ANTAGONISMO DE Trichoderma spp. EN HONGOS
ASOCIADOS AL DAÑO DE Diatraea saccharalis Fabricius.
(LEPIDOPTERA : CRAMBIDAE ) EN MAIZ
(ANTAGONISM OF Trichoderma spp. IN FUNGI ASSOCIATED
WITH DAMAGE OF Diatraea saccharalis Fabricius.
(LEPIDOPTERA : CRAMBIDAE ) IN CORN
José Luis Arispe V.1, Abiel Sánchez A.1*, Ma. Elizabeth Galindo C.1, Mario Ernesto Vázquez B.1, Arnoldo Oyervides G.1, Raúl Rodríguez G.2
1Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Coahuila, México.
2INIFAP General Terán, Nuevo León, México.
*Autor para correspondencia: [email protected]
RECIBIDO: 20 de Julio de 2019 APROBADO: 24 de Septiembre de 2019 DOI: 10.22370/bolmicol.2019.34.2.1802 LOS AUTORES DECLARAN NO TENER CONFLICTO DE INTERESES
Palabras claves: Capacidad; Hongos; Software; Fórmula; Maíz.
Key words: Capacity; Fungi; Software; Formula; Corn.
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo, fue evaluar
in vitro, mediante cultivo dual la capacidad anta-gónica de las cepas de Trichoderma asperellum
T11, Trichoderma harzianum T1 4, y Trichoderma longibrachiatum T1 40 sobre hongos asociados;
Alternaria arborescens, Bipolaris shoemakeri, Bipolaris victoriae, Epicocum sorghinum, Exse-rohilum longirostratum, Fusarium brevicatenu-latum, Penicillium polonicum, Phaeocytostroma ambiguum y Fusarium equiseti, el muestreo se realizó en Tepalcingo, Morelos en tallos de maíz y el experimento se estableció en el laboratorio de Fitopatología de la Universidad Autónoma Agra-ria Antonio Narro en el mes de abril de 2018. La evaluación se realizó bajo un diseño factorial AxB,
con nueve niveles en A y tres en B con cuatro re-peticiones por tratamiento, siendo A las cepas de
hongos fitopatógenos y B las tres cepas de Tricho-derma, se colocó en el extremo de la placa de Petri un explante de PDA con micelio de Trichoderma
spp. de 5 mm de diámetro, y en el extremo opuesto
un explante del hongo fitopatógeno, las siembras
fueron incubadas a 25 ± 2 ºC por 120 h, evaluán-dose las medias del Porcentaje de Inhibición en el Crecimiento del Micelio (PICM) mediante la
fórmula de Fakhrunnisa modificada y se determi -nó el área de desarrollo de los hongos mediante el software GeoGebra Classic versión 5.0.473.0-d, los resultados se analizaron con el programa (FAUANL) versión 2.5, mediante Tukey con nivel
ABSTRACT
The objective of the present work, was to evaluate in vitro, by dual culture, the antagonis-tic capacity of the strains of Trichoderma aspe-rellum T11, Trichoderma harzianum T1 4, and
Trichoderma longibrachiatum T1 40 on Alterna-ria arborescens, Bipolaris shoemakeri, Bipola-ris victoriae, Epicocum sorghinum, Exserohilum longirostratum, Fusarium brevicatenulatum, Penicillium polonicum, Phaeocytostroma ambi-guum and Fusarium equiseti, the sampling was done in Tepalcingo, Morelos in corn stalks and the experiment was established in the Phytopatholo-gy laboratory of the Antonio Narro Autonomous Agrarian University in the month of April 2018. The evaluation was carried out under an AxB factorial design, with nine levels in A and three in B with four repetitions per treatment, being A the strains of phytopathogenic fungi and B the three strains of Trichoderma, was placed at the end of the Petri dish a explant of PDA with mycelium of
Trichoderma spp. 5 mm in diameter, and at the opposite end an explant of the phytopathogenic fungi, the sowings were incubated at 25 ± 2 ° C for 120 h, evaluating the means of the Percentage of Mycelium Growth Inhibition (PICM) using
the Fakhrunnisa formula modified and the fungi
development area was determined using GeoGe-bra Classic software version 5.0.473.0-d, the re-sults were analyzed with the program (FAUANL)
version 2.5, using Tukey with a significance level
of 0.05, with greater antagonism effects 67.74%.
