EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE
CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES
GINA PAOLA SOLANO FLOREZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Bióloga
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGIA Bogotá, D. C.
2007
NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE
CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES
GINA PAOLA SOLANO FLOREZ
APROBADO
________________________
Maria del Pilar Márquez M.Sc Directora
________________________ ________________________
Ingrid Schuler Ph.D José Salvador Montaña M.Sc Jurado Jurado
EVALUACIÒN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE
CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES
GINA PAOLA SOLANO FLOREZ
APROBADO
________________________ ______________________
Angela Umaña Muñoz, M.Phil Andrea Patricia Forero Decana Académica Directora de Carrera
Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias
A Dios y a mis padres por su ejemplo de lucha, por sus sabios consejos; agradezco su compresión, su dulzura y dedicación
A mi hermana por que ha contribuido con mi formación a lo largo de mi vida y mi carrera.
A mi familia y Cesar por el cariño y apoyo durante todo este tiempo, a todos gracias por que hoy alcanzo una meta más en mi vida
Agradecimientos
Durante este proceso de preparación como profesional y crecimiento personal han sido muchas las personas que de una u otra forma han colaborado y enriquecido mi vida tanto profesional como personal.
A Maria del Pilar Márquez por su colaboración y constante asesoría por su confianza, enseñanzas y amistad
A la Dra. Ingrid Schuler por brindarme la oportunidad, por la confianza depositada y por posibilitar tantas oportunidades
A Andrea Forero por introducirme en el mundo de la biotecnología, por sus consejos y sugerencias constructivas
A William Escobar y Nixon Pérez por su colaboración en el trabajo en campo
Al Centro de investigaciones y Estudios en Diversidad y Recursos Genéticos CIEBREG
A Colciencias
A mis compañeros de laboratorio Diego Mejía, Paula Aguilar; a mi Amiga Ángela García, a ellos por el apoyo moral y compañía en este tiempo, por enseñarme que la paciencia es la mejor compañía y consejera en este trabajo
Finalmente, agradezco a todas aquellas personas de la Unidad de Biotecnología Vegetal que colaboraron siempre que fue necesario para que este proyecto saliera adelante; al igual que a todos mis compañeros de carrera.
TABLA DE CONTENIDOS
RESUMEN _________________________________________________________ 1 1. INTRODUCCION __________________________________________________ 2 2. MARCO TEORICO_________________________________________________ 4
2.1. Clasificación botánica ... 4
2.2 Taxonomía Y Botánica ... 4
2.2.1 Descripción botánica de Passiflora ligularis, Juss ... 5
2.3 Origen y distribución ... 6
2.4 Importancia Económica ... 6
2.5 Condiciones De Cultivo y Propagación ... 9
2.5.1 Clima ... 9
2.5.2 Suelos ... 9
2.5.3 Biología reproductiva y Propagación ... 9
2.5.5 Usos y Propiedades ... 11
2.6 Problemas Agronómicos y de Cultivo ... 12
2.6.1 Plagas y Enfermedades ... 12
2.7 Marcadores genéticos ... 14
2.7.1 Marcadores Moleculares ... 14
2.7.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ... 17
2.8 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) ... 19
2.8.1. Ventajas del Método ... 19
2.9 Marcadores AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ... 20
2.9.1. Ventajas del Método ... 21
2.10. Extracción de DNA ... 22
2.11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ... 23
2.11.1 Coeficientes de Asociación ... 24
2.12. ESTADO DEL ARTE DEL GENERO PASSIFLORA ... 26
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ___________________ 30 3.1 Problema y justificación ... 30
5. OBJETIVOS _____________________________________________________ 32 5.1 Objetivo General ... 32
5.2 Objetivos Específicos ... 32
6. MATERIALES Y METODOS ________________________________________ 32 6.2 Material utilizado ... 34
6.3 Fase de Laboratorio ... 34
6.3.1 Estandarización del protocolo de extracción de DNA ... 34
6.3.2 Diseño experimental ... 35
6.4 Cuantificación de DNA ... 35
6.5 RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar) ... 36
6.6 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ... 38
6.7 Análisis de datos ... 41
6.7.1 Extracción de DNA ... 41
6.7.2 Análisis RAPD y AFLP ... 42
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ______________________________________ 42 7.1 Estandarización del protocolo de extracción de DNA ... 42
7. 2. Análisis RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado al azar) ... 49
7.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ... 54 8. CONCLUSIONES ________________________________________________ 57 9. RECOMENDACIONES ____________________________________________ 58 10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS _________________________________ 59 11. ANEXOS ______________________________________________________ 69
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Composición nutricional de la granadilla (Passiflora ligularis)__________11
Tabla 2. Plagas que afectan el cultivo de granadilla (Passiflora ligularis)________13
Tabla 3.Enfermedades principales que afectan el cultivo de ganadilla (Passiflora ligularis___________________________________________________________14
Tabla 4.Factores, niveles y tratamientos evaluados para la extracción de DNA de (Passiflora ligularis)_________________________________________________34
Tabla 5. Concentraciones de MgCl2 y DNA evaluadas______________________35
Tabla 6. Perfiles de amplificación de DNA para RAPD______________________35
Tabla 7.”Primers” Operon utilizados para el análisis de Passiflora ligularis mediante RAPD.____________________________________________________________36
Tabla 8. Combinaciones de “Primers” EcoRI x MseI para el análisis de Pasiflora ligularis mediante AFLP. _____________________________________________39
Tabla 9. Incidencias de los distintos factores (método y tipo de tejido) y sus interacciones en la calidad y Cantidad de DNA extraído según el modelo factorial___________________________________________________________43
Tabla 10. Condiciones de PCR para RAPD_______________________________51
Tabla 11. Ciclos de temperatura del termociclador_________________________51
Tabla 12. Porcentaje de polimorfismos y bandas en el ensayo de AFLP________54
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Comportamiento de la producción de granadilla (Passiflora ligularis) en Colombia desde 1992 hasta 2003. ... 7 Figura 2. Representación de las posibles combinaciones de las OTU. ... 24 Figura 3. Diagrama deSíntesis de la metodología ... 33 Figura 4. Evaluación de la calidad de DNA extraído con tejido seco (A) y tejido conservado e frio (B), con los diferentes protocolos ... 43 Figura 5. Evaluación de la calidad de DNA extraído con tejido conservado en frio mediante el protocolo 3 (Mc Couch I et al 1988) de los 90 individuos colectados. ... 45 Figura 6. Dendrograma usando el algoritmo UPGMA, basado en el índice de similitud de Dice. Muestra las similitudes entre las procedencias evaluadas de Passiflora ligularis mediante marcadores molecualres RAPD………..53 Figura 7. Gel de acrilamida al 6% donde se observa la amplificación por medio de marcadores AFLP, combinaciones E- TA x M- CTT (90.63%), E-TT x M- CAA (61.54%), E- AT x M- CTT (90.82%). ... 55 Figura 8. Dendrograma usando el algorismo UPGMA, basado en el indice de similitud de Dice. Muestra las similitudes entre las procedencias evaluadas de Passiflora ligularis mediante maracadores moleculares AFLP……….
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Procedencia del material vegetal de Passiflora ligularis analizado mediante RAPD _______________________________________________ 70 Anexo 2. Protocolos evaluados para la extracción de DNA total de tejido foliar de Passiflora ligularis ______________________________________________ 75 Anexo 3. Protocolo de extracción de DNA. MC Couch, S.R, G. Kochert, Z.H. Yu,ZY.
