3 Evaluación de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas
María del Carmen Cuevas Díaz, Joahana de la Luz Rosaldo Santiago, Jaime López Luna
intRoDucción
Las plantas son esenciales en los ecosistemas porque son las responsables de trans- formar la energía solar en energía química, al tiempo que absorben dióxido de car- bono. De esta manera proveen de alimento y oxígeno al resto de los organismos.
Además, las plantas son uno de los componentes más importantes de los ecosiste- mas terrestres porque proporcionan refugio y sitio de anidamiento para numerosos organismos, y participan de forma primordial en el reciclaje de nutrientes y en la estabilización de los suelos (Wang y Freemark, 1995).
El daño a las plantas por los contaminantes puede afectar directamente a la estructura y la función de un ecosistema, al reducir la producción primaria, incre- mentar el lavado y erosión del suelo y degradar el hábitat de la vida silvestre. Los efectos letales de los contaminantes sobre las plantas pueden significar pérdidas ecológicas y económicas muy importantes; incluso los efectos subletales tienen un impacto significativo sobre la producción de alimentos y el desarrollo de la vegeta- ción natural, e implicaciones adversas para los organismos pertenecientes a niveles superiores en la cadena alimenticia (Wang y Freemark, 1995).
En los bioensayos de toxicidad con semillas se evalúan los efectos adversos de los contaminantes en el proceso de germinación y en el desarrollo de las plán- tulas durante los primeros días de crecimiento. Como respuesta se determina la inhibición en la germinación y de la elongación de la radícula y del hipocótilo. Es
importante destacar que durante la germinación y los primeros días de desarrollo ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de un compuesto tóxico puede interferir y alterar la supervivencia y el desarrollo normal de las plán- tulas. La división celular de los ápices radiculares puede afectarse, retardando el proceso de mitosis o alterando el proceso de alargamiento radicular, por lo que la fitotoxicidad de un compuesto puede ser determinada a través de la medición de dichas respuestas (Uribe, 2008).
Algunas plantas son más sensibles que otras a los efectos de los contaminantes;
sin embargo, se sabe que generalmente las comunidades vegetales son afectadas por los suelos contaminados con hidrocarburos del petróleo. Estos compuestos afectan en particular a las raíces y los brotes de plantas jóvenes (Adam y Duncan, 2002).
Para el desarrollo de estas pruebas se han empleado diversas especies, tanto de importancia económica (ornamental o de cultivo), como ecológicas (nativas); sin embargo, el trigo (Triticum aestivum) y el sorgo (Sorghum vulgare) son las que han sido ampliamente utilizadas.
En este capítulo está basado en los procedimientos de prueba recomenda- dos por el protocolo 208 de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD, 1984), la guía OPPTS 850.4200 de la USEPA (1996a) y el ensayo de Uribe, 2008.
campo De aplicación
Estas pruebas se pueden aplicar directamente a suelos contaminados con hidro- carburos (como el petróleo o diésel) o a suelos que han sido sujetos a algún trata- miento de remediación. También pueden ser aplicados a extractos de estos mismos suelos.
pRueba De toxiciDaD aguDa con extRactos De suelo Fundamento del método
Este bioensayo es una prueba aguda, con exposición a 14 días, en la que se expo- nen las semillas a varias diluciones de los extractos del suelo problema, y poste- riormente se mide la inhibición de la germinación y del crecimiento temprano de las plántulas, y la producción de biomasa a través de las concentraciones efectivas
medias (CE50), las cuales representan las concentraciones de los extractos de suelo que ocasionan una inhibición del 50 % en cada una de estas respuestas, compara- das con la respuesta máxima observada en el control negativo.
