Análisis descriptivo y experimental de los procesos de diferenciación del área cardíaca de Bufo arenarum

Análisis descriptivo y experimental de los

procesos de diferenciación del área cardíaca de

Bufo arenarum

Paz, Dante Agustín

1987

Tesis Doctoral

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

www.digital.bl.fcen.uba.ar

Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar

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Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la

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Fuente / source:

UNIVERSIDAD DE BUENOS AlRES

FACULTAD DE ClENClAS EXACTAS Y NATURALES

TEMA DE

TESlS

ANALISIS DESCRIPTIVO Y EXPERIMENTAL DE LOS PROCESOS GE DlFERENClAClON DEL AREA CARDIACA DE

Bufo arenarum. AUTOK: Dante Agustin Paz

DIRECTOR DE TESlS l Prof. Dr: ARMAND0 PISANO

LUGAR DE TRABAJO

Tesis presentada para optar al titulo de Doctor en Ciencias Biol6gicas

A m i s P a d r e s ,

quienes con s u s esfuer- z o s p e r m l t l e r o n e l l o - -gro de m i c a r r e r a c i e n -

tif i c a .

A A n a

que m e ' acompafia y com-

~ r . . , . on p e u t c o n s i d g r e r l e d&ve-fi

loppement d e s o r g a n e s c o m e une longue c h a i n e d ' i n d u c t i o n s succe- s s i v e ~ e t r 6 c i p r o q u e f i '(woLFF 1. r

A 1 Doctor Armando

PIS AN^

por haberme guiado e n l a r e a l i - z a c i 6 n de Gste t r a b a j o , ofreciendome t o d o s s u s conocimientos cier t i f i c o s y t 6 c n l c o s y , fundamentalmente, p o r h a b e r s i d o siempre m i maestro y amigo.

A l a Dra. Dora RENGEL q u i & n m e ha b r i n d a d o e n v a r i a s oca- s l o n e s s u s e r e n a c r i t i c a y una p a l a b r a de e s t i m u l o .

A l a Dra. C r i s t i n a MAGGESE q u i e n como a s e s o r a sup0 suge- rime l a p a u t a n e c e s a r i a p a r a e l d e s e n v o l v i m i e n t o de m i Carre- r a Doctoral.

A t o d o e l p e r s o n a l d e l LABINE que e n t o d o momento m& b r i n - d6 apoyo y a m l s t a d y e n mod0 p a r t i c u l a r a l a s Sras. Ana Maria BAE C N L L I y Rosa SPADACCINI, por l a ayuda m a t e r i a l que m e h a n p r o p o r -

-

-

c l o n a d o e n l a r e a l i z a c i 6 n d e l manuscrito.

A1 Consejo Nacional de l n v e s t i g a c i o n e s ~ i e n t i f i c a s y T ~ C -

n i c a s que a t r a v 6 s de b e c a s de e s c u d i o y p e r f e c c i o n a m i e n t o , m e p o s i b i l i t 6 10s medios n e c e s a r i o s p a r a l l e v a r a cab0 m i l a b o r

ciec

I;:

4 ~ 5 4

.

L I S T A D O DE TABLAS Y FIGURAS,...,... V I I I PRIMERA P A R T E SEGUNDA PARTE M A T E R I A L E S Y M E T O D O S , . . , . . . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ . ~ ~ ~ - - 1 4 P a r t e d e s c r i p t i v a . . .

...

MGtodo p a r a o b t e n c i 6 n de embriones... M6todo p a r a m i c r o s c o p i a A p t i c a

...

~ g t o d o p a r a m i c r o s c o p i a e l e c t r 6 n i c a de barrido...-...-... 2.2. P a r t e e x p e r i m e n t a l . .

...

~ l i m i n a c i 6 n t o t a l d e l endodermo... T r a s p l a n t e de endodermo de d i s t i n t a s $ r e a s C u l t i v o i n v i t r o de mesodermo p r e s u n t i v o c a r d i a c 0 y endodermo, e n d i f e r e n t e s medios C u l t i v o i n v i t r o de mesodermo d e l S r e a c a r d i a c a de embriones e n d i s t i n t o s e s t a d i o s C u l t i v o i n v i t r o d e mesodermo p r e s u n t i v o c a r d i a c o junto' con endodermo a n t e r i o r . . . C u l t i v o i n v i t r o de mesoderrno p r e s u n t i v o c a r d i a c o e n c o n t a c t o con endodermo de d i s -

t i n t a s Areas de embriones d e l mismo e s t a d i o 20 C u l t i v o i n v i t r o de mesoderrno p r e s u n t i v o c a r d i a c o e n c o n t a c t o con endodermo a n t e r i o r de embriones e n d i s t i n t o s e s t a d i o s d e l de- Medios condicionados...,. 2 2 ~ e ~ e n e r a c i 6 n e x p l a n t e s

...

2 4 Trasplantes....

...

.:...

2 4

TERCERA PARTE

Observaciones descriptivas...

27

Observaciones experimentales

...

48

Explante de todo el endodermo.,... Tras~lante de endodermo...

Cultivos in vitro. Medios salines... Cultivo de mesoderrno del Area cardiaca e x

plantado de distintos estadios

de

desarrg

llo...-...-

Acci6n inductora del endodermo anterior... ~ c c i 6 n inductorA de distintas &reas endo- dgrmicas sobre la diferenciaci6n cardiaca Acci6n inductora de endodermo de distin- tos estadios embrionarios...

Medios condicionados....-...-...

Cultivos de explantes en nsandwich"... ~egeneraci6n del esbozo cardiaco...

CUARTA PARTE

4.1.1. Conceptos inherentes a la induccihn

...

4.1.2. Conceptos inherentes a la regeneracihn

....

4.2. . ~nterpretacihn dql anslisis descriptivo.

....

1nterpretaci6n de, 10s ensayos experimentales

-

-

Explantes trasplantes cultivos...

~egeneraci6n

...

QUINTA PARTE

...

SEXTA PARTE

SEPTIMA PARTE

OCTAVA PARTE

A listado de tablas.

I. Reshen de las'reacclones hlstoquimicas durante el

desarrollo cardiaco de Bufo arenarum... 4 7

11. Resultados obtenidos a1 trasplantar endodermo de

distintas Areas de embriones en estadio de surco neural, en el Area faringea de embrlones en el

...

mlsmo estadio.... 54

111. Rescmen de 10s resultados obtenidos cultivando

m e

sodermo cardiaco solo y mesodermo cardiaco en prg

sencia de endodermo circundante de embriones en distintos estadios de desarrollo...,.

IV. Resultados obtenidos a1 cultivar mesodermo presun tivo cardiaco de embriones en estadio de surco neu ral (estadio 14) en contact0 con endodermo anterior

de embriones en distintos estadios de desarrollo.. 64

B listado de flguras,

1. ~e~resentaci6n esquemAtica de la metodologia utili-

zada a1 cultivar mesodermo presuntivo cardiaco juy

to con endodermo de la regi6n anterior..., 21

2 . Cultivo de .mesoderm0 presuntivo cardiac0 en presen cia de endodermo anterlor de embriones en.estadios

distintos de desarrollo... 23

3. Corte transversal de placa neural temprana (estadio

4. Corte transversal de placa neural tardia (estadio

5. Corte transversal de bot6n caudal de B. arenarum.

6. Corte transversal de un embri6n de B. arenarum en

...

estadio de ~ o t 6 n Caudal 3 2

7. Corte.transversa1 de un embri6n de B. arenarum en

estadio de respuesta muscular...,...,... 3 4 a

8. Corte transversal de un embri6n de B. arenarum en

9. Corte transversal de un embri6n de B. arenarum a1 finalizar el estadio de respuesta muscular... 3 5 10. Embrihn de Bufo arenarum en estadio de latido car

...

diaco.. 36

11. Embri6n de Bufo arenarum en estadio de latido car

...

diaco. 37

12. Corte transversal de un embri6n de B. arenarum en

estadio de latido cardiaco...

...

3 8

13. Corte transversal de un embri6n de B. arenarum en

estadio de circulaci6n branquial...

....

4 0 14. Corte transversal de un embri6n de B. arenarum en

estadio de b ~ c a abierta... 41 15. Corte trhnsverkal de un embri6n de Bufo arenarum

en estadio de circulaci6n branquial...

...

16. Corte transversal de un embri6n de Bufo arenarum

en estadio de circulaci6n branquial.

...

43 17. Corte transversal de un embri6n de Bufo arenarum

en estadio de circulaci6n en la aleta de la cola. 18. ~mbri6n de B. arenarum a1 que en estadios neura-

les se le explant6 todo el endodermo...,.

19. Embri6n normal (control). Corte transversal a ni- vel del coraz6n

...

20. Embri6n de B. arenarum que recibi6 el trasplante,

en el Area faringea, do endodermo de la regi6n me

dia de otro embri6n..

...

5 2 21. ~mbri6n de Bufo arenarum que recibi6 el trasplan-

te en el &rea faringea, de endodermo de la regi6n posterior de otro embri6n

...

