APUNTES EN PDF PARA SABER MUCHO MÁS Y MUCHO MÁS

(1)

2010 Enrique Castro 1

DNA, genes y cromosomas DNA, genes y cromosomas

➢ Estructura del DNA

 Nucleótidos: estructura, nomeclatura y propiedades

 Estructuras secundarias  Estructura supersecundarias

➢ Dinámica del DNA

 Estabilidad y desnaturalización del DNA  Parámetros topológicos y estabilidad  Topoisomerasas

➢ Estructura de cromatina y cromosomas  Cromatina: organización nucleosómica  Estructura de cromosomas: centrómeros y

telómeros

➢ Organización genómica

 Genomas: DNA codificante y no codificante  Estructura molecular del gen

Para © Enrique Castro Los trabajos de terceros retienen su licencia original

Base

nitrogenada

Azúcar

fosfato

ribosa

desoxi-ri bosa enlace

β-glucósido

nucleósido

nucleótido

Estructura de nucleósidos y nucleótidos Estructura de nucleósidos y nucleótidos

RNA

(2)

2010 Enrique Castro 3 *Nucleósido y nucleótido son nombres genéricos que incluyen tanto

las formas ribo- como las

desoxirribo-RNA uridilato

uridina Uracilo

RNA DNA Timidilato

desoxitimidilato Timidina

desoxitimidina Timina

RNA DNA Citidilato

desoxicitidilato Citidina

desoxicitidina Citosina

Pirimidinas

RNA DNA Guanilato

desoxiguanilato Guanosina

desoxiguanosina Guanina

RNA DNA Adenilato

desoxiadenilato Adenosina

desoxiadenosina Adenina

Purinas

Ácido nucleico Nucleótido*

Nucleósido* Base

RNA DNA Inosinato

desoxi-inosinato inosina

desoxiguanosina Hipoxantina

Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos

Funciones de nucleótidos Funciones de nucleótidos

Constituyente de los ácidos nucleicos.

Acoplador en intercambios energéticos

Actúan como señales químicas.

Componente estructural de cofactores/coenzimas

cAMP

NAD+

(3)

Estructuras de nucleobases mayoritarias Estructuras de nucleobases mayoritarias

Cafeína (1,3,7-trimetil-xantina)

Estructuras de nucleobases minoritarias Estructuras de nucleobases minoritarias

Más frecuentes en DNA Más frecuentes en RNA

Cafeína (1,3,7-trimetil-xantina)

(4)

2010 Enrique Castro 7 N _N N N NH2 R N _N N NH+ NH2 R N _N N NH O NH₂ R N _N N _N O NH2 R N _N N H + NH O NH₂ R N NH O O C H₃ R N N O O C H₃ R N N O NH₂ R N NH+ O NH₂ R Adenina guanina citosina timina pKa=3.8

pKa=2.4 pKa=9.4

pKa=9.5

pKa=4.5

N1 N7 N3 N3 Propiedades ácidobase de los ácidos nucleicos Propiedades ácidobase de los ácidos nucleicos

➢ El grupo fosfato es fuertemente ácido • Fosfatos totalmente ionizados a pH fisiológico

(pKa=1.0)

• Carga neta negativa

• Repulsión entre cadenas dependiendo de I

Ionización afecta a la estabilidad de

la doble hélice

➢ Las bases pueden ionizarse • Carga neta depende del pH • Carga aumenta solubilidad

• Capacidad de formar pdh depende del pH Protonación en N cíclico sp2

Desprotonación formas enol

Formas tautómeras de las nucleobases Formas tautómeras de las nucleobases

Formas mayoritarias

(99:1) Formas minoritarias

citosina

guanina

adenina

timina Sólo éstas forman

pares Watson-Crick Nuevas ionizaciones alternativas

Devlin 7e Fig. 2.12

(5)

Espectros de absorción de luz por nucleótidos Espectros de absorción de luz por nucleótidos

➢ Absorción característica en UV

• Máximo a 260 nm (diferencial de proteínas 280 nm)