mateRial y equipo Cajas de Petri
Contenedores de vidrio Pyrex de 150 x 75 mm
Vasos de precipitados Pyrex de 125 y 300 mL
Matraz Soxhlet
Matraz volumétrico de 100 mL Papel filtro del No. 1 o 40 Pipeta graduada de 10 mL Regla graduada o vernier Matraz aforado de 500 mL
Balanza analítica
Cámara oscura con temperatura controlada Horno
Reactivos
Ácido bórico (H3BO3) con pureza > 98 %, de preferencia 99.5 % Agua destilada
2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio con pureza > 98 % Diclorometano grado HPLC
Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5 % o blanqueador comercial Sulfato de sodio anhidro (NaSO4) grado analítico
soluciones
Solución de cloruro de trifeniltetrazolio al 1 %. Pesar 10 g de 2,3,5-cloruro de trife- niltetrazolio y depositar en matraz aforado de 1000 mL, aforando y mezclando suavemente con agua destilada. El pH debe estar entre 6 y 8.
Solución de hipoclorito de sodio al 5 %. En un matraz aforado de 500 mL, adicionar 25 mL de NaClO y aforar con agua destilada, agitando lentamente. Se puede utilizar blanqueador comercial, que contiene comúnmente 6 % de hipoclorito.
Solución de ácido bórico. Pesar 25 g de H3BO3, depositar en un matraz y aforar a 1 litro con agua desionizada.
extRactos De suelo
Se depositan 40 g de suelo en charolas de vidrio o aluminio para su secado a temperatura ambiente (25-30 ºC) durante 48 h; no colocar al sol. Se realiza una trituración hasta obtener partículas finas y homogéneas, con la finalidad de mejorar la extracción del hidrocarburo. Finalmente se coloca en un frasco limpio y seco.
Los extractos de suelo pueden ser preparados mediante la extracción con di- clorometano empleando el método de Soxhlet. Para ello se mezclan de 5 a 10 g de suelo seco y triturado. Se le adiciona sulfato de sodio anhidro en relación 1:1 suelo:sulfato, y se deposita en un cartucho de celulosa. El cartucho se coloca den- tro de la columna de extracción del Soxhlet (USEPA, 1996b; Fernández-Linares et al., 2006). Se adicionan 140 mL de diclorometano en el matraz balón, y de 4 a 5 perlas de ebullición para evitar proyecciones del disolvente por el calentamiento.
Las parrillas deben mantenerse a 55 °C. A partir del primer reflujo, se cuenta el tiempo para lograr un total de 6 reflujos por h durante 6 h.
Finalizada la extracción, se pasa el matraz bola a un rotavapor y se evapora a sequedad. Se recupera el concentrado en un vial de 50 mL; este concentrado sirve como solución para realizar las diluciones, en función de las concentraciones de- seadas y de la concentración existente en el suelo muestra.
Se preparan cinco concentraciones del extracto de suelo en orden logarítmico, por ejemplo 0.1 1, 10, 100, 1000 mg/L. Para ello, se usa la concentración mayor y de esta se preparan las diluciones. Por ejemplo, si se requieren 100 mL de extrac- to con una concentración de 1000 mg/L y se parte de una de una concentración de 10000 mg/L, se toman 10 mL de esta solución y se lleva a 100 mL con el disolvente empleado. De la solución de 1000 mg/L se toman 10 mL y se afora a 100 mL para obtener una concentración de 100 mg/L, y así sucesivamente.
oRganismos De pRueba
En estos bioensayos se utilizan semillas de trigo (Triticum aestivum), sorgo (Sorghum vulgare), maíz (Zea mays), soya (Glycine max), lenteja (Lens culinari) o jitomate (Lycopersicum esculentum). Todas las semillas deben ser certificadas o de tipo orgánico. Como control de calidad de las semillas debe realizarse una prue- ba de viabilidad antes de realizar los ensayos de toxicidad. Una vez determinada la viabilidad de los lotes de semillas, estos deben guardarse en recipientes a prueba de humedad a 5 ºC, en oscuridad y ambiente seco.