22. ~mbri6n de Bufo arenarum del mismo grupo experimec

tal de la fig. 21... 53

23. Cultivo de mesodermo del srea cardiaca sola y del mesodermo del Srea cardiaca en presencia 'de endo- dermo adyacente...

...

24. Cultivos de mesodermo presuntivo cardiaco de ngu-

rulas en presencia de endodermo anterior, de la regi6n media

y

de la regi6n posterior de embrio- nes en el mismo estad;o

...

25. Grupo

1.

Cultivo en ltsandwich". Endodermo organ& zado en tub0 y mesodermo diferenciado en cglulas mesenquimsticas

...

26. Grupo 1. Cultivo en "sandwich", Se aprecia el en

dodermo y las c6lulas me~en~uimsticas

...

27. Grupo 1, Cultivo en "sandwich". Idem anterior.., 6 8

28. Grupo 1. Cultivo en "sandwichf1. El mesodermo ha quedado aislado del endodermo...,i--...

29. Grupo 1. Cultivo en llsandwich". Control, Ectoder mo banal y mesodermo no diferenciado,...

30. Grupo. Cultivo en "sandwich". Idem anterior,.... . 70

31. Grupo 2. Cultivo en Ifsandwich". Ectodermo y meso-

dermo no diferenciado...,,..,... 71

32. Grupo 3. Cultivo en llsandwichll. Endodermo y meso- dermo no diferenciado...,,

33. ~mbri6n de B. arenarum (corte sagjtal) dos horas

despugs del explante del k e a cardiacz....

...

34. ~mbri6n control de B. arenarum (corte saqital)

- - - ,--

en estadio de bot6n caudal,...,...-.,.

35. ~rnbri6n de B. arenarum 4 (corte sagitall dos horas

despu6s del explante del Grea cardiaca y del en-

dodermo ubicado inmediatamente por encima.,..,...

36, Corte transversal de un embri6n de Bufo arenarum a1 que, en estadio de b o t h caudal, se le explan t6 solamente el srea cardiaca..,,,.

...,,.,...,.

37. Corte transversal de un embri6n de Bufo arenarum

a1 que, en estadio de respuesta muscular, se le

explant6 el srea cardia~a...

...

38. Corte transversal de un embri6n de Bufo arenarum a1 que, en el estadio de bot6n caudal, se le ex- el srea cardiaca y el endodermo adyacente

39. Corte transversal de un embribn control de Bufo arenarum. El coraz6n ests totalmente desarrolla-

40. Vista de una larva de B. arenarum a la que se

le trasplant6 el esbozo cardiaco.,,.,.

.,...

41. Corte transversal de una larva de B. arenarum

La diferenciaci6n tisular, la constituci6n de la for ma y la aparici6n de la funci6n de 10s distintos 6rganos embrio- narios, dependen de complicados procesos que involucran interac ciones especificas entre las varias cglulas y entre grupos celu- lares de distinto significado.,

No escapa de esta vasta problem&tica, la diferencia-

ci6n del srea. cardiaca para la

queintervieneninteracciones

ce-

- -- -- --

lulares y mss e~~ecificamente mecanismos de inducci6n embrlona-

ria. Por lo tanto hemos considerado de interes realizar un estu- dio tanto descriptivo como experimental en la tentativa de reco-

nocer 10s episodios morfologicos

y,

por lo menos parcialmente,

bioquimicos, que se verifican durante el desarrollo del coraz6n

. . - --

de Bufo arenarum, anfibio de amplia distribuci6n en el pais

y

muy usado para ensayos de car&cter experimental.

Cabe sefialar que en esta especie, salvo dos someras comunicaciones en Congresos, el Tema que nos hemos propuesto de- sarrollar no habia sido todavia tratado.

La primera parte comprende un estudio descriptivo tanto de 10s procesos de diferenciaci6n del srea cardiaca.como asi tambih de la formaci6n del coraz6n embrionario; las obser- vaciones han sido realizadas con el empleo de microscopio opti- co y en ocasiones con microscopia electr6nica de barrido. ~dernss el an&lisis en algunos casos ha sido completado con tgcnicas his- toquimicas especificas.

Se pus0 de manifiesto que si bien 10s' procesos de di-

ferenciaci6n del Area cardiaca de Bufo arenarun siguen el esque- ma descripto para otras especies anfibias, demuestran ciertas di- ferencias no s6lo en 10s tiempos de aparicion de 10s episodios,

sin0 tambign en las'expresiones morfolbgicas descrlptas especial

-

El analisis histolGgico e histoqu%mico, demuestra

por primera vez en Anfbbio, la presencia de una "gelatins cardic caw que si bien puede homologarse a la observada en Aves, parece poseer diferente composici6n quimica.

En la segunda parte del trabajo, se ha encarado, de manera experimental, el an6lisis de 10s procesos inductores que se verifican durante la diferenciaci6n cardiaca. El estudio, rea- lizado tanto con tgcnicas de explantes y trasplantes, como asi

tambign de cultivo organotipico., ha puesto en evidencia la im-

portancia del endodermo en funcibn de inductor para que se veri- f ique el desarrollo del coraz6n. ~ 6 s especificamente y s e g b re- sulta de 10s ensayos esta capacidad estaria limitada al area m6s anterior del endodermo, es decir a la que cooresponde a1 endoder- mo faringeo,

~ d e m 6 s se ha demostrado fehacientemente que la capa- cidad inductora se encuentra limitada a estadios embrionarios tempranos; 10s resultados de ensayos que han utilizado el endo- dermo anterior de embriones en estadio de respuesta muscular o mss avanzados, no le asignan m6s capacidad inductora.

Resulta sumamente interesante haber Constatado, me- _{- - - -}

- - -

-

diante el empleo de distintas metodologias de cultivo, que la in- ducci6n del endodermo anterior sobre el 6rea presuntiva cardiaca,

se verificqria sin un intimo contact0 entre las dos hojas embrio-

.

narlas, dado.que un factor o factores liberados en el medio pare-

cerian actuar sobre el 6rea presuntiva cardiaca e inducir su di-

f erenciaci6n.

El explante del mesodermo del Area cardiaca de embrio- nes en distintos estadios de desarrollo por lo menos hasta el de bot6n caudal ha comprobado que se verifican procesos de regenera-: cion, Estos Gltimos resultados demostrarian que tambign en Bufo

7 arenarum, el coraz6n se diferencia dentro de un "camp0 cardiaco", situaci6n morfol6gica adecuada para que el mesodermo adyacente a1 explante del esbozo del corazh.n, se diferencie en estructuras car- diacas.

PRIMERA PARTE

1

-

1ntroducci6n.

1.1.

-

Un organismo r e p r e s e n t a e l c o r o l a r i o de una s e r i e de manifestaciones, morfol6gicas y b i o q u h i & t s i . q u e s e v e r i f i c a n a l o l a r g o d e l d e s a r r o l l o seg6n una secuencia i m - p u e s t a por un p a t r 6 n e s p e c i f i c o . Tanto en l a s e s p e c i e s g o n o c 6 r ~ c a s , como a s i tambign en l a s hermafroditas, l a p e n e t r a c i 6 n d e l espermatozoide en e l o v o c i t o , marca e l comienzo de una a c t i v i d a d que se r e s u e l v e en procesos que s i b i e n s e compenetran y super- ponen, no es p o s i b l e encuadrar, por su complejidad, e n esquernas r i g i d o s . No o b s t a n t e , e x i s t e n e t a p a s b i e n d e f i n i d a s que propor- cionan p a u t a s e x a c t a s de determinados acontecimientos: una vez que s e v e r i f i c a l a p e n e t r a c i h d e l espermatozoide en e l o v w i t o seguida por e l movimiento r e s p e c t i v o de 10s dos pron6cleos mas- c u l i n o y femenino y s u f u s i 6 n (cariogamia) 10s cromosomas que han recuperado s u f a s e

-

2 n s e disponen de mod0 t a l que s e i n i c i a l a primera d i v i s i 6 n m i t h t i c a , De l a c i g o t a por l o t a n t o s e o b t e n drAn en un comienzo dos blast6meros y, finalmente,por una s e r i e de sucesivos c l i v a j e s , numerosas c g l u l a s cuya ordenada d i s p o s i - c i 6 n obedece a una e s p e c i f i c a informaci6n. En e t a p a s

mss

avanza- d a s y debido a l a d i f e r e n c i a c i 6 n de 10s d i v e r s o s t i p o s c e l u l a r e s , reconocible por s u s c a r a c t e r i s t i c a s p r o p i a s , s e c o n s t i t u i r s e l complejo c a r i z h i s t o f i s i o l 6 g i c o d e l organismo,

E l conjunto de 10s procesos de d i f e r e n c i a c i 6 n c e l u l a r r e p r e s e n t a uno de 10s

mss

a t r a c t i v o s problemas de l a biolog$a moderna, ~ e g 6 n s e sabe, cada t i p 0 c e l u l a r s e ca- r a c t e r i z a por l a p r e s e n c i a de p r o t e i n a s p a r t i c u l a r e s y, e n l a a 2 t u a l i d a d , prevalece e l concept0 que, en e l Smbito de una d e t e r - minada e s p e c i e , l a s c g l u l a s poseen una misma informaci6n g e n g t ~ ca.

