas larvas (nauplios) son sensibles a gran variedad de sustancias, la citotoxicidad de extractos sirve para dirigir el fraccionamiento bioguiado en forma rápida y simple, es una prueba útil aunque no es selectiva para ninguna molécula química.
La técnica consistió en la preparación de un medio salino adecuado, la colocación de huevos del crustáceo en dicho medio y eclosión. Se transfirió la mayor cantidad de nauplios vivos a un erlenmeyer con medio salino fresco. Se prepararon para cada sustancia de prueba 3 niveles de dilución (1000, 500 y 250 μg) y se colocaron por triplicado en 9 pozos de la microplaca, haciendo un volumen total por pozo de 100 μL de solución a ensayar. Posteriormente se agregaron a cada pozo 100 μL de medio salino conteniendo de 10 a 15 nuplios y 100 μL de medio salino. Se
16 utilizaron 3 pozos como controles negativos los que se preparan en forma similar, utilizando como sustancia de prueba el medio de disolución de los extractos. Después de 24 horas se procedió a contar el número de sobrevivientes en cada dilución, del que por diferencia con el valor inicial, se calculó el número de muertos observados. La Concentración Letal Media (CL50) se calculó mediante una regresión no paramétrica utilizando el programa Finney para Basic.
Actividad antibacteriana: La medición de esta actividad se realizó por métodos de dilución, que sirve tanto para el tamizaje como para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) que se requiere del agente antimicrobiano para inhibir al microorganismo. La CIM es la concentración más baja en la que no hay crecimiento visible en agar (placa), está basado en el descrito por Mitscher et al. (1972).
Se midió por el crecimiento de bacterias inoculadas en superficie de medios conteniendo moléculas bioactivas. El procedimiento ofrece una distribución homogénea del compuesto en el agar que consiste en preparar cajas de Agar Muller-Hinton (AMH) con 1.0 mg/mL del extracto (AMH-E). Se inocularon las bacterias en caldo, se incubaron 24 horas a 36°C, se diluyó 1:100 en agua destilada estéril, se inoculó con estrías por cuadruplicado (error < 0.05) en la superficie de AMH-E e incubó a 36°C por 24 horas. Este procedimiento se aplicó a levaduras, diluyendo el inóculo 1:10 e incubando a 48 horas. Se evaluó el crecimiento de bacterias (-) o su inhibición (+). Para la CIM se utilizaron diluciones decrecientes (1, 0.5, y 0.25 mg/mL), se consideran positivos los extractos activos a concentraciones <1 mg/mL. El tamizaje se efectuó con las siguientes cepas de microorganismos: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhi ATCC 14028, Mycobacterium smegmatis ATCC 607, Bacillus subtilis ATCC 6051, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATCC 10231 y Cryptococcus neoformans C 13.
Actividad anti tirosinasa por cromatografía en capa fina
Preparación de muestra y controles: Se disolvió 20mg de cada extracto metanólico y/o diclorometano en 1ml de acetona grado analítico (98%), se disolvió 1mg de ácido kojico en 1ml de agua destilada.
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Actividad: Se saturaron las cámaras cromatográficas con la fase móvil 20min antes de someter las placas. En la placa de silica gel se aplicaron 10μl de muestras y 5μl del control. Se dejó secar al aire las placas. Se colocaron las placas y se dejó eluir, posteriormente se roció L-tirosina (2mM). Se incubó a 25 ˚C por 10 min. Seguidamente se roció la placa con solución de tirosinasa (enzima) e incubó a 25˚C por 30 min. Se observó la coloración gris-purpura en la placa y zonas claras donde hubo inhibición de la enzima (Momtaz, et al., 2008).
Determinación por medio de ácido kójico (por espectrofotometría): Se disolvió 0.20 mg de L-tirosinasa en 10 mL de tampón de fosfatos, 20 mg de extractos y compuestos purificados en DMSO hasta obtener concentraciones de 25-400 μg/mL. Se aplicaron 70 μL de extractos y estándar + 30 μL de tirosinasa en placa de microtitulación de 96 pocillos. Se incubó a 37˚C por 60 min. Se añadió 110 μL del substrato (2 mM L-tirosina), e incubó a 37˚C por 15 min. Se midió el cambio de absorbancia a 492 nm y se calculó el porcentaje de inhibición.