Preparación de las semillas
Para desinfectar las semillas, estas se sumergen en la solución de hipoclorito de sodio durante 15 min, luego se lavan con agua destilada y finalmente se colocan en un contenedor con agua destilada durante 15 min para eliminar los residuos del hipoclorito.
pRoceDimiento Prueba de viabilidad
Antes de realizar los bioensayos de toxicidad, se deberá determinar la viabilidad de las semillas mediante el método químico de cloruro de trifeniltetrazolio (Moore, 1985) modificado. Este método, también llamado prueba rápida de germinación, consiste en probar en un periodo de 24 a 48 h la capacidad de germinación de un lote (más una réplica) de 50 semillas tomadas al azar.
Esta prueba se basa en la actividad de las enzimas deshidrogenasas, particu- larmente las deshidrogenasas del ácido málico, que reduce la sal de tetrazolio en los tejidos vivos de las semillas. En esta reacción los iones H+ son transferidos a la referida sal. Cuando la semilla se sumerge en la solución de cloruro de trifeniltetra- zolio, ocurre la reacción de reducción en las células vivas y se forma un compuesto de color rojo (trifenilformazán) que indica la presencia de actividad respiratoria en las mitocondrias y, consecuentemente, que el tejido es viable. Los tejidos muertos (no viables) no reaccionan con la solución y conservan su color natural (Russi et al., 2007).
Para llevar a cabo la prueba de viabilidad se siguen los pasos que a continuación se describen:
1 Se remojan 50 semillas de la especie seleccionada en agua destilada o en papel filtro humedecido con agua destilada durante 4 a 18 h a temperatura ambiente.
2 Si se usan semillas grandes, como las del maíz, estas se tiñen en un vaso de pre- cipitados de 250 mL adicionando aproximadamente de 150 a 200 a mL de la solución de cloruro de trifeniltetrazolio. Si son semillas más pequeñas, como las de tomate, se utiliza un vaso de precipitado de 125 mL y se adicionan de 80 a
100 mL de la misma solución. Se dejan reposar 2 h si son semillas pequeñas y hasta 24 h si son semillas grandes (tabla 3.1) a una temperatura de 30 °C en la oscuridad (Moreno, 1984; Moore, 1985).
3 Se lavan las semillas con agua corriente bajo un flujo reducido y posteriormente se observa el cambio de coloración en el embrión (figura 3.1).
tabla 3.1. tiempodeimbibicióncontrifeniltetrazoilo. fuente: moore, 1985; KameSwara,
etal., 2007; del valle, 2008
figura 3.1. SemillaSviableSdetrigoenlaSqueSeaprecialatincióncontrifenilformazán
Semilla tiempo de imbibición o remojo
(h)
Avena, trigo, maíz y soya 8
Sorgo 10
Frijol 12 envueltas en toalla de papel húmedo, después 4 h de remojo
DesaRRollo De la pRueba
Previamente a la prueba, las semillas deben ser desinfectadas con hipoclorito de sodio, conforme el procedimiento anteriormente descrito.
Se coloca papel filtro en el interior de las cajas de Petri y se adicionan 2 mL del extracto de suelo. Este paso se repite para cada una de las 5 concentraciones
preparadas con el extracto de suelo. Se colocan 15 semillas de las especies selec- cionadas en cada caja de Petri, dejando suficiente espacio entre ellas. En el caso del control negativo, sólo se adicionan 2 mL de agua destilada al papel filtro y se depo- sitan las 15 semillas. De la misma manera, se prepara un tratamiento control con el disolvente empleado para preparar los extractos del suelo (Fernández-Linares et al., 2006), así como un control positivo agregando 2 mL de la solución de ácido bórico (EC, 2005). Una vez preparadas, todas las cajas de Petri deben ser coloca- das en la cámara oscura a una temperatura controlada de 22 ± 2 °C.
Cuando se observe que al menos el 65 % de las semillas en el control negativo han germinado y sus radículas muestran un tamaño de al menos 5 mm de largo, deben evaluarse las variables de respuesta en todos los tratamientos. Para ello, se extraen las plántulas de las cajas de Petri. Con la regla o el vernier se mide la altura de las plántulas (longitud del hipocótilo) y la longitud de la radícula (figura 3.2).