Durante muchos aiios s e sostuvo l a h i p 2 t e s i s de que l a informaci6n n e c e s a r i a para l a c o n s t r u c c i 6 n de un organismo se e n c o n t r a r i a contenida s 6 l o en e l genoma; e s t a hip6

_-

-

( I :

4

t e s i s e n l a a c t u a l i d a d ha s i d o d e s c a r t a d a dado que s e c o n s i d e r a i n s u f i c i e n t e una e v e n t u a l acci6n a i s l a d a d e l genoma ( ~ b v t r u p , 1 9 8 3 ) y l a b i o l o g i a molecular confirma cada vez m & s e s t e concepto, En base a e s t o s d a t o s vuelve a s e r reconsiderado l o enunciado por Brachet (19211, e s d e c i r que e l d e s a r r o l l o ontogen&tico r e p r e s e 2 t a r i a un proceso e p i g e n & t i c o c r e a t i v o , dependiente de o t r o s pro- c e s o s "causalmentew r e l a c i o n a d o s e n t r e si. E s t e concepto c o r r o b g r a r i a l o propuesto por l a t e o r i a " e p i g e n & t i c a w , l a que, en opos& c i 6 n a l a " p r e f o r m i s t a w , s o s t i e n e que e l d e s a r r o l l o embrionario se debe a l a c o n s t i t u c i 6 n s u c e s i v a de nuevas formas, que no p r e e x i s t e n e n e l o v o c i t o (Lhvtrup, 19831,

Expresado e n o t r o s tgrminos, e l d e s a r r o

-

110 de un organismo, ademss de l a a c t i v i h a d ggnica e s p e c i f i c a , dependeria de o t r o s f a c t o r e s t a l e s como d i f erencf a s r e g i o n a l e s c i t o p l a s m ~ t i c a s e n l a c 6 l u l a huevo y, e n l o s u c e s i v o , de i n t e r r e

-

l a c i o n e s de e s t i m u l o s i n d u c t o r e s que t i e n d e n a a s e g u r a r e l arm& n i c o v e r i f i c a r s e de l a s d i f e r e n t e s e t a p a s d e l d e s a r r o l l o . En fun

-

c i 6 n de e s t o s f a c t o r e s , cada t i p 0 c e l u l a r s e d i f e r e n c i a r 5 en e l momento oportuno y e n l a ubicaci6n c o r r e c t a (Markert y Ursprung,

'

1973).

La morfog6nesi.s c a r d i a c a r e p r e s e n t a un v a l i o s o par&metro p a r a e l a n s l i s i s de e v e n t o s que acontecen duran t e l a d i f e r e n c i a c i h n c e l u l a r e n e l ~ e r i o d o de l a organoggnesis; queremos d a r g n f a s i s a 1 hecho de que d u r a n t e e l d e s a r r o l l o d e l Srea c a r d i a c a s e v e r i f i c a n no s 6 l o i n t e r r e l a c i o n e s c e l u l a r e s , s& no tambi6n procesos de induccihn embrionaria y cambios e n l a ma- t r i z e x t r a c e l u l a r , Cualquier a l t e r a c i 6 n e n l a secuencia de 10s aconteoimientos, t a n t o de c a k a c t e r morfol6gico como bioquimico, d a r s como r e ~ u l t a d o ~ e n e s t e c a s o , malformaciones c a r d i a c a s de d i s t i n t o t i p o .

Cabe s e E a l a r a 1 r e s p e c t o que s i b i e n e l empleo de modernas t & c n i c a s h i s t o l 6 g i c a s e h i s t o q u i m i c a s han p e r m i t i d o un adecuado a n s l i s i s de l a g & n e s i s c a r d i a c a e n Vertebra- d o s ' ( D e Haan, 1968; Mamasek, 1968, 1969; Hendrix y Morse, 1977; Qrts L l o r c a

-

e t -9 a 1 1982; I c a r d o , 1983; Hiruma y Hirakow, 1985;

Garcia Martinez y Hurle, 1986) ' para 10s Anfibios urodelos 10s

d a t o s que s e poseen a 1 r e s p e c t o son e s c a s o s y t o d a v i a

mss

l o son p a r a 10s Anfibios anuros de 10s que

~ 6 1 0

s e poseen informaciones e s p o r s d i c a s (Copenhaver, 1955; Willens, 1955; Lemanski, 1973).

Los primeros e s t u d i o s i n h e r e n t e s a l a formaci6n d e l coraz6n en Anfibios d a t a n de l a segunda mitad d e l s i g l o pasado y s e c a r a c t e r i z a n por l a s d i s c r e p a n c i a s e n que i n - curren.

ast tars

r e c o r d a r que e l t e r r i t o r i o involucrado e n l a f o g maci6n d e l coraz6n en Urodelos habia s i d o considerado, seg6n e l

caso, de origen:

a ) totalmente endodgrmico (Marshall, 1800. Houssay, 1893 1,

b ) de o r i g e n mixto, en cuanto e l miocardio se form2 r i a a expensas d e l mesodermo, mientras que e l endocardio prove2 d r i a d e l endodermo (Brachet, 1898, 1903).

C ) de o t r a f u e n t e de d i s c u t i b l e i n t e r p r e t a c i 6 n ( ~ o h n -

son, 1903; Sampson, 19041,

d ) M o l l i e r (1906) seiiala, despu6s de un e s t u d i o d e t ~ l l a d o de secciones s e r i a d a s d e l Srea c a r d i a c a de embriones de

2-

na sp., que e l coraz6n t e n d r i a su o r i g e n de un primordio p a r ,

-

c o n s t i t u i d o por & r e a s t a n t o de l a somsto como de l a esplscnopleu- r a d e l mesodermo.

E l a c t u a l mapa de 10s t e r r i t o r i o s pre- s u n t i v o s de g s s t r u l a s de Anfibios urodelos ubica en ;reas super- f i c i a l e s , respectivamente l o c a l i z a d a s en ambos l a d o s d e l e j e an- t e r o p o s t e r i o r d e l e m b r i h , dos grupos c e l u l a r e s que corresponde- r i a n a 1 mesodermo p r e s u n t i v o cardiaco. Durante 10s complejos mo- vimientos g a s t r u l a r e s , e s t o s dos grupos penetran a l a a l t u r a de 10s l a b i o s l a t e r a l e s d e l b l a s t o p o r o e insinusndose e n t r e e c t o y endodermo, migran h a c i a l a r e g i 6 n a n t e r i o r , junto con e l remaneq t e manto mesod6rmico ( N a k a t z u j i , 1975; Balinsky, 1978). A 1 prome- d i a r 10s e s t a d i o s n e u r a l e s , debido a sucesivos desplazamientos, forman, a 1 u n i r s e ventralmente, un esbozo h i c o que, en e s t a d i o de b o t h caudal s e e n c o n t r a r s l o c a l i z a d o por debajo d e l endoder- mo f a r i n g e o (Copenhaver, 1926).

E l m&todo de l a s marcas coloreadas pro- puesto por Vogt (1929) ha permitido ampliar l a p o s i b i l i d a d de

- .-

reconocer

,

con mayores d e t a l l e s , e l d e s a r r o l l o d e l esbozo c a r d i a

-

co de Ambystoma punctatum. Willens (1955) aplicando e n e s t a d i o s de ngurula, a z u l n i l 0 y/o r o j o n e u t r o e n algunas Areas de l a s lsminas l a t e r a l e s mesod&rmicas, pudo reconocer 10s movimientos que s u f r e n a l o l a r g o de l a s v a r i a s e t a p a s d e l d e s a r r o l l o , ~ e g c n

s u s observaciones e l mesodermo l a t e r a l de una ni?urula, ubicado inmediatamente por debajo d e l & r e a p o s t e r i o r d e l f u t u r o encgfa- l o , c o n s t i t u i r i a e l mesodermo p r e s u n t i v o cardiaco: con p o s t e r i o - r i d a d , m i g r a r i a h a c i a & r e a s v e n t r a l e s h a s t a u b i c a r s e e n e l s i t i o donde s e d i f e r e n c i a e l coraz6n. En o t r o s t&rminos, e l mesodermo de l a s lsminas l a t e r a l e s ubicado a l a derecha y a l a i z q u i e r d a , respectivamente, d e l embri6n r e p r e s e n t a r i a l a h i c a f u e n t e de formaci6n d e l coraz6n dado que no i n t e r v e n d r i a n o t r a s h o j a s em- b r i o n a r i a s u o t r o s t e r r i t ~ r i o s mesod&rmicos.