Wing, G.S. Khush, W.R Coffman y S.D.Tanksley. 1988. Molecular mapping of rice chomosome. Theor Appl.Genet 76: 815-829 (Modificado) __________________ 77 Anexo 4. Cuantificación de calidad y cantidad de DNA muestras Quindío, Risaralda y Tolima, protocolo de Mc Cauch modificado tejido fresco _________________ 79 Anexo 5. Cuantificación de calidad y cantidad de DNA tejido fresco __________ 81 Anexo A. Cuantificación de calidad de DNA (260/208 OD) Muestras Quindío, Risaralda tejido fresco ___________________________________________ 81 Anexo B. Cuantificación de cantidad de DNA (µg/ml) Muestras Quindío y Risaralda tejido fresco ___________________________________________________ 81 Anexo 6. Cuantificación de calidad y cantidad de DNA tejido seco ___________ 82 Anexo A. Cuantificación de calidad de DNA (260/208 OD) Muestras Quindío, Risaralda tejido seco ____________________________________________ 82 Anexo B. Cuantificación de Cantidad de DNA (µg/ml) Tejido seco ___________ 82 Anexo 7.Resultados para la prueba de medias de Duncan ________________ 83 Anexo 8. Productos de amplificación marcador RAPD ____________________ 87 Anexo 9. Productos de Pre amplificación marcadores AFLP ________________ 89 Anexo 10. Formato libreta de campo ________________________________ 90 Anexo 11. Protocolo de tinción con nitrato de plata ______________________ 91
RESUMEN
La granadilla (Passiflora ligularis) es una especie neotropical perteneciente a la familia Passifloraceae, con gran valor comercial por sus frutos comestibles.
Colombia es uno de los mayores productores de esta fruta a escala mundial gracias a las campañas de consumo de productos exóticos que vienen realizando los países productores de la fruta en todo el mundo.
Una primera etapa para desarrollar programas de fomento, requiere del conocimiento de la diversidad genética de la especie en las zonas donde se concentra su producción. Las técnicas de biología molecular y en particular el uso de marcadores moleculares permiten conocer, caracterizar y estimar la diversidad genética y las relaciones entre grupos de interés.
En este estudio se evaluaron individuos de Passiflora ligularis procedentes del eje cafetero, para estimar la diversidad genética con marcadores RAPD y AFLP, como un primer acercamiento al análisis de diversidad genética dentro de la especie. El protocolo de extracción de DNA de Mc Couch modificado (1988) permitió obtener DNA de calidad y cantidad óptima para la amplificación con marcadores moleculares.
Se obtuvo un protocolo óptimo de amplificación para los marcadores RAPD, evidenciándose un bajo polimorfismo en la población evaluada con 11 “primers”, lo cual se refleja en índices de similitud altos. De la misma forma para los marcadores AFLP se establecieron las combinaciones de “Primers” que evidencian el mayor polimorfismo.
Se sugiere que los AFLP pueden generar mayor información en el análisis de diversidad, debido a que presenta el mayor grado de polimorfismo, siendo las combinaciones E- AT x M-CTT, E- TA x M- CTT, E- TG x M- CTG las más informativas con un total de 231 bandas polimórficas.
1. INTRODUCCION
El conocimiento de la distribución de la variabilidad genética es de suma importancia para el desarrollo de estrategias de conservación efectivas. La variabilidad puede ser muy diferente entre especies y entre poblaciones de una misma especie y esta variabilidad puede ser de gran interés para programas de selección y mejoramiento de especies con valor comercial y ambiental.
La granadilla (Passiflora ligularis) es una especie neotropical perteneciente a la familia Passifloraceae, con gran valor comercial por sus frutos comestibles.
Colombia se caracteriza por ser uno de los mayores productores de esta fruta a escala mundial, junto con Venezuela, Sudáfrica y Australia. La granadilla ha ganado importancia en el comercio internacional gracias a las campañas de consumo de productos exóticos que vienen realizando los países productores de la fruta a escala mundial.
La granadilla presenta un mercado interno activo, siendo los departamentos de Huila, Risaralda, Valle del cauca, Cundinamarca y Tolima los principales productores. La fruta además se exporta a diferentes países con beneficios arancelarios que la ponen en una situación ventajosa frente a otros productos. Sin embargo hasta el momento no existen investigaciones que permitan el desarrollo de un paquete tecnológico para el fomento del cultivo.
Una primera etapa para desarrollar programas de fomento, requiere del conocimiento de la diversidad genética de la especie en las zonas donde se concentra su producción. Las técnicas de biología molecular y en particular el uso de marcadores moleculares permiten conocer, caracterizar y estimar la diversidad genética y las relaciones entre grupos de interés. La primera fase de este proceso requiere ajustar los protocolos de extracción de DNA y amplificación para RAPD y AFLP, para la especie en estudio.
Dentro de estos marcadores moleculares encontramos los RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), desarrollados por Williams et al. (1990); los cuales están basados en la amplificación de DNA geonómico mediante la utilización de “primers” de secuencia nucleotídica corta (10 nucleótidos) al azar; donde los productos de amplificación son separados en geles de agarosa.
Por otra parte los marcadores moleculares AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), es un método altamente sensible para detectar polimorfismos de DNA (Vos et al., 1995), que combina una digestión enzimática con endonucleasas, con una amplificación posterior por PCR. El análisis de AFLP permite obtener marcadores dominantes, no específicos para un locus, se caracteriza por presentar una alta resolución y sensibilidad al mostrar los polimorfismos y no requieren información previa del genoma en estudio.
Estas son dos de las herramientas más utilizadas y sugeridas para los estudios de variación genética. Igualmente han sido aplicadas en estudios de genotipificación, diferenciación poblacional y diversidad genética en una gran variedad de organismos, al igual que para realizar selección asistida por marcadores.
Con este trabajo se pretende caracterizar molecularmente el material de granadilla cultivado en una de las zonas de mayor producción en Colombia como lo es el Eje Cafetero, como un primer paso para el futuro desarrollo de programas de fomento para esta especie.
2. MARCO TEORICO 2.1. Clasificación botánica
Reino: Vegetal
División: Angiospermas Clase: Dicotyledoneas Subclase: Archiclamydeeae Orden: Violales
Suborden: Flacourtineae Familia: Passifloraceae Género: Passiflora
Especie: Passiflora ligularis Nombre común: Granadilla dulce
Sinónimos (Romero 1991): Passiflora ligularis Juss. Var. germiniflora DC
Passiflora loweri Heer
Passiflora serratispula DC
Passiflora tiliaefolia
2.2 Taxonomía Y Botánica
La granadilla, Passiflora ligularis, Juss. Ann Mus. Hist. Nat. 6: 113.1805, pertenece a la familia de las Passifloraceae. El nombre de la familia y del género principal, Passiflora, tiene su origen en “flor de la pasión”, refiriéndose a la pasión de Jesucristo (Escobar 1988).
Dentro de la familia de las Passifloraceae se encuentran plantas comunes como:
granadillas, curubas, badeas, pasifloras, pasionarias, parchas, parchitas, tumbo, curubo, curubito, maracuyá, taxo, etc. Estas se encuentran, desde el nivel del mar hasta los subpáramos. Presentan dos tipos de crecimiento vegetal como lo son las lianas o enredaderas herbáceas con zarcillos axilares, y los árboles (Escobar 1988).
Las hojas de esta familia se caracterizan por ser alternas, pecioladas con estipulas, con nectarios extra florales (ausentes en algunas especies de pasiflora). Con pedúnculos axilares, tres brácteas grandes involucradas o pequeñas y esparcidas sobre el pedúnculo. Presenta flores hermafroditas; con cuatro o cinco sépalos, cuatro o cinco pétalos, aunque en algunas especies de Passiflora se encuentran ausentes. Tiene opérculo membranoso; cinco estambres unidos por los filamentos, formando un androginóforo, en otras ocasiones son ocho libres, con ovario supero, sub-sesil con tres o cuatro placentas parietales. El fruto se caracteriza por tener semillas que presentan testa lisa o reticulada, con arilo (Escobar 1988).