INTRODUCCIÓN
El maíz tiene para México una impor-tancia económica y cultural, debido a que gran parte de la fuerza laboral campesina se dedica al cultivo del grano y su consumo. Más allá de la contribución a la dieta, tiene origen en las tradi-ciones y costumbres que conforman una cultura ancestral1.
En el año agrícola 2017, la producción de maíz grano en México fue de 27,762,480.90 t2,
sin embargo, las pérdidas provocadas como daño indirecto de Diatrea saccharalis alcanzan en pro-medio una disminución del rendimiento de 9.6%3,
si se toma el 9.6% de pérdidas como referencia, durante el 2017 se perdieron 2,665,198.1664 t por este insecto.
Las pérdidas en el rendimiento de maíz de-bido a las enfermedades en los Estados Unidos y Ontario, Canadá del año 2012 al 2015 variaron del 2 al 15%4, en este caso la pudrición del tallo (
Fu-sarium verticillioides) es la quinta o sexta causa más importante de pérdida de rendimiento relacio-nados con enfermedades, mientras que la pudri-ción de la mazorca (Fusarium spp. y Aspergillus spp.) se clasificó como la principal que causó la
pérdida de rendimiento en el año 2012. En gene-ral, el total estimado de pérdidas económicas de-bidas a las enfermedades durante los cuatro años fueron de 27.4 millones de dólares5.
El control biológico de hongos mediante
Trichoderma spp. puede ser una posibilidad
via-ble y eficiente6. Los avances han demostrado el
efecto de Trichoderma en plantas, incluyendo in-ducción sistémica o resistencia localizada, en adi-ción para la inducadi-ción de rutas de resistencia en la planta, incrementa el crecimiento y disponibilidad de nutrientes, en maíz incrementa la respuesta al
crecimiento en genotipos específicos7. Reportaron
que T. asperellum induce resistencia sistémica en plantas de pepino mediante elevado nivel de eti-leno y ácido jasmónico, teniendo efecto protector contra Pseudomonas syringae pv. Lachrymans8.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de las muestras vegetales
al 6 de febrero del 2018, en un cultivo de maíz de 160 días. Se recolectaron larvas del barrena-dor del tallo de diferentes estadios, colocándolas en pequeños frascos, para luego llevarlas al De-partamento de Parasitología de la Universidad Au-tónoma Agraria Antonio Narro para su posterior
identificación, mediante las claves taxonómicas
de la Universidad de Florida9,se muestrearon los
cuatro genotipos siendo H-515, Zapata 7, H-507 y un Criollo con 20 repeticiones cada uno y se eligieron al azar 10 plantas por repetición, se pro-siguió a cortar cada tallo de forma longitudinal y con esto se observó si el daño estaba o no presen-te por D. saccharalis, y de los tallos dañados se extrajeron pequeños cortes de 10 cm, los cuales
fueron puestos en bolsas y éstas se identificaron de
acuerdo al genotipo, para su traslado al laboratorio
de fitopatología del Departamento de Parasitolo -gía en la UAAAN para su posterior análisis.
Aislamiento de los hongos fitopatógenos
Las muestras de tallos se llevaron a una
campana de flujo laminar y con ayuda de un bis -turí se hicieron cortes de ± 1 cm (tejido dañado y sano), se lavaron con hipoclorito de sodio al 3% durante 3 min, se retiraron y después se enjuaga-ron por tres veces durante 1 min en agua destilada estéril, y con una pinza estéril se colocaron cuatro cortes de manera equidistante por cada placa Petri con medio de cultivo PDA, sellándose las placas con cinta clean pack y llevándolas a una incubado-ra a tempeincubado-ratuincubado-ra de 25 °C ± 2 °C por 10 días.
De cada colonia de hongos que creció por cada placa de Petri con los cuatro cortes, con la ayuda de un sacabocados estéril se retiró un
ex-plante y se transfirió a una nueva placa de Petri
con PDA sintético, las cuales se sellaron con cinta clean pack y se llevaron a una incubadora a una temperatura de 25 °C ± 2 °C durante 10 días.
