PATOLOGIA INFECCIOSA
Manual del Laboratorio de prácticas
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
INDICE
Práctica 01 Bioseguridad, Técnicas de desinfección y esterilización Práctica 02 Principios básicos de pruebas inmunológicas
Práctica 03 Medio de cultivo
Práctica 04 Siembras y aislamientos
Práctica 05 Tipo de muestras útiles en microbiología, estructuras micóticas, hongos ambientales, toma de muestra
Práctica 06 Protozoos intestinales, coprológico, coproscópico Práctica 07 Morfología bacteriana Cocos Gram Positivos Práctica 08 Enterobacterias, Antibiograma
Práctica 09 Tuberculosis
Práctica 10 Diagnóstico de infecciones de piel, tejidos blandos y análisis de Liquido Cefalo-raquideo
Práctica 11 Diagnóstico de infecciones del tracto genito-urinario Práctica 12 Urocultivo, Coprocultivo, Hemocultivo
Práctica 13 Diagnostico de dengue, hepatitis B, VIH
Práctica 01
Bioseguridad, Técnicas de desinfección y
esterilización
BIOSEGURIDAD Y ESTERILIZACION OBJETIVOS GENERALES:
Dar a conocer las normas de bioseguridad y los procesos de desinfección y esterilización en el ámbito clínico.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar los conceptos que definen las normas de bioseguridad y su aplicación en el desempeño profesional en las instituciones de salud.
Identificar y reconocer los principios para seleccionar los métodos adecuados de desinfección y esterilización.
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO 1. El acceso al laboratorio estará limitado solo personal autorizado.
2. El personal que trabaje en laboratorio debe responsabilizarse con el cumplimiento de las normas de bioseguridad.
3. Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico y el nivel de contención.
4. Ingrese al laboratorio con bata manga larga, abotonada, y limpia, una vez ingrese, coloque los abrigos, libros, y demás en localizaciones especificadas pero nunca sobre los bancos o mesones.
5. Lave sus manos al entrar y al terminar cada sesión, limpie la superficie de trabajo con una solución desinfectante.
6. El personal con cabello largo debe recogerlo para trabajar dentro del laboratorio así como usar: bata, cofia, tapaboca, guantes y demás equipos de barrera de protección según el nivel según el riesgo biológico.
7. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o al término del mismo coloque el material contaminado o limpio en sus respectivos lugares pero nunca sobre los mesones.
8. Comer, beber, fumar aplicarse cosméticos (en especial pestañina, pues esta acelera el deterioro delo oculares del microscopio) y usar lentes de contacto es una actitud prohibida dentro del laboratorio. Es necesario el uso de zapato cerrado durante el trabajo de laboratorio igualmente como mantener las uñas cortas y limpias y sin esmalte.
9. Está prohibido pipetear con la boca, para ello emplee los dispositivos adecuados.
10. Emplear los equipos según las instrucciones o P.O.E (procedimientos operativos estandarizados) al igual que emplear los protocolos correspondientes a las prácticas. No manipular ni operar equipos sin la autorización respectiva o si no tiene claro los P.O.E.
11. El transporte de muestras dentro o entre laboratorios se realizara de tal manera que en caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras transportables, las cuales deberán ser rígidas y resistentes, contar con materiales absorbentes en su interior, de fácil desinfección y no ser utilizadas con otros fines.
12. Todo personal debe poner especial cuidado en evitar contacto con la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin, debe usarse guantes para la manipulación de muestras o cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del área de trabajo.
13. Informar todos los derrames y accidentes al supervisor de forma inmediata y al jefe del laboratorio.
14. Usar gafas protectoras y mascaras faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles.
15. Cada estudiante debe contar con su equipo básico de trabajo, el cual incluirá entre otros laminas portaobjetos, laminas cubreobjetos, jabón, tijeras, cinta de enmascarar, lápiz, marcador de vidrio permanente, papel absorbente, algodón, alcohol, asas bacteriológicas, guantes.
MARCO TEORICO. DEFINICION
Se entiende por bioseguridad a toda una disciplina encargada de prevenir accidentes biológicos, valiéndose de un conjunto de medidas y controles destinados a prevenir al máximo la exposición a agentes potencialmente infecciosos o patógenos en los sitios de trabajo donde exista dicho riesgo. Principios de bioseguridad
Se describen métodos seguros para manejar materiales infecciosos en el laboratorio bien sea para manipulación o conservación; dicha descripción se conoce como CONTENCION, su aplicación fundamental es la reducción y/o eliminación de la exposición de cualquier persona trabajador ó no, como también al medio ambiente externo de agentes peligrosos.
Contención primaria, propende por la protección del personal y del medio ambiente propio e inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos, mediante la utilización correcta de las técnicas necesarias, los equipos indispensables y con un uso apropiado. La vacunación del personal que labora en los laboratorios.
Contención secundaria, se aplica en referencia al medio externo y la combinación entre la aplicación de las practicas operativas, y un adecuado diseño de la planta física, permite la consecución de su objetivo.
Se debe evaluar el riesgo de trabajo con agentes específicos para lograr la combinación de los tres elementos de contención que son: técnicas y practicas en le laboratorio, equipos de seguridad, y el diseño de la instalación.
Los trabajadores deben conocer los riesgos potenciales y tener experiencia en las prácticas y técnicas indispensables en la manipulación de material infeccioso, debe existir una persona que organice y capacite adecuadamente al personal.
Los laboratorios están obligados a elaborar e implementar un manual de operaciones que identifique los posibles riesgos prácticas y operaciones. Dicho manual debe ser socializado para su correcta aplicación.
Es necesario implementar medidas adicionales cuando las prácticas estándar no son suficientes para controlar los riesgos, es indispensable que el director del laboratorio seleccione este tipo de prácticas, en relación a los riesgos tanto con los agentes o los procedimientos.
BARRERAS PRIMARIAS
Son aquellas que ofrecen niveles significativos de protección al personal y al medio ambiente brindando protección contra la contaminación externa de los materiales (cultivos celulares, stocks microbiológicos). Ej.: Gabinetes de
Elaborado por: Dra. María Victoria Figueroa Ramírez
seguridad biológica (BSCs), recipientes cerrados, cubetas de centrifugas. También se incluyen elementos de protección personal, tales como guantes, delantales batas, cobertores de zapatos, botas respiradores, cofias, tapa bocas, anteojos de seguridad y mascaras faciales.
BARRERAS SECUNDARIAS
Son las que contribuyen en la protección de quienes trabajan en el laboratorio y la comunidad evitando el escape de agentes infecciosos al medio ambiente. Se refieren al diseño y construcción de la planta física, sistemas de descontaminación del sitio de trabajo y del personal, dichas características incluyen procesos de ventilación especializados para asegurar el flujo del aire direccional, zonas de acceso controladas.
