Villa de Álvarez, Col., junio de 2013
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES VIRALES EN
CAÑA DE AZÚCAR
Nombre del Residente
Karen Itzel Orantes Saavedra
Nombre del Asesor
Dr. Francisco Javier Delgado Virgen
Nombre de la Carrera
Ingeniería Bioquímica
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Contenido
Justificación ... 3
VIRUS DEL MOSAICO ... 6
SÍNDROME DE LA HOJA AMARILLA ... 7
Objetivos ... 9
General: ... 9
Específicos: ... 9
Problemas a resolver ... 10
1. Lograr la extracción de ARN con buena calidad. ... 10
2. Lograr la extracción de ARN sin degradaciones. ... 10
3. Optimizar las condiciones para obtener una mejor resolución en la electroforesis. ... 11
4. Obtener buena calidad de cDNA. ... 11
Actividades realizadas ... 12
1. Colecta y procesamiento de tejido foliar con síntomas virales. ... 12
Fundamento teórico: ... 12
Metodología: ... 12
2. Extracciones de RNA. ... 13
Fundamento teórico: ... 13
Principios básicos de la extracción de ácidos nucleicos ... 14
Purificación de los ácidos nucleicos ... 15
Concentración de los ácidos nucleicos ... 20
Metodología: ... 20
3. Cuantificación de ácidos nucleicos. ... 22
Fundamento teórico: ... 22
Metodología: ... 23
4. Reacciones de transcripción inversa (RT). ... 24
2
Metodología: ... 25
5. Reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) de los cDNA obtenidos del tejido enfermo. ... 26
Fundamento teórico: ... 26
Desnaturalización ... 26
Alineación ... 27
Extensión ... 27
Factores importantes a considerar ... 28
Metodología: ... 29
6. Electroforesis en gel de agarosa. ... 30
Fundamento teórico: ... 30
Metodología: ... 33
Resultados ... 34
1. Colecta y procesamiento del tejido foliar... 34
2. Extracción y cuantificación de RNA. ... 35
3. Electroforesis en gel de agarosa para los ARN. ... 36
4. Electroforesis en gel de agarosa para los controles positivos de los virus. ... 37
5. Resultados positivos de la RT – PCR a los virus. ... 39
Muestras positivas a SCMV ... 39
Muestras positivas a SCYLV ... 40
Conclusiones ... 41
Competencias desarrolladas ... 43
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Justificación
La caña de azúcar (Saccharum spp. Ver Fig. 1) es un cultivo ampliamente distribuido en el mundo. Actualmente se produce en más de 130 países y la superficie cosechada se distribuye en 7,638 millones de hectáreas en Asia, 3,519 millones en América del Sur, 2,300 millones en Centroamérica, 1,060 millones en África, 0.489 millones en Oceanía y 0.393 millones en América del Norte (Aguilar, 2011). Los principales productores son Brasil (30%), India (21%), China (7%), Tailandia (4%), Pakistán (4%), México (3.5%), Colombia (3%), Australia (3%), Estados Unidos (2%) e Indonesia (2%). La producción mundial de este cultivo asciende a 1,558 millones de toneladas (Aguilar, Arturo, Castillo, & Herrera, 2012).
En México, la agroindustria azucarera se encuentra muy arraigada a procesos culturales, sociales y políticos, y se encuentra distribuida en siete regiones y 15 estados: Región Centro, Córdoba Golfo, Noreste, Noroeste, Pacífico, Papaloapan Golfo y Sureste además de 227 municipios que aportan materia prima a 55 ingenios azucareros (Ver Fig. 2). Esta agroindustria tiene un gran impacto socioeconómico en 12 millones de personas al generar 400 mil empleos directos, distribuidos en 165 mil productores de caña, 176 mil trabajadores de campo, 28 mil transportistas, 23
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Fig. 2 Estimación de la superficie sembrada con caña de azúcar, correspondiente a la zafra 2013-2014, mediante la interpretación de imágenes satelitales y supervisión directa de predios.
mil obreros sindicalizados, 16 mil en labores administrativas, entre otros. El valor de esta agroindustria en las últimas zafras hasta el año 2013, es de 33 mil millones de pesos que representan el 0.5% del PIB nacional, 2.5% del PIB manufacturero, 11.6% del sector primario y 12% del sector alimentario. El principal derivado, el azúcar o sacarosa (tipo mascabado, estándar, blanco popular y refinado) tiene un consumo nacional promedio de 5.6 millones de toneladas (aproximadamente 47 kg consumo per cápita por año). Asimismo, la sacarosa aporta 17% de las calorías diarias de la población mexicana (CNIAA, 2011). Sin embargo, la agroindustria mexicana del azúcar ha afrontado varias crisis económicas, originadas por desajustes entre la producción de caña y sacarosa; el consumo nacional, las limitadas exportaciones y la importación, principalmente debido a que la rama azucarera del país se desarrolló orientada hacia el mercado interno y aunque han surgido diversas empresas a partir de subproductos del proceso del azúcar (ingenios sucro - alcoholeros y biorefinerías) y se ha discutido ampliamente por los industriales, académicos e investigadores como alternativas lógicas y económicamente ventajosas para incrementar la competitividad y la sostenibilidad del sector, su implementación ha sido limitado ya que las regiones cañeras continúan en la inercia productiva de caña y azúcar (Aguilar, 2013).
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desfavorables de clima, suelo y manejo. Es la planta cultivada más productiva en el mundo dada su mayor eficiencia para sintetizar carbohidratos en comparación con cualquier otro cultivo y su habilidad para almacenar sacarosa en su tallo, contribuyendo al 75% del total de azúcar que se produce en el mundo pues el 25% restante es producido por la remolacha azucarera (Beta vulgaris L.). Estas características además de su alta capacidad para producir biomasa y su fácil cultivo la hacen una de las materias primas agrícolas más interesantes globalmente y no sólo útil en la industria alimentaria sino también en la bioenergía e industria química, entre otras. La producción de caña de azúcar genera dividendos cercanos a los 34 mil millones de pesos y tienen un efecto positivo en las regiones donde se produce, causando un menor índice de marginación principalmente a nivel municipal, es decir, disminuyendo los rezagos en materia de ingreso, acceso a la educación, vivienda apropiada y otros servicios básicos según la Secretaría de Economía (Sentíes, 2013).
Como la mayoría de los cultivos, el método más eficiente y económico de mitigar los efectos nocivos de enfermedades sobre la producción, es mediante la búsqueda de variedades tolerantes o resistentes a los patógenos. En México, se han reportado 55 enfermedades, 22 de origen parasitario y 33 de origen no parasitario (bacterianas, virales y fúngicas) (Chinea & Milanés, 2006). Entre las enfermedades de mayor importancia destacan: Roya, carbón, mosaico, escaldadura y síndrome de hoja amarilla (Sentíes, 2013). Además de la resistencia genética, el uso de semilla libre de patógenos se ha implementado para evitar la propagación de las mismas. Los tratamientos térmicos y de cultivo de tejido son métodos de desinfección que garantizan el estado fitosanitario de la caña como semilla (Morán, Milanés, Rodríguez, & Aguilar, 2006). Además el control de la vegetación no deseada o malezas es una práctica esencial en las etapas iniciales de desarrollo pues existen diversas especies portadoras de los virus y si no son controladas oportunamente, pueden ocasionar pérdidas en la productividad del cultivo del 10 – 84% (Cruz, 2009).