2.2.1 Descripción botánica de Passiflora ligularis, Juss
La granadilla se caracteriza por ser una planta con raíces fasciculadas, con tallo herbáceo, cilíndrico, voluble, típico de una enredadera glabra, con zarcillos axilares simples. Presenta hojas de color verde claro, acorazonadas con margen liso, simple y alterno con nervaduras pronunciadas por el envés que miden aproximadamente 8 a 14 cm de largo, el pecíolo tiene tres pares de glándulas finas y alargadas.
Las flores miden de 6 a 8 cm de diámetro, los sépalos y pétalos son de color blancuzco o amarillento y la corola por su parte presenta bandas alternadas moradas y blancas (Escobar 1988). Los estambres están sostenidos por su base;
las anteras se unen hacia la mitad del filamento. Lo cual facilita la labor de los polinizadores.
Su fruto tiene forma redonda ovalada y su sabor se describe como dulce y agridulce.
Dentro de su cáscara dura, lisa y cerácea, encerrada en un saco membranoso, donde se encuentra una pulpa gelatinosa compuesta de alrededor de 250 pequeñas semillas comestibles, de color café oscuro o negro (Escobar 1988).
El fruto esta sostenido con dos brácteas que miden de 6 a 12 cm de largo, la cáscara es semidura, encerrada y delgada, de color amarillo o naranja, generalmente presenta un pecíolo largo. El pericarpio está formado de varias capas de células, que le da la solidez al fruto. Por su parte el mesocarpo es de color
blanco, con una textura esponjosa y seca, mide alrededor de 3 mm de grosor (Escobar 1988).
En el interior de la fruta se encuentran tres placentas longitudinales almacenando las semillas que están rodeadas de una membrana fina de color blanco (parénquima), las semillas son planas, elípticas, de color negro, estas junto con el arilo tienen cerca del 76% de los carbohidratos (Escobar 1988, Trujillo 1983).
2.3 Origen y distribución
La granadilla (Passiflora ligularis) es originaria de Sudamérica, esta planta crece entre los 2000 y 3000msnm, se cultiva desde el norte de Argentina hasta México.
Colombia es uno de los países con mayor producción a nivel mundial (aproximadamente 20.504 Tn/año), al igual que Venezuela, Sudáfrica y Australia (CAQ 1992; Escobar 1988; Espinal et al. 2005).
Los principales cultivos en Colombia se encuentran en los departamentos de Antioquia, Boyacá, Caldas, Chocó, Cundinamarca, Huila, Santander, Tolima, Valle del Cauca, Quindío y Risaralda.
2.4 Importancia Económica
Las especies del género Passiflora constituyen una riqueza muy valiosa, tanto a nivel económico, como de recursos genéticos. Su flor ha despertado gran interés en la industria de plantas ornamentales en Europa. Algunas pasifloras tienen propiedades sedativas, antiespasmódicas y antibacteriales (Perry et al 1991). En América Latina, centro de diversidad y origen de las Passifloras, es el fruto, el que tiene mayor importancia a nivel de la agroindustria.
Dentro de esta gran variedad genética, inter e intraespecífica las que producen frutos comestibles son las que se convierten en un recurso importante para nuestro país y por la tanto es vital su conservación. Colombia es el país que mayor número de especies de pasifloras posee en el mundo, esto se debe a la gran diversidad de hábitat y climas, de igual manera su evolución está influenciada por la presencia de
las tres cordilleras, debido a que éstas forman una gran cantidad de sitios aislados por su posición y ubicación geográfica (Escobar 1988).
La granadilla es una fruta de gran importancia para los países andinos, en especial para Colombia y Ecuador, ya que se ha convertido en la fruta tropical exótica con mayor participación y crecimiento durante los últimos cinco años, dentro del renglón de las exportaciones. En Colombia los cultivos comerciales de estas frutas son relativamente nuevos, pero a pesar de la excelente aceptación del mercado ante estos frutales, no se cuenta con una oferta tecnológica que permita satisfacer toda la demanda que está exigiendo el mercado (Espinal et al 2005).
Según datos del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR), en Colombia, del área sembrada destinada a los frutales de exportación, la granadilla participó aproximadamente con el 4.7% en el 2003, presentando en el período 1992-2003 un crecimiento de 3.9% promedio anual. En 1992 se cultivaron 1.069 ha. y en 1998 se llegó a las 1.545 ha cultivadas., pero en 1999 el área dedicada a este cultivo cayó vertiginosamente hasta alcanzar 914 ha cultivadas, aunque a partir de ahí se inicia una gran recuperación del cultivo alcanzando en el 2003 una superficie de producción de 1.821 ha (Figura 1) (Espinal et al 2005).
Comportamiento de la producción de granadilla en Colombia (Tn/Año)
Figura 1. Comportamiento de la producción de granadilla (Passiflora ligularis) en Colombia desde 1992 hasta 2003.
Ton
Año
La dinámica de la producción ha superado el crecimiento en área, lo que indica ganancias en productividad dado que el crecimiento promedio en el período 1992- 2003 fue de 5,0%, alcanzando en este último año una producción de 20.504 ton.
Los rendimientos han experimentado un crecimiento de 1.1% promedio anual, manteniéndose alrededor de 11 y 12 ton/ha (I Censo nacional de frutas agroindustriales y promisorias 2004, Espinal et al 2005).
Según información suministrada por el MADR, la mayor producción de granadilla en el año 2003 se presentó en los departamentos del Valle del cauca (45%), Huila (20%), Risaralda (12%), Caldas (7%), Cundinamarca (4%) y Tolima (4%) (I Censo nacional de frutas agroindustriales y promisorias 2004, Espinal et al 2005).
Risaralda es actualmente el tercer productor nacional, y se destaca por el gran auge que ha adquirido el cultivo en la zona, pasando de 53 hectáreas cultivadas en 1992 a 208 hectáreas en el 2003, lo que significó pasar de producir 579 toneladas a 2.457, con un crecimiento 1992-2003 promedio anual de 12.8% con relación a la superficie de cultivo y de 12.5% en la producción (Espinal et al 2005).
La expansión en el cultivo parece estar más relacionada con incrementos en área que por mejoras productivas, pues los rendimientos, aunque se mantienen sobre el promedio nacional muestran una tasa de crecimiento negativa de -0.2% (Espinal et al 2005).
El departamento de Quindío, que participó en el 2003 con tan solo el 3% de la producción nacional, muestra la mayor dinámica de crecimiento del cultivo en todo el país durante el período 1992-2003, aunque con un volumen de producción muy por debajo del logrado por el departamento de Valle, con un crecimiento del 27%
promedio anual en área y producción. Los rendimientos en este departamento han estado cercanos al promedio nacional llegando a 11.1 ton./ha. en el 2003 (Espinal et al. 2005).
2.5 Condiciones de Cultivo y Propagación 2.5.1 Clima
La temperatura óptima para el cultivo de granadilla, con un buen desarrollo fisiológico y productivo, se encuentra entre los 13 y 19 °C. A temperaturas mayores o menores a las señaladas, el desarrollo se ve afectados sustancialmente (CIA 1992).
Los niveles de precipitación para el buen desarrollo van de los 600 a 1.000 mm anuales, por lo que en áreas con precipitaciones pluviales inferiores se cultiva con riego adicional. Los mejores rendimientos se obtienen en altitudes entre los 1.800 y 2.700 m.s.n.m, pero existen plantas en estado silvestre o cultivadas fuera de este rango; sin embargo a altitudes superiores a los 2.500 m.s.n.m existe el peligro de las heladas, que ocasiona la quema de las hojas y tallos inhibiendo de esta manera la producción de frutos (CIA 1992). La especie prospera bien con una humedad relativa de 75% (Benalcázar et al. 2001).
2.5.2 Suelos
Dentro de las características edáficas para el cultivo de granadilla se encuentran el buen drenaje de los suelos y la buena disponibilidad de humedad. Los suelos deben presentar una textura entre franca: franco arenoso o los franco arcillo-arenoso. Con cantidades superiores al 3% de materia orgánica, con el fin de mantener la humedad, temperatura y mejorar las características estructurales al igual que las químicas. El pH del suelo debe ser ligeramente ácido por lo que se encuentra entre 6.0 a 6.5 (CIA 1992, Benalcázar et al. 2001).