• Identificación y cuantificación

Conformaciones de ribosa en nucleótidos Conformaciones de ribosa en nucleótidos

➢ Rotación del anillo furanosa • C de ribosa tetraédricos

• Separación fosfatos C3'-C5' • Proyección de -OH en C2'

➢ Rotación del enlace glucosídico • Impedimentos estéricos en syn

(prefieren anti)

• GMP prefiere syn (P5'-NH2)

Impedimento estérico base-ribosa Distancia

entre fosfatos

(6)

2010 Enrique Castro 11 P 3’ 5’ P 3’ 5’ P 3’ 5’ P 3’ 5’ P P OH P 3’ 5’ P 3’ 5’ P 3’ 5’ P 3’ 5’ P 3’ 5’ P P

H₂O

hidrólisis

Extremo 5’

polimerización

5’

3’ NTP + H₂O NMP+ PP_i

ΔG0_{= -31 kJ/mol}

DNA_n + NMP DNA_n+1 + H₂0

ΔG0_{= +25 kJ/mol}

DNAn + NTP DNAn+1 + PPi

ΔG0_{= -6 kJ/mol}

PP_i + H₂O 2 P_i

ΔG0_{= -31 kJ/mol}

Química de la polimerización de DNA Química de la polimerización de DNA Enlace fosfodiéster 3'-5' Extremo 3’ Enlace fosfodiéster 3'-5' Estabilidad del esqueleto fosfodiéster Estabilidad del esqueleto fosfodiéster

➢ Hidrólisis espontánea • Muy lenta en DNA (t_½200 Ma)

• Rápida en RNA (-OH nucleófilo)

➢ Hidrólisis enzimática: nucleasas • Exonucleasas 3' o 5'

• Endonucleasas

• Endonucleasas de restricción

2'NMP + 3'NMP

Lehninger 5e Fig. 8.8

-OH en 2' actúa como nucleófico en reacción de desplazamiento intramolecular P 3’ 5’ P 3’ 5’ P 3’ 5’ OH P 3’ 5’

A T G G _{Corte en 5' 3' NMP}

(7)

2010 Enrique Castro 13 P 3’ 5’ P 3’ 5’ P 3’ 5’ OH P 3’ 5’ P 3’ 5’ P 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ OH

A T G C T G

pApTpGpCpTpG

( ApTpGpCpTpGp )

ATGCTG 5’ 3’ 5’ 3’ Convenios de escritura de secuencias (nucleótidos) Convenios de escritura de secuencias (nucleótidos) a) b) c) d) Siempre 5'→3' • Replicación • Transcripción • Traducción

Forma más común siempre 5'3'

Plegamiento en doble hélice de oligonucleótidos Plegamiento en doble hélice de oligonucleótidos

➢ Estructura • Helicoidal

• Micelar: fosfato-ribosa exteriores, bases interiores

• Hebras no opuestas: surcos

➢ Topología • Hélice doble • Dextrógira • Antiparalelas • Complementarias Surco mayor Surco menor

5' 3' 5' 3'

3' 5' 3' 5'

Fosfatos cargados exteriores Bases hidrófobas interiores Dextrógira antiparalela

Reglas de Chargaff %A = %T , %G = %C % Purinas = % Pirimidinas

(8)

2010 Enrique Castro 15 ● Puentes de hidrógeno de Watson-Crick:

● Autoreplicativa:

ATGCATGCATGC TACGTACGTACG

ATGCATGCATGC

TACGTACGTA

ATGCATGCAT

TACGTACGTACG

5’

5’ 3’

3’

5’ 3’

Puentes de hidrógeno

[purinas] = [pirimidinas] [A] = [T]

[G] = [C]

Complementariedad entre bases Complementariedad entre bases

● Reglas de Chargaff:

surco

menor surco

mayor

Grupos superficiales y surcos en el DNA dúplex Grupos superficiales y surcos en el DNA dúplex

Fosfatos: interacciones electrostáticas inespecíficas

Surco mayor:

(9)