Identificación
La identificación de los hongos se hizo mi -cro y ma-croscopicamente, mediante claves
taxo-nómicas10 y un microscopio compuesto
(Olym-pus CX21LED) con los objetivos 5x, 10x, 40x y 100x, debido a poca esporulación de los hongos se realizaron análisis moleculares en el Labora-torio Gisena Texcoco, en donde se extrajo ADN de los hongos, utilizando cultivo monospórico
y para la amplificación de la región ITS4 e ITS5 se utilizaron los iniciadores ITS4 (5′-TCCTC
-CGCTTATTGATATGC) e ITS5 (5′-GGAAG -TAAAAGTCGTAACAAGG) y posteriormente secuenciándose en el centro de investigación y de estudios avanzados del IPN unidad Cinvestav Irapuato y las secuencias obtenidas se analizaron en la base de datos del GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI), usando el programa BLAST (Basic Local Alig-ment Search Tool) para secuencias altaAlig-mente si-milares.
Antagonismo de Trichoderma spp. en hongos
asociados al daño de D. saccharalis en cultivo dual
El experimento se estableció en un dise-ño factorial AxB, nueve niveles en A y tres en B con cuatro repeticiones por tratamiento, siendo
A las cepas de fitopatógenos y B las cepas de T. asperellum T11, T. harzianum T1 4, y T. longi-brachiatum T1 40 (Figura 1), colocándose en el extremo de la placa de Petri un explante de PDA con micelio de Trichoderma spp. de 5 mL de diá-metro, y en el extremo opuesto un explante del
hongo fitopatógeno, las siembras fueron incuba -das a 25 ± 2 ºC y evalua-das diariamente cada 24 h hasta las 120 h. Las medias de Porcentaje de Inhibición en el Crecimiento del Micelio (PICM) mediante la fórmula de Fakhrunnisa11, en este
caso modificada, se determinó el área de desarro -llo de los hongos mediante el software GeoGebra Classic versión 5.0.473.0-d12 (Figura 2 y 3), los
resultados se manejaron en términos de porcenta-je y se ajustaron mediante la transformación del arco seno de la raíz cuadrada y se analizaron con el programa (FAUANL) versión 2.513, mediante
I= (R1-R2) /R1 *100 I= (A1-A2) /A1*100
Formula de Fakhrunnisa Formula de Fakhrunnisa modificada
Donde:
I = Porcentaje de inhibición en el crecimiento del micelio
R1 = Crecimiento radial del hongo asociado sobre el lado opuesto, evaluado en la placa de Petri R2 = Crecimiento radial del patógeno en enfrentamiento
A1 = Área del hongo asociado sobre lado opuesto evaluado en la placa de Petri A2 = Área del patógeno en enfrentamiento
Figura 1. Cultivo dual real, A-T. longibrachiatum, B- E. sorghinum
En la literatura se reportan datos positivos donde evaluaron el porcentaje de antagonismos
in vitro17 midiendo el crecimiento radial del fito
-patógeno confrontado con el antagonista, tenien-do resultatenien-dos de inhibición in vitro en cultivos duales de 66.6% para Sclerotium rolfsii, 56.7% para F. solani y 30 .9% para F. oxysporum utili-zando T. harzianum, en el mismo sentido men-cionan que T. harzianum mostró una inhibición
de 88% sobre Rhizoctonia solani en cultivos duales18, siendo todos estos resultados positivos
para Trichoderma, ésto podría ser debido a los diferentes mecanismos de acción entre especies, por ejemplo: alta producción de enzimas degra-dadoras, siendo un gran competidor de nutrientes y espacio, dentro de los nutrientes principalmen-te por carbono, nitrógeno y hierro, de la misma manera reportan que Trichoderma spp. generan
RESULTADOS
La identificación de los hongos fitopatógenos
asociados
Las cepas de hongos obtenidas e identifi -cadas se obtuvieron mediante secuenciación de la región intergénica ITS1 e ITS4, las secuencias ob-tenidas comparadas en BLAST dieron como resul-tado a las siguientes especies de hongos (Tabla 1).