Propuesta de un producto: Se seleccionó la especie más promisoria con mejores resultados de acuerdo a su análisis nutricional, capacidad antioxidante, antibacteriana, para la propuesta de un producto.
I.4.7 Los Instrumentos a utilizar
Se utilizaron cuadernos para el registro de las actividades realizadas diariamente y resultados obtenidos, además de la documentación registrada en la bitácora del laboratorio. Se elaboraron informes mensuales y trimestrales para indicar el avance de la investigación. Se utilizó el equipo, materiales e infraestructura del Laboratorio de Investigación de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Química y Farmacia, para los análisis fitoquímicos, fisicoquímicos y espectrofotométricos y la evaluación de la actividad biológica.
I.4.8 Cronogramas
18 En la siguiente tabla se describen las actividades realizadas por trimestre.
Tabla 1. Cronograma de Actividades
Actividades I II III IV V VI VII VIII
Colecta del material fúngico X x X Secado y molienda X x X Extracción de aceites esenciales x X x Obtención de extractos etanólicos x X x x Caracterización fitoquímica x X Análisis nutricional (azúcares y proteínas) x x X Análisis de oligoelementos X x Evaluación de actividad antioxidante y antitirosinasa x x Evaluación de actividad antibacteriana x x X Evaluación de actividad citotóxica X x x Desarrollo de producto x x x Análisis e interpretación de resultados x
I.4.8.2 Cronograma de Desembolsos
La ejecución financiera del proyecto se realizó mediante presentación de requisiciones de compra y presentación de solicitudes de honorarios, hubo dificultad en la ejecución por el cambio de fideicomiso y falta de disponibilidad financiera por parte del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología por lo que no se logró la ejecución del 100%. La presentación de solicitudes de pagos
19 a investigadores fue de forma trimestral, aunque los pagos no fueron realizados continuamente de manera trimestral, respecto a las compras aunque se presentaron las solicitudes en tiempo no hubo un proceso de seguimiento y control por lo que se compraron cuando había disponibilidad de fondos de una manera muy irregural y atrasada. A continuación se presenta el cronograma trimestral de compras y honorarios que en la mayoría de casos no fue posible su cumplimiento en el tiempo establecido
Tabla 2. Cronograma de ejecución financiera
I II III IV V VI VII VIII
Pagos a investigadores y auxiliares X X X x x x x Compra de reactivos y disolventes X x x Compra de útiles menores, suministros X x x Compra de equipo x Alimento para personas (actividad de capacitación) x
20 PARTE II
MARCO TEÓRICO
Los hongos (reino Fungi) son un grupo muy diverso de individuos con un papel ecológico importante como descomponedores de materia orgánica y simbionte de plantas vasculares (Guzmán, 1998). Contribuyen a la formación del suelo y al reciclaje de elementos en los ecosistemas. Se desarrollan en climas ecuatoriales subtropicales o tropicales, templados y aún en los fríos; y desde el nivel del mar, hasta altitudes de 4,000 msnm (Herrera, 1990).
Son organismos unicelulares o pluricelulares que se alimentan mediante la absorción directa de nutrientes presentes en su sustrato, junto con las bacterias, los hongos son los causantes de la putrefacción y descomposición de toda la materia orgánica (Herrera, 1990). Por su tipo de nutrición, que consiste en absorción a través de la membrana celular, depende íntimamente del sustrato donde viven y desdoblan materiales orgánicos tan complejos como lignina, celulosa y quitina (Guzmán, 1998).
Los hongos desempeñan una función importante en el equilibrio ecológico de la naturaleza en muchos aspectos. Los hongos simbióticos son indispensables para el buen desarrollo de muchas plantas, las que no prosperarían sin su asociación en forma de micorrizas. Los saprófitos, utilizan sustancias orgánicas inertes, muchas de ellas en descomposición, que pueden ser reservadas de otros organismos, productos de excreción y excrementos o restos de animales o vegetales. Otros hongos son parásitos que se desarrollan en otros organismos vivos. (Guzmán, 1998)
El grupo de los hongos se considera el segundo taxón más diversos, después de los insectos y el menos estudiado, estimándose que solamente se conoce el 4.6% de la diversidad mundial (Hawksworth et al., 1995). Tiene aproximadamente 103 órdenes, 484 familias, 4,979 géneros y unas 100,00 especies descritas (Alexopoulos, et al., 1996).