Estructuras secundarias de polinucleótidos Estructuras secundarias de polinucleótidos

➢ Estructuras interconvertibles • Monocatenarios: hélice - ovillo • Bicatenarios: A – B - Z

• Tricatenarios: H

Estructura secundaria:

Configuración local, repetitiva, del esqueleto

de una macromolécula

Las estructuras secundarias están matenidas por

interacciones débiles locales

Esqueleto DNA es flexible

B-DNA A-DNA Z-DNA H-DNA

2 dextrógira 2.37 nm 0.34 nm 36o 1o 3.4 nm 10 C2’ endo anti Ancho y profundo Estrecho y profundo DNA normal Cadenas Sentido Diámetro Elevación Rotación inclinación Paso Residuos Ribosa Base S. Mayor S. Menor Condiciones 2 dextrógira 2.55 nm 0.25 nm 33o 19o 2.8 nm 11 C3’ endo anti Estrecho y profundo Plano DNA deshid. DNA/RNA RNA/RNA 2 levógira 1.84 nm 0.37 nm -30o 9o 4.56 nm 12

CT C2’, AG C3' CT anti, AG sin Plano

Estrecho y profundo Alternando Pur Pir (GCGC)

3 dextrógira 2.5 nm

---2 Hebras Pir y 1 Pur DNA: conformaciones en hélice

(10)

HDNA: triples hélices dextrógiras HDNA: triples hélices dextrógiras

Funciones:?

● Relajamiento superhelicoidal ● Recombinación

Hebra suelta ↓L_k DNA dúplex

DNA dúplex

H-DNA triple

● Hélice triple dextrógira

● Apareamientos de Hoogsteen

● Hebras asimétricas: sólo Pur / sólo Pir

HDNA: apareamientos de Hoogsteen HDNA: apareamientos de Hoogsteen

Apareamiento Watson-Crick Hebra

Pur

Hebra Pur Hebra

Pir

Hebra Pir Hebra

Pir' Hebra

Pir'

Apareamiento Hoogsteen

Apareamiento Watson-Crick

(11)

Formación de HDNA Formación de HDNA

No sige

Hebra Pir'

Vuelve sobre dúpex Encajando en surco mayor

Variaciones locales y supersecundarias en la doble hélice

palíndromo

(secuencia repetida invertida)

Estructura cruciforme

GC GC

AT

AT ● Variaciones locales

diámetro torsión surcos

Dependientes de secuencia local

● Estructuras en horquilla secuencias autocomplementarias

rep. palindrómicas rep. Directas (en tándem) rep. en espejo

Variación en forma molecular:

•Interacción específica con proteína •Bloqueo de función

● DNA curvado

(12)

DNA curvado: TATAbinding protein DNA curvado: TATAbinding protein

TBP reconoce secuencia poli-A en promotor Se une al DNA en conformación

agudamentemente curvada

telómeros

(13)

Estabilidad de la doble hélice Estabilidad de la doble hélice

Fuerza iónica, I

Especificidad: pdh Estabilidad: apilamiento

Transición hélice-ovillo

reversible

➢ Término entálpico, ΔH • Repulsión electrostática de Pi

• Puentes de hidrógeno intercatenarios

• Interacción π-π por apilamiento de bases

ΔG = ΔH - TΔS

➢ Término entrópico, ΔS

• Restricción en rotación de enlaces

• Liberación de agua por apilamiento

(Efecto hidrofóbico)

➢ Factores que afectan a la estabilidad

• Temperatura • Fuerza iónica • pH

• Formadores de pdh • Detergentes

• Solventes orgánicos pH

urea formamida

Calor, T ΔHapilamiento_{≈ 16-65 kJ/mol}

ΔHpdh_{≈ (2,3) · 8-12 kJ/mol}

detergentes solventes org.