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(Quintero, 2012) por lo que es necesario revertir esta tendencia y diseñar estrategias eficientes y fuentes de financiamiento que permitan aprovechar el potencial de este cultivo.
VIRUS DEL MOSAICO
(Rott, Bailey, Comstock, Croft, & Salem, 2000)
Causa: Sugarcane mosaic virus (SCMV) y Sorghum mosaic virus (SrMV), género
Potyvirus, familia Potyviridae.
Síntomas: El síntoma general del mosaico es un patrón de tonos contrastantes de verde resultado de la variación de la concentración en los niveles de clorofila en el filo de la hoja (Ver Fig. 3). En muchos cultivares de acuerdo a la cepa pueden resultar en áreas cloróticas definidas acompañadas de enrojecimiento o necrosis. Una coloración café rojiza se asocia con ciertos cultivares y combinaciones de cepas del virus.
Diagnóstico: La visualización es el método primario, el tiempo después de la transmisión por áfido o inoculación mecánica hasta que los síntomas son expresados varían de acuerdo a la edad y cultivar, condiciones de crecimiento y cepa del virus. Las protocolos de ELISA o RT – PCR son raramente aplicados para diagnóstico de rutina del mosaico ya que pruebas inmunológicas o basadas en el ADN permiten confirmar que el germoplasma o caña a usar para la propagación mediante semilla está libre del mosaico.
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Importancia económica: Las pérdidas de cultivos por el mosaico varía enormemente dependiendo del cultivar y cepa del virus. Los cultivares susceptibles a infección pueden ser o no tolerantes, el mosaico ha causado pérdidas de cultivo con rangos del 7 al 21% en un ciclo mayor a 3 años y en combinación con otras enfermedades frecuentemente reduce el crecimiento y el cultivo más que por sí sola. Quizás las pérdidas más grandes causadas por mosaico ha sido la pérdida del germoplasma comenzando por cañas nobles en los primeros años del siglo XX seguido por la aparición de nuevas cepas.
SÍNDROME DE LA HOJA AMARILLA
(Rott, Bailey, Comstock, Croft, & Salem, 2000) Causa: Sugarcane Yellow Leaf Luteovirus (ScYLV).
Síntomas: En general el notable amarillamiento de la nervadura de la hoja pues los otros asociados son variables y dependientes del cultivar y condiciones ambientales; acortamiento de los internodos terminales, acumulación de sucrosa en la nervadura, decoloración de la nervadura mientras que la hoja permanece verde (Ver Fig. 4).
Fig. 4 Síntomas visuales en tejido foliar de Saccharum officinarum presuntivamente causadas
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Diagnóstico: Dado que ópticamente la identificación no es confiable, debido a la diversidad de enfermedades que pueden causar síntomas visuales similares, se ha empleado DAS – ELISA y el DIBA empleando anticuerpos contra cepas aisladas de Brasil, Florida y Hawái así como la RT – PCR.
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Objetivos
General:
Detectar mediante RT-PCR la presencia de virus de importancia económica que afectan el cultivo de la caña de azúcar en el municipio de Tecomán.
Específicos:
Extracción de RNA de X plantas, empleando Tiocianato de Guanidina (TRIPURE isolation reagent de Roche).
Estandarización de las metodologías de RT y PCR de acuerdo a las necesidades para realizarlas por separado.
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Problemas a resolver
1.
Lograr la extracción de ARN con buena calidad.
El proceso de familiarización con el proceso de extracción es ineludible ya que cada etapa es importante para obtener material libre de contaminantes.
2.
Lograr la extracción de ARN sin degradaciones.
Dado que la molécula de ARN es muy susceptible a la degradación por su alta inestabilidad, se debe asegurar la nula presencia de ribonucleasas durante el proceso de extracción por lo que todo el material empleado para la extracción debe ser tratado para eliminar la actividad RNasa residual.
Al comienzo del procesamiento de muestras, el tejido foliar debe ser fragmentado para facilitar su homogenización con el nitrógeno por lo que debe ser inmediatamente sumergido en agua tratada con DEPC para evitar la degradación del ARN durante la fragmentación, así como asegurarse de no permitir el calentamiento de la muestra mientras se trata con nitrógeno por lo que una vez colocado el tejido molido en los viales, éstos deben mantenerse sumergidos en nitrógeno líquido hasta el comienzo de la extracción.
Durante el proceso, es imprescindible el uso de soluciones tratadas con DEPC para que inhiba cualquier rastro de RNasas.
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3.
Optimizar las condiciones para obtener una mejor
resolución en la electroforesis.
Estandarización del voltaje y tiempo adecuado para el proceso, teniendo en cuenta protocolos realizados previamente y las modificaciones realizadas durante la práctica, así como el tipo de molécula que se espera separar.
4.
Obtener buena calidad de cDNA.
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Actividades realizadas
1.
Colecta y procesamiento de tejido foliar con síntomas
virales.
Muestreo en dos cultivos del municipio de Tecomán, recolectando material foliar con síntomas virales.
Fundamento teórico:
El tejido foliar se recolecta preferentemente a partir de la identificación visual de síntomas de los virus, sin embargo no se puede confiar en ello, ya que los síntomas son similares a otras enfermedades de origen bacteriano.
Las muestras colectadas deben ser las hojas íntegras, enrolladas y no dobladas para disminuir el riesgo de degradación por la actividad de las endonucleasas que se activan inmediatamente cuando el tejido sufre lesiones.
Para el transporte se deben mantener en un recipiente térmico con hielo y/o bolsas de gel para mantener la temperatura baja.
El tejido debe ser lavado con detergente para eliminar impurezas superficiales y partículas extrañas. Y si no será usado, el almacenamiento es a -70°C para asegurar la detención máxima de la actividad enzimática.
Metodología:
Búsqueda visual de síntomas en tejido foliar de las plantas.
Corte de la hoja completa y enrollamiento para evitar lesiones por doblamiento.
Almacenamiento en bolsas de plástico colocadas dentro de un recipiente térmico con hielo para su transporte.
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2.
Extracciones de RNA.
Extracciones de RNA a partir de tejido foliar de caña de azúcar ().
Fundamento teórico:
Los ácidos nucleicos (DNA y RNA) son polímeros de nucleótidos formados por pentosas (desoxirribosa en DNA y ribosa en RNA), una base nitrogenada y una molécula de fosfato (Fig. 5). El DNA contiene el código genético de las células procariotas, eucariotas y adenovirus, mientras que el RNA es responsable de la síntesis de proteínas y constituye el material genético de los retrovirus (Madigan, Martinkom, & Parker, 2000).
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Principios básicos de la extracción de ácidos nucleicos
Los principios básicos de su manipulación mediante purificación y concentración son comúnmente empleados en los laboratorios por lo que la remoción de moléculas contaminantes (e.g.; proteínas, carbohidratos y lípidos) es requerido previamente a su manipulación enzimática o en distintos análisis de las mismas (Dowhan, 2008).
Los ácidos nucleicos empleados rutinariamente en la experimentación son primeramente aislados del tejido vegetal, células animales, microorganismos o virus. Las membranas celulares deben romperse para liberar el contenido obteniéndose un lisado celular crudo. Esto se realiza empleando detergentes iónicos y/o tratamientos con proteasas (generalmente, la metodología es específica para cada tipo de muestra), para células bacterianas se emplean lisis alcalinas que requieren de dodecil sulfato de sodio (SDS) (Birnboim & Doly, 1979) o tratamiento con lisozima, Tritón (detergente no iónico) y calor (Holmes & Quingley, 1981). Para órganos y tejido vegetal, deben congelarse previamente con N2 líquido y macerados
hasta obtener un polvo fino favoreciendo la lisis celular.