2.5.3 Biología reproductiva y Propagación
Passiflora ligularis es una planta diploide (2n = 18) (Snow et al 1993) que posee dos juegos de cromosomas y se reproduce por polinización cruzada, en donde los gametos de diferentes plantas se unen para formar el cigoto.
Debido a la forma de reproducción se presenta un constante intercambio genético en cada generación aumentando de esta manera la variabilidad genética con un alto grado de heterocigosis (Chaves 1993)
La propagación de la granadilla se puede realizar sexualmente y asexualmente. La propagación por semilla se inicia con la selección y extracción del fruto, por lo que debe ser extraído de plantas sanas de alta productibilidad, que presenten frutos maduros, enteros, sanos y con un peso individual de 100 gramos o más.
El proceso se inicia con el corte del fruto por la mitad, luego se evacua su contenido en un recipiente con agua donde se mantiene por un periodo de 48 horas. Después de este tiempo la semilla es tamizada hasta que el arilo sea totalmente desprendido.
Luego, se deja secar a la sombra durante 24 horas y pasado este tiempo se procede a sembrar la semilla en tierra con una mezcla de materia orgánica para luego ser trasplantada. En promedio la semilla germina entre 15 o 20 días después de la siembra (Benalcázar et al. 2001).
El segundo método de propagación se realiza por injertos. Este tipo de propagación generalmente se utiliza para superar problemas de enfermedades causadas por hongos presentes en el suelo. Así como por estacas, la cual dura dos meses antes de ser trasplantada a la tierra (Benalcázar et al. 2001).
2.5.4. Composición nutricional del fruto
La granadilla es rica en fósforo y vitamina C, es una fruta con un alto contenido en calorías (Tabla 1) y presenta propiedades diuréticas y digestivas (Nagy 1980).
Tabla 1. Composición nutricional de la grandilla (Passiflora ligularis) Componentes Contenido de 100 g de
parte comestible
Valores diarios recomendados (basado
en una dieta de 2000 calorías)
Agua 86 %
Proteínas 1.1 %
Carbohidratos 11.6 % 300 g
Cenizas 0.9 %
Grasa total 0.1 % 66 g
Calorías 46
Fibra 0.3 g 25 g
Ácido ascórbico 20 mg 60 mg
Calcio 7 mg 162 mg
Fósforo 30 mg 125 mg
Hierro 0.8 mg 18 mg
Niacina 2.0 mg 20 mg
Riboflavina 0.1 mg 1.7 mg
Tomado de Nagy 1980
2.5.5 Usos y Propiedades
El principal uso es consumo en fresco (no procesada), el refresco y helados de pulpa de granadilla son otra forma de consumo. También se prepara jalea y mermelada, opciones agro industriales que permiten emplear las frutas sanas, con características de apariencia externa no recomendada para el mercado de consumo en fresco (Cerdas et al 2003).
La raíz de la planta tiene propiedades narcóticas y es considerada como emética;
Con la cocción de flores, hojas y/o raíces se obtiene una bebida tranquilizante y relajante para dormir. Los frutos son considerados de los más agradables en la flora americana, son refrescantes, laxantes y diuréticas, muy útil para el control de cálculos y malestares del sistema urinario e intestinal, al igual que depura la sangre
(Cerdas et al 2003, Trujillo 1983). La infusión de las hojas de la planta se utiliza para controlar la fiebre tifoidea (Nagy 1980).
La pasiflorita es un alcaloide muy usado como sedativo, el cual actúa en el sistema nervioso. Por otra parte el jugo fresco de las hojas preparado con agua azucarada es una bebida eficaz para tratar las fiebres biliosas (Trujillo 1983).
2.6 Problemas Agronómicos y de Cultivo 2.6.1 Plagas y Enfermedades
La granadilla es susceptible al ataque de plagas, dentro de las que sobresalen las larvas masticadoras, que atacan las hojas de la granadilla y producen la defoliación llegando a producir la muerte de la planta en algunas ocasiones (Benalcázar et al.
2001).
El factor más limitante del cultivo de la granadilla en Colombia lo constituyen las enfermedades, dentro de las que se destacan principalmente la roña o antracnosis producido por Glomerella cingulata, la secadera producida por Nectria haematococca y más recientemente el virus de la hoja morada o mancha anular del fruto atribuida a una cepa del virus del mosaico de la soya (Tamayo 2000).
La secadera es causada por el hongo Nectria haematococca, el cual es un habitante natural del suelo, por lo que su control se realiza aplicando químicos al suelo donde se va a sembrar. Este hongo ataca la granadilla por las heridas naturales que presentan las raíces, sin embargo cuando estas heridas son causadas por el trasplante, el efecto es más severo y rápido. De igual manera, el ataque de insectos deja expuestas las superficies para el ataque del patógeno, favoreciendo de esta forma la presencia de secadera en las ramas (Tamayo 2004).
El efecto que causa Nectria haematococca es la pudrición del cuello de la planta, especialmente en condiciones de alta humedad al igual que puede invadir sistemáticamente la planta a través de la raíces provocando síntomas de flacidez y marchitez en los diferentes estados de desarrollo de la planta (Tamayo y Becerra 2004).
Por otra parte el cultivo se ve afectado por el hongo Oidium que está en el follaje más joven de la planta, y se presenta cuando existen cambios bruscos de temperatura y humedad en el ambiente (Benalcázar et al. 2001).
La maduración temprana de las flores y frutos y por ende su pudrición se da a causa de Botrytis eata; este hongo se presenta principalmente en las flores y frutos en desarrollo debido a la alta humedad por encajamiento o densidad de las ramas (Benalcázar et al. 2001).
En los cuadros 2 y 3 se muestra un resumen de las enfermedades y plagas que atacan al cultivo con su respectivo tratamiento biológico
Tabla 2. Plagas que afectan el cultivo de granadilla (Passiflora ligularis)
Nombre común Nombre científico Tratamiento Dosis Gusano de los
brotes
Dionne juna Bacillus thuringiensis Polibia sp.
30 g / ha 50 individuos al
inicio de la infestación Gusano del follaje Dionne glycera Bacillus
Thuringiensis 300 g / ha Acaro rojo Tetranychus urticae Acrinatrin
Phytoseiulus persimilis Feltiella sp.
1 lt / ha 100 individuos m2 50 individuos por m2
al
inicio de la infección Tomado de Benalcázar et al. 2001.
Tabla 3. Principales enfermedades que afectan el cultivo de granadilla (Passiflora ligularis) Nombre común Nombre
científico Tratamiento Dosis
Antracnosis Colletotrichum Gloeosporioides
Bacillus sp.
Pseudomonas sp.
106 UFC / ml 107 UFC / ml Pudrición de flores. Botrytis cinerea Bacillus subtilis.
Trichoderma koningii T. longibranchiatum
107 UFC / ml 106 - 108 UFC / ml 106 – 107 UFC / ml Pudrición de las
raíces Fusarium
oxysporum Trichoderma hamatum.
T. viride
107 UFC / ml 106 UFC / ml
Pudrición negra de la Raíz.
Pythium sp. Trichoderma Lignorum
105 UFC / ml
Pudrición limitada
de la raíz. Rhizoctonia solani Streptomyces Griseoviridis
107 UFC / ml
Tomado de Benalcázar et al. 2001
2.7 Marcadores genéticos
En la actualidad se conocen tres tipos de marcadores; los marcadores morfológicos, los bioquímicos, también conocidos como enzimáticos, y por último los marcadores moleculares.
Los marcadores morfológicos son por lo general, características observables o medibles, que resultan de la expresión de un número de genes y son dependientes de la interacción con el medio ambiente, lo cual al momento de un análisis hace difícil la interpretación de los datos, por lo que la probabilidad de encontrar asociaciones con características agronómicas es baja (Rocha 2003).