GRUPOS DE RIESGO BIOLOGICO GRUPO DE RIESGO 1
Microorganismos que representan escaso riesgo para el individuo y la comunidad, tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales por
Ejemplo agentes como: Naegleria gruberi, Bacillus subtilis, entre otros. GRUPO DE RIESGO 2(GR2)
Microorganismos que representan riesgo moderado para el individuo y limitado o bajo para la comunidad; pueden provocar enfermedades humanas o animales pero tienen bajas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagaciónes limitado por ejemplo existe disponibilidad de tratamiento y medidas preventivas y el riesgo de diseminación está limitado, por ejemplo agentes como; Micobacterium (excepto M. Boris y M. tuberculosis), Helicobacter, Salmonella, E. coli, Shigella, Streptococcus, Staphilococcus, HIV, virus de la hepatitis A, B, C, D y E, entre otros.
GRUPO DE RIESGO 3 (GR3):
Microorganismos que representan riesgo elevado para el individuo y escaso para la comunidad; usualmente causan enfermedades serias a humanos y animales que resultan en importantes consecuencias económicas, la diseminación no es ordinaria y depende del contacto casual de un individuo a otro, puede haber disponibilidad de medidas preventivas y terapéuticas eficaces, por ejemplo agentes como; Micobacterium tuberculosis. M. bovis, M. leprae, Histoplasma capsulatum, virus de la Influenza incluyendo HPAI (H7 y H5),
Virus del Nilo, entre otros. GRUPO DE RIESGO 4 (GR4):
Microorganismos que representan riesgo elevado para el individuo y para la comunidad; causa serias infecciones a humanos o animales, en ocasiones sin tratamiento y puede transmitirse fácilmente de un individuo a otro, o de un animal a humano o viceversa directa o indirectamente o por contacto casual; normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces, por ejemplo agentes como; Ebola, Hanta, virus de la rabia de murciélagos, Nipah, Junin, entre otros.
Agentes que desarrollan enfermedades que no están reportadas en el país (exóticas); su introducción y presencia están reglamentadas por leyes sanitarias locales, por ejemplo agentes como; Enfermedad de Aujeszky, CAE, virus de la hepatitis en patos, Nairobi, enfermedad Teschen, virus serotipo BT, enfermedad del caballo africano, entre otros.
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
Las recomendaciones de la CDC describen cuatro niveles de bioseguridad que constan de combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad e instalaciones, representando las condiciones bajo las cuales el agente pueda manipularse de una forma segura.
La adopción de los diferentes se efectúa de forma dinámica, y se clasifica de acuerdo:
-Grupo de microorganismos infectantes - Técnicas y prácticas de laboratorio -Equipos de seguridad.
-Tipo de laboratorio.
Nivel 1: Representa un sistema básico empleado en prácticas microbiológicas estándar, sin ninguna barrera primaria y secundaria.
Nivel 2: es adecuado cuando se trabaja con sangre humana fluidos corporales, tejidos, etc., donde puede existir la presencia de un agente infeccioso desconocido
Nivel 3: Trabajo con agentes exóticos con potencial de transmisión respiratoria que puede provocar una infección grave o potencial mente letal, se enfatizan barreras primarias y secundarias.
Nivel 4: trabajo con agentes peligrosos o tóxicos que representa un alto riesgo individual de enfermedades que ponen en peligro la vida, para las cuales no existen vacunas o terapias disponibles.
EQUIPOS DE SEGURIDAD.
Es un hecho aceptado que una buena parte de las infecciones adquiridas en los laboratorios son debidas, además de los accidentes que pueden tener lugar (roturas, salpicaduras, cortes y pinchazos), a la inhalación de aerosoles con potencialidad infectiva que se generan en las diversas operaciones del laboratorio clínico.
Se debe implementar una medida donde para la correcta manipulación de materiales peligrosos. Es evidente que la eliminación de materiales peligrosos debe conllevar a la evolución del fundamento de las tradicionales campanas de humos, las cuales precisan la protección del producto manipulado como la del trabajador, sumándose a esta necesidad la protección del medio ambiente laboral y comunitario.
CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA.
Son equipos que proporcionan una barrera de contención para trabajar de forma segura con agentes infecciosos. Presenta diversos nombres tales como cabinas de seguridad, campanas microbiológicas, o campanas de flujo laminar.
Figura 1. Cabina de seguridad biológica
Estos equipos han sido diseñados para mantener un área denominada zona de trabajo libre de partículas y de contaminantes tales como bacterias que puedan alterar el producto con el cual se trabaja, al trabajador o al medio ambiente.
La protección se logra mediante la combinación de elementos electromecánicos/electrónicos (motor, ventilador, filtro, ductos, eliminación, etc.) y procesos físicos (flujo laminar, diferencias de presiones) que impulsan el aire a través de unos filtros especiales de gran superficie, estratégicamente ubicados que tienen una eficiencia mínima de retención de partículas de 99,99%, estos filtros son conocidos como FILTROS HEPA y resultan adecuados para retener aerosoles que se generan cuando se realizan procedimientos experimentales con agentes biológicos como agitación, centrifugación o mezcla.
ESTERILIZACION MARCO TEORICO
Es la eliminación de toda forma de vida de un medio o material, utilizando, medios físicos como la filtración, y el calor, medios químicos como alcoholes, fenoles, desinfectantes.
ASEPSIA: se define como la eliminación de material orgánico extraño de la superficie de los objetos, se logra con la acción manual directa o mecánica con el uso de agua y jabón o soluciones detergentes y algunos germicidas. Etapas del proceso de esterilización
Limpieza y descontaminación: es la remoción de toda materia extraña en la superficie de objetos inanimados mediante el uso de agua y soluciones jabonosas. La descontaminación disminuye la carga microbiana de los materiales dejándolos seguros para su manipulación.
Inspección: corresponde a la evaluación visual de los artículos lavados buscando desperfectos o suciedad que pueda interferir en los métodos de esterilización.
PREPARACION /EMPAQUE
Se debe preparar, empaquetar los artículos facilitando su uso y evitando daños y deterioro del material.
ESTERILIZACION ALMACENAMIENTO
Los artículos se conservan hasta su uso asegurándose la esterilidad o proceso de desinfección
ENTREGA DE MATERIALES
Es la distribución de los elementos de trabajo en sus aéreas correspondientes, teniendo en cuenta la cantidad y la calidad necesaria para su utilización.
Tipo de material Procedimiento Ejemplo Material critico: aquel
que entra en contacto con tejidos estériles o con el sistema vascular.
Esterilización Instrumental quirúrgico Implantes
Aparatos de endoscopias Catéteres, sondas, drenajes, agujas
Material semicríticos: aquellos que están en
contacto con membranas, mucosas y piel no intacta Desinfección de alto nivel Aparatos de endoscopia Endoscopios flexibles Maquinas de diálisis Otoscopio, sinuscopio Equipos de terapia respiratoria Especulo vaginal Termotetos rectales Material no critico: aquel
que entra en contacto con piel intacta no con membranas mucosas
Desinfección de nivel
intermedio o bajo Termómetros de axilaOrinales planos Fonendoscopios Desfibriladores
Manguitos de tensión arterial.
Principales métodos de esterilización
MÉTODOS QUÍMICOS: Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.
1) OXIDO DE ETILENO:
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Destruye todos los microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma, plástico, papel, etc.), equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerígeno.