En l o r e f e r e n t e a 10s Anfibios anuros, 10s r e s u l t a d o s obtenidos con t e c n i c a s de c o l o r a c i 6 n v i t a l (Naka- t s u j i , 1975; K e l l e r , 1975, 1976; Smith y Malacimski, 1983; C l e i -

ne y Slack, 1985) s u g i e r e n que 10s procesos g a s t r u l a r e s d i f i e r e n e n algunos aspec.tos de 10s d e s c r i p t o s para Urodelos. La p r i n c i - p a l d i f e r e n c i a r a d i c a en que en e s t o s Gltimos e l p r e s u n t i v o me-

s o d e r m ~ s e l o c a l i z a s u p e r f i c i a l m e n t e mientras que e n Anuros se u b i c a r i a e n p o s i c i 6 n

m 5 s

i n t e r n a . Esto i m p l i c a r i a que 10s movi- mientos g a s t r u l a r e s que conducen a l a p o s i c i 6 n f i n a l d e l mesodec mo Sean d i s t i n t o s e n t r e Urodelos y Anuros; s e g h K e l l e r (1976) en e s t o s Gltimos (Xenopus l a e v i s ) l a migraci6n h a c i a l a r e g i 6 n v e n t r a l d e l mesodermo p r e s u n t i v o c a r d i a c o , o c u r r i r i a e n e s t a d i o s menos avanzados d e l d e s a r r o l l o que en Urodelos.

Copenhaver (1926) d e s c r i b e e l desarro- 110 d e l corae6n de Ambystoma punctatum (Anfibio u r o d e l o ) corre- lacionandolo con 10s e s t a d i o s embrionarios d e s c r i p t o s por Harri- son para e s t a e s p e c i e y c o n s t a t a que e n e l e s t a d i o de tubo neu- r a l , l a lsmina de mesodermo l a t e r a l d e . u n l a d o t o d a v i a no se ha unido, en l a l i n e a media v e n t r a l . con l a d e l opuesto, E s t a f u s i 6 n

s e v e r i f i c a r e c i 6 n e n e l e s t a d i o de bot6n caudal avanzado, en

2-

r e a s ubicadas por debajo de l a f u t u r a zona f a r i n g e a , dando l u g a r a 1 denominado "esbozo cardiaco".

En una primera e t a p a d e l d e s a r r o l l o , e l coraz6n de 10s Anfibios "senso l a t o t * s e p r e s e n t a como un tub0 r e g t o que e n e s t a d i o s p o s t e r i o r e s s u f r e una f l e x i 6 n e n forma de " S " .

Durante e s t e Gltimo proceso s e ' v e r i f i c a n c o n s t r i c c i o n e s de mod0 t a l que queda s u b d i v i d i d o en: 1) sen0 venoso; 2 ) a t r i o ; 3 ) ven-

t r i c u l o ; 4) con0 a r t e r i a l .

Consideramos oportuno d e s t a c a r , e n cuan t o l o u t i l i z a r e m o s como parsmetro u t i l e n l a i n t e r p r e t a c i 6 n de n u e s t r o s r e s u l t a d o s , que e l a n s l i s i s microsc6pico d e l d e s a r r o l l o d e l coraz6n e n ~ v e k , ha p u e s t o de m a n i f i e s t o l a p r e s e n c i a , e n e l tubo c a r d i a c o , de un m a t e r i a l amorfo ubicado e n t r e endo y miocar- d i o que, por s u s c a r a c t e r i s t i c a s ha s i d o llamado " g e l a t i n a c a r - d i a c a w (Davis, 1 9 2 4 ) ; e n e s t a d i o s i n i c i a l e s d e l d e s a r r o l l o s e e n c u e n t r a homog6neamente d i s t r i b u i d o , e n cambio e n e s t a d i o s

rnss

avaniados se l o c a l i z a en s i t i o s e s p e c i a l i z a d o s , (Gessner e t a l . 1965; Hurle y Ojeda, 1977; Nakamura y Manasek, 1981).

i

~ e g G n Barry (1948) l a g e l a t i n a c a r d i a - c a de Aves t e n d r i a importancia p a r a l a s r i t m i c a s c o n t r a c c i o n e s d e l coraz6n embrionario, e n cuanto l a e s p e c i f i c a e l a s t i c i d a d de

--

l a g e l a t i n a c a r d i a c a , p e r m i t i r i a que l a l u z d e l endocardio s e a- b r i e r a despu&s de cada c o n t r a c c i 6 n f a v o r e c i e n d o e l l l e n a d o d i a s - t 6 l i c o . La v i s c o s i d a d de l a g e l a t i n a i m p e d i r i a ademss l a defor- maci6n que h u b i e r a de p r o d u c i r s e por e l paso de l a c o r r i e n t e s a n guinea; a 1 mismo tiempo, f a c i l i t a r i a l a e x p u l s i 6 n de l a sangre h a c i a a d e l a n t e ,

mss

considerando que e l coraz6n embrionario e n e s t a s e t a p a s no posee v s l v u l a s adecuadas p a r a e s e proceso ( B a r r y , 1948; P a t t e n

-

a t -9 a 1 1 9 4 8 ) ;

m s s

e s p e c i f i c a m e n t e s e a t r i b u y e a 10s

glicosaminoglicanos p r e s e n t e s e n l a g e l a t i n a c a r d i a c a , l a r e s p o n s a b i l i d a d de l a e l a s t i c i d a d y v i s c o s i d a d n e c e s a r i a s ( I c a r d o , 1983).

En 10s A n f i b i o s , t a n t o Anuros C d m O Uro-

d e l o s , ha s i d o d e s c r i p t o un e s p a c i o amplio, e n t r e endo y miocar- d i o , ocupado por m a t e r i a l amorfo homologado a l a " g e l a t i n a c a r -

d i a c a w de Aves ( J a f f e e , 1962). No o b s t a n t e , e s muy poco l o que s e sabe e n e s t e c a s o e n l o r e f e r e n t e a s u s p o s i b l e s funciones y a s u composici6n quimica.

ema ah ski

(1973

1

e n un e s t u d i o h i s t o q u i

-

mica d e l d e s a r r o l l o c a r d i a c 0 de Ambystoma mexicanum m rodel lo) se- fiala l a p r e s e n c i a de mucopolisac&ridos s i n p r e c i s a r s u camposi- c i 6 n quimica y s u d i s t r i b u c i 6 n a l o l a r g o d e l d e s a r r o l l o .

E l problema de l a d i f e r e n c i a c i h c a r d i g c a e n c i e r r a , en s i _{. .} mismo, una amplia terngtica embriol6gica que posee como c o m b denominador e l concepto de l a i n d u c c i 6 n embrio- n a r i a . La formaci6n de 10s d i s t i n t o s 6rganos, l a d i f e r e n c i a c i 6 n c i t o l 6 g i c a de l a s c i ? l u l a s que 10s c o n s t i t u y e n y - l a gradual a p a r i - c i 6 n de s u s e s p e c i f i c a s f u n c i o n e s r e p r e s e n t a n f a s c i n a n t e s temas de a c t u a l i d a d , de d i f i c i l i n t e r p r e t a c i 6 n .

La inducci6n r e v i s t e un r o l de suma im-

p o r t a n c i a p a r a l a ~ n t o g g n e s i s de 10s Vertebrados;

e l

concepto s u g

i

g i d o luego de una e x t e n s a s e r i e de i n v e s t i g a c i o n e s e x p e r i m e n t a l e s , puede ser d e f i n i d o como e l r e s u l t a d o de acciones e s p e c i f i c a s que un esbozo embrionario ( i n d u c t o r ) e j e r c e s o b r e o t r o esbozo ( t e r r i - t o r i o competente) t o d a v i a no determinado y a 1 que o r i e n t a h a c i a una muy p r e c i s a d i f e r e n c i a c i 6 n . Desde un punto de v i s t a

m5s

am-

p l i o , un i n d u c t o r e x i s t e e n cuanto e x i s t e n uno o m & s s i s t e m a s s u s

-

c e p t i b l e s de f u n c i o n a r f r e n t e a 1 i n d u c t o r .

Los cambios que s e producen e n e l terri-

t o r i o competente por l a p r e s e n c i a d e l i n d u c t o r , son generalmente d r k t i c o s ; de un esbozo embrionario, p l u r i p o t e n c i a l e i n d i f e r e n - c i a d o , e l t e r r i t o r i o competente s e transforma e n un esbozo d i f e - r e n c i a d o con nuevas propiedades, con una d i s t i n t a o r i e n t a c i 6 n e s - p a c i a l de s u s c & l u l a s , con c a r a r t e r i s t i c a s e s t r u c t u r a l e s e s p e c i - f i c a s y una a c t i v a c i 6 n d i f e r e n c i a l d e l genoma qu& permite l a s i n - t e s i s de p r o t e i n a s p a r t i c u l a r e s . e n e l nuevo t e r r i t o r i o d i f e r e n c i a do.