El DNA es una molécula estable y manejable, al contrario del RNA que experimenta hidrólisis alcalina y la presencia de ribonucleasas (RNasas) lo degradan rápidamente. Por lo que se requieren métodos muy particulares para su aislamiento; todas las soluciones que se emplean deben ser tratadas con dietilpirocarbonato (DEPC) que inactiva las RNasas mediante modificaciones covalentes, así como el químico Tiocianato de Guanidina es un poderoso desnaturalizante de proteínas e inhibidor de la actividad de las ribonucleasas por lo que también se usa en estos procedimientos de extracción de RNA (Dowhan, 2008).
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que su porcentaje de composición es mayor (Bermúdez G., Barbosa V., Valadez R., Ríos V., & Guzmán, 2013).
Purificación de los ácidos nucleicos
Frecuentemente es necesario purificar las soluciones de A. N. antes de emplearlos en análisis posteriores ya que el método usual para desproteinizar los ácidos son las extracciones con fenol que desnaturaliza proteínas y probablemente las disuelve (Kirby, 1957).
El propósito del fenol es disociar los A.N. de las proteínas en combinación con soluciones salinas, esta capacidad se debe a la propiedad que tiene de desnaturalizar proteínas y lípidos pero no a los A. N., por sí mismo es hidrofóbico por lo que es capaz de solvatar o formar interacciones con los interiores hidrofóbicos de las proteínas y con las cadenas largas de hidrocarburos en los lípidos. Dado que el DNA es hidrófilo (por su esqueleto azúcar – fosfato) se acumula en la fase acuosa que no es soluble en fenol (Dowhan, 2008).
El cloroformo también es usado para la desnaturalización y estabiliza el límite entre una fase acuosa y una fase pura de fenol. La mezcla fenol/cloroformo es más eficiente al desnaturalizar las proteínas que con cualquier de los dos reactivos por sí mismos ya que la combinación reduce el particionamiento de los mARN poliadelinados hacia la fase orgánica y reduce la formación de complejos RNA – proteínas en la interfase (Perry, La Torre, Kelley, & Greenberg, 1972) además, el fenol retiene alrededor del 10-15% de la fase acuosa lo que resulta en una pérdida similar de RNA mientras que el cloroformo previene esta retención y así mejora el rendimiento de RNA (Palmiter, 1974).
Esto se debe a que el fenol puro tiene una densidad de 1.07 g/cm3 por lo
tanto forma una fase al fondo cuando está mezclado con agua, el cloroformo asegura la separación de fases entre los dos líquidos porque es miscible con el fenol y su densidad es mayor (1.47 g/cm3); así fuerza una separación nítida de la fase
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En general, un soluto se disuelve mejor en un solvente que sea muy similar en estructura química a sí mismo, generalmente la capacidad de solvatación de un solvente depende primeramente en su polaridad (McMurry, 2003), dado que los ácidos nucleicos son polares por su esqueleto fosfatado cargado negativamente, por lo tanto estarán disueltos en la fase acuosa. A la inversa, las proteínas contienen proporciones variadas de dominios cargados y no cargados, produciendo regiones hidrofóbicas e hidrofílicas. En la presencia de fenol, los núcleos hidrofóbicos interactúan con él, causando la precipitación de proteínas y polímeros incluyendo carbohidratos) para recoger en la interfase (usualmente de color blancuzco) o en el caso de los lípidos en la fase orgánica inferior (Avison, 2007).
El pH del fenol determina el particionamiento de DNA o RNA entre la fase orgánica y acuosa (Ver Fig. 7). En pH neutral o ligeramente alcalino, los diésteres fosfato en los ácidos nucleicos están cargados negativamente por lo que DNA y RNA se desplazarán hacia la fase acuosa. El DNA es removido de la capa acuosa incrementando su eficiencia al ritmo en que el pH disminuye con un punto máximo a 4.8. En éste pH, la mayoría de proteínas y pequeños fragmentos de DNA (<10 kb) se fraccionan hacia la fase orgánica mientras que los fragmentos más pesados y algunas proteínas se mantienen en la interfase formada entre la acuosa y la orgánica. El fenol acidificado retiene el RNA en la fase acuosa y mantiene el DNA en él porque los grupos fosfato en el DNA son neutralizados más fáciles que los del RNA (i. e., el DNA es menos ácido y tiene un mayor pKa que el RNA). Un pH ácido también minimiza la actividad de las RNasas (Zumbo, 2016).
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La inestabilidad del ARN se debe a que la pentosa en su estructura contiene dos grupos hidroxilo unidos al anillo, mientras que el ADN sólo tiene uno. Este grupo adicional lo hace más propenso a la hidrólisis por nucleasas; ribonucleasas, las cuáles son capaces de romper los enlaces fosfodiéster, que covalentemente vinculan las subunidades de nucleótidos del ARN, específicamente a los vinculados a las bases de pirimidina como el uracilo. Las ribonucleasas no hidrolizan el ADN porque éste carece del segundo grupo hidroxilo que es esencial para la formación de intermediarios cíclicos requeridos para el proceso de escisión (Dowhan, 2008).
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Fig. 8 Modificación con DEPC. El DEPC modifica covalentemente a los aminoácidos, aquí se muestra como una histidina desprotonada reacciona con el dietilpirocarbonato.
El principal problema que se presenta en el proceso de purificación del RNA es la contaminación por las RNasas, éstas son muy estables y por lo general no requieren de cofactores para funcionar. Por ello, una pequeña cantidad de RNasa degrada cualquier muestra. Para sobrellevar este problema, cualquier solución empleada en la extracción de ARN debe ser tratada con dietilpirocarbonato (DEPC); este químico inactiva las RNasas por modificación covalente (Ver Fig. 8). Las soluciones que contienen Tris no pueden ser tratadas eficazmente con DEPC porque el Tris reacciona con DEPC interfiriendo la inactivación de las enzimas (Bermúdez, G. M.J. y otros, 2013).
El reactivo Tiocianato de Guanidina es uno de los más eficaces desnaturalizantes de proteínas usado en la extracción de ARN, originalmente su uso se desarrolló para lisar las células y permitir la purificación de RNA a partir de células con altos niveles de ribonucleasas endógenas (Cox, 1968; Chirgwin, Przbyla, MacDonald, & Rutter, 1979).
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permanecer soluble en agua en una solución que contiene tiocianato de Guanidina y presencia de una fase fenol/cloroformo (Bermúdez, G. M.J. y otros, 2013).
Desde su introducción, el método de un solo paso (Chomczynski & Sacchi, 1987) se ha convertido en el más utilizado para el aislamiento de ARN a partir de un gran número de muestras. Además el procedimiento permite la recuperación de ARN total de pequeñas cantidades de tejido o células, por lo que es adecuado para estudios de expresión génica cada vez que la cantidad de tejido o células disponibles es limitada.
Existen diversos kits comerciales para el aislamiento de ARN total que emplean la Guanidina, la mayoría basados en el método de un paso, entre los cuales hay un grupo que se basa en la combinación de la solución desnaturalizante, fenol, y el tampón en una única solución monofásica. Estos kits ofrecen rendimientos mejorados y en menor tiempo, destacando: Isogen (Nippon Gene), RNA-Stat 60 (Tel-Text), Tri-Pure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim), TRIzol Reagent (Invitrogen), TriPure Isolation Reagent (Roche), RNAzol B (Cinna Scientific), TRI Reagent (Molecular Research Center) and TRI Reagent (Sigma), casi todos exceptuando RNAzol B permiten el aislamiento simultáneo de DNA y proteínas a partir de una muestra utilizada para el aislamiento de ARN (Bermúdez, G. M.J. y otros, 2013).