Para determinar la producción de biomasa, se pesan las plántulas en una balanza analítica, para lo cual previamente se colocan en cajas de Petri y se meten en la estufa a 75 °C durante 20 a 24 h para eliminar la humedad.
figura 3.2. plántulaSdetrigo
Cálculos
Una vez que los datos han sido registrados, se realizan los siguientes cálculos:
El porcentaje de viabilidad de cada especie seleccionada.
•
El porcentaje de las semillas germinadas en cada especie.
•
El promedio, la desviación estándar y el porcentaje de producción de biomasa
•
y de elongación de la radícula y el hipocótilo de las plántulas de cada especie seleccionada.
Parámetros toxicológicos
Con los datos de germinación, producción de biomasa y elongación radicular y del hi- pocótilo, se elabora una curva dosis-respuesta donde se marcan los siguientes paráme- tros toxicológicos: la CE50 (concentración efectiva media), la NOAEC (concentración máxima en la que no se observan efectos adversos) y la LOAEC (concentración míni- ma en la que se observan efectos adversos). La CE50 se calcula con el método Probit (USEPA, 1999a; Díaz-Baez et al., 2004) o de Spearman-Karber recortado (Hamilton et al., 1977) para cada una de las especies seleccionadas. Dichos métodos se describen en el capítulo 2. Los valores de la NOAEC y la LOAEC se obtienen estadísticamente mediante el análisis de comparación de medias por una prueba de Dunnett.
En este tipo de pruebas no se puede establecer con precisión la mortalidad (CL50) de una plántula, por lo que se utilizan otros parámetros, como los ya des- critos, que indiquen otros efectos tóxicos. Sin embargo, los bioindicadores, como germinación, producción de biomasa y elongación de raíz y tallo, deben estanda- rizarse previamente, puesto que el software disponible está diseñado para calcular concentraciones letales (CL50). Para estandarizar los datos, la germinación prome- dio de los tratamientos se establece como porcentaje en relación al control, el cual se asume como 100 %. Posteriormente, se consideran solo los efectos negativos, que se obtienen calculando la disminución del porcentaje de germinación de los tratamientos con respecto al control (100-% de germinación con respecto al con- trol). Con estos datos se construye la curva dosis-respuesta y se calcula la CE50 utilizando el software libre Trimmed Spearman Karber Method (USEPA, 1999b).
Antes de ingresar los datos en el programa, se establece que el número total de individuos de prueba en el control y en cada concentración de los tratamientos equivale a 100 (100 %).
Se asume que no existe mortalidad en el control (equivale a cero), y como dato de mortalidad de los tratamientos se ingresa la disminución del porcentaje de germinación con respecto al control. El valor de la CE50 calculado nos indicaría entonces la concentración a la cual el porcentaje de germinación disminuye un 50
% con respecto al control negativo.
Se procede de la misma manera para producción de biomasa, elongación de radícula e hipocótilo y cualquier otro bioindicador de toxicidad, en donde la CE50 indicaría una disminución del 50 % de respuesta con respecto al control negativo.
La NOAEC y la LOAEC se obtienen estadísticamente mediante el análisis de comparación de medias de los valores naturales (datos crudos), utilizando la prue- ba de Dunnett que compara cada uno de los tratamientos con el control. La con- centración del tratamiento que sea estadísticamente diferente del control equivale a la LOAEC, es decir a la concentración mínima en la cual se observa un efecto adverso. La concentración máxima que no sea estadísticamente diferente del con- trol equivale al valor de NOAEC, que es la concentración máxima en la que aún no se observan efectos adversos.
Estos parámetros toxicológicos son de gran importancia porque se utilizan para calcular índices de riesgo. Se puede consultar información toxicológica adicional en López-Luna et al., 2009.
RepoRte
Para elaborar el reporte se recomienda incluir los siguientes puntos (ISO, 1993):
Tipo de contaminante presente en el suelo problema y su control
•
Tipo de suelo, su origen y características. Variedad de semilla o detalles de otras
•
especies empleadas
Condiciones del crecimiento de la semilla
•
Tipo de contenedor, dimensiones y cantidad de suelo utilizada.