2) ALDEHIDOS: Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas, provocando una modificación irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimática. Estos compuestos destruyen las esporas.
3) GLUTARALDEHIDO: Consiste en preparar una solución alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos. Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Puede esterilizar plástico, goma, vidrio, metal, etc. 4) FORMALDEHIDO: Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodón, que después pueden ser expuesta al calor para una rápida esterilización (acción del gas formaldehído). También pueden ser usadas en Estufas de Formol, que son cajas de doble fondo, en donde se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60° C y pueden esterilizar materiales de látex, goma, plásticos, etc. Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs.
5) GAS PLASMA DE PEROXIDO DE HIDROGENO: Se usa la forma en gel del peróxido de hidrogeno usado a baja temperatura es biocida, no deja residuos tóxicos se convierte en agua y oxigeno su actividad se logra entre 54 y 75 minutos, su utilización es muy costosa.
Posee como ventajas:
No deja ningún residuo tóxico.
Se convierte en agua y oxígeno al final del proceso. El material no precisa aireación.
El ciclo de esterilización dura entre 54 y 75 minutos. Desventajas:
No se pueden esterilizar objetos que contengan celulosa, algodón, líquidos, humedad, madera o instrumental con lúmenes largos y estrechos.
Es el método de esterilización más caro de entre los descritos. MÉTODOS FÍSICOS:
1.CALOR: la efectividad de este método depende del tiempo de exposición y la temperatura debido a que todos los microorganismos son susceptibles a diferentes grados de temperaturas provocando desnaturalización de
proteínas, desorganización de las membranas y procesos oxidantes irreversibles.
2. CALOR HÚMEDO: produce desnaturalización y coagulación de proteínas debido a que el agua genera reacciones en estructuras biológicas debido a que posee un coeficiente de calor mucho mas elevado que el aire, presentando como ventajas rápido calentamiento y penetración, destruye las bacterias y esporas en corto tiempo, sin dejar residuos tóxicos, hay un bajo deterioro del material expuesto y es económico
2.1.AUTOCLAVE : Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión utilizando 120 º (estas condiciones pueden variar) durante 20- 30 minutos, constituido por una caldera de cobre sostenida por una camisa externa mecánica recibiendo calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica que se cierra por una tapa en bronce en la parte superior presentando tres orificios uno para el manómetro, otro para el escape de vapor y el tercero para una válvula de seguridad que funciona como resorte, se debe colocar agua en la caldera si alcanzar los objetos que se encuentra en la rejilla de metal, se cierra asegurando la tapa, si ajustar las grapas, dejando abierta la válvula de escape hasta que libere todo el vapor en forma de chorro continuo y abundante.
2.2. TYNDALIZACION: esterilización por acción discontinua del vapor de agua, aplicando el principio TYNDAL, donde las bacterias son destruidas por la repetición de la misma operación con intervalos separados y en varias sesiones, efectuándose por medio del autoclave, dejando abierta la válvula de escape, es decir funcionando a la presión normal, también puede realizarse a temperatura menores como 56 º- 80º evitando la descomposición de las sustancias a esterilizar.
Ventajas del calor húmedo:
Rápido calentamiento y penetración
Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo
No deja residuos tóxicos
Hay un bajo deterioro del material expuesto
Económico Desventajas:
No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos 3. CALOR SECO:
Produce desecación de las células debido a los elevados niveles de electrolitos y fusión de membranas mediante la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos la acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material esta seco o la actividad del medio son bajos.
La utilidad del calor seco no permite una actividad corrosiva en metales e instrumentales, permitiendo la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, viscosas y no volátiles.
3.1. ESTUFAS
Se mantiene una temperatura estable mediante termostato de metal que al dilatarse por el calor cortan el circuito eléctrico generando una resistencia la cual circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperaturas de 170º para el instrumental metálico.
Ventajas del calor seco:
No es corrosivo para metales e instrumentos.
Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.
Desventajas:
Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.
3.2. LLAMA DIRECTA
Se usa para esterilizar asas bacteriológicas, agujas de disección y se realiza a través del mechero.
4. RADIACIONES: su acción depende de: tipo de radiación, tiempo de exposición y la dosisi. Se utilizan en salas de cirugía.
4.1. IONIZANTES:
Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos.
Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos.
4.2. RAYOS ULTRAVIOLETAS:
Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilización en quirófanos.
4.3. RAYOS GAMMA:
Su empleo está basado en los conocimientos sobre la energía atómica. Este tipo de esterilización se aplica a productos o materiales termolábiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibióticos, vacunas, alimentos, etc.
5. FILTRACIÓN
Se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están en el límite de separación según el diámetro de poro que se utilice.
La filtración se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas. Materiales
Estufa Autoclave
Horno esterilizador Cámara de flujo laminar
Mecheros Cajas de petri Papel kraft
Cinta de enmascarar CONSULTA
1. Mencione las diferencias entre un laboratorio de microbiología y un laboratorio convencional.
2. Mencione los pasos a seguir cuando un cultivo líquido bacteriano se derrama sobre una superficie.
3. ¿Qué características de un material o sustancia se requieren conocer para elegir el método adecuado de esterilización?
Práctica 02
Principios básicos de pruebas inmunológicas
OBJETIVOS GENERALES:
Comprender el fundamento y la utilidad de los diferentes tipos de enzimoinmunoensayos.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Establecer diferencias entre los diversos tipos de pruebas serológicas.
Conocer el mecanismo de acción y las propiedades de las enzimas y sustratos empleados en los enzimoinmunanalisis.
Realizar el procedimiento para la reacción antígeno-anticuerpo. MARCO TEORICO.
El sistema inmune es aquel conjunto de estructuras y procesos biológicos que en el interior de organismo genera una protege contra enfermedades identificando y matando células patógenas y cancerígenas. 1Detecta una amplia variedad de agentes, desde virus hasta parásitos intestinales 23 y necesita distinguirlos de las propias células y tejidos sanos del organismo para funcionar correctamente. El sistema inmune está compuesto de leucocitos, anticuerpos, citoquinas, macrófagos, entre otros componentes que ayudan a su funcionamiento.
La detección es complicada ya que los patógenos pueden evolucionar rápidamente, produciendo adaptaciones que evitan el sistema inmunitario y permiten a los patógenos infectar con éxito la célula huésped. Sin embargo, existen técnicas de laboratorio que han sido diseñadas para evidenciar bajo diversas formas la reacción antígeno-anticuerpo.
PRUEBAS DE AGLUTINACION DE PARTICULAS.