Los primeros r e s u l t a d o s e x p e r i m e n t a l e s a t r i b u y e r o n a 1 & r e a c a r d i a c a p r e s u n t i v a de A n f i b i o s , l a capacidad de a u t o d i f e r e n c i a r s e e n coraz6n (Ekmann, 1921). E s t o s r e s u l t a d o s no f u e r o n aceptados por ~ t G h r (1924, 1929) quien usando e n Bombi-

n a t o r l a metodologia d e l e x p l a n t e y d e l t r a s p l a n t e , reconoce que l a d i f e r e n c i a c i 6 n d e l Srea c a r d i a c a en Anfibios se c o r r e l a c i o n a con l a p r e s e n c i a de c g l u l a s de t e r r i t o r i o s endodhrmicos y mesod62 micos adyacentes a 1 f u t u r o esbozo d e l coraz6n. Por o t r a p a r t e , Copenhaver (19261, u t i l i z a n d o l a metodologia d e l t r a s p l a n t e e n embriones de Ambystoma (Urodelo), e n e l e s t a d i o de bot6n caudal, o b t i e n e corazones b i e n d e s a r r o l l a d o s a p a r t i r de p r e s u n t i v o s es- bozos c a r d i a c o s s i n l a p r e s e n c i a de e s t r u c t u r a s endod&rmicas, por l o que considera que, por l o menos en e s t a e s p e c i e , e l coraz6n e s capap de a u t o d i f e r e n c i a r s e i

E l a n s l i s i s experimental a p o r t 6 eviden- c i a s cada vez

m s s

c o n c r e t a s de que elendodermoubicado en l a cer- c a n i a d e l s r e a c a r d i a c a i n f l u y e en l a d i f e r e n c i a c i 6 n d e l coroz6n.

Bacon (1945

1

reemplaza e l esbozo c a r d l a - co de una n6urula de Ambystoma punctatum con.mesodermo de l a zo- na marginal de g s s t r u l a , & r e a 6 s t a que no p a r t i c i p a e n l a forma-

-

c i 6 n d e l corazhn; e n este caso e n p r e s e n c i a de endodemo l i m i t r o - f e a l a r e g i 6 n c a r d i a c a , se d i f e r e n c i a en t e j i d o cardiaco. Como prueba complementaria, e x p l a n t a mesodermo de l a zona marginal de g g s t r u l a y l o mantiene, experimentalmente, e n c o n t a c t o con endo- dermo d e l & r e a c a r d i a c a d e ngurula, u t i l i z a n d o e l m6todo d e l "san

-

dwichn; e n v a r i o s casos o b t i e n e d e s a r r o l l o de t e j i d o c a r d i a c o que

!

h a s t a se t o r n a p u l s s t i l . Cabe sefialar que e n Ambystoma e l mesoder

_-

mo, por l o menos en e l e s t a d i o de ngurula, a6n no se ha puesto en c o n t a c t o con e l endodermo d e l p i s o de l a f a r i n g e , e s d e c i r , e l inductor., Explantes d e porciones l a t e r a l e s de l a b i o blastopo- r a l mantenidos en c u l t i v o proporcionan r e s u l t a d o s d i s c o r d e s en cuanto en algunos c a s o s d i f e r e n c i a n t e j i d o que puede p r e s e n t a r pulsaciones; seg6n sefiala Jacobson (1960) es probable que 10s en- sayos r e a l i z a d o s por Bacon incluyan o t r o s t e r r i t o r i o s adyacentes a 1 mesodermo cardiaco.

E l conjunto de 10s r e s u l t a d o s obtenidos por Bacon no pueden i n t e r p r e t a r s e como concluyentes. Por una par-

t e i n d i c a r i a n que e l endodermo ubicado e n l a r e g i 6 n a n t e r i o r d e l e m b r i h , dorsalmente a 1 t e r r i t o r i o c a r d i a c o , e s capaz de i n d u c i r

l a s c g l u l a s mesod6rmicas competentes p a r a que s e d i f e r e n c i e n e n c & l u l a s c a r d i a c a s ; por o t r a p a r t e demostrarian que e l endodermo adyacente a 1 Srea c a r d i a c a no s e r i a e s e n c i a l p a r a e v i d e n c i a r l a e x p r e s i 6 n de l a s p o t e n c i a l i d a d e s c a r d i a c a s d e l mesodermo presun-

L - .

, t i v o d e l coraz6n. Debe r e c o r d a r s e que, a 1 r e s p e c t o , o b t i e n e d i - f e r e n c i a c i 6 n d e l coraz6n a p a r t i r de mesodermo p r e s u n t i v o de una n & u r u l a , mantenido e n c u l t i v o s i n l a presenda de o t r o s t e r r i t o - r i o s .

Resultados e n f a v o r de una a c c i 6 n induc- t o r a d e l endodermo e n l a d i f e r e n c i a c i 6 n c a r d i a c a , son 10s de Ba- l i n s k y (19391, Nieuwkoop (1947) y Jacobson (1960) q u i e n e s respec- tivamente e x p l a n t a n e n d i s t i n t a s e s p e c i e s de Urodelos todo- e l en- dodermo de l a s v a r i a s e t a p a s de n & u r u l a , obteniendo embriones s i n coraz6n.

LOS ensayos de Jacobson (1960, 1961) p r o

-

porcionan d a t o s t o d a v i a

mSs

convincentes. U t i l i z a n d o l a t g c n i c a d e l c u l t i v o e n "sandwichv propuesta por H o l t f r e t e r (19331, com- prueba, e n Taricha t o r o s a , que manteniendo e n e x p l a n t e mesodermo p r e s u n t i v o d e l coraz6n, s e d i f e r e n c i a n e s t r u c t u r a s c a r d i a c a s s6- l o e n

un

14% de 10s casos; s i n embargo, c u l t i v & d o l o e n c o n t a c t 0 con endodermo de l a r e g i 6 n a n t e r i o r , correpondiente a 1 & r e a f a r i r gea, s e o b t i e n e e n e l 100% de 10s ensayos, d i f e r e n c i a c i 6 n de t e - j i d o c a r d i a c 0 h a s t a con c o n t r a c c i o n e s r i t m i c a s .

Jacobson y Duncan (19681, u t i l i z a n d o t g c n i c a s de c u l t i v o " i n v i t r o t 1 confirman e s t o s r e s u l t a d o s y seiia- l a n ademgs, que e l homogenado de r e g i o n e s a n t e r i o r e s endodermicas r e s u l t a p a r a l a d i f e r e n c i a c i 6 n c a r d i a c a

un

i n d u c t o r t a n e f i c a z , como e l t e j i d o endodermico i n t e g r o .

Una prueba d e c i s i v a de l a a c c i 6 n induc- t o r a , por p a r t e d e l endodermo, p a r a que se d i f e r e n c i e e l Area c a r d i a c a p r e s u n t i v a , por l o menos e n Anfibios u r o d e l o s , l a pro-

.

.-

- _{porcionan 10s r e s u l t a d o s obtenidos u t i l i z a n d o un grupo de Ambys-}

toma mexicanum c a r a c t e r i z a d o s por un gen r e c e s i v o ( c a r d i a c l e t h a l )

-

designado con l a l e t r a I1cv (Humphrey, 1968).

cruza de padres heterocigotos(+/c)

y

pueden ser distinguidos de

10s normales (+/c;

+/+)

recign'en

el estadio

34

en el que estos

Gltimos presentan latidos cardiacos, Los embriones mutantes pue-

den vivir de 15

5

30

dias y sus movimientos natatorios normales

sugieren que el gen "cW no afecta a1 xa&sculo esquel&tico,

Los embriones homocigotos c/c no presen

tan latidos cardiacos en estadfos en que Qstos son visibles en

10s embriones normales; el anslisis histol6gico revela en este

caso, s6lo una pared miocsrdica monoestratificada (Lemanski,l97&).

Cabe seiialar ademss que el esbozo cardiaco de un embri6n mutante

(c/c) trasplantado en la regi6n cardiaca de embriones normales

(+/c;

+ / + I

se diferencia en un coraz6n hasta con latidos cardia-

cos (Humphrey, 1972); en cambio, realizando el trasplante a la

inversa, es decir cuando el esbozo cardiaco de embrionesnorma-

les (+/+;

+/c)

se trasplanta en el srea cardfaca de un embri6n

mutante (c/cl, la diferenciaci6n cardiaca no se verifica,

El conjunto de estos resultados permite

emitir la hip6tesis que la falla en el desarrollo del coraz6n se

deberia a una deficiencia de inducci6n por parte del endodermo o,

por lo menos, a un efecto inhibitorio del tejido que rodea a1

6-

rea cardfaca. No se excluye la posibilidad que el endoderrao de

embriones mutantes se dif

erencie rs~idamente

,

perdiendo

su

capa-

cidad de inducir el tejido cardiaco (Kulikowsky y Manasek; 1977).

En este Gltimo caso el anglisis hist016~ico

del endodermo de re-

giones anteriores de 10s embriones mutantes, demuestra una mayor

diferenciacibn,ah cuando de dificil intespretaci6n,que el endo-

dermo de embriones normales de un mismo estadio (Lemanski, 1977).

El anglisis bioquimico

y ultraestructu-

ral del coraz6n de embriones mutantes, revela adem& una disminu-

ci6n en el contenido de proteinas contrgctiles y una falta de or-

ganizaci6n de las miofibrillas (Lemanski

--

et

al 1976; Lemanski y

Fuldner, 1977; Lemanski, 1978; Fuldner et a1 1984).

--

En def

initiva, la informaci6n bibliogrs-

:

fica demuestra que para 10s procesos de diferenciaci6n del meso-

interrogantes y dudas tanto desde un punto de vista morfol6gic0,

como as5 tambi&n bioquimico. Es de suponer que anslisis descrip-

tivos comparativamente realizados entre estadios distintos y en

mod0 particular ensayos de caracter experimental, podrsn aportar

datos de intergs no sblo inherentes a1 problema de la diferencia-

ci6n cardiaca en Anfibios, sino tambign en lo inherente a las in-

terrelaciones celulares,

1.2.