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Concentración de los ácidos nucleicos
En la precipitación de los ácidos nucleicos, el etanol y el isopropanol son usados para concentrar las soluciones tanto de DNA como RNA y además para la eliminación de residuos de fenol y cloroformo de la solución acuosa desproteinizada sin embargo, el segundo es menos volátil y tarda más en ser eliminado por evaporación, se debe mencionar que algunas sales son menos solubles en éste a comparación del etanol, por lo que pueden requerirse varios lavados adicionales para eliminarlas (Dowhan, 2008).
En presencia de concentraciones elevadas de cationes monovalentes (0.1 a 0.5 M), el etanol induce una transición estructural en las moléculas de los ácidos nucleicos, lo que ocasiona que éstas se agreguen y precipiten en la solución (Eickbush & Moudrianakis, 1978). Dado que la mayoría de sales y pequeñas moléculas orgánicas son solubles en etanol 70% (v/v), el lavado del pellet en la solución eliminará eficientemente las sales. Comúnmente se emplea cloruro de sodio, acetato de sodio o amonio y cloruro de litio para propiciar la precipitación pero es más difícil de eliminar el NaCl debido a su menor solubilidad en etanol. Por otra parte el LiCl se emplea principalmente para la precipitación de RNA pues tiene la ventaja de ser incapaz de precipitar carbohidratos, proteínas o DNA (Barlow, Mathias, Williamson, & Gammack, 1963)
Metodología:
Moler el tejido vegetal con N2 líquido en morteros estériles y congelados
previamente a -70°C, almacenando alrededor de 50 – 100 mg en un vial estéril de 2 mL. Guardar en N2 hasta su uso para evitar la oxidación.
Agregar 1 mL de TRIPURE Isolation Reagent al vial. Homogeneizar la muestra e incubar 5 min a temperatura ambiente (en un rango de 15-25°C).
Centrifugar a 12,000 rcf durante 10 min a 4°C.
Rescatar sobrenadante y pasarlo a un vial estéril de 1.5 mL.
Agregar 200 uL de cloroformo y agitar vigorosamente por 15 s.
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Centrifugar a 12,000 rcf durante 15 min a 4°C.
Transferir sobrenadante a un vial nuevo.
Precipitar con 500 uL de isopropanol frío, mezclando por inversión.
Incubar 10 min a temperatura ambiente.
Centrifugar a 12,000 rcf durante 10 min a 4°C. Decantar sobrenadante.
Lavar el pellet con 1 mL de etanol 75% (v/v) preparado en agua tratada con DEPC. Despegar la pastilla con ayuda del vórtex.
Centrifugar a 7,500 rcf durante 5 min a 4°C. Descartar supernadante.
Invertir sobre papel absorbente para facilitar el secado y con ayuda de tiras de papel filtro estéril terminar de absorber la humedad remanente o dejarlos secar a temperatura ambiente durante 10 min.
Resuspender la pastilla con un volumen de 30-40 uL de agua tratada con DEPC.
Incubar 15 min a 60°C.
Almacenar a -70°C.
Fig. 10 Diagrama general para la extracción de ARN a partir de tejido foliar triturado con N2.
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3.
Cuantificación de ácidos nucleicos.
Fundamento teórico:
Un espectrofotómetro de absorbancia es un instrumento que mide la fracción de luz incidente transmitida a través de una solución. Se emplea para medir la cantidad de luz que atraviesa una muestra de material y comparando el resultado con la intensidad inicial de luz, de esta manera indirecta se mide la cantidad de luz absorbida por la muestra. Muchos fueron diseñados para transmitir en ciertos rangos de longitud de onda. Sucede que los materiales absorben de la misma manera pero no en las mismas longitudes de onda y debido a esto, el espectrofotómetro puede usarse para distinguir compuestos. Adicionalmente, la cantidad de luz absorbida es directamente proporcional a la distancia en que la luz viajó a través de la muestra y la concentración de compuestos absorbentes en la misma. Por ello se emplea para cuantificar la concentración de diferentes componentes presentes en una solución
El método más empleado para determinar la concentración de ácidos nucleicos en una solución es mediante la medición de la absorbancia a 260 nm. La absorción de la luz UV de las moléculas del DNA y RNA (en un rango de 240-275 nm), esto se debe a las transiciones de π π* de las bases de pirimidina y purina en los sistemas de los nucleótidos. Las bases pueden protonarse y entonces el espectro de los ácidos nucleicos es sensible al pH. En un pH neutral, el máximo rango de absorción varía de 253 nm (para la guanosina) a 271 nm (para la citidina) y por lo tanto los polímeros de ADN y ARN muestran una amplia y fuerte absorbancia cercana a los 260 nm (Schmid, 2001).
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Fig. 11 De arriba hacia abajo y de izquierda a derecha: Interfaz de inicio al ejecutar el software de Nanodrop 2000 Thermo Scientific; Colocación de la muestra a analizar (1 uL); Acercamiento de la muestra sobre el pedestal de
análisis.
La relación de absorbancia 260/280 se utiliza para evaluar la pureza del DNA y RNA. Una proporción de aproximadamente 1.8 es generalmente aceptable como un DNA puro, mientras que para el RNA la proporción deberá ser de 2.Si la relación es un poco más baja, es indicador de la presencia de proteínas, fenol u otros contaminantes que absorben fuertemente en ese rango de medición (260-280 nm). La relación 260/230 nm es una medida secundaria de la pureza, los valores de ésta proporción para los A. N., son superiores a la relación anterior en un rango de 1.8-2.2. Si estos coeficientes son menores, se indica la presencia de contaminantes en la purificación (Gallagher, 2008).
Metodología:
Encender la computadora y cargar el programa Nanodrop, esperar a visualizar la interfaz.
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Verificar que el tipo de muestra seleccionada en la interfaz sea el tipo de ácido nucleico que se desea analizar.
Colocar 1 uL de la muestra a cuantificar, dar clic en “Measure” y esperar a que la interfaz muestre una ventana para guardar el archivo que se generará para que automáticamente se almacenen el resto de los datos con las muestras que se medirán posteriormente.
Limpiar con un pañuelo desechable.
Repetir procedimiento para el resto de las muestras.
SI se desea exportar el archivo como una tabla de Excel (ya que el archivo guardado previamente es para uso exclusivo con el software de Nanodrop), al finalizar la cuantificación se debe dar clic a la opción “Reports” de lado izquierdo inferior, luego a la opción “Export” y seleccionar la extensión deseada del archivo a generar.
4.
Reacciones de transcripción inversa (RT).
Fundamento teórico:
La transcripción inversa (Reverse transcription: RT) se emplea para sintetizar ADN complementario a partir de ARN, específicamente ADN monocatenario (cDNA), lo cual resulta muy útil en el estudio de los mRNA ara la transcripción de genes, estudio de los retrovirus, fabricación de sondas para hibridación, entre otros. Los cDNA obtenidos pueden amplificarse por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La combinación de la transcripción inversa con la PCR (RT – PCR) permite la detección de bajas cantidades de RNA en una muestra.