2.7.1 Marcadores Moleculares
Los marcadores moleculares son definidos como secuencias de DNA, las cuales en los últimos años se han convertido en una herramienta útil para la detección de la diversidad genética, con su consecuente aplicación en programas de selección genética de plantas asistida por marcadores. Los polimorfismos (variantes) a nivel de DNA pueden ser detectados mediante técnicas moleculares (Rocha 2003).
Rocha (2003) plantea que estos fragmentos de DNA pueden ser físicamente localizados dentro del genoma de un organismo. En ocasiones estos fragmentos pueden encontrarse cerca de un gen que codifica una característica de interés, aunque también pueden estar en una región no codificante. Una de las características fundamentales de estos marcadores es que son específicos para cada individuo, especie o grupos sistemáticos mayores. Dentro de las ventajas que ofrecen estos marcadores es que no se ven afectados por el medio ambiente lo cual los convierte en una herramienta útil para el análisis tanto de poblaciones como de individuos (Karp et al. 1997).
Los marcadores morfológicos por su parte son todos aquellos atributos de las plantas o características observables y cuantificables, resultantes de la expresión de un número determinado de genes, los cuales pueden ser altamente heredables y permiten la discriminación rápida de fenotipos (Demey et al. 2003).
Comparados con los marcadores moleculares, los marcadores morfológicos presentan algunas desventajas, entre las que encontramos la dependencia directa de la interacción con el medio ambiente para la expresión de los caracteres, lo cual al momento de un análisis hace difícil la interpretación de los datos, por lo que la probabilidad de encontrar asociaciones con las características agronómicas es baja (Kurt et al. 2005, Rocha 2003).
Por otra parte los datos arrojados por estos marcadores son cuantitativos y cualitativos limitando de esta manera la cantidad de caracteres evaluados en comparación con las que se puede llegara a evaluar con los marcadores moleculares (Kurt et al. 2005, Rocha 2003).
Aunque la descripción morfológica de los órganos vegetativos, reproductivos y rasgos agronómicos han sido útiles para la caracterización y evaluación de los recursos genéticos, estas descripciones se ven limitadas por la dependencia del tipo de heredabilidad del carácter, ya que se puede presentar que una característica se herede a través de poligenes, dominancia parcial o completa; Otra limitante dentro de estos es el tiempo requerido para la evaluación completa de los mismos (Demey et al. 2003).
Los marcadores bioquímicos, por su parte, son fundamentalmente isoenzimas las cuales son generalmente utilizadas en estudios de identificación de genotipos y estudios de genética de poblaciones. A pesar de que son marcadores codominantes, es decir que diferencian entre homocigotos y heterocigotos en organismos diploides, y que ésta es un técnica de bajo costo; la principal limitante es el bajo número de enzimas disponibles para cada organismo, igualmente se ven afectados por el ambiente, por lo que son unos marcadores inestables (Kurt et al.
2005, Rocha 2003).
Dentro de las ventajas de los marcadores moleculares encontramos la estabilidad, permitiendo que sean detectados en todos los tejidos, independiente de la etapa de desarrollo de la planta y carecen de efectos pleitrópicos y epistáticos, ya que no se ven afectados por el medio ambiente (Stuber et al. 1999, Caetano-Anolles &
Trigiano 1997).
Actualmente los marcadores moleculares se emplean, para hacer más eficiente la selección de plantas y de variedades que son utilizadas en programas de mejoramiento genético (metodología que se conoce como selección asistida por marcadores). Este tipo de selección hace posible la predicción de los genotipos a obtener en un determinado cruce, con base en la información de los parentales empleados. De igual forma los marcadores pueden ser utilizados para identificar plantas individuales que contienen características de interés particular (Rocha 2003).
En la actualidad los estudios de mejoramiento genético y propagación masiva, exigen el conocimiento de las variedades y los genotipos promisorios para que sean utilizados con el fin de obtener cultivares de alta calidad. Varios marcadores moleculares permiten establecer las diferencias existentes entre los individuos comparando su DNA, entre los que se destacan los RFLP, RAPD, SSR, AFLP entre otros, los cuales abren las posibilidades de generar huellas genómicas (fingerprintings), de las especies de interés, útiles para la identificación genética de individuos dentro de la misma especie (Bustamante et al. 2001, Dahlberg et al.
2002, Karp et al. 1997, Thompson et al. 1998).
Adicionalmente el grado de polimorfismo obtenido con los diferentes marcadores moleculares es mayor comparado con los marcadores morfológicos y bioquímicos
La elección de un marcador molecular depende del objetivo que se busca, de la estructura de la población, de la diversidad genómica de la especie que se va analizar, de la disponibilidad del sistema y del tiempo requerido para el análisis.
Debido a que cada uno de los marcadores presenta ventajas y desventajas antes de escoger algún sistema, es vital evaluar el potencial de utilidad que puede tener en una población, especie o género, de igual forma se debe evaluar la eficiencia de la técnica en la detección de polimorfismos (Staub et al. 1997).
2.7.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La técnica PCR fue desarrollad por Kary B. Mullis en 1984, ésta permite obtener millones de copias (in vitro) de un fragmento de DNA, el cual sirve como molde, mediante la acción de la enzima taq polimerasa. Esta enzima aislada de Thermus aqualticus, es una proteína termoestable, la cual polimeriza los nucleótidos de manera fiel, permitiendo la formación de nuevas moléculas de DNA (Rocha 2003).
La amplificación del DNA mediante PCR, simplifica los procesos de clonaje, análisis y modificación de ácidos nucleicos y se caracteriza por ser una técnica sencilla, sensible y rápida. La cantidad de DNA requerido para la reacción es mínima. De
igual manera no se requiere previo conocimiento del material genético (Kurt et al.
2005). La mezcla de “primers”, DNA, dNTPs y taq es sometida a cambios de temperatura que permiten separa las cadenas de DNA que tienen la secuencia de interés, permitir que los “primers” encuentren la secuencia complementaria y la cadena sea elongada, la repetición de estos ciclos permite la multiplicación exponencial de la secuencia de interés (Erlich et al. 1992)
Componentes del método
La amplificación específica de las regiones de DNA se realiza mediante tres pasos fundamentales que son: la desnaturalización de DNA, el anillamiento o hibridación de “primers” específicos y por último, la elongación de la cadena
Desnaturalización del DNA: temperaturas elevadas (94°C) permiten que el DNA de doble cadena se separe, quedando de esta manera DNA de cadena sencilla, el cual es utilizado por la enzima taq polimerasa como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Cuando se presenta una denaturación incompleta se da el realineamiento de las cadenas lo cual se ve reflejado en la disminución del producto;
cuando este ciclo es muy prolongado la enzima pierde actividad (Erlich et al. 1992, Kurt et al. 2005).
Anillamiento: en este paso la temperatura disminuye (50- 65°C) para permitir el apareamiento de los “primers” con las cadenas sencillas de DNA. Los “primers” son cadenas de DNA, generalmente complementarias al extremo del fragmento que se quiere amplificar. Si la temperatura es muy alta el anillamiento no sucede, pero cuando es muy baja se presenta anillamientos inespecíficos. Generalmente esta temperatura depende de la composición de las bases, longitud y concentración de los “primers” (Kurt et al. 2005).
Elongación de la cadena: teniendo el DNA de cadena sencilla y el “primer” como cebador, la taq polimerasa empieza el proceso de elongación o copia, añadiendo deoxinucleótidos en el extremo 3´ al “primer”, esta etapa se da a 72°C para evitar el anillamiento inespecífico de los “primers” (Erlich et al 1992, Kurt et al. 2005).