Actualmente, se estima que el reino Fungi está constituido por 1.5 millones de especies, solo 70.000 de ellas han sido descritas, cerca del 50% de las especies de hongos existentes son comestibles en diferentes grados, y de los hongos descritos a nivel mundial, alrededor del 32% corresponden a hongos Basidiomicetos (Peng, y otros, 2017) Más de 3000 especies están
21 distribuidas en 31 géneros que son considerados como hongos comestibles primarios. De las 14.000 especies conocidas de hongos que son producidas a nivel industrial, 650 son medicinales con una amplia variedad de beneficios para la salud, pero solo 10 especies de estas son cultivadas a escala comercial. Alrededor del 10% de las especies conocidas pueden llegar a poseer componentes venenosos y 30 especies son consideradas letales. (Khatun, Islam, Cakilcioglu, & Chatterjee, 2012) (Sharma, 2015) (Linde, Luciani, Lopes, Silveira do Valle, & Colauto, 2017)
Los macromicetos son un gran grupo de macrohongos muy diversos y de gran importancia en la naturaleza debido a su papel dentro del ciclo del Carbono, y en la degradación de materiales recalcitrantes. Este grupo se compone de dos subdivisiones, los Basidiomicetos y los Ascomicetos, quienes tienen una distribución cosmopolita, encontrándose principalmente en lugares donde haya material orgánico en descomposición y agua, a una temperatura cercana a los 25°C. Los macromicetos tienen un ciclo celular que implica la formación de esporangios sexuales, en el caso de la subdivisión Ascomicotina son llamados Ascas, los cuales generan esporas conocidas como ascosporas. La unión de ascas conforma el cuerpo fructífero (Ascocarpos) de los Ascomicetos. En la subdivisón Basidiomicotina se representan hongos que en su ciclo biológico forman esporas conocidas como basidiosporas, las cuales a su vez son desarrolladas en los cuerpos fructíferos de los Basidiomicetos, conocidos como Basidiocarpos. (OrtizMoreno, 2010) Dichos hongos son considerados medicinales gracias al valor nutricional que exhiben por su alto contenido de carbohidratos, proteínas, aminoácidos libres, vitaminas, minerales esenciales y algunos elementos trazas. Además de esto son utilizados en la medicina por ser ricos en metabolitos secundarios como lectinas, compuestos fenólicos y polifenólicos, terpenoides, polisacáridos, entre otros. (Elsayed A, Enshasy, Wadaan, & Aziz, 2014) Igualmente presentan enzimas que tienen diferentes aplicaciones biológicas, como enzimas antioxidantes y enzimas lignolíticas que son de gran importancia biotecnológica, pues estas últimas logran degradar compuestos aromáticos, una vez el hongo que las excreta logra crecer en presencia de un sustrato recalcitrante. Algunas especies de estos hongos son empleadas en la industria y la medicina, por ejemplo, debido a sus componentes activos, caso especial de Psilocybe, hongo rico en Psilocibina, sustancia de acción psicotrópica que ocasiona alucinación a consumidores de este, y que ha sido utilizado desde tiempos prehispánicos. (Ortiz-Moreno, 2010)
22 Los hongos constituyen un grupo de microorganismos de gran interés económico, industrial, y científico. Son organismos heterótrofos, por lo que la absorción de nutrientes es por vía saprofítica o como parásitos facultativos u obligados. Como saprofitos Intervienen en los ciclos naturales de circulación de nutrientes, destruyen plantas y restos de animales degradándolos a formas químicas simples, que posteriormente pasan a formar parte del suelo siendo absorbidas por las plantas. A esta actividad de los hongos es atribuible la mayor o menor fertilidad de la tierra; aunque el crecimiento saprofito de los hongos también puede ser dañino y causar numerosas pérdidas si ocurre en alimentos u otros artículos comerciales e industriales, como en el caso de la descomposición y generación de compuestos carcinogénicos como las micotoxinas en los cereales. Sin embargo, estos organismos también tienen múltiples beneficios, algunos de ellos en la alimentación y salud, al ser usados en procesos fermentativos de índole industrial como la elaboración de pan, quesos, cervezas, vinos, producción de antibióticos, enzimas, hormonas, proteína unicelular, inmunomoduladores, vitaminas y ácidos orgánicos; mientras que como parásitos, los hongos enferman a plantas, hombres y animales, la mayor parte de esos males son menos graves que los causados por otros microorganismos.