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El cDNA generalmente causa mayores problemas en la PCR que otros ADN moldes (plasmídicos o genómico). La mayoría de las veces debido a bajos rendimientos de cDNA durante la transcripción inversa o que contiene cantidades considerables de cebadores, nucleótidos y sales que también se encuentran en las preparaciones de PCR por lo que se debe optimizar la purificación de las muestras previo a su amplificación. Además Sellner & colbs.(1992), demostraron que la transcriptasa inversa tiene un efecto inhibidor sobre la Taq polimerasa.
Metodología:
Tomar 5 uL de ARN total extraído e incubarlo a 70°C durante 10 min. Centrifugar brevemente (30 s) y poner en hielo. El manual del producto recomienda usar 1 ug de RNA, se toman 5 uL ya que la mayor proporción de ARN es de la planta, siendo el viral el de menor presencia.
Preparar el mix según la siguiente tabla en relación al número de muestras:
Reactivo Volumen por reacción # de reacciones
MgCl2, 25 mM 4 uL -
Amortiguador de reacción, 10 X
2 Ul -
Inhibidor recombinante de Rnasa, (RNAsin)
2 Ul -
Transcriptasa inversa AMV (Alta concentración)
0.5 Ul -
Random primers (hexámeros) 0.6 Ul (15 U) -
RNA total 5 Ul -
Agua libre de Rnasas, aforar a: 20 Ul -
Colocar 15 Ul de ésta mezcla a cada uno de los tubos que contiene el ARN para completar el volumen de 20 Ul.
Incubar a temperatura ambiente 10 min (15-25°C).
Incubar la reacción a 42°C durante 15 min.
Calentar la muestra a 95°C durante 5 min e inmediatamente después, incubar 5 min a 0-5°C.
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5.
Reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) de los cDNA
obtenidos del tejido enfermo.
Fundamento teórico:
La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por K. Mullis y colaboradores en 1985 ha revolucionado la biología y medicina molecular (Saiki, y otros, 1985). La PCR es una técnica usada para amplificar enzimáticamente una región específica de ADN que yace entre dos regiones conocidas de la secuencia de ADN. Mientras que anteriormente sólo pequeñas cantidades de un gen específico podría ser obtenido, ahora una sola copia de un gen o secuencia puede amplificarse millones de veces con sólo unas horas empleando la PCR.
La técnica consiste de una etapa de desnaturalización, una de alineamiento y otra de extensión (Ver Fig.12):
o En la desnaturalización del ADN al aumentar la temperatura hasta su punto de fusión para romper los puentes de hidrógeno existentes entre las cadenas de ácidos nucleicos (de estructura secundaria a primaria).
o Alineamiento o hibridación de los oligonucleótidos usados como cebadores para señalizar el blanco a amplificar.
o Y la extensión de la secuencia limitada por los cebadores en la cadena de ADN por medio de la adición de los nucleótidos con la polimerasa en presencia de iones de Mg2+ como catalizador.
Desnaturalización
27
Alineación
La hibridación de las cadenas de ADN se produce a un rango de 55-65°C (según los oligonucleótidos usados), en esta etapa los enlaces de hidrógeno se forman y rompen constantemente entre los cebadores y la cadena molde. Los enlaces más estables duran un poco más (usualmente los primers que encajan perfectamente con el molde) y ése pequeña pieza que se hibridó permite que la polimerasa se adhiera a la hebra y comience la síntesis. En el momento en que unas cuantas bases han sido pegadas, el enlace iónico del híbrido es tan fuerte que no se romperá (Somma & Querci, 2016).
Extensión
Aquí a 72°C, la elongación comenzará ya que es la temperatura óptima de trabajo de la Taq polimerasa. Los cebadores que no fijaron de manera exacta podrían separarse debido a la alta temperatura y no se extendería el fragmento. Las bases complementarias al molde se alinean desde el extremo 3’ (la polimerasa agrega los dNTP’s en el sentido 5’ 3’, leyendo el molde en el sentido inverso). El
28
tiempo de elongación puede aumentar si la región de ADN a amplificar es larga, pero en la mayoría de un programa típico de PCR con 1 minuto es suficiente para lograr la extensión completa.
Normalmente, las condiciones estándar de la PCR requieren de: Una desnaturalización de 5 min a 94°C; 30 ciclos, que consisten de 30 s a 94°C, 30 s a 55°C y 90 s a 72°C y una extensión final de 5 min a 72°C para asegurar que la polimerasa haya terminado por completo su trabajo. Y posteriormente se enfriará la reacción a 4°C para su ulterior manipulación (Mülhart & Beese, 2007).
Factores importantes a considerar
La concentración de ADN molde, normalmente en la práctica se ocupan al menos 10,000 moléculas para obtener el fragmento deseado, pero resulta complicada la determinación de esa cantidad a partir de una concentración dada. En la mayoría de los casos estas cantidades pueden reducirse sustancialmente y además no debe usarse cantidades muy grandes ya que puede incrementar los errores de alineamiento y que la reacción se pueda saturar demasiado pronto afectando la calidad del producto (Mülhart & Beese, 2007).
La elección de amortiguador, el pH óptimo para la Taq polimerasa es a más de 8 y el que ha tenido más éxito es el Tris HCl (hidroximetil aminometano clorado.
Las sales a usar, KCl hasta 50 mM o (NH4)2SO4 hasta 20 mM; el rendimiento
aumenta gradualmente con el uso de KCl en un rango de 10-50 mM y decae a concentraciones superiores. No se usa NaCl pues inhibe la amplificación (Mülhart & Beese, 2007).
La concentración de MgCl2 influye en; la hibridación, la separación de las
hebras durante la desnaturalización, especificidad del producto, formación de dímeros entre los cebadores y tasa de errores. Pero es necesaria para la polimerasa así que debe determinarse una concentración óptima para cada reacción (usualmente entre 0.5 – 2.5 mM). Siendo usado 2 mM en la mayoría de casos (Bermúdez, G. M.J. y otros, 2012).
29
menos 200 uM de cada nucleótido es requerido y es adecuada para sintetizar 13 ug de ADN a partir de una preparación de 50 uL) (Mülhart & Beese, 2007).
En cuanto a los oligonucleótidos, estos afectan el rendimiento. Se requieren aproximadamente 10 pmol de cebador para una reacción de 50 uL; 1 pmol de cebador es suficiente para sintetizar 6.6 ug de un fragmento de 1 Kpb (Mülhart & Beese, 2007).
Finalmente, el uso de la Taq DNA polimerasa aislada de Thermus aquaticus (una cepa bacteriana termoestable que crece en manantiales de agua caliente a 70°C. Su actividad óptima está a 74°C y a un pH por encima de 8. Tiene actividad polimerasa de 5’ 3’ y también actividad exonucleasa 5’ 3’ pero no en el sentido contrario. Su tasa de síntesis es de 2,800 nucleótidos por minuto y aunque existen polimerasas termoestables más eficientes con características ventajosas adicionalmente, se ha demostrado que sus tasas de síntesis son equivalentes a la
Taq por lo que sigue siendo popular (Cline, Braman, & Hogrefe, 1996).
Metodología:
Descongelar reactivos y hacer cálculos de acuerdo al número de muestras a amplificar.