2.8 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)
La técnica de RAPD, desarrollada paralelamente por Welsh y Mc Clelland (1990) y Williams et al. (1990) tiene como base la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction). Esta técnica involucra la utilización de “primers”
arbitrarios cortos (10 nucleótidos), que amplifican segmentos aleatorios dentro del genoma generando de tres a diez puntos de información por cada muestra analizada (Williams 1990). Los productos de esta amplificación son separados en geles de agarosa al 1.5%, teñidos con bromuro de etidio y son visualizados bajo rayos ultravioleta (Tingey et al. 1992).
Este se caracteriza por ser un marcador dominante, por lo que los polimorfismos que se observan son el resultado de inserciones, deleciones o cambio de un solo nucleótido en la cadena molde que alteran la secuencia en uno o los dos puntos de homólogia con el “primer”, y se hacen visibles por la presencia o ausencia de una banda. Como resultado se obtienen patrones electroforéticos con bandas de diferentes tamaños correspondientes a múltiples locus, que forman una huella genética (Tingey et al. 1992)
Esta técnica es útil para detectar polimorfismos para el mapeo genético, estudios filogenéticos, y estudios de genética de poblaciones; al igual que para determinar el nivel de distribución genética entre y dentro de las poblaciones (Anand 1998).
2.8.1. Ventajas del Método
Los marcadores RAPD se caracterizan por no requerir información previa de la secuencia de DNA para el diseño de “primers” específicos, por lo que se utilizan
“primers” universales. Es un proceso rápido, sencillo, automatizable, para el cual se requiere poca cantidad de DNA.
Sin embargo esta técnica se puede ver afectada por diferentes factores como la concentración del “primer”, la temperatura de anillamiento del “primer” y la baja calidad de DNA (Caetano-Anolles & Trigiano 1997, De Vicente et al. 2003).
2.9 Marcadores AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
La técnica del polimorfismo en la longitud del fragmento amplificado (AFLP) hace uso de la huella genómica del DNA. Esta huella es usada para visualizar los polimorfismos del DNA entre las diferentes muestras que se analizan. De igual manera estos pueden ser usados para evaluar la relación existente entre estas muestras. Por otra parte se utilizan como fuente de marcadores moleculares para generar mapas de ligamento (Mueller et al. 1999).
La técnica de AFLP, se basa en la detección de fragmentos de restricción por amplificación de PCR (Segura 2002; Vos et al. 1995). Los AFLP son una herramienta útil para determinar la identidad de una muestra específica de DNA, para asegurar la relación entre muestras o para identificar marcadores moleculares asociados a rasgos fenotípicos y/o loci genéticos (Invitrogen 2003)
Los marcadores AFLP se caracterizan por combinar dos técnicas, una de ellas los RAPD, basados en la amplificación de fragmentos de DNA, utilizando “primers”
arbitrarios y los RFLP basados en la hibridación con sondas específicas, y el corte o digestión con enzimas de restricción. Por esta razón los AFLP presentan varias ventajas, entre las que se encuentran, el no requerir información previa de la secuencia a analizar y la sensibilidad que permite la detección de fragmentos de baja abundancia (Echenique et al. 2004).
Se plantea que esta técnica se divide en cuatro pasos fundamentales: digestión, Ligación, Pre-amplificación y amplificación, estos dos últimos son tomados como una solo por muchos autores.
Digestión: Se lleva a cabo por medio de dos enzimas específicas de restricción, una de ellas es de corte raro y la otra de corte frecuente (Vos et al. 1995, Blears et al. 1998). La utilización de dos enzimas de restricción es justificada por Vos et al (1995), debido a que los fragmentos que generan estas enzimas, están en un rango de tamaño ideal, tanto para ser amplificados como para ser separados en el gel de acrilamida.
Ligación: Los fragmentos generados en la digestión, son ligados, mediante una ligasa, a adaptadores específicos para cada enzima de restricción con el fin de generar secuencias conocidas para la amplificación.
Generalmente estos adaptadores son “primers” de doble cadena, complementarios a la secuencia de corte de las enzimas; estos están diseñados de tal manera que la ligación de un fragmento a un adaptador no reconstituye los sitios de restricción (Blears et al. 1998).
La secuencias terminales en cada fragmento adaptado están conformadas por la secuencia del adaptador y el remanente de la secuencia del sitio de restricción, las cuales sirven para la unión de los “primers” (Blears et al. 1998, Muller et al. 1999).
Pre amplificación (PRC + 1): Se realiza una primera PCR (preselectiva), usando cebadores oligonucleótidos complementarios al adaptador y a los sitios de restricción, más un nucleótido selectivo (Blears et al. 1998)
Amplificación selectiva: Los productos de la amplificación preselectiva se someten a otra PCR, y nuevamente se selecciona un subconjunto de fragmentos.
Generalmente, en la segunda amplificación selectiva se agregan dos nucleótidos más a los “primers”
2.9.1. Ventajas del Método
La cantidad de DNA requerida es poca, debido a que combina la generación de fragmentos por medio de enzimas de restricción y la amplificación con PCR.
El número de polimorfismos por reacción es mayor que el obtenido con RFLP, puesto que genera un mayor número de bandas. Por otra parte no es necesario conocer las secuencias del genoma de la especie estudiada. (Vos et al. 1995, Blears et al. 1998, Muller et al. 1999).
De igual manera Vos et al (1995) plantea que la preamplificación seguida de una amplificación disminuye el ruido de fondo en la lectura, puesto que se eliminan bandas que son producto de errores en el apareamiento de los “primers”, lo cual sucede cuando se hace una amplificación, al igual se reduce el número de fragmentos amplificados, por esto es altamente reproducible.
Durante el aislamiento y purificación de DNA genómico de plantas pueden surgir una serie de problemas que disminuyen la calidad y cantidad del DNA y pueden afectar las reacciones enzimáticas lo cual influye en la calidad de los productos amplificados por PCR (Weising et al. 2005)
Debido a que la composición bioquímica de tejidos y especies vegetales varia considerablemente es difícil contar con un único protocolo de extracción que pueda servir para todas las especies de plantas especies cercanamente relacionadas puede requerir diferentes procedimientos de extracción de DNA. (Weising et al.
2005)
2.10. Extracción de DNA a partir de tejido vegetal
Generalmente el trabajo en biología molecular requiere en principio del aislamiento del ácidos nucleicos (DNA, RNA) y es necesario que estos sean de alta calidad y cantidad. El aislamiento de DNA genómico es esencial para muchas de las aplicaciones en técnicas de biología molecular, incluidas la digestión con enzimas de restricción, análisis de southernblot, construcción de librerías genómicas, Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), entre otras (Michiels et al. 2003). Es por esto que se han planteado diferentes protocolos para su aislamiento.
Cada una de estas metodologías de extracción presenta una lisis celular, donde un detergente (SDS, CTAB) se encarga de solubilizar proteínas, tejidos y membranas al igual que solubiliza polisacáridos (Michiels et al. 2003).
Sin embargo después de este proceso, en el DNA extraído se encuentra un alto contenido de metabolitos secundarios como fenoles y polisacáridos que pueden
afectar la reacción de PCR, inhibiendo la acción de de la polimerasa (Rogers et al.
1995). Es por esto que dentro de los protocolos de extracción se encuentra la utilización de sales, que precipitan los polisacáridos; de igual manera se hace uso de solventes orgánicos como el fenol cloroformo y cloroformo isoamílico para eliminar compuestos fenólicos, con el fin de obtener un DNA de alta calidad que pueda ser amplificado (Roger 1996, Vroh et al. 1996).
La pureza del DNA extraído puede ser evaluada mediante espectrofotometría, la cual mide la relación de la absorbancia A260/A280, si está entre 1.7 – 2.0 el DNA es de alta pureza y no está acompañado de otras moléculas contaminantes; una relación mayor a 2.0 indica que en la muestra se encuentra RNA; y si la relación es menor de 1,7 existe la posibilidad de encontrarse en la muestra proteínas u otros contaminantes como fenoles, compuestos orgánicos entre otros (Brown, 2000;
Davis et al. 1994 ).