Los hongos son organismos eucariotas, pluricelulares o unicelulares, acidófilos, aerobios, anaerobios facultativos, con temperaturas de crecimiento en intervalos que comprenden entre los 0°C y 55ºC. La mayoría son inmóviles pero pueden tener células reproductoras móviles, no poseen clorofila por lo que no realizan fotosíntesis, siendo entonces quimiorganotróficos y requiriendo para ello de compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía. Sus cuerpos son alargados o filamentosos, generalmente ramificados, de entre 5 a 10 µm de grosor, su reproducción puede ser de manera sexual o asexual llevando a la formación de esporas (cuyas características son importantes para la clasificación de los hongos), aunque en las levaduras este fenómeno se lleva a cabo mediante un proceso de gemación. Los filamentos poseen una pared celular la cual es de importancia taxonómica y antigénica, constituida por diversos compuestos, entre ellos polisacáridos como la quitina (N-acetil glucosamina); los cuales le confieren a esta una determinada rigidez. Los organismos fúngicos pueden ser afectados en su forma de crecimiento (levaduriforme, micelial, algodonosa entre otras) principalmente en los patógenos, al
23 ser expuestos a diferentes condiciones de estrés ya sea nutricional o ambiental generando fenómenos de crecimiento como el dimorfismo bifásico y pleomorfismo. La mayoría de los hongos están formados de estructuras filamentosas alargadas llamadas hifas, las cuales son consideradas su unidad estructural y funcional que durante el crecimiento se incrementan en número y tamaño, formando el micelio, el cual de acuerdo a la función que realice puede ser considerado vegetativo (penetrando en el sustrato con la finalidad de absorber y transformar nutrientes) o reproductor (habitualmente extendiéndose en el aire y manteniendo las estructuras especializadas para la generación de esporas)
En la cultura medicinal tradicional China los hongos han sido utilizados abundantemente por siglos, para tratar condiciones como dolores regulares, fatiga asociada al envejecimiento celular, problemas cardiacos, enfermedades en los pulmones y parásitos intestinales, caso específico donde es utilizado el hongo Lentinula edodes (Shitake). Y si bien en varias culturas del mundo los macrohongos son empleados de manera empírica por conocedores de los mismos, existe también información científica que soporto el hecho de que varias de las condiciones mencionadas anteriormente en realidad pueden mejorar con el consumo regular de ciertos hongos o sus extractos. En especial, el hongo L. edodes ha sido estudiado a profundidad, y más puntualmente las propiedades de los compuestos químicos que lo conforman.
En un estudio presentado por el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC, 2015), se menciona que la Lentina extraída del Skitake actúa como un adyuvante que estimula la producción de anticuerpos en ratones inyectados con una vacuna contra la Hepatitis B. Por otro lado, el hongo de repisa Ganoderma lucidum, conocido como Lingzhi en China y Reishi en Japón, es uno de los hongos medicinales más populares y tradicionales del mundo entero. Tal como con el hongo Shitake, se cree que el hongo Reishi puede ser empleado para tratar cáncer, problemas cardiovasculares y diabetes. A pesar de estas afirmaciones, es apresurado asegurar que estas especies pueden mejorar dichas condiciones, sin embargo, según investigaciones conducidas en otros hongos como Inonotus obliquus y Grifola frondosa, por lo menos es posible mencionar que todos ellos estimulan el crecimiento celular en cultivos de tejidos. (Money, 2016)
24 Los estudios de hongos en Guatemala se clasifican en cuatro grupos: inventarios, taxonomía, etnomicológicos y ecológicos.