Realizar la master mix de reactivos en un vial de 1.5 mL estéril de acuerdo a la siguiente tabla:
Reactante Conc. Final Conc. Inicial 1
Reacción (uL) # de Reacciones Amortiguador de reacción
1X 10 X 2.5
MgCl2 1.5 mM 50 mM 0.75
dNTP’s 100 uM 250 uM 10
Primer F 0.5 uM 25 uM 0.5
Primer R 0.5 uM 25 uM 0.5
Taq DNA Polimerasa
1.5 U 5 U/uL 0.3
DNA total 100 ng 20 ng/uL 5
H2Od - - 5.2
30
Distribuir 20 uL de esta mezcla en cada uno de los tubos de PCR previamente etiquetados y colocar 5 uL de DNA a 20 ng/uL.
Colocar los tubos en el termociclador y programar los ciclos adecuados para el ADN blanco que se desea amplificar.
Condiciones:
Ciclos Temperatura (°C) Tiempo
1 50
95
30 min 2 min
30 94
54 72
30 s 30 s 1 min
Analizar los productos amplificados por electroforesis en gel de agarosa al 1% /p/v) en amortiguador TAE 1X.
6.
Electroforesis en gel de agarosa.
Fundamento teórico:
La electroforesis es el proceso de migración de moléculas cargadas a través de soluciones sometidas a un campo eléctrico. En la mayoría de las aplicaciones prácticas en biología molecular y bioquímica emplean una electroforesis enfocada en zonas en las que la solución iónica es corrida en un soporte sólido y las muestras aplicadas como puntos o bandas. Entre los ejemplos se encuentra la electroforesis de papel, en celulosa y la de gel.
La movilidad o tasa de migración de una molécula incrementa conjuntamente al voltaje aplicado y la carga neta de la molécula. Inversamente, disminuye por la fricción molecular o resistencia a fluir en el medio debido al tamaño y forma (Biological Chemistry Lab: College of arts & sciences of the University of Kentucky, 2014).
31
tanto para análisis de productos de PCR, ADN plasmídico digerido por enzimas de restricción y para purificar fragmentos generados de ADN por enzimas de restricción y productos de PCR para fines de clonación. La separación de las moléculas es por tamaño; las moléculas pesadas emigran más lento y las pequeñas más rápido por lo que avanzan más en el gel. También es necesario un amortiguador con pH de 8-8.3 para contrarrestar los cambios de pH y permitir el paso de la corriente (Armstrong & Schulz, 2008).
La agarosa es un polímero compuesto de largas unidades repetidas de disacáridos sin carga. El gel se forma mezclando la agarosa con un amortiguador TAE o TBE y se calienta hasta que la solución quede transparente; luego se deja enfriar para poder verter en la cámara electroforética y conforme la temperatura decae, se forman los enlaces hidrógeno que crean la matriz del gel (Armstrong & Schulz, 2008).
Para separar ADN, se emplean los amortiguadores Tris-acetato-EDTA (TAE) o Tris-Borato-EDTA (TBE). El primero es el más usado pues es más sencillo de preparar y almacenar a diferencia del segundo que puede precipitar. Los fragmentos pequeños de ADN (<1 Kpb) funcionan mejor en geles de TBE pues interactúa de manera más estrecha formando poros más pequeños pero el TAE también muestra una resolución adecuada. El TAE debe ser usado si el ADN se va a purificar pues la interacción entre agarosa y TBE puede reducir la cantidad de ADN separado (Ogden & Addams, 2008).
El rango de voltaje empleado es de 1-10 V por cm de longitud de electrodo a electrodo (V/cm) pero también depende del tamaño de la macromolécula del ácido
32
nucleico. La resolución de fragmentos grandes de DNA (por arriba de 5Kbp) mejora si el gel corre más lento. Un voltaje demasiado alto puede sobrecalentar el buffer y afectar la resolución del gel y contrariamente, un voltaje bajo provoca la difusión de las moléculas de menor tamaño (Armstrong & Schulz, 2008).
Debido a que los ácidos nucleicos son incoloros por lo que es necesario teñir con colorantes que migren a la par con el ADN para observar su recorrido en la cámara y así saber en qué momento detener el flujo de voltaje para que las muestras no se salgan de la matriz. Los más comunes son naranja G (6X) y buffer de carga azul de bromofenol (6X) (Bermúdez, G. M.J., y otros, 2012) que contienen otras sustancias para que la muestra se asiente en el fondo del pocillo y no flote por encontrarse sumergido en el amortiguador de corrida.
Finalmente se debe teñir a los ácidos nucleicos con colorantes que sean fluorescentes al unirse a los ácidos nucleicos para poder visualizar los geles; el más usado es el bromuro de etidio (EtBr). Este químico compuesto por moléculas aromáticas tiene una estructura plana que se intercala entre los pares de bases apilados en el ARN y ADN (Ver Fig. 14), concentrándose en las moléculas que posteriormente son expuestas a luz UV para su visualización (Armstrong & Schulz, 2008).
33
Metodología:
Preparar un gel de agarosa 1% (p/v). Para esto, pesar 1g de agarosa y disolver en 100 mL de TAE 1x aplicando calor sin permitir la ebullición.
Dejar que se enfríe un poco sin gelificar y vaciar sobre la base de la cámara de electroforesis con el peine puesto.
Dejar que solidifique el gel y colocarlo dentro de la cámara de electroforesis. Retirar el peine con cuidado de no romper los pocillos formados.
Adicionar buffer SB 1X hasta cubrir por completo el gel.
Colocar el marcador de peso molecular en el primer pocillo (1 kb).
Colocar las muestras a analizar con amortiguador de carga azul de bromofenol 6X. (El volumen demuestra se carga con base a las necesidades de estudio y la cantidad de A.N. contenidos en la muestra completando el volumen 6X con agua grado molecular).
Cerrar la cámara, conectar los electrodos de manera correcta y conectarla a un voltaje de 100V, en un tiempo considerable (aprox. 2.25 hrs) hasta que el avance sea de ¾ de distancia en el gel (el tiempo depende de la separación de colorantes en el gel).
Apagar fuente eléctrica y remover el amortiguador.
Teñir el gel de manera cuidadosa con bromuro de etidio (10 m/mL) durante 10 min en agitación constante. Sacar y dejar escurrir.
Visualizar en transiluminador de luz UV.
34
Resultados
1.
Colecta y procesamiento del tejido foliar.
Se colectaron 15 muestras de un predio ubicado en el municipio de Tecomán, Colima cuyas coordenadas son: 18°58'19.5"N 103°51'01.1"W (Ver Fig. 15).
Fig. 16 Ubicación satelital del predio donde se colectaron las muestras. ©2016 Google, INEGI.
35
2.
Extracción y cuantificación de RNA.
Se emplearon trozos de aproximadamente 15 cm de longitud para moler en morteros estériles con nitrógeno líquido habiendo sido previamente lavadas en agua tratada con DEPC, tras lo cual se siguió el protocolo de extracción de ARN del kit Tripure Isolation Reagent de Roche, tras una serie de extracciones, se presentan en la siguiente tabla, las muestras con mejor integridad y porcentajes mayores de pureza para el ARN (Un valor de ~2 en el parámetro 260/280 y de 1.6 a más de 2 para 260/230) de los lotes 4,5 y 6 (Tabla 1):
Tabla 1 Cuantificación de ARN extraído del tercer lote de muestras (18°58'19.5"N 103°51'01.1"W).