1.5

1.0

0.5

A26

0

Desnaturalización del DNA: efecto hipercrómico Desnaturalización del DNA: efecto hipercrómico

nativo (frio)

Desnaturalizado

(caliente)

250

200 300

Longitud de onda, nm

A

b

so

rb

an

ci

a

1.5

1.0

0.5

El apilamiento interfiere con absorción UV: A₂₆₀

(14)

Desnaturalización térmica del DNA Desnaturalización térmica del DNA

T_m: temperatura de fusión

El DNA se funde al calentar

Rehibrida la enfriar

Tm=

H

S

Transición fuertemente cooperativa

T_m= T₀ + k·log(I) + α·(%GC) + β·(%F)

T_m aumenta con %(G+C)

El DNA se desnaturaliza en medio fuertemente básico (o ácido) El DNA se desnaturaliza en medio fuertemente básico (o ácido)

(15)

Hibridación Hibridación

Devlin 4e Fig. 2.19, 2.22

Asociación por secuencia complementaria local

Extensión del apareamiento

Identificación mediante sonda de hibridación

Calentado:

todo en hebra simple

Sonda:

Segmento corto marcado

Enfriado:

híbrido nativo-sonda

Filtrado: Eliminar sondas no unidas (cortas)

Superenrollamiento del DNA Superenrollamiento del DNA ●Propiedad topológica

●Sin rotura de enlaces covalentes ●Invariable a deformaciones

●Extremos fijos

●DNA circular

●Puntos de anclaje inmóviles

Topoisómeros de DNA circular

Densidad superenrollamiento, σ →

plectonémico

solenoidal

En solución

(16)

Topología del superenrollamiento Topología del superenrollamiento

L

_k

= T

_w

+ W

_r

Link Twist Writhe

enlace giro torsión (Stryer)

ligamiento torsión retorcimiento (Lehninger)

ligazón torsión retorcimiento (Mathews)

enlace torsion retorcimiento (Devlin)

ligazón giro Super

enrollamiento

Diapositivas W: superenrollamiento

T: giro de hélice L: nº de cruces del plano

L_k: Parámetro topológico

Nº entero

Constante (extremos fijos)

T, W: Parámetros geométricos

variables (interconvertibles) no enteros

Interconversión tensióngirosuperhélice Interconversión tensióngirosuperhélice

DNA relajado L₀ = 8

DNA tenso L_k = 7

T = 8

W = 0

-1 vuelta

Tensión ΔG >0

ΔL

_k

= ΔT

_w

+ ΔW

_r

L ≠ T + W

T = 7

W = 0 T = 8

W = -1

ΔW_r

Superenrollamiento ΔT_w

Fusión local ΔL_k=-1

(17)

Relajación de tensiones superhelicoidales Relajación de tensiones superhelicoidales

● Cambios conformacionales:

● Mecanismos enzimáticos: Topoisomerasas

reclutamiento activación

Cambio topológico Características de la secuencia

Fusión local (ΔT= -1/10 pb) Ricas en AT Paso a Z-DNA (ΔT= -2/10 pb) Alternando Pur-Pir

Paso a H-DNA Δ L Hebras Pur/Pir

Estructuras cruciformes

Δ L palíndromos

G_SC=k⋅2 Superenrollamiento _{requiere energía}

 = Lk

L₀

DNA celular σ ≈ -0,06

Topoisomerasas: catálisis de cambios en L_k

• Tipo I: Corte monohebra ΔL = ±1

• Tipo II: Corte de doble hebra ΔL = -2

Eucariotas: antitumorales (camptotecina) procariotas: antibióticos

(ác. Nalidíxico)

Topoisomerasas cromosómicas Topoisomerasas replicativas (novobiocina)

―P | Tyr

P― | Tyr Intermediario covalente Intermediario covalente

ATPasas

(18)

telómeros

11 nm

5.5 nm DNA empaquetado: cromatina

DNA empaquetado: cromatina

I normal

(0.15 M KCl) I baja

Fibras de cromatina

(30 nm)

Cuentas en rosario

(10 nm)

Fibra de DNA

Núcleo de histonas octámero

DNA ligado ≈ 146 pb

compacto, estable DNA de conexión ≈ 15-55 pb

sensible a nucleasa

Nucleosoma

(19)