Por lo expuesto hemos considerado opor-

tun0 realizar un estudio, descriptivo y experimental, de 10s a-

contecimientos que se verifican durante el desarrollo del 6rgano

cardiaco de un Anuro, utilizando como modelo experimental, Bufo

arenarum, anfibio de amplia difusi6n geogrgfica en nuestro pais,

Con el objeto de tener un parhetro ade-

cuado de lo que ocurre en esta especie en condiciones normales,

el estudio en su primera etapa ha focalizado y tratado de anali-

zar las caracteristicas del desarrollo cardiaco en comparacidn

.

con lo descripto a1 respecto para Urodelos, A las observaciones

morfol6gicas se han apoyado, en algunos casos, 10s resultados ob-

tenidos mediante tgcnicas histoquimicas que han permitido una ma

yor y mejor comprensi6n de 10s hechos que se verifican a lo lar-

go del complejo juego de las interrelaciones celulares y de las

inducciones durante la diferenciaci6n cardiaca.

En la segunda parte, la diferenciaci6n

pel Srea cardiac; he Bufo arenarum ha sido tratada desde un pun-

-

to de vista experimental en mod0 particular para reconocer el e-

ventual inductor

y

delimitar el Srea involucrada en 10s procesos

inductivos y su potencialidad a lo larg~

del desarrollo del co-

SEGUNDA PARTE 3 ', 5

. . . . .

.

.

,.

2. 1, Parte descriptiva

2,1.1, ~6todo

_{- - - ' - - -}

para obtencidn de embriones

Los ejemplares adultos de Bufo arenarum, capturados en 10s alrededores de la ciudad de Buenos Aires, se mantuvieron en peceras de vidrio, en un ambiente con humedad y temperatura adecuadas, hasta el momento en que se indujo la ovu- lacibn, Con este fin se inyectd una suspensidn de hip6fisis hom6- loga, mantenida se&n pisand ( 1956)

,

en la cavidad abdominal de hembras aclimatadas a 25QC con un fotoperiodo de 12 horas de luz durante 24-48 horas antes del estimulo hormonal. A1 comenzar la oviposicidn se desmedulaba la hembra y las tiras ovocitarias, ex- traidas de 10s ovisacos y colocadas en c&psulas de Petri humede-

_--

cidas, se fertilizaron con el agregado de un macerado de testicu- lo que previamente se observaba a1 microscopio, para constatar la motilidad y movilidad de 10s espermatozoides. Aproximadamente 5 minutos despu&s, se afiadia una cantidad suficiente de soluci6n de Holtfreter standard (ver apgndice), de mod0 tal de dejar com- pletamente sumergidos 10s trozos de tiras ovocitarias y permitir su irnbibici6n.

Los embriones distribuidos en nhero de 200 por capsulas de Petri de 20 cm. de diametro se desarrollaron en soluci6n de Holftreter standard a temperatura ambiente (222 24QC) y 10s estadios embrionarios se identificaron teniendo en cuenta la tabla de Del Conte y Sirlin (1952)

A 1 alcanzar 10s estadios que se precisa- ban para el ensayo,los embriones se trataban brevemente con una

solucibn de Qcido tiog1.ic8lico a1 1% neutralizado con NaOH, (pH.

7.2) con el fin de eliminar las membranas gelatinosas que 10s re- cubren,

Con el objeto de reconocer eventuales anomalias que pudiesen ocurrir a partir de la fertilizacibn del ovocito, se controlaron con frecuencia hasta comenzar la segmen- tacidn, las tiras ovocitarias fertilizadas. Cabe seHalar que la morfologia del ovocito, cambiante por 10s eventos que se verifi-

can con la activacibn (contact0 de la cabeza del espermatozoide

con el cortex ovular) ofrece, a1 respecto, parametros seguros-

En efecto en el ovocito de Bufo arenarum, de forma subesfgrica,

se distinguen claramente 2 hemisferios: uno que

represents

el

llcasquete

animal" y que se caracteriza por una cantidad conside-

rable de pigmento melanic0 y el otro, mgs claro por la escasa

cantidad de pigmento, que se denominancasquete

vegetativow.

El impact0 del espermatozoide sobre la

superficie ovular, provoca una serie de procesos morfolbgicos y

bioquimicos propios de la activacibn. A raiz de que se forma la

"membrana de fertilizacibnv,

el huevo, rotando en el espacio pe-

rivitelino y obligado por el peso del vitelo ubicado en el polo

vegetative,

se posiciona con el polo animal hacia arriba; este

movimiento se verifica entre 10s 30 y 50 minutos despu&s de la

fertilizaci6n y su aparici6n se considera como uno de 10s par&-

metros para determinar que ocurri6 la fertilizaci6n.

2.1-2. ~gtodo

- - -

para microscopia 6ptica

Los embriones con mucho contenido de vi-

telo fueron fijados en el liquido de Ancel

y

Vintemberger (1948)

o en 1,5% de glutaraloehido en buffer cacodilato (0-1

M, pH

7-41.

En 10s casos de embriones mss avanzados o larvas se us6 el liqui

do de Bouin.

Los embriones sometidos a t&cnicas his-

toquhicas para poner en evidencia mucopolisac&ridos, se fijaron

en la mezcla de form01 a1 10% y cloruro de cetil-piridinum a1 10%

en agua; este fijador no permite la difusibn de sustancias muy

solubles y su uso resulta recomendable para tgcnicas histotquirni-

_:

--

cas de carbohidratos (Pearse, 1980).

. - - - - -.. - .--

La inclusi6n para las pieias que ulterior

mente se analizaban con microscopia 6ptica se realizd en una mez-

cla de parafina-cera de abeja (56QC) y 10s cortes seriados de

6

micras se trataron respectivadente y segih lo imponla el ensayo

experimental, con las coloraciones que se consignan a continua-

cibn

:

-

1. Hematoxilina alcoh6lica de Ehrlich-eosina acuosa.

-

2, ~olucibn tricr6mica de Mallory.

-

3. Alcian Blue 1% en &Ado clorhidrico 0,1N, pH 1.0 (Troyer, 1980

1.

-

4. Alcian Blue 1% en &id0 acetic0 a1 3%, pH 2,5 (Pearse, 1980

1,

-

5. ~eacci6n de PAS precedida o no por la oxidaci6n con sci- do pery6dico a1 1% en soluci6n acuosa (Lillie, 1951).

-

6 . Tratamiento con hialuronidasa (0,5 gr de hialuronidasa

testicular por ml de buffer fosfato-citrato pH 5.8)

y

su-

cesiva coloraci6n con Alcian Blue pH 2.5 (Troyer, 1980).

-

7. Azul de bromofenol-mercurio para tinci6n de proteinas

(Bonhag, 1955).

Los cortes fueron deshidratados en una serie ascendente de alcohol, clarificados en xilol y montados en el medio sintgtico Pearmount (Fisher, Sci.),

Para la determinaci6n cuantitativa, si bien aproximada, de 10s carbohidratos, se tuvo especial cuidado en mantener uniformes 10s parsmetros tecnicos como fijaci6n, es- pesor de 10s cortes, tiempo de coloraci6n, etc,

r

2.1.3. ~etodo

. . .

para microscopia electr6nica de barrido

Los embriones en 10s distintos estadios utilizados para nuestros ensayos han sido fijados en glutaralde- hido a1 2,5% en buffer cacodilato (0,1M, pH 7-71 durante 24 hs a 4QC y lavados varias veces en el mismo buffer. En algunos casos, tanto el ectodermo como el pericardio se separaban de 10s territg rios circundantes mediante delicadas agujas de vidrio, en otros casos se realizaban cortes macrosc6picos con el objeto de poner

en evidencia la estructura interna del coraz6n

en.

desarrollo, To-

das las piezas fueron deshidratadas en una serie ascendente de a- cetona, desecadas de acuerdo con la tgcnica del punto critico, revestidas con oro-paladio y observadas a1 microscopio electr6ni- co de barrido JEOL 25 S I1 que se ope& entre 10s 5 y 15 KW,*

Agradecemos el servicio de ~icroscopia ~lectr6nica de Barrido

2.2. Parte experimentA1

2.2.1, ~liminacibn

- - -

total del endodermo

Para realizar la faz t6cnica de estos

ensayos se colocaban en cspsulas de parafina negra conteniendo soluci6n Holtfreter madre, estadios de placas neurales cuya mem- brana vitelina se separaba mecsnicamente mediante pinzas de re12

jero de puntas finas, Con laayuda de una aguja de vidrio, prepa- rada s e g h Spemann, se realizaba un corte en la linea media ven- tral de la ngurula y con un ansa de cabello, se eliminaba el en-. dodermo, tratando de no dafiar el mesodermo presuntivo cardiaco,

A1 verificarse el cierre de la'herida, 10s embriones, con la a-

yuda de una pipeta doble, eran trasladados a cspsulas de Petri con base de agar y mantenidos en soluci6n salina de Holtfreter standard que se renovaba dia por medio,

2,2,2, Trasplante de endodermo de distintas &reas

- - - - - - - - - - - - - - - - I - - - -

-- .