Sample Date and time Nucleic
Acid
Unit 260/280 260/230 Saple
Type
Factor
40 06/04/2016 01:16:11 p. m. 458,2 ng/µl 1,98 1,06 RNA 40
41 06/04/2016 01:16:39 p. m. 491 ng/µl 2,02 1,06 RNA 40
42 06/04/2016 01:18:21 p. m. 468,6 ng/µl 2,05 1,49 RNA 40
43 06/04/2016 01:18:27 p. m. 471,6 ng/µl 2,04 1,5 RNA 40
44 06/04/2016 01:22:58 p. m. 373,3 ng/µl 1,98 1,23 RNA 40
45 06/04/2016 01:23:07 p. m. 374,9 ng/µl 1,99 1,22 RNA 40
46 06/04/2016 01:24:15 p. m. 602,6 ng/µl 2,07 1,45 RNA 40
47 06/04/2016 01:24:02 p. m. 608,1 ng/µl 2,06 1,45 RNA 40
51 11/06/2016 10:10:06 a. m. 369,3 ng/µl 1,83 1,42 RNA 40
52 11/06/2016 10:16:18 a. m. 254,3 ng/µl 2 2,28 RNA 40
53 11/06/2016 10:17:57 a. m. 171,5 ng/µl 1,95 2,45 RNA 40
54 11/06/2016 10:19:55 a. m. 370,2 ng/µl 2,03 2,19 RNA 40
55 11/06/2016 10:26:18 a. m. 272,9 ng/µl 1,83 1,48 RNA 40
56 11/06/2016 10:31:44 a. m. 481,2 ng/µl 1,97 2,07 RNA 40
57 11/06/2016 10:33:47 a. m. 298 ng/µl 1,66 1,74 RNA 40
58 11/06/2016 10:34:12 a. m. 351,9 ng/µl 1,64 1,53 RNA 40
59 11/06/2016 10:34:55 a. m. 320,2 ng/µl 1,95 2,03 RNA 40
10 11/06/2016 10:37:08 a. m. 159,7 ng/µl 1,87 2,36 RNA 40
11 11/06/2016 10:39:00 a. m. 472,6 ng/µl 2,01 2,05 RNA 40
60 24/05/2016 12:52:13 p. m. 421,8 ng/µl 1,94 1,58 RNA 40
61 24/05/2016 12:55:58 p. m. 393,9 ng/µl 1,96 1,64 RNA 40
62 24/05/2016 12:56:11 p. m. 395,6 ng/µl 1,98 1,6 RNA 40
63 24/05/2016 01:00:18 p. m. 420,1 ng/µl 2,01 2,89 RNA 40
64 24/05/2016 01:01:07 p. m. 437,5 ng/µl 1,97 2,83 RNA 40
65 24/05/2016 01:03:59 p. m. 1849,2 ng/µl 1,94 1,13 RNA 40
66 24/05/2016 01:03:59 p. m. 1849,2 ng/µl 1,94 1,13 RNA 40
67 24/05/2016 01:04:58 p. m. 2051,5 ng/µl 1,94 2,11 RNA 40
36
Fig. 18 Lote de ARN #5. Se ven bandas de RNA ribosomal definidas en 9 carriles. El marcador de peso molecular (1 kb) no se observa con la debida separación y se ve una contaminación del mismo con muestra del primer carril.
Fig. 17 Electroforesis de los ARN extraídos del tercer lote de muestras.
3.
Electroforesis en gel de agarosa para los ARN.
Para analizar la calidad de la integridad de los ARN extraídos, se realiza una electroforesis y se revela con bromuro de etidio, encontrando que las muestras se encontraban degradadas (Ver carriles barridos en la Fig. 17).
37
4.
Electroforesis en gel de agarosa para los controles
positivos de los virus.
El amplicón para SCMV mide 720 pb y el de SCYLV 512 pb (Yujia, Mingqiang, Donglin, Ruhui, & Guohui, 2009), estos amplicones se tenían almacenados en el laboratorio de Biotecnología Vegetal del INIFAP Campo Tecomán en gliceroles que fueron digeridos para su posterior comparación con las muestras en las electroforesis.
En la figura 19 se observa el control positivo para SCMV, se cargó marcador de peso molecular Invitrogen 1kb Plus, los dos carriles siguientes se cargaron con cDNA del virus de muestras almacenadas, del carril 4 – 7 son muestras de ADN plasmídico (pGEM® T easy vector) digerido.
38
En cuanto al control positivo para SCYLV (Fig. 20) se realizaron únicamente 3 digestiones con ECOR1, el inserto se observa a la altura coherente de 500 pb (su tamaño es de 512 pb) (Yujia, Mingqiang, Donglin, Ruhui, & Guohui, 2009)en el gel (entre las bandas de 600 y 400 pb del marcador de 1kb Bioline) y las bandas débiles del plásmido a 3000pb.
En el tercer carril correspondiente a la d2, no se observa nada, esto puede ser resultado del uso de una muestra que no entró en el pocillo adecuadamente o en última instancia que en ella no crecieron células competentes, ya que la metodología para extracción de ADN plasmídico es muy fiable.
39
5.
Resultados positivos de la RT – PCR a los virus.
Muestras positivas a SCMV
En la figura de abajo (Fig. 21), se observa la electroforesis del #5 lote de muestras (en total 9) que se observaron con un nivel de integridad muy bueno durante la electroforesis realizada a los ARN extraídos (Fig. 18) y el lote #6 de únicamente 8 muestras.
Del lote #5 únicamente dieron positivas 2 muestras, la 58 (banda muy débil) y 59, en cuanto al lote #6, también se observa el amplicón (720 pb) resultante en la 62 y 68.
40
Muestras positivas a SCYLV
En la Fig. 21 de lado izquierdo, se cargó marcador de peso molecular de 1kb de la marca Bioline, seguido por dos controles; negativo y positivo, las 9 muestras con mejor integridad del lote #5, seguidas por las 8 de la última extracción de ARN (#6). En ese primer segmento de la imagen, ninguna muestra dio positiva al virus de la hoja amarilla.
En cuanto al segundo segmento de la imagen, después de la muestra 68, se cargó un carril con marcador de 50 pb de Bioline, en el segundo carril el control positivo para SCYLV y finalmente muestras del lote #4. Para este lote, sólo una muestra dio positivo para el virus, mostrando una banda a la altura de 500 pb que corresponde al fragmento del control positivo con 512 pb (Yujia, Mingqiang, Donglin, Ruhui, & Guohui, 2009).
41
Conclusiones
El objetivo general del proyecto se planteó como la identificación molecular de dos virus de importancia económica en el estado de Colima, el Mosaico y Hoja amarilla, esto se lograba mediante una serie de procesos cuyos resultados concatenados permitirían la detección mediante una electroforesis final donde de manera visual se observarían bandas de tamaño específico de cada virus (De 720 pb para el SCMV y 512 pb para SCYL) que permiten verificar su presencia en las muestras, de acuerdo a la metodología de detección simultánea donde todas las muestras son sometidas a las mismas condiciones durante todas las etapas, incluyendo la PCR donde el número de ciclos, temperaturas y tiempos fueron las mismas con la única variación de preparar dos juegos de las muestras con los pares de cebadores para cada virus (el SCMV y el SCYLV).
Este objetivo se alcanzaría obteniendo resultados óptimos en los diferentes procesos algunos siendo establecidos como objetivos específicos tales como la extracción de ARN, la retro transcripción del ARN en ADN monocatenario para finalmente realizar la síntesis de ADN de doble hebra mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuyo resultado positivo o negativo de la presencia de los virus se observaría mediante una electroforesis.
Sin embargo, de todos los procesos realizados, solamente la extracción de ARN se realizó varias veces buscando mejorar la integridad de la molécula durante el proceso y verificando con electroforesis hasta obtener una buena calidad y que no se observaran totalmente degradados (Fig. 18).