Antagonismo de Trichoderma spp. en hongos
asociados al daño de D. saccharalis en cultivo dual
Las tres especies de Trichoderma
inhibie-ron el crecimiento de los hongos fitopatógenos en
porcentajes del 67.74 al 87.56% (Figura 4), con
coeficiente de variación del 3.61% no encontrán -dose diferencia estadística entre las especies de
Trichoderma P>0.592, sobresaliendo T.
longibra-chiatum T1 40 con una media de 75.77, pero sí hubo diferencia en el área de control de los
hon-gos fitopatógenos P> 0.000 (Figura 4), en donde se
muestran cinco grupos estadísticos, existiendo in-teracción entre los factores A y B, es decir, las tres cepas de Trichoderma inhiben mayor a B. shoe-makeri, con una media de 87.56, de modo similar reportan un 67.1% de inhibición in vitro de Bipola-ris oryzae por T. harzianum14. Igualmente reportan
porcentajes de inhibición de 60 a 92%15, midiendo
con el área de desarrollo de las confrontaciones en el medio de cultivo PDA para evaluar la inhibición de los aislamientos nativos de Trichoderma vs T. harzianum, cepa T22, esto debido a los diferentes mecanismos de acción antagonista de Trichoder-ma, antibiosis, competencia, micoparasititmo, des-activación de enzimas de los patógenos16, y en este
caso sobresaliendo la competencia por nutrientes, la velocidad de esporulación y crecimiento.
CONCLUSIONES
• El antagonismo por parte de Trichoderma en cul-tivo dual con cepas de hongos asociados al daño de
D. saccharalis fue mayor del 67.79%.
• Presentaron una media de inhibición de 75.18,
75.22 y 75.77, T. asperellum T11, T. harzianum T1 4 y T. longibrachiatum T1 40 respectivamente.
• La cepa que inhibe mayor a los hongos fitopa -togenos en estudio fue T. longibrachiatum T1 40,
probablemente se debe a que esta cepa en
compara-ción con las otras, coloniza la superficie del medio
de cultivo en placa de Petri más rápido, limitando
el desarrollo de los hongos fitopatógenos.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Autónoma Agraria Anto-nio Narro, y al Laboratorio Gisena, Texcoco por su apoyo.
enzimas, como glucanasas, quitinasas, celulasas, proteasas y amilasas, que les dan una alta capa-cidad para dañar o destrozar la pared celular de
distintos hongos fitopatógenos19, 20. T.
longibra-chiatum coloniza toda la superficie del medio en
una placa de Petri y reduce la colonia del patóge-no en cultivo dual21, sin embargo, la importancia
de T. longibrachiatum ha sido cuestionada, debi-do que su uso puede representar un grave peligro para la salud de las personas 22, 23.
Figura 4. Porcentaje de inhibición en los hongos fitopatógenos. Letras iguales no son estadísticamente
REFERENCIAS
IFAS; c2001 [actualizado Jun 2019; citado 10 may 2019]. Feature Creatures, Diatraea saccharalis (Fa-bricius) (Insecta: Lepidoptera: Pyralidae) [aprox. 1
pantalla]. Disponible en: http://entnemdept.ufl.edu/ creatures/field/sugarcane_borer.htm.
10. Barnett, H. y Hunter B. Illustrated genera of imperfect fungi. 3a edition. Linconl United King-dom: Burgess Publishing Company, 1972.
11. Fakhrunnisa, H. and Ghaffar, A.In vitro inte-raction of Fusarium spp., with other fungi. Pak. J. Bot. 2006; 38(4): 1317-1322.
12. GeoGebra [internet]. Linz, Austria: GeoGebra GmbH; c2019 [citado 8 ene 2019]. Dynamic Mathe-matics for Everyone. Mathematical applications [aprox 1 pantalla]. Disponible en: https://www.geo-gebra.org/?lang=es.
13. Olivares, S. E. Paquete de diseños experimenta-les FAUANL, 1994. Versión 2.5. Facultad de Agro-nomía UANL. Marín, N. L.
14. Pérez E., Milanés P., Bernal A., Leiva M., García G., Lobato L., et al. Antagonismo “in vitro” de Trichoderma harzianum sobre aislados camagüe-yanos de Bipolaris oryzae y Sarocladium oryzae. Centro Agrícola. 2013; 40(3): 29-36.