Estudio de Inventario:
La primera colecta de macrohongos del país fue realizada por Sharp en 1948. Este autor citó diversas especies silvestres de venta en los mercados, como Amanita caesarea, Cantharellus cibarius y Schizophyllum commune (Sharp, 1948). En 1964, Lowy reportó 8 especies nuevas del orden Tremellales, asi como un género nuevo de la familia Tulasnellaceae (Morales, 2001). En 1983, Argueta reportó 27 géneros y 45 especies para los municipios de Mixco y San Juan Sacatepéquez (Argueta, 1993). En 1984, Sommerkamp publicó un trabajo sobre los macromicetos del Biotopo Universitario “Lic. Mario Dary Rivera” para la conservación del Quetzal, en Purulhá Baja Verapaz; reportando 51 géneros y 89 especies (Sommerkamp, 1984). En 1988 Sommerkamp realizó el estudio “Hongos Comestibles en los Mercados de Guatemala” apoyada por la Dirección General de Investigación (DIGI). El trabajo de Sommerkamp permitió la estandarización de la micoteca, el enriquecimiento de la biblioteca de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, la producción de material gráfico y la creación de la línea para la micología nacional. Sommerkamp encontró 21 especies comestibles pertenecientes a 17 géneros y 12 familias distintas (Sommerkamp, 1984).
En 1993, Aguilar realizó un estudio de macromicetos en la finca San Luis, en Escuintla, reportando géneros como Auriculara, Trametes, Trichaptum, Cantharellus, Pleurotus, Polyporus, Collybia, Higrophoropsis, Dacryopinax, Geastrum y Stereum entre otros (Aguilar, 1994). En 1995, Fuentes realizó una caracterización de macromicetos en el Astillero Municipal de San Pedro Sacatepéquez, San Marcos. En este estudio se reportó 23 géneros y 12 nuevos registrados para Guatemala (Fuentes, 1996).
Rizzo, en 1999 reportó 28 géneros y 37 especies para el parque Arqueológico Tikal Petén, de las cuales 20 especies constituyen nuevos registros para Guatemala (Rizzo, 1999). En el año 2000, Flores y Simonini, publicaron un artículo sobre Boletales de Guatemala en el que se enlistó 9 especies pertenecientes a 6 géneros, nombrando dos especies nuevas para la ciencia (Flores &
25 Simonini, 2000). En el 2001, Márquez realizó un estudio de macromicetos en la Finca Aprisco, en Totonicapán, donde reportó 29 géneros y 5 nuevos registros para el país (Márquez, 2001).
Estudios Etnomicológicos:
Etnomicología se puede definir como un área de la etnobiología interesada en el estudio de las interrelaciones del hombre con los hongos que se desarrollan en su entorno, haciendo referencia a la influencia que estos organismos han tenido en las expresiones culturales del hombre a través del tiempo y en diferentes regiones geográficas (Estrada, 1989).
Los estudios etnomicológicos son los que más se han realizado en Guatemala especialmente en el área occidental del país. En 1970, Lowy publicó varios artículos haciendo referencia a las piedras hongo, que habían sido descritas previamente por Sapper en 1898 y por Borhegyi en 1957. En 1972, Lowy documentó el simbolismo de los hongos en algunos códices Mayas. Toda esta información se enfocó en torno a la etnomicología, haciendo especial referencia al uso de hongos alucinógenos (Lowy, 1972).
En 1974, Lowy publicó un artículo sobre la relación existente entre fenómenos naturales y los hongos, así como su significado mortal o divino para Amanita muscaria. En 1975 documentó la micofilia que prevalece entre los habitantes indígenas del país. Un año más tarde, colectó y registró por primera vez en Guatemala el hongo alucinógeno, Psilocybe mexicana, conocido popularmente como “Pajarito”. Los últimos artículos de Lowy continuaron describiendo aspectos mayas relacionados con los hongos (Lowy, 1972).
En 1984, Guzmán escribió sobre la importancia de los hongos comestibles entre los pobladores de Mesomérica, principalmente en las regiones con bosque pino-encino, reportando además la venta de Amanita caesarea en los mercados del país (Guzmán, 1998). En 1985 Guzmán, Torres y Logemann describieron la primera especie nueva para el país: Morchella guatemalensis, un hongo comestible encontrado en bosque de pino-encino en Chimaltenango (Guzmán, 1998). En 1987 Guzmán registró Psedofistulina radicata, como objeto de venta en el
26 mercado local de Santiago Atitlán y reportó además la venta masiva de Schizophyllum commune en mercados del país (Guzmán, 1998). Torres, publicó sobre hongos alucinógenos en la cultura maya en la compilación “Etnomedicina de Guatemala” (Torres, 1984).