42
Además una situación crítica fue la descomposición del termociclador, equipo esencial para la realización de la PCR retrasó dos meses el proyecto siendo su llegada una semana antes de la culminación de mi residencia por lo que la retro transcripción y la PCR se realizaron sólo 2 veces impidiendo seguir con la mejora de las diferentes metodologías.
Durante la primera identificación molecular realizada con los lotes 1 - 3 se obtuvieron resultados negativos que pudieron ser por la ausencia del virus en las muestras, degradaciones del ARN durante las extracciones debido a su naturaleza tan delicada y la insuficiente sintetización de cDNA en las muestras más viables durante la retrotranscripción que culminaría a su vez en una PCR sin productos amplificados y por lo tanto siendo negativa la presencia del virus.
43
Competencias desarrolladas
Para el desenvolvimiento óptimo de las actividades que realicé durante mi estancia profesional en el Laboratorio de Biotecnología de plantas en el INIFAP, fueron indiscutiblemente requeridas las bases teóricas y prácticas básicas de la genética y biología molecular dado el enfoque de desarrollo en la investigación científica en la cual se basa la actividad de este campo experimental y siendo la médula central del proyecto que se me asignó.
Sin embargo, esas bases aprendidas y desarrolladas en la vida escolar me permitieron adquirir rápidamente un desempeño eficiente y en continua mejora durante las actividades dado que no solamente participé en mi proyecto, también se me asignaron tareas pertenecientes a otros proyectos vinculados al laboratorio donde puse en práctica competencias básicas en las que se me instruyó desde el inicio del plan de estudios; capacidad de análisis, de autocrítica, organización y trabajar de manera autónoma sobre todo porque durante la mayor parte del desarrollo se hizo de manera individual con ocasionales colaboraciones con otros trabajadores de la institución y por supuesto de mi asesor el M.C. Manuel Bermúdez.
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Referencias
1. Aguilar, N. R. (2011). Competitivdad de la agroindustria azucarera de
la huasteca de México. San Luis Potosí: Universidad Autónoma de San Luis
Potosí.
2. Aguilar, N. R. (2013). Análisis de productividad de etanol de caña de
azúcar en ingenios azucareros de México. Ciencia Ergo Sum.
3. Aguilar, N. R., Arturo, A. R., Castillo, A. M., & Herrera, A. S. (2012).
Sucroquímica, alternativa de diversificación de la agroindustria de la caña de azúcar. Multiciencias.
4. Armstrong, J., & Schulz, J. (2008). Agarose Gel Electrophoresis,
current protocol. Essential Lab. Tech.
5. Avison, M. (2007). Measuring gene expression. Taylor & Francis Group. 6. Barlow, J., Mathias, A., Williamson, R., & Gammack, D. (1963). A simple method for the quantitative isolation of undergraded high molecular weight ribonucleic acid. Biochemistry & Biophysics research community, 13: 61-66.
7. Bermúdez G., M., Barbosa V., M., Valadez R., P., Ríos V., R., & Guzmán, G. S. (2013). Manual: Detección de fitopatógenos mediante RT-PCR y
PCR en tiempo real. Tecomán: INIFAP Tecomán - UDC.
8. Biological Chemistry Lab: College of arts & sciences of the University
of Kentucky. (30 de January de 2014). Obtenido de
http://www.chem.uky.edu/courses/che554/3_Chromatography/Chapter4_Elec trophoresis_ExperimentalBiochemistry.pdf
9. Birnboim, H., & Doly, J. (1979). A rapid methodforthe preparation of bacterial plasmids. Nucleic Acid Research, 7: 1513-23.
45
11. Chirgwin, J., Przbyla, A., MacDonald, R., & Rutter, W. (1979). Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry, 18:5294.
12. Chomczynski, P., & Sacchi, N. (1987). Single-step mthod of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate - phenol - chloroform extraction.
Analytic Biochemistry, 162:156-159.
13. Cline, J., Braman, J., & Hogrefe, H. (1996). PCR fidelity of Pfu DNA polmerase and other thermoestabile DNA polymerases. Nucleic Acids Research, 24: 3546-3551.
14. CNIAA. (2011). Manual Azucarero Mexicano. México, D.F.: Cámara Nacional de las Industrias Azucarera y Alcoholera.
15. Cox, R. (1968). The use of guanidine chloride in the isolation of nucleic acids. Methods Enzymol, 12:120-129.
16. Cruz, E. G. (2009). Manual del productor de caña de azúcar. México, D.F.: ATIDER.
17. Dowhan, M. (2008). Purification and concentration of nucleic acids. Essential Lab Technology.
18. Eickbush, T., & Moudrianakis, E. (1978). The compaction of DNA helices into either continous supercoils or folded-fiber rods and toroids. Cell, 13: 295-306.
19. Gallagher, S. (2008). Overview of electrophoresis. Curr. Protoc. . Essential Lab Tech.
20. Holmes, D., & Quingley, M. (1981). A rapid boiling method for the preparation of bacerial plasmids. Analytic Biochemistry, 114: 193-197.
46
22. Madigan, M., Martinkom, J., & Parker, J. (2000). Brock: Biology of
microorganisms. New Jersey: Prentice Hall.
23. McMurry, J. (2003). Organic Chemistry. Brooks Cole.
24. Morán, A. C., Milanés, N. R., Rodríguez, D. L., & Aguilar, N. R. (2006). Producción de "semilla" de caña de azúcar. Temas selectos de la caña de
azúcar, 74-81.
25. Mülhart, C., & Beese, E. (2007). The polymerase chain reaction. En
Molecular Biology and Genomics (pág. Unidad 4).
26. Ogden, R., & Addams, D. (2008). Overview of electrophoresi. Current
protocol. Essential Lab Tech.
27. Palmiter, R. (1974). Magnesium precipitation of ribonucleoprotein complexes. Expedient techniques for the isolation of undergraded polysomes and messenger ribonucleic acid. Biochemistry, 13:3606-3615.
28. Perry, R., La Torre, J., Kelley, D., & Greenberg, J. (1972). On the lability of poly(A) sequences during extraction of messenger RNA from polyribosomes. Biochemistry Biophysics Research Communications, 262: 220-226.
29. Quintero, S. N. (2012). CNDSCA. Obtenido de http://www.cndsca.gob.mx/citcana/PROYECTO%20MEJORAMIENTO%20GEN%C3 %89TICO%20PIASA.pdf
30. Rott, P., Bailey, R. A., Comstock, J. C., Croft, B. J., & Salem, A. S. (2000). A guide to sugarcane diseases. Montpellier, Francia: REPÉRES.
31. Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., Eldrich, H., & Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of B-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230: 1350.
47
33. Sellner, L., Coelen, R., & MacKenzie, J. (1992). Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Research, 20: 1487-1490.
34. Sentíes, H. E. (2013). Variabilidad genética y caracterización de
variedades de caña de azúcar. Montecillo, San Luis Potosí: Colegio de
Postgraduados.
35. Somma, M., & Querci, M. (23 de Mayo de 2016). JRC European
Comission. Obtenido de
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN/Session06.pdf 36. Yujia, X., Mingqiang, W., Donglin, X., Ruhui, L., & Guohui, Z. (2009). Simultaneous detection and identification of four sugarcane viruses by one-step RT-PCR. Journal of Virological Methods, 64-68.
37. Zumbo, P. (20 de Mayo de 2016). Department of physiology &
biophysics- Weill Cornell Medical College. Obtenido de