2.11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO APLICADO A LOS ESTUDIOS DE DIVERSIDAD
Dependiendo el problema que se desea resolver y el tipo de información molecular recolectada, se pueden escoger las herramientas interpretativas que más se ajusten.
Generalmente en los estudios de diversidad genética, se trabajan con variables cualitativas de tipo binario. En este caso la variable maneja dos estados, presencia (1) y ausencia (0)
Distancia y similitud genética
La distancia genética entre dos secuencias, individuos o taxa, es definida como un estimativo cuantitativo de la divergencia genética que puede existir entre estos.
Inverso a esto se habla de similitud genética. De esta manera cuando la distancia genética es baja la similitud genética es alta (Page 1998).
2.11.1 Coeficientes de Asociación
Estos coeficientes permiten medir las coincidencias y diferencias en los estados de caracteres entre dos características o OTU “operacional Taxonomic Unit”. Para la aplicación de estos índices se requieren datos doble estado (Crisci et al. 1983)
Al comparar dos OTU, A y B, para un carácter doble estado (presencia- ausencia), se presentan cuatro posibilidades:
1. Ambas OTU Presenten el carácter comparado (a) 2. Ambas OTU tenga ausente el carácter comparado (d)
3. La primera OTU tenga el carácter presente y la segunda lo tenga ausente (b) 4. La primera lo tenga ausente y la segunda lo tenga presente (c)
Al pasar cada una de estas posibilidades a una matriz de dos por dos se obtiene la siguiente representación (Figura 2).
Figura 2. Representación de las posibles combinaciones de las OTU.
Tomado de IPGRI y Cornell University, 2004
Dentro de los múltiples coeficientes de asociación existentes los que se muestran a continuación son los más utilizados en estudios de diversidad genética con marcadores moleculares.
2.11.1.1 Coeficiente de asociación de Jaccard (CAJ)
Solamente cuenta las bandas presentes para cualquiera de los individuos (‘i’ o ‘j’).
Las ausencias dobles se consideran como datos ausentes, esto como elemento a favor de la similitud. Si se presentan falsos positivos o falsos negativos, la estimación del índice tiende a ser sesgada (Crisci et al. 1983).
Puede aplicarse con datos de marcadores codominantes. Los valores de la similitud que se obtienen a partir de la aplicación de este coeficiente varia entre 0 (mínima similitud) y 1 (máxima similitud) (Crisci et al. 1983)
CAJ = a
————
a + b+c 2.11.1.2 Coeficiente de Dice (SD)
En este coeficiente se le da mayor peso a las coincidencias, es decir a los caracteres que están presentes en las dos OTU. Considera que la ausencia tiene menor importancia biológica y, de esta manera, este coeficiente tiene un significado completo en función de la similitud del DNA. Los valores varían entre 0 y 1, lo cual equivale a los valores de mínima y máxima similitud, respectivamente (Crisci et al.
1983. I PGRI y Cornell University, 2004).
SD = 2 a ————
2 a + b+ c
UPGMA (unweighted pair – group method using arithmetic averages)
Este es un análisis de agrupamiento computacional, comúnmente empleado, el cual analiza grupos cercanos, teniendo en cuenta el valor de similitud genética. Las figuras obtenidas mediante este método consisten en un algoritmo que se utiliza para establecer las relaciones genético poblacionales, agrupando las poblaciones de acuerdo a las bandas en cada una de las especies. Donde aquellas que comparten más bandas son las más cercanas y forman un grupo (Crisci et al. 1983).
2.12. ESTADO DEL ARTE DEL GENERO PASSIFLORA
En Colombia y a nivel internacional son varias las instituciones que se han interesado en realizar estudios en las diferentes especies del género Passiflora, debido a la importancia económica y farmacológica que representan.
En la Unidad de Biotecnología Vegetal de la Pontificia Universidad Javeriana, se destacan en el campo de cultivo In Vitro el trabajo realizado por Becerra (2003) donde se evaluó el efecto del origen del material vegetal y la edad sobre la capacidad morfogenética, de dos especies de Passifora (P. edulis y P. mollissima) cultivados In Vitro, para lo cual se utilizó medio Murashige & Skoog suplementado con reguladores de crecimiento. Se observó un mayor número de brotes por disco foliar para P. edulis de plantas de 1 y 2 meses de edad del material cultivado en invernadero, mientras que para P. mollissima el mayor número de brotes se presentó con las plantas de invernadero que estaban entre los 2 y 3 meses de edad.
Por lo que se concluye que para cada una de las especies el material que mejor respuesta morfogenética tiene es el cultivado en invernadero (Becerra 2003)
Ovalle (1995) evaluó la organogénesis In Vitro de Passiflora mollissima y Passiflora ligularis a partir de discos foliares; en este trabajo se establecieron las condiciones de cultivo para lograr la regeneración de brotes para P. mollissima y la regeneración de callos de P. ligularis a partir de discos foliares, en diferentes medios. Malaver (2000) evaluó algunos factores en el cultivo de anteras de Passiflora edulis.
García (1993) realizó una comparación de material parental y micropropagado de maracuyá (P. edulis), mediante electroforegramas de proteínas totales y esterasa.
Según los resultados se planteó que las esterasas son indicadores indirectos de estabilidad genética más eficiente que las proteínas
De igual manera se han desarrollado trabajos en transformación genética en el género Passiflora con P. mollissima a partir de discos foliares infectados con Agrobacterium tumefaciens (Leal 2002). Forero (1999) evaluó las condiciones para la transformación genética de la curuba de castilla usando Agrobacterium tumefaciens; de igual manera se destacan los trabajos realizados por Hodson &
Góngora 1999 y Cancino 2000, 1994.
A nivel molecular Rodríguez (2001), empleó fragmentos de restricción para evaluar los marcadores moleculares como herramienta en estudios de taxonomía y filogenia en Passiflora, donde se evaluaron las relaciones existentes entre 12 especies de Passiflora a partir de los patrones generados por la combinación de sondas provenientes de distintos genomas y cuatro enzimas. Al realizar el análisis las especies trabajadas se agrupan en cuatro subgéneros: Passiflora, Tacsonia, Decaloba y Dysosmia, lo cual coincide con la taxonomía tradicional; de igual manera se encontró que la mayor diversidad se encuentra en el subgénero Passiflora.
Por otra parte Varón (2000) desarrolló el estudio de detección de polimorfismo en regiones amplificadas de cpDNA, mtDNA y rDNA de Passiflora utilizando enzimas de restricción con 11 especies del género; encontrando bandas polimórficas en los tres genomas, siendo las regiones de DNA de cloroplasto las que ofrecen un mayor porcentaje de polimorfismo, al contrario de las regiones de DNA mitocondriales que son las menos polimórficas. Al realizar el análisis de agrupamiento; con el genoma de cloroplastos evidenció mejor las relaciones taxonómicas en el género Passiflora (Varón 2000).
Vargas (2000) estudió las relaciones filogenéticas de especies del genero Passiflora haciendo énfasis en el subgénero Tacsonia a partir de RFLP, utilizando dos genomas (cpDNA y mtDNA). De acuerdo con los resultados el árbol resultante de
RFLP cpDNA fue el más concordante de acuerdo con estudios realizados anteriormente con base en caracteres morfológicos.
Otros trabajos moleculares que se destacan son los realizados por el programa nacional de recursos genéticos de CORPOICA (Fajardo et al. 1998; Sánchez et al.
1999). En 1998 Fajardo et al desarrollaron el análisis de variación genética del género Passiflora L. utilizando marcadores RADP, donde se evaluaron catorce (14) especies con 50 “primers” aleatorios, dando como resultado 626 bandas polimórficas; al realizar el análisis se observó que P. ligularis y P. adenopoda muestran una amplia variación intraespecifica, contrario a lo que se observa con P.
edulis y P. maliformis (Fajardo et al. 1998).