En 1990, Sommerkamp publicó los nombres populares que reciben los hongos comestibles que se venden en los mercados de las cabeceras departamentales del país, incluyendo algunos en idioma kaqchiquel y q´eqchi’ (Sommerkamp, 1984). En ese mismo año, Herrera investigó la nomenclatura de los hongos de la región de Cipotón, Sumpango, Sacatepéquez, en donde reportó la especie Ramaria flava como una especie comestible. En 1994, Ohi y Torres editaron el libro tilutado Piedras Hongo, describiendo las piedras hongo de museos y colecciones privadas y documentando la posible utilización de estas esculturas en la cultura Maya. En 1999, Flores y colaboradores publicaron los nombres en idioma mam de algunos hongos comestibles de la Sierra de los Cuchumatanes (Ohi & Torres, 1994).
En el 2001, Morales recabó importante información acerca del conocimiento que tienen los habitantes de Tecpán Guatemala, Chimaltenango, acerca de los hongos, en aspectos como el concepto, fenología, ecología, morfología, nomenclatura, clasificación tradicional y uso de los hongos locales. En este estudio se reportaron 38 nombres en idioma kaqchiquel y 21 en español. Además concluyó que los pobladores de esta región clasifican a los hongos como un grupo diferente a plantas y animales, y que los nombres de los mismos han sido asignados por analogía con los elementos del medio y algunos por metáfora (Morales, 2001).
El proyecto de investigación “Hongos Comestibles de Guatemala: Diversidad, Cultivo y Nomenclatura Vernácula” reportó hasta el año 2002, 70 especies de hongos comestibles en 21 comunidades del país. Este proyecto ha contribuido a incrementar el cepario de hongos comestibles de Guatemala; hasta la fecha se ha logrado aislar y mantener alrededor de 100 cepas de hongos comestibles nativos (Bran et al, 2001).
Con respecto al uso de basidiomicetos en la alimentación, el primer estudio en Guatemala fue publicado en 1948, donde se describe la venta en mercados de A. caesarea, C. cibarius y S.
27 commune (Sharp, 1948). En 1983 se realiza un estudio de los macromicetos de venta en mercados de la ciudad de Guatemala y los municipios de Mixco y San Juan Sacatepéquez, detectándose especies de Cantharellus, Lactarius, Ramaria y Amanita (Argueta, 1983). Posteriormente, se describe una nueva especie de hongo comestible en Chimaltenango, M. guatemalensis (Guzmán et al., 1985) y el comercio de P. radicata en Santiago Atitlán (Guzmán, 1987).
Un estudio importante sobre los macromicetos comestibles de venta en Guatemala fue el realizado durante 1988-90 en las 22 cabeceras departamentales del país, en búsqueda de lugares de venta de hongos comestibles en los mercados locales. Este amplio estudio demostró la presencia de 18 especies correspondientes a 15 géneros de basidiomicetos, sobresaliendo 9 géneros que se detectaron en varios departamentos (Sommerkamp, 1990). Durante 2001-2002 se recolectaron 600 especímenes de hongos comestibles en 21 comunidades de 10 departamentos del país y 21 especies no descritas para Guatemala anteriormente (Bran et al., 2003).
Estudios Ecológicos:
En 1998, se realizó la descripción de los hongos ectomicorrícicos asociados a encino (Quercus sp.) en bosques de Tecpán Guatemala, Chimaltenango (Cáceres et al., 1999). En 1999 Flores, publicó los trabajos titulados “Hongos Ectomicorricicos asociados a Abies guatemalensis, Pinus rudis y Pinus ayacahuite de la Sierra de los Cuchumatanes y su aprovechamiento en la producción de planta forestal micorrizada” y “Hongos ectomicorrícicos asociados a Pinus en Poptún, Petén, Guatemala” (Flores et al., 2002). Otros estudios refieren se a la producción o síntesis de micorrizas entre hongos locales y diversas especies de pino (Flores et al., 2005). El estudio de los macromicetos en Guatemala se ha enfocado principalmente al de hongos comestibles, faltando mucho por hacer en el campo ecológico, fitoquímico y farmacológico de los mismos. Hasta la fecha, se han registrado aproximadamente 220 especies de macromicetos, pertenecientes a 92 géneros (Bran et al., 2001).
28 Estudios químicos y farmacológicos:
Los basidiomicetos producen una amplia gama de productos naturales que abarca desde componentes estructurales con actividad antitumoral e inmunológicamente activos hasta agentes antimicrobianos, antifúngicos, antivirales, citostáticos, enzimas, reguladores de crecimiento y aromas.