15. Ortiz, J. M., Hernández, R. G., Cruz, T. M., Figueroa, R. K. A., Figueroa, S. B. y Hernández, R. F. Inhibición in vitro de aislamientos nativos de
Trichoderma en presencia de la cepa comercial T22. Rev. colomb. biotecnol. 2013; 15(1):126-136.
16. Martínez, B., Infante, D., y Reyes, Y. Tricho-derma spp. y su función en el control de plagas en los cultivos. Rev. Protección Veg. 2013; 28(1): 1-11.
17. Srinivasa, R.D., Naveena, H., Pushpa, L.M.
Antagonic activity and shelf life study of Trichoder-ma harzianum (Rifai). Int. J. Curr. Micobiol. App. Sci. 2017; 6(7): 2611-2615.
1. FIRA. Fideicomisos Instituidos en Relación con la Agricultura. Programa Agroalimentario Maíz 2016 [Internet]. México: FIRA; 2016 [Citado
2 Feb 2019]._Disponible_en: https://www.gob.mx/ cms/uploads/attachment/file/200637/Panorama_ Agroalimentario_Ma_z_2016.pdf
2. SIAP. Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera [Internet]. México: Gobierno de México [citado 21 mar 2019]. Anuario Estadístico de la Pro-ducción Agrícola [aprox. 1 pantalla]. Disponible en https://nube.siap.gob.mx/cierreagricola/.
3. Leiva, D. y Iannone N. Bioecología y daños del barrenador del tallo Diatraea saccharalis Fab. en maíz. 1993. Carpeta de producción vegetal. INTA, Maíz, Pergamino. Bs As. XII (113). pp 5
4. Munkvold, G. P. and White, D. G. Compen-dium of Corn Diseases. 4th edition. St. Paul, MN: American Phytopathological Society, 2016.
5. Mueller, D., Wise, K., Sisson, A., Allen, T., Bergstrom, G., Bosley, D., et al. Corn Yield Loss Estimates Due to Diseases in the United States and Ontario, Canada from 2012 to 2015. Plant Health Progress.2016; 17: 211-222.
6. Papavizas, G. C. and Lumdsen, R. D. Improved medium for isolation of Trichoderma spp. from soil. Plant Disease. 1982; 66(11): 1019-1020.
7. Harman, G. E. Overview of Mechanisms and Uses of Trichoderma spp. Phytopathology. 2016; 96(2):190-194.
8. Shoresh, M., Yedidia, I. and Chet, I. Involve-ment of jasmonic acid/ethylene signaling pathway in the systemic resistance induced in cucumber by
Trichoderma asperellum T203. Phytopathology. 2005 95(1):76-84.
18. Küçük, Ç. y Kivanç, M. Isolation of Tricho-derma spp. and determination of their antifungical, biochemical and physiological features. Turk. J. Biol. 2003; 27: 247- 253.
19. De Marco, J. L., Valadares, I. M. C., Felix, C. R. Purification and characterization of an N-
acetylglucosaminidase produced by a Trichoderma harzianum strain which controls Crinipellis perni-ciosa. Applied Microbiology Biotechnology. 2004; 64(1): 70–75.
20. González, I. Infante, D., Martínez, B., Arias, Y., González, N., Miranda, I., et al. Inducción de quitinasas y glucanasas en cepas de Trichoderma
spp. promisorias como agentes para el control bio-lógico. Biotecnol. Apl. 2012; 29(1): 12-16.
21. Epifanio, C. D.A. Control de Fusarium ver-ticillioides en genotipos de maíz con especies de
Trichoderma bajo condiciones de campo [internet]. Cohauila, México: 2013. [citado 18 sep 2019]. Disponible en: http://repositorio.uaaan.mx:8080/ xmlui/handle/123456789/7086
22. Chouaki, T., Lavarde, V, Lachaud, L. Rac-curt, C. P. and Hennequin, C. Invasive Infections Due to Trichoderma Species: Report of 2 Cases, Findings of in vitro Susceptibility Testing, and Review of the Literature. Clin. Infect. Dis. 2002; 35(11): 1360–1367.
23. Sánchez, V., Rebolledo, O., Picaso, R. M., Cárdenas, E., Córdova, J., González, O., et al.
In vitro antagonism of Thielaviopsis paradoxa by