•
Cualquier problema o desviación del protocolo
•
pRuebas DiRectas De toxiciDaD aguDa en suelo Fundamento del método
Este bioensayo es una prueba aguda, con exposición a 14 días, en la que se ex- ponen directamente las semillas al suelo problema (prueba de tratamiento único) o a sus diluciones (prueba de tratamientos múltiples), y posteriormente se mide la inhibición de la germinación, del crecimiento temprano de las plántulas y de la producción de biomasa. En la prueba de tratamiento único se determina si el suelo produce esta inhibición comparada con el control negativo, mientras que en la prueba de tratamientos múltiples se determinan las concentraciones efectivas medias (CE50), las cuales representan las concentraciones del suelos problema que ocasionan una inhibición del 50 % en cada una de estas respuestas, comparadas con la respuesta máxima observada en el control negativo.
tabla 3.2. reSumendelaScondicioneSrecomendadaSparalaSpruebaSdeSemillaSexpueStaS aextractodeSuelo
Duración de la prueba 14 días
Temperatura 22 ± 2 °C
Condiciones de iluminación Oscuridad hasta germinación
Recipientes de prueba Cajas de Petri con papel filtro humedecido Cantidad de extracto de suelo re-
querida por réplica
2 mL
Especie de prueba Trigo (Triticum aestivum), sorgo (Sorghum vulgare), maíz (Zea mays), soya (Glycine max), lenteja (Lens culinari) o jitomate (Lycopersicum esculentum) Número de semillas por réplica 15
Número de réplicas 3
Respuesta a medir Inhibición de la germinación, de la elongación de la radícula y el hipocótilo, y de la producción de biomasa
Control negativo Agua destilada y el disolvente empleado en la extracción
Control positivo Ácido bórico
mateRial y equipo
Bolsas plásticas de 0.05 X 0.015 m o fras- cos de vidrio Pyrex con diámetro de 5.5 cm y 5 cm de altura
Cajas de Petri
Cristalizadores de vidrio de diámetro de 15 cm y 7.5 cm de altura, o de 8 cm de largo, 6 cm de ancho y 4 cm de altura
Matraz volumétrico de 100 mL Papel filtro del No. 1 o 40 Pipeta graduada de 10 mL Regla o vernier
Balanza analítica Balanza granataria
Cámara con temperatura y fotoperiodo controlados
Criba de malla 10 con abertura de 2 mm Estufa
Mortero
Reactivos
Acetona o diclorometano grado HPLC
Ácido bórico (H3BO3) con pureza mayor al 98 % Agua destilada
Agua tipo II
Arena o suelo sin contaminar
2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio de 98 % de pureza Hipoclorito de sodio (NaClO) grado analítico Soluciones
Solución de cloruro de trifeniltetrazolio al 1 %. Adicionar 10 ml de cloruro de trife- niltetrazolio en 500 ml de agua, mezclar y aforar a 1000 mL.
Solución de hipoclorito de sodio al 5 %. Tomar 25 mL de NaClO y depositar en un matraz aforado que contenga 100 mL de agua destilada, aforar a 500 mL con agua destilada y mezclar.
Solución de ácido bórico. Pesar 25 g de H3BO3, depositar en un matraz y aforar a 1 litro con agua desionizada, mezclar depositando una barra magnética en el matraz Erlenmeyer y agitar durante 15 min.
Suelo
Para las pruebas en las que solo se evalúa la toxicidad del suelo problema como tratamiento único, el suelo se seca a temperatura ambiente. Posteriormente se tritura con un mortero para homogenizarlo y se criba para eliminar las piedras. Se depositan 8 g de suelo en las bolsas de plástico, para facilitar el crecimiento de las plantas. Se ajusta el contenido de humedad del suelo con agua destilada a un valor entre el 28 y el 30 % de la capacidad de campo.