Embriones en estadfo de.placa neural o

bot6n caudal, eran ubicados en cavidades previamente practicadas en el fondo de cspsulas de parafina negra que contenian solucibn Holtfreter madre est6ril. Con el auxilio de agujas de Spemann se

trasplantaba endodermo de la reg& media, o bien de la reg%

posterior de un embribn en placa neural o botbn caudal, en el

6-

rea faringea de otro embribn en estadio de placa neural. Una vez cerrada la herida, 10s embriones se colocaban en cspsulas de Pe-

tri con fondo de agar

y

soluci6n Holtfreter standard que diaria-

mente se sustituia con solucibn fresca.

2.2-3, Cultivos en "Sandwichn,

- - -

Embriones en estadio de placa neural fug ron puestos en cavidades previamente practicadas en el fondo de cspsulas de parafina negra que contenian solucibn Holtfreter ma- dre est&ril. Con la. ayuda de agujas de vidrio (agujas de ~pemann)

pectivamente en c o n t a c t 0 con endodermo a n t e r i o r (grupo

1 1 ,

con endodermo de l a r e g i 6 n meqia (grupo 2) o con endodermo d e l grea p o s t e r i o r (grupo 3 ) tambign explantados, envolviendolos con ec- todermo de S r e a s p o s t e r i o r e s , e s d e c i r ectodermo banal ( H o l t f r e - t e r , 1933). Los "sandwich" presionados con puentes de v i d r i o por algun tiempo, s e pasaban luego a cApsulas con fondo de Agar y

so

l u c i 6 n H o l t f r e t e r standard e s t g r i l , que se renovaba diariamente.

2.2-4. C u l t i v o i n v i t r o de mesodermo p r e s u n t i v o c a r d i a c o

- - - -

. . .

y endo- dermo, en d i f e r e n t e s medios s a l i n o s ,

- - -

Embriones e n e s t a d i o de p l a c a n e u r a l , s u r c o n e u r a l o r o t a c i & n , secolocaban,respectivamente, en cavi-

-

dades previamente p r a c t i c a d a s en e l fondo de c g ~ s u l a s de para- f i n a negra, que contentan s o l u c i 6 n H o l t f r e t e r madre

e s t g r i l .

Con e l a u x i l i o de a g u j a s d e Spemann s e explantaba e l &ea correspon- d i e n t e a 1 mesodermo c a r d i a c o , junto con e l endodermo c i r c u n d a n t e y se c u l t i v a b a segfin l a metodologia de l a "gota pendienten des- c r i p t a por Andrew y Gabie (1969.) levemente modificada. E s d e c i r :

10s . e x p l a n t e s , t r a n s f e r i d o s para s u lavado a cGpsulas e s t g r i l e s , que contencan, segfin e l caso, H o l t f r e t e r madre, H o l t f r e t e r stan- dard o Niu y Twitty ( v e r ap&ndice) se pasaban luego a un cubre-

-

o b j e t o cuyo c e n t r o c o n t e n i a una gota de una de l a s tres solucio- n e s de c u l t i v o y , en l a s e s q u i n a s , una mezcla de p a r a f i n a y va- s e l i n a c a l i e n t e . Acto seguido se apoyaba de manera i n v e r t i d a un p o r t a o b j e t o s excavado sobre e l cubreobjetos, presionando 10s bof d e s por encima de l a parafina-vaselina, Con e s t a misma mezcla se

A-

-s e l l a b a e l cubreob j e t o en toda s u p e r i f e r i a . Los d u l t i v o s , man- t e n i d o s a temperatura c o n s t a n t e (18-20QC) se examinaban d i a r i a - mente con microscopia de c o n t r a s t e de f a s e s .

C u l t i v o i n v i t r o

- - - -

- - -

de mesoderm~ d e l Area n e s en d i s t i n t o s e s t a d i o s d e d e s a r r o l l o .

. . .

Desde e l e s t a d f o de l a p l a c a n e u r a l ( e g t a d f o 1 3 ) h a s t a e l e s t a d i o d e c i r c u l a c i b n b r a n q u i a l ( e s t a d i o 20)

la presuntiva Srea mesodermica cardiaca sufre, morfol6gicamente, variaciones significativas. Por lo tanto se consider6 oportuno explantar, en cada una de estas etapas embrionarias, el mesoder- mo cardfaco y mantenerlo en cultivo. La metodologia consisti6 en explantar con el auxilio de una aguja de vidrio y un ansa de ca- bello, el territorio mencionado.el que se trataba de hacer Gesa- rrollar en la soluci6n de Niu-Twitty, utilizando en la mayoria de 10s casos el mgtodo de la gota pendiente, Con el objeto de es tablecer comparaciones, algunos explantes se mantuvieron en csp-

sulas de Petri de 2,s de dihetro que contenian 2 ml de soluci6n

de Niu-Twtty a la que se le agregaba gentamicina (5mg/ml). Todos

10s cultivos han sido mantenidos a temperatura constante

y

se e-

xaminaron diari+mente.con microscopia de contrastes de fases.

2.2-6. Cultivo in vitro

- - - -

~e-rn~sgd=rgo-pgep~t&v,o =agdfaso-junto-

COG

'ndoiepg antegigrz

-

Con el objeto de verificar el efecto del endodermo anterior (endodermo faringeo) sobre la diferencia- ci6n del mesodermo presuntivo cardfaco de embriones en estadio de placa neural, hasta estadio de circulaci6n branquial, se man- tuvo en contact0 mesodermo presuntivo cardiac0 con endodermo de la regi6n anterior (srea farfngea) (ver fig. 11, La metodologia empleada es la misma que se utiliz6 en 10s ensayos anteriores.

2-2.7. Cultivo in vitro de mesodermo presuntivo cardiaco en con-

- - - -

_{. . .}

tacto con endodermo de distintas sreas de embriones del

. . .

Dado que a1 utilizar la metodologfa de explantes y trasplantes pudimos comprobar una diferente acci6n inductora de las distintas sreas del endodermo, consideramos o- portuno explantar mesodermo presuntivo cardiaco de embriones en

estadio de surco neural y cultivarlo in-vitro respectivamente con

endodermo de la regi6n anterior, media-o posterior de otros em-

briones del mismo estadio. La metodologia del explante y del cul

surco neural

mesodermo

ec toderrao

endodermo

-

cavidad faringea

drea endod6rmica explantada

+

area mesod6rmica explantada

-

_---

_ _ _ _ _

-- -

. - -

---.

' * h i r Fig. 1: ~epresentacibn esquemstica de la metodologia utili-

I I

.

,

zada a1 cultivar mesodermo presuntivo cardtaco jun- to con endodermo de la regi6n anterior. a: en c6p-

I sula de Petri; b: en gota pendiente.

8 .

tivo es la misma.de 10s casos ya descriptos (2.2-5).

.% * - 7 .. ,.

. n .

,#;;&

, .

. - .- 1 . -

' 2.2.8, ~ul'<ivo

- - - -

in vitro de mesodermo presuntivo cardiaco en con-

. . .

tacto con endodermo anterior de embriones en distintos es-

. . .

tadios del desarrollo,

- - -

Con el objeto de comprobar si la acci6n

i inductora del endodermo es privativa de un determinado estadio

del desarrollo embrionario ozbien si el endodermo de embriones en distintos estadios tiene un mismo efecto sobre el mesodermo presuntivo cardiaco, hemos cultivado porciones de endodermo de la regi6n anterior de embriones en sucesivos estadios del desa- rrollo, en contacto con el mesodermo presuntivo cardiaco explan-

tad0 de embrianes en estadio de surco neural (fig, 21, La netodo-

logfa es similar a la descripta en puntos anteriores.

2.2.9. Medios condi~ionados

- - -

Con el objeto de conocer si la acci6n inductora del endodermo se verifica a travgs del intimo contacto entre inductor y territorio competente o bien si el inductor li- bera sustancias difusibles a1 medio, que actuarian a nivel del

territorio competente, hemos realizado una serie de ensayos

u-

tilizando la metodologfa propuesta por Niu y Twitty (1953) deno- minada "medias condicionadosn. Consiste en cultivar mesodermo presuntivo cardiaco de embriones en estadio de surco neural, en presencia (pero no en contacto) de endodermo anterior de otros embriones en el mismo estadio. El cultivo se realizd en ngota pendiente" siguiendo 10s lineamientos generales ya descriptos,

En otra serie de ensayos se introdujo una modificaci6n

a

la me-

todologia que consistid en cultivar el endoderrno poc

4

dias, 11.12

go retirarlo y cultivar en la misma soluci6n salina, el mesoder- mo presuntivo cardiaco.

7

HPC

.

llnll

CULT I vo

F i g . 2 .

Cultivo

de mesoderrno

presuntivo

cardiac0 ( W C ) en presencia de endodermo

ante-

r i o r

(EA)

de embriones en es- tadios d i s t i n t o s de desarro- 110.