Uno de los basidiomicetos más conocidos es el L. edodes, por ser el hongo comestible más cultivado en países como Japón, Corea y China y existir gran tradición de su uso como hongo medicinal. Por estos motivos este organismo ha sido ampliamente estudiado para definir los principios activos que provocan sus efectos medicinales. Chihara y col. en 1969 aislaron varias fracciones activas a partir de cuerpos fructíferos de Lentinus, las cuales correspondieron a polisacáridos (Chihara, et al., 1969). La caracterización estructural de las mismas evidenció la presencia en una de ellas de un glucano. A partir de estos primeros indicios se continuaron los estudios hasta lograr la formulación de un fármaco que se comercializa por la firma Ajinomoto con el nombre de Lentinan®. Estudios biológicos han demostrado que contra varios tumores experimentales, el Lentinan® prolonga la vida y reduce el tamaño del tumor. Su modo de acción se caracteriza no por efectos citotóxicos directos, sino por la activación mediada del hospedero de sus factores de defensa. Estudios clínicos han demostrado que en combinación con otras drogas incrementa la reducción del tamaño del tumor y prolonga la vida en pacientes con cáncer gástrico (Furue et al., 1981; Taguchi et al., 1985).
El T. versicolor perteneciente a la familia de los Poliporaceae ha sido usado como medicina en varias enfermedades malignas en China y Japón principalmente. A partir de cultivos miceliales de este hongo se aisló un complejo polisacárido-proteína altamente soluble en agua. Este compuesto se comercializa con el nombre de Krestin® (PSK), habiéndose evaluado en pacientes operados de cáncer colorectal y para el tratamiento combinado con quimioterapia, radioterapia y cirugía en pacientes con cáncer gastrointestinal, cérvico-uterino, de mamas y pulmonar (Ito, et al., 1979; Fujii et al., 1995).
29 Los primeros trabajos empleando basidiomicetos, reportados por Florey en 1949, fueron los realizados por Anchel, Hervey y Wilkins en 1941, quienes examinaron extractos de cuerpos fructíferos y cultivos miceliales de más de 2,000 especies de hongos, detectando en los mismos diversas actividades antibióticas y cuyos resultados conllevaron al aislamiento e identificación del pleuromutilin, compuesto utilizado para el tratamiento de las enfermedades producidas por micoplasmas en el ganado vacuno.
A partir de los trabajos de Wakman con actinomicetos y del descubrimiento de que estos microorganismos eran mucho más fáciles de aislar y cultivar, y a su vez mucho más prolíferos en la producción de compuestos con aplicaciones médicas y veterinarias, el interés en los antibióticos producidos por basidiomicetos decreció considerablemente (Anke, 1989). Sólo recientemente, y gracias a los progresos alcanzados en la tecnología de las fermentaciones y recobrado de productos, así como al desarrollo de los métodos espectroscópicos para el análisis estructural, es que estos microorganismos recobran su interés como posible fuente de metabolitos secundarios bioactivos. Los compuestos con actividad antibiótica producidos por basidiomicetos han sido agrupados acorde a su naturaleza química, teniendo en cuenta la relación existente entre ésta y las diferentes actividades biológicas reportadas.
Los cuerpos fructíferos de algunas especies del Lactarius son considerados no comestibles debido a su sabor acre y picante; este sabor está determinado por la presencia de aldehídos sesquiterpénicos con marasmanos y lactaranos en su esqueleto, que se forman enzimáticamente a partir de ácidos grasos. Estos aldehídos insaturados poseen alta actividad antimicrobiana y mutagénica y parecen ser los principios activos responsables de la defensa química en plantas. En la especie de Lactarius flavidulus fue aislado un compuesto con actividad antimicrobial, llamado flavidulol (Takahashi et al., 1988). Lactarius es un género muy abundante en los bosques de pino y encino de Guatemala (Flores et al., 2005).
El merulidial, aislado de cultivos sumergidos de Merulius tremellosus posee fuerte actividad antifúngica, mutagénica y citotóxica. Su aldehído sesquiterpénico en forma cristalina inhibe la síntesis del DNA en células ECA (células de carcinoma ascítico de Ehrlich) (Sterner, et al.,1990).