Es una reacción serológica clásica que comprende la aglomeración de una suspensión celular mediante un anticuerpo específico. Este fenómeno se puede observar cuando antígenos corpusculares, como las células sanguíneas o bacterias se exponen a un anticuerpo específico en condiciones adecuadas. Las reacciones con antígenos solubles se pueden adaptar a las pruebas de aglutinación mediante el recubrimiento o
Elaborado por: Dra. María Victoria Figueroa Ramírez
acoplamiento covalente del antígeno o del anticuerpo especifico o un transportador corpuscular, es decir, eritrocitos, partículas de látex, etc. En esta reacción primero se une el anticuerpo con el antígeno y luego se produce la aglutinación, el anticuerpo recibe la denominación de completo. Si el anticuerpo se une a un antígeno específico de los hematíes sin producir aglutinación se trata de un anticuerpo incompleto. Estos se determinan a través de la prueba de antiglobulina donde se produce la aglutinación de los eritrocitos en solución salina cuando la mezcla contiene 20-30% de concentración de albumina o las células rojas han sido tratadas con ciertas enzimas proteolíticas. Presenta como ventaja el alto grado de sensibilidad y la gran cantidad de antígenos que se pueden detectar mediante el uso de partículas recubiertas de antígeno o anticuerpo. Las reacciones de aglutinación se pueden clasificar en directas, indirectas (pasivas) o antiglobulinas.
Precipitación.
Se trata de la mezcla de un anticuerpo con un antígeno homologo, estando ambos en solución, conduciendo a la formación de un precipitado frecuentemente referido como precipitado inmune. Presentan un alto índice de sensibilidad y pueden ser cualitativas y cuantitativas.
Clases de inmunoanalisis.
Los inmunoanalisis son técnicas para detectar y cuantificar los antígenos o los anticuerpos. Pueden emplearse reactivos marcados o sin marcar. Los inmunoanalisis sin marcar presentan limitaciones en cuanto a su sensibilidad, ya que para conseguir la detección deben formarse grandes complejos antígenos-anticuerpo. Ej.: inmunoprecipitacion, de aglutinación y de dispersión lumínica, para detectar dichos complejos por técnicas de equilibrio o cinéticas empleándose en el análisis de proteínas.
Las técnicas de inmunología clínica son de naturaleza variable técnicas como la fijación del complemento que hoy son consideradas obsoletas van siendo reemplazadas por técnicas más finas como el análisis inmunoenzimatico y nefelometría , por esto es indispensable estar familiarizados con la nueva tecnología existente y emergente lo que conlleva a mejorar la atención del paciente .
RADIOINMUNOANALISIS (RIA)
Consiste en le marcaje de antígenos o anticuerpos con isotopos radiactivos para la detección del Ac o Ag correspondiente en la muestra del paciente, este método presenta alta sensibilidad y especificidad donde pueden ser usadas para dosificación de hormonas, fármacos, Antígenos y Anticuerpos. Ejemplo cuantificación de hormona del crecimiento, tiroideas, testosterona, marcadores tumorales, y PSA. Estas técnicas pueden ser de tipo en Sandwich, competitivo.
INMUNOFLUORESCENCIA
Se utiliza para demostrar la presencia de Ag o Acs específicos buscando visualizar la unión Ag-Ac con la ayuda de sustancias fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína). Se utilizan dos variantes: directa e indirecta, las cuales permiten detectar Chlamydia tracomatis, y Bordetella pertusis, Acs antinucleares, antimitocondriales.
ANALISIS INMUNOENZIMATICO (ELISA)
Esta técnica dispone de un gran número de Acs monoclonales al desarrollo de Ags recombinantes específicos, para muchas enfermedades infecciosas y autoinmunes. Han tomado el lugar del radioinmunoanálisis ofreciendo una sensibilidad comparable, sin los problemas de disponibilidad y corta vida media asociada con materiales radioactivos aparte de la contaminación con estas sustancias, estas pruebas tienen la ventaja de permitir procesar un gran número de muestras en corto tiempo determinando la concentración de un Ag o Ac por medio del uso de uno de ellos en fase solida y el otro en solución, detectándose posteriormente el complejo Ag- Ac mediante una enzima catalizada por un sustrato (fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa ).
Existen diversos tipos de ELISA: Análisis inmunoenzimatico indirecto, competitivo.
NEFELOMETRIA
Esta técnica se basa en la detección de los complejos Ag-Ac, por la refracción que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos láser y se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados.
INMUNODIFUSION
Es la detección de complejos inmunes antígeno-anticuerpo visualizado por precipitación en una placa de agar pueden ser sencillas o dobles.
FIJACION DE COMPLEMENTO
Permite detectar una gran variedad de anticuerpos, el suero del paciente es sometido a diluciones a las que se le agrega cantidades constantes del antígeno correspondiente si hay presencia de anticuerpos en el suero se presenta la formación de complejos inmunes. Al adicionar complemento ala reacción dichos complejos fijan el complemento y lo consumen. Como paso final se agregan a la reacción glóbulos rojos de carnero sensibilizados con un Anticuerpo específico (hemolisina). Que requiere del complemento para producir lisis celular
CITOMETRIA DE FLUJO
Es un método que permite la determinación simultanea de múltiples características físicas de una célula, mientras pasan a través del instrumento de medición formando una sola fila a una velocidad de 500-4000 células por segundo permitiendo estimar el tamaño de la célula las características de su superficie y citoplasma y su contenido de DNA.
RADIOINMUNOELECTROFORESIS
Es desarrollada usando antígenos o haptenos marcados con radioisótopos para la investigación de anticuerpos.
El suero en ensayo es recorrido por una capa de gel en la canaleta longitudinal se coloca una mezcla de antígeno radioactivo y antisuero contra la fracción globulìnica del suero en ensayo. El antígeno se combina con el anticuerpo específico formando complejos que luego son precipitados por el suero antigammaglobulina. Después el precipitado es lavado para eliminar las proteínas no precipitadas, el preparado es secado y previa coloración o
Elaborado por: Dra. María Victoria Figueroa Ramírez
sin ella las placas son puestas en contacto con una película sensible a rayos X. después de la exposición conveniente la película es revelada.
WESTERN-BLOT
Esta técnica es de gran ayuda en la identificación de muchos auto-anticuerpos que reaccionan con complejos antigénicos relacionados, y que por fluorescencia dan patrones de tinción muy similares difíciles de diferenciar , comienza con la degradación del DNA a través de una electroforesis en el cual se evidencian las bandas luego se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o nailon agregando sondas marcadas con fluorocromos la cual es complementaria a la secuencia evidenciándose a través de rayos x.
CONSULTA.
1.- Defina que es la inmunoquimica?
2.- defina que es un anticuerpo, antígeno, precipitar y aglutinar.
3.- que son anticuerpos monoclonales y policlonales.de ejemplo de cada uno de ellos.
4.- defina hemoaglutinación directa e indirecta y de ejemplos.
Práctica 03
Medio de cultivo
OBJETIVOS GENERALES:
Reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para el crecimiento de microorganismos y aplicar los conceptos básicos de el diagnostico microbiológico (coloraciones, aislamiento, e identificación bacteriana). OBJETIVOS ESPECIFICOS
Conocer las coloraciones más utilizadas en microbiología.
Analizar la definición, clasificación y propiedades de los medios de cultivo. Determinar la descripción microscópica de las bacterias.
MARCO TEORICO.