2,2.10, ~egeneraci6n:

- - -

explantes.

Con el objeto de reconocer eventuales

procesos de regeneraci6n del esbozo cardiaco de Bufo arenarum,

-

hemos realizado una serie de ensayos en 10s cuales hemos explan- tad0 el srea cardiaca de embriones en estadio de bot6n caudal, respuesta muscular y latido cardiaco.

~gsicamente se 'realizaron dos tipos de ensayos: en un primer grupo experimental, se explant6 el mesoder-

mo cardiaco solo, tratando de no dafiar el endodermo ubicado in- mediatamente por encima. En el segundo grupo experimental, el ex- plante interes6 tanto el mesodermo cardiaco como el endodermo an- terior, En 10s dos casos 10s explantes se realizaron en soluci6n

salina de Holtfreter madre estgril

y

a1 cerrar la herida, 10s em-

s briones eran trasladados a soluci6n Holtfreter standard estgril.

Se fijaron algunos embriones operados de ambos grupos a las dos horas del cierre de la herida, elegidos a1 azar y tambign contro- les a fin de confirmar la extensi6n del explante, es decir si el srea explantada interes6 s6lo el mesodermo cardiaco o bien si se habia explantado el mesodermo cardiaco junto con endodermo adya- cente.

2.2-11, Trasplantes

- - -

En el caso de 10s explantes mencionados en el punto anterior, el esbozo cardiaco explantado de embriones en estadio de bot6n caudal, fug trasplantado en el Brea ventral de otro embri6n del mismo estadio,

Para la realizaci6n de 10s trasplantes, 10s embriones receptores fueron ubicados en apropiadas cavidades practicadas en el fondo de cspsulas de parafina negra, de mod0

tal que quedara accesible el srea ventral posterior del embri6n

que debla recibir el trasplante, ~n esta srea, con el auxilio

de una aguja de Spemann, se introducia el material animal a tras- plantar, es decir el esbozo cardfaco. Se trataba luego de cerrar

la herida con puentes

y

manubrios de vidrio, El trasplante se

rrar la herida, 10s embriones se trasladaron a cspsulas de petri con soluci6n salina de Holtfreker standard e s d r i l que se renova-

TERCERA PARTE

3.1, Observaciones d e s c r i p t i v a s

E l a n & l i s i s d e s c r i p t i v o de 10s procesos que se v e r i f i c a n durante e l d e s a r r o l l o d e l coraz6n de Bufo arena- rum no habia s i d o r e a l i z a d o h a s t a e l momento y por l o t a n t o , a

-3

10s e f e c t o s de t e n e r un parsmetro v a l e d e r o p a r a l a i n t e r ~ r e t a c i h de 10s r e s u l t a d o s experimentales tuvimos que r e a l i z a r

un

e s t u d i o i n h e r e n t e a 1 d e s a r r o l l o d e l coraz6n desde e l e s t a d i o de p l a c a n e s r a l , h a s t a e l comienzo de l a s e t a p a s l a r v a l e s . E l e s t a d i o de p l a - c a n e u r a l r e p r e s e n t a una f a s e embrionaria muy adecuada p a r a nues- t r o e s t u d i o , dado que permite l o c a l i z a r e l mesoderm0 p r e s u n t i v o c a r d i a c o en un period0 temprano de l a organog6nesis.

-

~ s t a d i o 1 3 ( P l a c a n e u r a l ) . La morfo- l o g i a i n t e r n a que presentan 10s embriones a 1 i n i c i o de este e s k z d i o no es andloga a l a que o f r e c e n 10s e'mbriones pr6ximos a a k a 2 z a r e l e s t a d i o s u b s i g u i e n t e , e s d e c i r e l de s u r c o neural. En e f e c t o , un c o r t e t r a n s v e r s a l de 10s primeros demuestra que a n i v e l d e l f u t u r o esbozo c a r d i a c o , l a s l h i n a s l a t e r a l e s mesod&rmicas

,

s i b i e n durante 10s procesos de g a s t r u l a c i h n han podido avanzar desde e l b l a s t o p o r o h a c i a l a r e g i 6 n a n t e r i o r e n b e e c t o y endo- dermo, no han migrado t o d a v i a h a c i a l a l i n e a media v e n t r a l ( f i g ,

3

1.

Cabe s e f i a l a r que en cada lsmina mesod&rmica, b i e s t r a t i f i c a

-

da y r i c a en p l a q u e t a s v i t e l i n a s , no s e reconoce a h l a somato

y l a esplacnopleura. E l a n d l i s i s de c o r t e s h i s t o l 6 g i c o s de ernbrio- nes en e s t a d i o c a s i t e r m i n a l de p l a c a n e u r a l , c o n s t a t a , en cambio, que l a s lsminas l a t e r a l e s mesod&rmicas se han extendido

y

f u s i o - nado en l a l i n e a media v e n t r a l ; s i n embargo, a h no hay i n d i c i o s de d i f e r e n c i a c i 6 n de e s t r u c t u r a s c a r d i a c a s ( f i g . 4

1.

-

sta adios

14

-

15 (Surco n e u r a l , Rota- c i 6 n ) . La ngurula p i e r d e s u forma s u b e s f 6 r i c a y se a l a r g a ; e s t o s movimientos involucran a l a s t r e s h o j a s embrionarias. En e l meso- dermo, a n i v e l d e l f u t u r o 'esbozo c a r d i a c o , 10s dos e s t r a t o s celu- l a r e s que l o componen s e encuentran separados por una reducida hendidura que durante e l u l t e r i o r d e s a r r o l l o se t o r n a r g

m6s

am- p l i a , ubicando a l a somatopleura m & s externamente y a l a e s p l a c -

~ i y . 3. d o r t e t r a r i s v e r s a l de p l a c d n e u r a l . trmpra- na ( r s t d d i o 1 3 ) de 6. arenarum. 3a. Se o b s e r v a que e l mesodermo de l a s dos l & n i n a s l a t e r a l e s no

se

ha f u s i o n a d o e n l a l i n e a media v e n t r a l , q u e d a c do l i b r e una zona. Las l i n e a s i n d i c a n

e l

margen. m = mesodermo. x 50. 3b. D e t a l l e d e una l b i n a l a t e r a l mesod&rmica u b i c a d a e n t r e e c t o

y

en- dodermo. SEM. x 300.

F i g . 4 . C o r t e transversal de placd neural tardia ( e s t a d i o

13) de U. arenarum. 4a. E l mesodermo d e l a s l b i n a s l a t e & r a l e s se ha fusionado en l a l i n e a media

ventral.

rn

=

mesg

dermo. x 80.

4b.

Detalle d e l grea ventral,

.se

observa

que e l mesodermo forma un e s t r a t o continuo

(+

1.

SEM. u 250.

-

sta adios

16

-

17 (Tubo neural, Brote caudal). Durante el desarrollo de estos estadios embrionarios se verifica una diferenciaci6n morfol6gica en el mesoderm0 a ni- vel del Srea cardiaca; en efecto, la inicial separaci6n entre e s placno y somatopleura aumenta kodavia mis. Este espacio consti- tuirs la cavidad pericsrdica, limitada dorsalmente por la esplac- nopleura (que darg lugar a1 miocardio

1.

Se verif ican ademis, di- ferencias citoldgicas entre las dos lsminas mesod6rmicas: la es- placnopleura, que a este nivel+tambikn se denomina lll&nina pre-

miocardialfl, adquiere un aspect0 caracteristico por las c6lulas

,

.

de f o m a piramidal, altas

y

de n6cleos alternados (fig. 5 ), que la diferencian de las regiones circundantes. La somatopleura, a nivel cardiaco, no sufre, citol&gicamente, modificaciones signi- ficativas dado que sus cglulas quedan de forma cuboide.

A1 promediar el estadio de tubo neural, un grupo celular de origen rnesod6rmico se ubica entre el mesoder

iho pre-miocsrdico y el endodermo anterior; representa

el

origen

del endocardio, mss especificamente el revestimiento endotelial de las cavidades del coraz6n.'~u&ndo inicia el estadio de brote

caudal, las c~lulasendoc~rdicas se agrupan en forma de pequefios

-- -- - --

t6bulos. (fig. 6

1.

Los cortes hist~l&~icos, tanto de embrio- nes en estadio de tub0 neural, como as5 tambign de brote caudal, tratados con azul de bromofenol-mercurio o bien con la reacci6n de PAS, adquieren una intensa coloraci6n azul en el primer caso

y magenta en

el

segundo. Estos cuadros cromaticos se deben

a

la presencia de numerosas plaquetas vitelinas que a1 mostrar avidez

por 10s colorantes usados, indicarian su riqueza-en proteinas

y

carbohidratos.

Cabe sedalar que la matriz celular mues- tra una dgbil reacci6n para proteinas y carbohidratos; por otra parte, el alcian blue, en 10s msrgenes de pH en 10s que ha sido empleado, no constata presencia de mucopolisac~ridos.

-

~stadio 18 (Respuesta muscular).' Los cortes histol6gicos a nivel d e l esbozo cardiaco muestran un par-