Para las pruebas en las que se evalúan distintas concentraciones del suelo pro- blema, este se mezcla con suelo similar al del sitio contaminado para obtener dilu- ciones de 0, 25, 50, 75 y 100 %. Para ello se pesan 30 g de suelo de las diferentes diluciones y se depositan en los frascos de vidrio (Meier et al., 1997). Otra forma es realizar el bioensayo con el suelo contaminado y el suelo tratado (biorremedia- do) sin realizar mezclas. Cada tratamiento debe realizarse por triplicado.
organismos de prueba
Para las pruebas directas en suelo, se recomiendan las mismas especies menciona- das anteriormente en este capítulo.
pRoceDimiento Prueba de viabilidad
Antes de realizar los ensayos de toxicidad, se debe probar la viabilidad de las semi- llas de las especies seleccionadas. Para ello se sigue el procedimiento descrito con anterioridad en este capítulo.
Preparación de las semillas
Para desinfectar las semillas, estas se sumergen en la solución de hipoclorito de sodio durante 15 min, luego se lavan con agua destilada y finalmente se colocan en un contenedor con agua destilada durante 15 min para eliminar los residuos del hipoclorito.
Desarrollo de las pruebas
Para la prueba de tratamiento único, en cada bolsa se deposita una semilla hasta completar un total de 15 por cada especie seleccionada (figura 3.3).
figura 3.3. preparaciónde loSrecipienteS parala prueba conSemillaSde tratamiento único
Para las pruebas de tratamientos múltiples, se depositan 10 semillas por cada especie en los frascos de vidrio. Deben prepararse 3 réplicas por cada dilución (Sharifi et al., 2007). También se prepara el control negativo con arena o suelo no contaminado (con aproximadamente un 3 % de materia orgánica) y agua destilada, el control del disolvente (diclorometano, acetona o dimetilsulfóxido) con arena (OECD, 2006), y el control positivo con are- na adicionada de ácido bórico (EC, 2005). Existen guías o protocolos, como OECD, 1984 e ISO, 1993, que no incluyen un compuesto tóxico de referen- cia. El control positivo con ácido bórico debe emplearse cada vez que el lote de semillas sea nuevo, o en las pruebas del control de bioensayo que se realizan cada dos meses.
Posteriormente las bolsas o los frascos se incuban en la cámara oscura a una temperatura de 22 ± 2 °C hasta que se observa un 65 % de germinación de las
semillas del control negativo (Saterbak et al., 2000). Después de este periodo, las plántulas se mantienen bajo un régimen de 16 h de luz y 8 de oscuridad.
Dependiendo del ciclo de cada especie, se determina el porcentaje de germi- nación después de varios días. Un crecimiento de la radícula mayor a 5 mm se considera un indicador de la germinación. Diariamente se observan las plantas y se anota cualquier cambio que se aprecie, como cambios en la coloración o necrosis de las hojas. Posteriormente, al finalizar la prueba, se determinan los parámetros de producción de biomasa y de elongación del tallo y la raíz, como se describió ante- riormente en este capítulo.
Durante toda la prueba es necesario mantener un contenido de humedad del suelo de 70 ± 5 % de la capacidad de campo (USEPA, 1996a). Para ello, cada tercer día se adiciona agua tipo II (con una conductividad específica 1.0 umhos/
cm a 25 °C, cuenta total bacteriana de 0/mL y valor máximo de materia de 0.1 mg/l) a cada bolsa o frasco, en forma manual con una pipeta graduada o mediante atomización, hasta alcanzar el peso exacto del suelo (considerando el peso de la bolsa o el frasco).