Como todos los organismos vivos, microorganismos requieren ciertos nutrientes básicos y factores físicos para el mantenimiento de su vida, estas necesidades varían según el tipo de microorganismo y es necesario conocerlas para cultivarlos en el laboratorio.las necesidades nutricionales básicas pueden suministrarse en el laboratorio por la variedad de medios de cultivo; estos en general suministran:
1) Fuente de carbono 2) Fuente de nitrógeno
3) Elementos no metálicos 4) Elementos metálicos 5) Vitaminas
6) Agua 7) Energía
Las necesidades físicas involucran factores como la temperatura, PH, gases los cuales se encuentran en un rango óptimo especifico para cada microorganismo generando una variación que acelere o disminuya su crecimiento.
De manera general estos medios pueden ser artificiales o químicamente definidos en el cual los microorganismos toman sus requerimientos nutricionales a partir de la composición de estos medios.
Medios de cultivo
Es una solución acuosa en las que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un determinado microorganismo.
PROPIEDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
La humedad: indispensable para el crecimiento de microorganismos, su carencia (desecación) puede llevar a la muerte del microorganismo.
Fertilidad: Se refiere a los elementos o compuestos básicos que permiten el crecimiento bacteriano.
PH: Es la condición optima para el desarrollo bacteriano indispensable para su aislamiento; variaciones acidas ó alcalinas pueden inhibir su crecimiento. Transparencia: Permite la observación bacteriológica, evidenciar morfológica y físicamente su crecimiento en medios de cultivo adecuado.
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS SEGÚN SU ESTADO FISICO
Sólidos = 1.5-2.0 % de agar-agar.
Semisólidos = 0.5% de agar-agar.
Líquidos = no contienen agar.
Bifásicos = Contienen fase solida y fase liquida/ listos para utilizar. SEGÚN SU NATURALEZA O COMPOSICION
Naturales = utilizados para cultivar m.o tal y como se encuentran en la naturaleza, se usan con base a la experiencia y no a su composición. Ej. sangre diluida, leche, jugos vegetales.
Sintéticos = de composición exactamente conocida. Los más utilizados son los medios deshidratados comerciales.
Vivos = contienen células u organismos vivos, como las células de riñón de mono o huevos embrionados.
SEGÚN SU PROPOSITO
Medios enriquecidos = Con adición de sangre, suero o extractos de tejidos de animales o plantas al caldo o agar, proporcionando
Elaborado por: Dra. María Victoria Figueroa Ramírez
sustancias nutritivas complementarias para el crecimiento de m.o exigentes.
Medios selectivos = con adición de algunas sustancias que no permiten el desarrollo de un grupo de m.o sin afectar el desarrollo de los grupos de interés. En principio se pueden seleccionar los m.o que se desarrollan en medios orgánicos poco comunes, caso en el cual se omiten otros compuestos de carbono.
Medios diferenciales = contienen reactivos químicos que traen como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano después de la incubación (observación de hemolisis y coloraciones de las colonias).
Medios para identificación = para determinar el tipo de crecimiento producido por los microorganismos así como la capacidad para producir cambios químicos, se utiliza de manera convencional una amplia variedad de medios de cultivo.
Existen medios que pueden cumplir funciones mixtas en la cual favorece el aislamiento del microorganismo y muestra una reacción o cambio químico especifico del metabolismo cumpliendo una función de medios selectivos y diferenciales al tiempo.
La presentación comercial de los medios sintéticos y deshidratados puede ser en polvo o granulados. En l mercado se pueden encontrar medios listos para fundir o medios servidos en placas Petri o tubos.
ALMACENAMIENTO Y CONSERVACION.
Los medios de cultivo deshidratados se deben conservar en un lugar seco, protegidos contra la luz, a una temperatura entre 15-30 C y en envase bien cerrados. Después de haber sido retirada una cantidad de medio en los envases, estos debes cerrarse firmemente. Los medios de cultivo preparados y esterilizados listos para su uso son utilizables por tiempos cortos, máximo de una semana y lo más conveniente es almacenarlos a temperatura de refrigeración (máximo 4 C), aunque algunos medios que contienen tioglicolato se conservan mejor a temperatura ambiente, y protegidos de la luz por un tiempo máximo de 4 días. Bajo condiciones óptimas de almacenamiento los medios deshidratados conservan sus cualidades el tiempo indicado de caducidad impreso en la etiqueta del recipiente.
A los medios de cultivos se les realiza Test de esterilidad, ya sea cuando están deshidratado (ecomètrico), o preparados. En el último caso se toma del lote una muestra no inferior al 5% incubándose estas muestras a 37C/24 horas. Finalizado el tiempo de incubación se observa si presenta crecimiento microbiano con el fin de descartar los medios contaminados.
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
1.-DISOLUCION DEL MEDIO DE CULTIVO DESHIDRATADO.
Se debe emplear agua limpia, recién destilada o desmineralizada y con pH lo mas cercano posible al neutro. Los recipientes a usar deben ser lo suficientemente grandes para que el medio sea agitado con facilidad.
Inicialmente, se añade la mitad de agua y se agita y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea; después se incorpora la cantidad de agua restante. Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento, no debe calentarse más de lo estrictamente necesario. Leer siempre la etiqueta del envase, en caso de que no deba ser sometido a esterilización en autoclave, es imprescindible prestar atención en su disolución completa, esto se conforma cuando al agitar no se adhiere a la pared interna del recipiente ninguna partícula de agar o medio y la solución resbala libremente.
2.- ESTERILIZACION
Antes de su esterilización y después de su completa disolución se debe repetir el medio de cultivo en los recipientes definitivos o en los que se lleva a cabo el trabajo de investigación, excepto si corresponde a cajas de Petri. La esterilización, si así lo indica la etiqueta, se lleva a cabo en el autoclave 121 ºC a 15 libras de presión por 15 minutos.
Tras la esterilización y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones (válvula abierta) y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo, este debe sacarse enseguida del autoclave y enfriar los recipientes rápidamente a temperatura de vertido entre 45-50C, evitando la alteración del medio de cultivo.
3.-VERTIDO EN PLACA.
Remover previamente el medio de cultivo oscilando el recipiente en sentido circular para entremezclarlo de manera uniforme. Verter el medio a las cajas de Petri a la temperatura de vertido evitando la formación de humedad en la tapa de la caja de Petri. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente con la llama no luminosa de un mechero de bunsen.
4.-TUBOS DE AGAR INCLINADO Y SIN INCLINADO.
Los tubos llenos de medio de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en una posición inclinada de tal forma que se forme una placa de aproximadamente 3cm y una superficie inclinada de iguales dimensiones. (Agar inclinado en pico de flauta). En los casos en los cuales se requiere el medio sin inclina, estos deben dejarse solidificar en posición vertical sobre una gradilla.
POSIBLES DEFECTOS EN LA MANIPULACION Y PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una conservación en ambiente exclusivamente húmedo, puede ser la causa de envase abierto por tiempo prolongado o dejar mal cerrado el envase después de su uso o por ultimo que el medio de cultivo este pasado de fecha. Se recomienda después de usarlos, cerrarlos muy bien y almacenarlos en posición horizontal.
Desviación del pH causado por utilización de agua no neutra, envase mal cerrado, sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación o medio pasado de fecha.
Turbidez, precipitación causada por uso de recipientes incorrectamente limpios, sobrecalentamiento, pérdida de agua por evaporación del medio.
Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporción inadecuada del medio de cultivo deshidratado, mala disolución, ineficiencia en la agitación.
Medios de cultivo contaminados por esterilización deficiente o contaminación en su preparación.
Colonias incorrectas o desleídas causada por superficie del medio húmeda y por demasiado inoculo en la siembra.
CLASES DE MEDIO DE CULTIVO MEDIOS SIMPLES
Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.
Agar nutritivo = contiene extracto de carne, peptona, agar.
Caldo nutritivo = contiene extracto acuoso de carne adicionado de peptona al 1% y cloruro de sodio al 0.5% EJ. BHI (brain heart infusión), TSB (caldo de soya tripticasa).
Blood Agar base o Trypticasa soya Agar = medio solido que contiene peptona, enriquecido con sangre desfibrinada de conejo al 7% usando para el desarrollo de todo tipo de bacterias y especialmente para observar la actividad hemolítica.
MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).
Agar sangre = al medio Blood agar sangre se le añade sangre de conejo desfibrinada al 7 % estéril cuando este tenga una temperatura de 45C luego de su esterilización.
Agar chocolate = consiste en un agar sangre que antes de su solidificación se lleva a 100C por 1 minuto (ebullición) rompiendo los glóbulos rojos tomando un color marrón. Se usa para el aislamiento de Haemophillus y Neisseria.
Medio Tioglicolato = permite el aislamiento de aerobios tolerante y anaeróbicos. Debe conservarse en la oscuridad, en tubos tapa rosca, de manera que la anaerobiosis se mantenga en el fondo y la aerobiosis en la superficie.
MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES
Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.
Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.
Agar Mac Conkey = medio selectivo para el crecimiento de enterobacterias. Contiene peptona, sales biliares, lactosa, y rojo neutro.
Agar SS = contiene sales biliares en mayor concentración que el Agar Mac Conkey y verde brillante que impide el crecimiento de bacterias coliformes pero permite el crecimiento de Salmonella y Shigella.
Agar EMB (eosina azul de metileno) = contiene colorante que impide el crecimiento de bacterias Gram positivas, las colonias de E. coli generan un brillo metálico característico.
MEDIO DE TELURITO
Permite el crecimiento de Corynebacterias, Staphylococcus, Listeria. El telurito de potasio al 2% es reducido por las Corynebacterias reductoras apareciendo colonias de color gris-negro.
Medio de Sabouraud = contiene dextrosa peptona o maltosa agar, pH entre 5-5.5 inhibiendo el desarrollo de microorganismos que no sean hongos.
MEDIOS DE TRANSPORTE
Mantienen viables los microorganismos de una muestra antes de que se procesen, las conservas evitando su multiplicación y su muerte.
Medio de Stwart = se utiliza para transportar muestras de materiales purulentos recogidos con escobillón estéril, contiene un medio de buffer glicerinado, permitiendo el transporte de muestras de materia fecal para coprocultivos manteniendo la viabilidad de la Shigella.
MATERIALES Y EQUIPOS
CAJAS DE PETRI
TUBOS DE ENSAYO
PIPETAS
ERLENMEYER
AUTOCLAVE
CINTA DE ENMASCARAR
GASA
ALGODÓN
MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS
MECHERO DE BUNSEN ESTUFA ELECTRICA BALANZA ESPATULAS AGUA DESTILADA PROBETAS PAPEL FILTRO
FRASCOS TAPA AZUL 250 ML
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
Hacer el cálculo correspondiente para la preparación del medio de acuerdo con las indicaciones del profesor.
Medir el volumen de agua destilada según los cálculos
Teniendo en cuenta el volumen de agua que debe utilizar, hacer la relación de medio a pesar de acuerdo a lo especificado por la etiqueta del medio.
Pesar la cantidad de medio necesario de acuerdo a sus cálculos.
Mezclar el medio deshidratado con la mitad del agua, agitar suficientemente y agregar el agua restante. Llevar a ebullición si es necesario (en el caso de agares).
Esterilizar en autoclave según las indicaciones que menciones la casa comercial
Finalizada la esterilización servir asépticamente aproximadamente 15 o 20 ml del agar en la caja de petri o el volumen adecuado según el tamaño de los tubos.
COLORACIONES APLICADAS EN MICROBIOLOGIA.
Las bacterias o procariotas, son microorganismos unicelulares que se reproducen por fisión binaria (división simple). Muchos tienen vida libre. Contienen información genética, sistemas de producción de energía y sistemas biosintéticos necesarios para el crecimiento y reproducción.
Las bacterias se presentan con una morfología definida que está determinada por su pared rígida. Se pueden presentar como esféricas, ovaladas, denominándose cocos. Si la forma es cilíndrica se denominan bacilos o bastones. Estos bastones pueden ser rectos, curvos o con forma de espiral, en este último caso les llamamos espirilos.
TINCION DE GRAM
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleada en microbiología para la visualización de bacterias,
sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gram positivas a las bacterias que se visualizan de color moradas y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa o rojo. El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fuscina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
PROCEDIMIENTO COLORACION DE GRAM
1.-Agregar reactivo cristal violeta sobre la lámina durante 1 minuto, lavar y escurrir la lamina.
2.- Adicionar reactivo de lugol sobre la lámina por 1 minuto, lavar y escurrir. 3.- Adicionar alcohol cetona por 30 segundos o hasta decolorar la lamina. 4.- Agregar fuscina sobre la lámina por un minuto, lavar y escurrir.
C CULTIVO SÓLIDO E B CULTIVO LÍQUIDO F D
Preparación y fijación de frotis. CONSULTA
1. ¿Por qué es necesario esterilizar los medios de cultivo y realizar
controles a cada lote que se fabrica?
2. Método de esterilización utilizado para la esterilización de placas de
Petri de plástico.
3. ¿Cómo puede determinar si la colonia que se eligió para aislar es un cultivo puro?
4. Escriba el fundamento de las siguientes coloraciones también aplicadas en el campo de la microbiología.
Coloración Ziehl Neelsen
GIEMSA
Práctica 04
Técnicas de Siembras y aislamientos
OBJETIVOS GENERALES:
Que el alumno aplique diferentes técnicas de siembra y aislamiento de cultivos de bacterias en medios sólidos.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Realizar coloración de Gram para determinar la morfología de las bacterias utilizadas y para adquirir destreza en la elaboración del frotis.
MARCO TEORICO.
El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros.
El proceso de colocar las bacterias en medios de cultivo recibe el nombre de SIEMBRA, esta la podemos realizar a partir de muestras biológicas (orina, pues, secreciones, etc.), o de un cultivo bacteriano a otro denominado subcultivo o repique.
Para el estudio de las bacterias es necesario conocer tanto su morfología microscópica como macroscópica a partir de su crecimiento en medios de cultivos; estas se observan en las colonias bacterianas; se puede evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos o proporcionales a aquellos nutrientes que favorezcan su desarrollo.
Los elementos importantes para realizar la siembra son: el mechero, asa bacteriológica y los medios de cultivo incubados y atemperados a 37C en la incubadora, contando con estos implementos podemos realizar la siembra. TIPOS DE SIEMBRA.
SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN CAJA DE PETRI.
Mediante ella se busca obtener colonias separadas a partir de un inoculo para ello se toma con el asa previamente esterilizado al mechero. La muestra; se coloca en un área periférica de la caja de petri haciendo movimientos circulares para homogenizar el inoculo, precediéndose a usar estrías horizontales con el asa de argolla hasta la mitad o una tercera parte de la caja de petri. Recordar la constitución del medio, por lo tanto, deslizar el asa con suavidad y sin romper el agar. Gire la caja de petri hacia la izquierda y realizar el mismo procedimiento hasta lograr el objetivo final.
SIEMBRA EN TUBO INCLINADO.
Para la siembra en tubos con medio solido inclinado en bicel, se realiza movimiento en zic-zac deslizando el asa sobre la superficie y marcando surcos o estrias. Para este tipo de siembras aunque se puedan utilizar los dos tipos de asa bacteriológicas se prefiere el asa recta. Es importante mantener siempre el tubo inclinado para evitar contaminación por bacterias ambientales que proceden de la muestra. Los tapones de algodón o las tapas roscas de los tubos deben manipularse con el dedo meñique y anular de la mano derecha y nunca dejarlo sobre los mesones, ellos pueden contaminar la siembra.
Es importante flamear el asa antes de tomar la muestra, y flamear la boca del tubo, no tocar las paredes del tubo con la muestra y devolver el asa a su lugar previamente esterilizada después de haber realizado el procedimiento. SIEMBRA POR PICADURA EN TUBO.
Se realiza con el asa recta en medio solido generalmente sin inclinar aunque puede ser en agar inclinado en algunas ocasiones. Se introduce el asa con el inoculo por el centro de la superficie del medio de cultivo y hasta el fondo. No olvidar inclinar el tubo, flamear la boca junto al mechero y manipular correctamente los tapones.
SIEMBRA MIXTA EN TUBO.
Se realiza en forma combinada en picadura hasta el fondo del tubo y deslizando el asa por la superficie del agar en bisel marcando estrías.
SIEMBRA EN MEDIO LIQUIDO EN TUBO.
Se puede utilizar el asa bacteriológica, pipetas estériles, escobillones. Si se utilizan asas bacteriológicas, inocular el asa en el medio liquido haciéndola rotar.
Se debe marcar las cajas los tubos con sus respectivos nombres y fechas. Luego de realizar la siembra se debe proporcionar la temperatura y el tiempo adecuado para la proliferación o crecimiento bacteriano disponiendo de la incubadora o en dado caso un lugar adecuado a temperatura ambiente. Recuerda que las cajas de petri se incuban invertidas para evitar que la condensación que pueda formarse en la tapa de la caja caiga sobre el medio y disperse el crecimiento bacteriano.
La morfología de las colonias es un parámetro importante en el proceso de identificación bacteriana siendo las características comunes entre cada género bacteriano. Sin embargo esta morfología puede alterarse por tiempo de incubación, composición del medio de cultivo excesiva desecación de humedad etc.
OBSERVACION MACROSCOPICA DE CRECIMIENTO BACTERIANO. Se realiza a través de las características de las colonias aisladas, evaluándose de la siguiente manera:
Tamaño= grande, mediano, pequeño, puntiforme.
REDONDEADO ESPICULADO PLANA ACUMINADA PUNTIFIORME IRREGULAR
ONDULADO FILAMENTOSO PLANO CONVEXA UMBONADA CIRCULAR RIZOIDE
LOBULADO RIZOIDE CONVEXA PAPILALDA FILAMENTOSA FUSIFORME
PLANA ACUMINADA REDONDEADO ESPICULADO PUNTIFIORME IRREGULAR
PLANO CONVEXA UMBONADA ONDULADO FILAMENTOSO CIRCULAR RIZOIDE
CONVEXA PAPILALDA LOBULADO RIZOIDE FILAMENTOSA FUSIFORME
Forma Borde Elevación
Superficie = lisa o rugosa.
Consistencia = blanda, dura o mucoide.
Aspecto = brillante u opaco, traslucido.
Pigmento= amarillo, rojo, verde, etc.
hemolisis= parcial o alfa, total o beta, no hemolisis o gamma. PROCEDIMIENTO.
1.-Limpiar y desinfectar el área de trabajo. 2.- Realizar el frotis para la coloración.
3.- Sembrar por agotamiento en las respectivas cajas de medios de cultivo. 4.- Observar macroscópicamente el crecimiento bacteriano: tamaño, forma, borde, color, hemolisis.
Consulta
1. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación y fijación de frotis?
2. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la tinción de Gram? 3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la técnica de estría cruzada o por agotamiento? Proponga otras técnicas de aislamiento en medios sólidos que se aplican en microbiología.
4. fundamento de los medios de cultivo EMB, AN, MAC CONKEY Y TSI.
Práctica 05
Tipo de muestras útiles en microbiología, estructuras
micóticas, hongos ambientales, toma de muestra.
OBJETIVOS GENERALES:
Reconocer morfológicamente las estructuras microscópicas de los diversos hongos.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Reconocer las estructuras propias de los hongos filamentosos o mohos. Conocer e identificar las diversas formas de toma de muestra y su correspondiente transporte en el área de microbiología.
Observar diferentes cultivos de hongos ambientales identificar su aspecto, color y pigmento.
Reconocer las estructuras de reproducción de los hongos ambientales con las cuales se pueden hacer su caracterización en el laboratorio.
MARCO TEORICO.
TOMA DE MUESTRAS MICROBIOLOGICAS.
La calidad diagnostica del laboratorio de microbiología clínica depende de la calidad de la muestra recibida y su optima recolección y transporte, debido a que un error en estos parámetros conlleva a errores diagnósticos y un posterior tratamiento inadecuado.
La muestra debe cumplir las siguientes indicaciones: 1.-nombre completo
2.-documento identidad 3.-género.
4.- paciente hospitalizado = piso, sala, cama. 5.- solicitud de examen
6.- impresión diagnostica.
CRITERIOS DE RECHAZO DE LAS MUESTRAS
Inconsistencia en la identificación del paciente
Muestra enviada en un frasco no estéril o con conservante.
Muestras con pérdidas o derrames
Muestra con cantidad insuficiente
Muestras con evidencia de contaminación MUESTRAS PROCESADAS EN MICROBIOLOGIA. 1.-TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR
EXUDADO FARINGEO
CAVIDAD OROFARINGEA
SENOS PARANASALES
EXUDADO NASAL
2.- MUESTRAS DE OIDO.
CONDUTO AUDITIVO EXTERNO
OIDO MEDIO TIMPANOCENTESIS. 3.- MUESTRAS OCULARES
EXUDADO CONJUNTIVAL
RASPADOS CORNEALES
4.- MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR
EXPECTORACION
ASPIRADO TRAQUEAL
SECRECIONES TRAQUEALES.