Estructura del nucleosoma Estructura del nucleosoma

Histonas:

Básicas (20-30% R,K) muy conservadas

Pliege de histona (3 hélices) regulables

DNA unido:

•Int. Electróstáticas, pdh (surco menor, rico AT) •superenrollamiento negativo

(ΔL=-1/nucleosoma)

Solenoide levógiro 1.7 vueltas

Acetilación K Metilación K Fosforilación S Ubiquitinación K

“pinzas” para atrapar DNA

octámero

Tetrámero + Tetrámero

2 H3 2 H4

2 H2A 2 H2B

Ensamblaje del octámero de histonas Ensamblaje del octámero de histonas

Un

Pliegue de histona: 3 hélices conectadas por 2 lazos

Dímero H3-H4 encaje recíproco

(20)

30 nm

Fibra de cromatina de 30 nm

H1 fija DNA

H1 enrollamiento solenoidal (6 n/vuelta)

Histona H1

Brazo de unión 15-55 pb

Estructura de las fibras de cromatina 30 nm Estructura de las fibras de cromatina 30 nm

Compactación DNA: x100

Estructura de cromosomas en interfase Estructura de cromosomas en interfase

➢Cromosoma interfásico •1 molécula DNA

•Bucles cromatina 30 nm •Anclados a andamiaje por MAR •Transcripcionalmente activo

Andamiaje del cromosoma Secuencias específicas

de unión(MARs, SARs) 1-3·108_pb ≈ 3-10 cm

6,4·109_{pb /}

46 cromosomas ≈ 2.2 m

DNA:

una única molécula lineal

Bucles:

•Ricos H1, HMG, TopoII •Descondensables •Expresables

(21)

Estructura de cromosomas mitóticos Estructura de cromosomas mitóticos

➢Cromosoma mitótico •1 molécula DNA

•Altamente condensado •Condensinas

•Transcripcionalmente inactivo. No expresable

Condensinas

• Grandes complejos proteínas SMC • ATPasas.

• Unen DNA por extremos globulares • hidrolizan ATP

• forman bucles dextrógiros de DNA

Estructura de los elementos funcionales básicos del cromosoma

telómero centromero telómero

ARS

Múltiples (1/3-300 kpb) Ricas en AT (fácil fusión)

Inicio de replicación

Unión al uso mitótico segregación mitótica

Prevenir degradación anclaje de reparadores

Hebra rica en TG

Extensión 3' ≈1 kpb

Hebra rica en AC

Repeticiones teloméricas 1-50 kpb

Repeticiones de

secuencias TEL _{Repeticiones de}

secuencias CEN

ACAAACT 70-80pb ACAAACT Reiterado >10 kpb

(22)

Telómeros de mamíferos Telómeros de mamíferos

Protección de la degradación

anclaje de reparadores

5'TTAGGG 3'AATCCC

dímero TRF1 liga a cada repetición telomérica

Dímeros TRF1

se unen entre si: plegado

Bucle T PARP

TRF2 estimula invasión de hebra 3'

5'AGGGTT AGGGTT AGGGTT AGGGTT AGGGTT AGGGTT AGGGTT 3' 3'TCCCAA TCCCAA TCCCAA TCCCAA 5'

Alineamiento de DNA dúplex

Invasión por extensión 3' (D-loop)

Visualización molecular de buclesT Visualización molecular de buclesT

(23)

telómeros

telómero centromero telómero

Repeticiones de

secuencias TEL Repeticiones de secuencias CEN

Otras repeticiones

Organización génica en procariotas y eucariotas Organización génica en procariotas y eucariotas

Procariotas Eucariotas

Cromosomas 1 (+ plásmidos) muchos

Topología circular lineal

mRNAs Policistrónico

sin procesamiento gran procesamientoMonocistrónico

Intrones No Si

DNA no-codificante No Si

Empaquetamiento ligero Muy compacto

(histonas)

Cromosoma lineal Cromosoma circular

(24)