Cálculos
Al término de la prueba se realizan los siguientes cálculos:
El porcentaje de viabilidad de las semillas estudiadas
El porcentaje de las semillas germinadas en cada especie seleccionada
El promedio, la desviación estándar y el porcentaje de producción de biomasa y de elongación de la raíz y el tallo de las plantas de cada especie
Parámetros toxicológicos
Con los datos anteriores se elabora una curva dosis-respuesta y se calculan los parámetros toxicológicos de la CE50, la NOAEC y la LOAEC para la germinación, la elongación de la raíz y el tallo y la producción de biomasa. Los parámetros toxi- cológicos se obtienen como se describió previamente, con la excepción de que los valores de concentración quedarán expresados como porcentaje de adición de suelo contaminado, es decir, la CE50 equivaldrá a la proporción (%) de suelo con- taminado que provoca el 50 % de disminución de la germinación con respecto a un suelo control libre de contaminantes. La LOAEC sería la proporción de suelo contaminado mínima que genera un efecto adverso, y la NOAEC sería la propor-
ción de suelo contaminado máxima que no genera efectos adversos. De la misma manera se procedería para producción de biomasa y elongación de raíz y tallo, comparando los tratamientos con un suelo control de características similares al suelo contaminado.
RepoRte
Para elaborar el reporte se recomienda incluir los siguientes puntos:
El tipo de contaminante presente en el suelo problema y su concentración
•
Las características del suelo problema (pH, contenido de humedad y capacidad
•
de campo) antes, durante y al término de la prueba
Las características de las semillas de prueba (semillas certificadas u orgánicas,
•
especie, variedad, familia, nombre común, número de semillas utilizadas en cada contenedor, estación de cosecha, etc.)
Número de réplicas, condiciones de incubación y esterilización de las semillas
•
Los valores de humedad y pH del suelo registrados durante la prueba
•
tabla 3.3. reSumendelaScondicioneSrecomendadaSparalaSpruebaSdeSemillaSexpueStaS directamentealSueloproblema
Tipo de prueba Directa en suelo
Temperatura 22 ± 2 ºC
Duración De 10 a 21 días en función de la especie
Tipo de contenedores Recipientes de vidrio de 4.5 cm de diámetro y 7 cm de altura o bolsas plásticas
Cantidad de suelo requerida por contenedor 30 g
Organismo prueba Trigo (Triticum aestivum), sorgo (Sorghum vulgare), maíz (Zea mays), soya (Glycine max), lenteja (Lens culinari) o jitomate (Lycopersicum esculentum)
Número de organismos por réplica 10
Número de réplicas De 3 a 4
Control negativo Suelo no contaminado
Control positivo Ácido bórico
Control de calidad
El protocolo 208 de la OECD (1984) y la guía OPPTS 850.4200 de la USEPA (1996a) establecen que deben considerarse los siguientes aspectos durante estas pruebas:
Las pruebas de tratamientos múltiples deben contar con un mínimo de tres
•
concentraciones y un control negativo.
Se debe sembrar por réplica como mínimo cinco semillas, que deben ser lo más
•
homogéneas posible en cuanto a tamaño.
El tamaño de los recipientes de prueba debe ser adecuado para permitir el cre-
•
cimiento normal de las semillas.
Las plantas deben ser regadas según los requerimientos de su especie.
•
Debe buscarse que las semillas que se usen en estas pruebas presenten un por- centaje de germinación mayor al 90 %, así como baja variabilidad (CV < 30 %) en la elongación de la radícula y el hipocótilo. Debe garantizarse que la germinación ocurra a la temperatura óptima de la especie y probar si este proceso de da mejor en presencia o ausencia de luz.
Si no es posible tener un lote de semillas con una germinación mayor o igual al 90 %, se debe aumentar el número de semillas por réplica hasta un mínimo de 18 semillas germinadas. Si existe variación en elongación de la radícula o del hipocótilo en el control negativo, se debe aumentar el número de réplicas para reducir el error.
Si las semillas son de diversos tamaños, deben eliminarse los extremos, es de- cir, las más grandes y las más pequeñas, y utilizar solo la fracción de semillas de tamaño medio.
En el caso en que el control negativo no alcance más del 50 % de germinación, debe repetirse la prueba, estableciendo seis concentraciones como mínimo (inclu- yendo aquellas en donde se encontró efecto adverso) y el control negativo.
observaciones
La inhibición de la elongación de la radícula y el hipocótilo constituyen indicadores subletales muy sensibles para la evaluación de efectos biológicos en vegetales, que aportan información complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinación.
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