PUNCION TRANSTRAQUEAL
5.- MUESTRAS OBTENIDAS A TRAVES DEL FIBROBRONCOSCOPIO. ESTRUCTURAS MICOTICAS
Los hongos ambientales son contaminantes que circulan en la atmosfera de cualquier lugar, contaminan medios de cultivo, dentro de sus beneficios participan en el control biológico de plagas, degradan desechos orgánicos, se utilizan en la producción de alimentos antibióticos y químicos.
Dentro de su forma de condición encontramos: blastoconidias, mohos hialinos septados, aseptados y dematiaceos.
ESTRUCTURAS SOMATICAS DE LOS MOHOS
Conidióforo Esterigma Vesículas Microconidias Metula Esporangioforo Esporangio Esporangiosporas Columnela Rizoide Fialides Macroconidias.
ESTRUCTURAS MICOTICAS DE LAS LEVADURAS.
BLASTOCONIDIAS.
HONGOS TELEOMORFOS = reproducción sexual, se encuentran ascos con ascosporas basidios con basiodiosporas.
HONGOS ANAMORFOS = REPRODUCCION ASEXUAL artroconidos, blastoconidias, clamidoconidias, dictioconidios, aleurioconidios.
HONGOS HOLOMORFOS PERFECTOS = tienen los dos tipos de reproducción.
PROCEDIMIENTO
1.- Observar y describir la morfología micótica. 2.-montaje y observación de los hongos.
3.- descripción de los elementos observados.
4. realizar subcultivos de otros cultivos micoticos en agares sólidos. CONSULTA
1. medios de cultivo utilizados para el aislamiento de hongos
2. Técnicas de laboratorio utilizadas para la identificación de hongos
3. mencione 5 hongos ambientales (género y especie) y dibuje su estructura clave de identificación.
Práctica 06
Protozoos intestinales, coprológico, coproscópico
OBJETIVOS GENERALES:
Identificar la morfología de los diversos parásitos que causan alteraciones intestinales en el organismo.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Reconocer los equipos, materiales, reactivos que se utilizan en el laboratorio de parasitología, y recordar los principios fundamentales de trabajo en el laboratorio.
Describir las características macroscópicas y microscópicas de las muestras de materia fecal utilizadas en el coprológico.
Visualizar e identificas estructuras parasitarias en el microscopio. MARCO TEORICO.
El diagnostico de las enfermedades parasitarias no siempre es posible hacerlo por medio de la clínica y aun cuando este sea posible, siempre es necesario comprobarlo por la demostración del agente etiológico o por la comprobación de las reacciones que puede presentar el organismo parasitado. Así pues los métodos de diagnostico parasicológico en el laboratorio se puede dividir en:
Métodos directos = permiten ver al parasito, o sus estructuras (quiste, huevos, larvas, trofozoito).
Métodos indirectos = se investigan las reacciones citológicas o humorales del organismo parasitado (presencia de anticuerpos, estados alérgicos, etc.) estos métodos tienen un valor diagnostico inferior al de los métodos directos.
Técnicas comunes para detectar parásitos intestinales.
Coprológico.
Coproscópico (sangre oculta-azucares reductores)
Técnicas de concentración
Ziehl neelsen modificado.
Método de Graham.
INTERPRETACION DEL COPROSCOPICO:
Este examen incluye, además de un examen coprológico corriente, las siguientes pruebas: leucocitos, pH y azúcares reductores.
El pH fecal puede ser útil para la determinación etiológica, pH ácidos indican EDA de tipo viral y pH alcalinos indican EDA invasivas.
El pH fecal está alterado en la intolerancia de los azúcares, porque la reducción de los azúcares por las bacterias en el colon produce ácido. Los micelios nos indican EDA producida por hongos (las levaduras no tienen importancia).
Los azucares reductores están representados principalmente por lactosa y glucosa. Se consideran como indicadores de infecciones virales, infecciosas o indeterminadas en los niños.
Interpretación: Reacción intensa cualitativa a la lactosa es compatible con diarrea bacteriana tóxica. A la glucosa, con diarrea viral. La deficiencia de discaridasa manifestada por no desdoblar la lactosa de la leche materna, da intensa reacción positiva a la lactosa. Los leucocitos están presentes en las heces en enfermedades intestinales inflamatorias, esto puede ser el resultado de una EDA bacteriana o parasitaria, es así que entre 10-20 leucocitos (principalmente polimorfonucleares) indican EDA bacterianas invasivas 24.
Preparación del material a observar.
La solución salina se usa para la investigación de todos los parásitos intestinales y de sus formas derivadas (trofozoito-huevos- larvas) y en ella podemos ver sus movimientos, y realizar su respectiva caracterización. Los huevos inmóviles se ven con su morfología específica que ayudan a reconocerlos, los quistes de los protozoarios se verán refringentes, incoloros y muchas veces no es posible determinar a qué especie pertenecen.
Con el lugol, los quistes de protozoarios y los huevos se colorean detallando sus estructuras, los núcleos, flagelos, membrana, etc.
Recolección.
Las muestras fecales deben recogerse durante las deposiciones en un recipiente limpio, seco, de boca ancha y tapa hermética que mantenga la humedad. En el caso del Coproscópico se debe evitar comer carnes rojas, tomates, remolachas debido a que pueden ocasionar interferencias en la lectura de sangre oculta. El uso de laxantes y antibióticos debe suspenderse
porque puede inhibir o bloquear momentáneamente la aparición de los parásitos.
EXAMEN FISICO.
En este examen se describen los siguientes aspectos:
Cantidad
Color
Consistencia
Cantidad = normalmente se excretan aproximadamente 100gr de materia fecal en 1 día. Este varía según el estado del aparato digestivo y la ingestión de alimentos.
Color = debido a la presencia de urobilina, los alimentos, medicamentos y patologías varían. Normalmente van de pardo claro a pardo oscuros, observándose a veces de color amarillo, negro, blanco, verdoso, etc. Se presentan variaciones de color por enfermedades como la hepatitis, TBC, gastritis erosivas.
Consistencia = Normalmente son blandas pero moldeadas, según la consistencia se clasifican en:
Liquidas o acuosas en diarreas
Blandas
Pastosas
Duras o formadas en estreñimiento
Mucoide.
Residuos alimenticios de origen animal.
Fibras musculares = tienen forma rectangular, color amarillo y estrías transversales y longitudinales. Con lugol toman color rojizo.
Grasas = gotas refringentes de diferentes tamaños amarillas o transparentes, con bordes netos de color negro y se tiñen con el lugol de amarillo claro.
Residuos alimenticios de origen vegetal.
Almidón = tienen forma irregular, en solución salina son transparentes y en el lugol se colorean, cuando están no digeridos toman un color violeta o negro y los parcialmente digeridos toman un color morado o rojo.
Células o fibras vegetales = en ocasiones se ven formando un retículo en forma de panal, las fibras, a veces, se presentan como estructuras alargadas de doble pared con un canal central marcado o en forma de espiral.
Pelos vegetales = se parecen a las larvas de algunos parásitos, pero un examen cuidadoso permite diferenciarlos con facilidad por su falta de movilidad: su pared es muy refringente y homogénea y además poseen un conducto central que recorre toda su longitud.
PRODUCTOS DE IRRITACION DE LA MUCOSA INTESTINAL.