DNA genómico y tamaño del genoma DNA genómico y tamaño del genoma

virus

hongos

aves

103₁₀4₁₀5₁₀6₁₀7 ₁₀8₁₀9₁₀10 ₁₀11 ₁₀12 DNA genómico (pb por genoma haploide)

haba

E. coli

levadura

tiburón

Drosophila

Xenopus

Hombre 3.2·109_pb Procariotas

Eucariotas

Peces cartilaginosos bacterias

plantas

insectos

moluscos

Peces óseos

reptiles

mamíferos anfibios

C. elegans

19.000

H. sapiens

21.500 Genoma:

•Conjunto de genes del organismo

Valor C:

•DNA total por célula haploide

Paradoja de C:

•Ausencia de correlación C <―> complejidad •DNA no codificante

Tipos de DNA eucariótico: por función Tipos de DNA eucariótico: por función

DNA repetitivo

DNA copia única

Moderadamente reiterado

Altamente reiterado

Genes RNA

Expresión de genes Regulación génica

Rol

estructural ? Rep. CEN Rep TEL

transcrito

(25)

Tipos de DNA eucariótico: por repetición Tipos de DNA eucariótico: por repetición

➢DNA de copia única longitud copias % genoma humano •Genes únicos de proteínas variable 1 ~1.5%

•Pseudogenes (1:4) variable 1 ~0.4%

•Intrones y señales de control variable 1 ~28%

•Espaciadores (“junk”) ~25%

➢DNA moderadamente reiterado

•Genes en tándem proteínas variable 3-30 ~0.5%

•Genes en tándem RNA variable 10-100 ~0.5-1%

•Repeticiones intercaladas

•Transposones de DNA 2-3 kb 3·105 _~3%

•Retrotransposones con LTR 6-11 kb 4·105 _~8%

•Retrotransposones sin LTR

•LINES 6-8 kb 8.6·105 _~21%_L1

•SINES 100-300pb 1.6·106 _~13%_Alu

➢DNA altamente reiterado

•DNA secuencia simple, SSR 1-500 pb 105_-106 _~1-15% _{DNA satélite}

•Repeticiones invertidas SD 0.2-1 kb 2·106 _~5-%

Rep. CEN Rep TEL

Rol

estructural ? Rep. CEN Rep TEL

6 kb, 0.6·106_copias

300 pb, 106_copias

5 -10 - 20 pb >100 en tándem

y reiterado DNA

móvil

Virus integrados

Estructura molecular del gen Estructura molecular del gen

promotor

potenciadores

intrones

exones

adenilación

5' 3'

No funcional

Señales de control 5'

Señales de control 3'

Gen: secuencia completa de DNA necesaria para dirigir la síntesis de un producto funcional

Secuencia que es transcrita en un producto funcional

Región codificante

●Señales de control:

puntuación: inicio y fin de transcripción/traducción regulación de la expresión

Extremos 5', 3' cromosómicos

Secuencias de anclaje (estructura, topología) Señales en intrones

●DNA codificante: exones (minoritario)

●DNA no codificante: señales de control

Intrones

Pseudogenes, transposones, retrovirus DNA intergénico no funcional

(26)

Genes eucarióticos Genes eucarióticos

Organización del DNA codificante Organización del DNA codificante

Lisozima

15 kB _{no mRNA}

no mRNA

60 kB

Secuencias Alu

● Genes simples:_{Lisozima de pollo}

● Grupos génicos (clusters):_β-globina

ψβ2 ε Gγ Aγ ψβ1 δ β

codificante

pseudogenes (no funcional)

Secuencias Alu

● Repeticiones en tándem:_{histonas y RNAs}

RNA 18S

H1 H3 H4H2AH2B H1 H3 H4H2AH2B H1 H3 H4H2AH2B

6 kB

13 kB

RNA 6S RNA 28S

rRNA, n>100 tRNA, n=10-100 Histonas, n = 3-30

(27)

Clusters de las globinas: LINES y SINES Clusters de las globinas: LINES y SINES

Voet 4ª Ed. 2011

Secuencias Alu en ambas direcciones

Elementos L1