A nivel filogenético se han realizado estudios en el género Passiflora (Muschner et al. 2003), donde se analizaron 61 especies del género Passiflora, que generalmente se encuentran clasificadas en 11 subgéneros. Este estudio se realizó usando dos segmentos de DNA no codificantes (ITS and the plastid trnL-trnF), se utilizaron estas secuencias debido a su alta tasa de sustitución de nucleótidos (Muschner et al. 2003).
Crochemore et al (2003) evaluaron la diversidad genética en Passion fruit (Passiflora spp.) mediante marcadores moleculares RAPD. Para lo cual utilizo 11 especies de este género; se encontró que utilizando solo cinco “primers” se producían 136 bandas polimórficas; permitiendo de esta manera evidenciar un alto nivel de disimilaridad entre la especies evaluadas dando como resultado tres grandes agrupaciones. Teniendo como base estos mismos marcadores De Andrade et al (2002) evaluaron la variación genética existente entre las especies de Passiflora. Haciendo uso de 21 “primers”, que generaron 270 productos diferentes de amplificación; se obtuvo como resultado que la similaridad entre las especies de Passiflora es del 17,3%, mientras que el valor de similaridad entre P. edulis Sims y P.endulis Sims f. flavicarpia fue de 34.35%.
Segura et al (2002) realizaron el estudio de diversidad del genero Passiflora en el sub genero Tacsonia utilizando AFLP, haciendo uso de dos combinaciones de primers que generaron de 34 a 80 fragmentos por genotipo para un total de 260 fragmentos, las bandas observadas contribuyeron a revelar el polimorfismo global dentro del género evidenciándose de esta manera la gran diversidad existente en este. El mayor grado de polimorfismo fue observado en P. mixta de donde el 100%
de las bandas son polimórficas seguida de la cultivariedad P. tripartita var.
Mollissima con 84 %.
En el estudio realizado por Sanchez et al (1999), se obtuvo como resultado un alto nivel de polimorfismo intraespecífico en P. ligularis, P. maliformis y P. edulis dando bases para el mejoramiento genético de estas especies. Por otra parte el subgénero Tacsonia, presenta rangos de similaridad más estrechos, insinuando un importante flujo de genes por hibridizaciones interespecíficas, con importantes implicaciones para la taxonomía actual.
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3.1 Problema y justificación
La granadilla, Passiflora ligularis es una fruta originaria de América Tropical que se cultiva desde el norte de Argentina hasta México, en zonas cuya temperatura varía entre los 14°C y 22°C. Esta fruta presenta características importantes que la hacen llamativa para el consumo y su comercio, tales como el alto contenido de calorías, y alto contenido de calcio, fósforo y vitamina C. La principal forma de consumo de estos frutos es en fresco, puesto que su procesamiento es difícil por la fragilidad de sus semillas, que no son fáciles de retirar del arilo o pulpa. La granadilla en el comercio internacional ha ganado importancia gracias a las campañas de consumo de productos exóticos que vienen realizando los países productores de la fruta a escala mundial, entre los que se encuentran Colombia, Ecuador y Venezuela (CCI 2003).
Tradicionalmente, los principales departamentos productores de granadilla en Colombia han sido Valle del Cauca y Antioquia, que en 1998 produjeron aproximadamente el 88% del total de la producción colombiana. Sin embargo, para 1999 esta participación se redujo a 68%, por la disminución del área sembrada en Antioquia, donde el cultivo prácticamente desapareció, al pasar de 757 ha en 1998 a 30 ha en 1999 (MADR 2004).
Actualmente la producción de granadilla en Colombia se concentra en los departamentos de Huila, Risaralda, Valle del Cauca, Cundinamarca, Tolima y Boyacá (MADR 2006), siendo Huila el que tiene la proporción más alta de producción (44%), seguido de los departamentos de Risaralda (16%) y Valle del Cauca (14%). En el departamento de Antioquia la producción se ha reducido a un 0.8% (MADR 2006).
La granadilla además de presentar un mercado interno activo, se exporta a diferentes países, con beneficios arancelarios que la ponen en una situación ventajosa frente a otros productos. A pesar de las ventajas socio-económicas del cultivo, como la generación de empleos y la alta tasa de retorno, hasta el momento no existen investigaciones que permitan el desarrollo de un paquete tecnológico para el fomento de esta especie.
La reducción del área sembrada en granadilla por localidad, la pérdida de diversidad del cultivo por problemas fitosanitarios y la consecuente disminución de la producción para competir en el mercado nacional e internacional, exige una serie de investigaciones dentro de las cuales se debe identificar el nivel de diversidad genética de la granadilla en las zonas donde se concentra su producción.
Las técnicas de biología molecular y en particular el uso de marcadores moleculares, han permitido conocer y caracterizar el contenido genético de los organismos, así como estimar la diversidad y las relaciones entre los grupos de interés (Phillips-Mora 1995). Uno de los usos más generalizados de los marcadores moleculares en los programas de mejoramiento genético es la identificación y la selección de individuos (O´Malley et al. 1996), esto hace la selección más confiable y precisa.
Para llevar a cabo la caracterización molecular de cualquier especie se requiere de la estandarización de protocolos de extracción DNA y amplificación como un paso esencial para el análisis posterior de las muestras. Este trabajo tiene como finalidad estandarizar estos protocolos para la caracterizaron molecular de los materiales cultivados de granadilla provenientes del eje cafetero Colombiano.
4. PREGUNTA DE INVESTIGACION
¿Existe diferencia en la diversidad genética de materiales cultivados de Passiflora ligularis provenientes del eje cafetero Colombiano?
4.1 HIPÓTESIS
No hay una diferencia genética entre los materiales cultivados de Passiflora ligularis provenientes del eje cafetero Colombiano
5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo General
Caracterizar molecularmente los materiales cultivados de Passiflora ligularis provenientes del eje cafetero Colombiano
5.2 Objetivos Específicos
Definir un protocolo de extracción de DNA, para evaluación con marcadores moleculares, de granadilla (Passiflora ligularis) provenientes del eje cafetero
Definir las mejores condiciones para la amplificación de DNA de materiales cultivados de Passiflora ligularis con marcadores moleculares RAPD y AFLP
6. MATERIALES Y METODOS
Este trabajo es la etapa preliminar del estudio sobre diversidad genética de granadilla (Passiflora ligularis), que hace parte del proyecto “Valoración de Bienes y Servicios Ambientales de la Biodiversidad para el Desarrollo Sostenible de Paisajes Rurales Colombianos, Complejo Eco regional Andes del Norte (CEAN)” desarrollado en el laboratorio de biología molecular de la Unidad de Biotecnología Vegetal de la Pontificia Universidad Javeriana, el cual tiene como fin establecer los protocolos para extracción de DNA y amplificación mediante marcadores moleculares RADP y AFLP. Este estudio fue desarrollado en cuatro etapas que se muestran en la (figura 3).
M E T O D O L O G I A
FASE DE
CAMPO FASE DE LABORATORIO
Selección De
Fincas Muestreadas
Definición Protocolo de Extracción
de DNA Marcadores
RAPD Marcadores
AFLP
Selección De Individuos
Dellaporta Dellaporta I Mc Couch I Mc Couch Dellaporta II Doyle & Doyle
Digestión
PCR con Diferentes
“Primers”
Toma y Conservación De La Muestra
Evaluación de la Calidad y Cantidad
de DNA en Gel de Agarosa al 0.8%
Ligación
Preamplificación
Recolección De Datos Geográficos y observaciones
Fenotípicas del material
Cuantificación de DNA por espectrofotometría
Amplificación Selectiva
Evaluación de Amplificación
en Gel de Agarosa al
1.5%
Comprobación de Amplificación
en Gel de Acrilamida al
6%
Figura 3. Diagrama de Síntesis de la metodología
