INSTRUCTIVO DE SIEMBRA BACTERIOLOGICA INSTRUCTIVO DE. Índice

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Hospital Dr. Mauricio Heyermann Torres de Angol

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

BACTERIOLOGICA

Código: APL Fecha elaboración:07/05/10 Revisión: 01 Fecha Revisión: 25/05/13 Página: 1 de 4 Vigencia: 5 años

Este documento es propiedad del Hospital Dr. Mauricio Heyermann Torres de Angol. Cualquier copia parcial o total no es válida sin la debida autorización de la Dirección del establecimiento.

INSTRUCTIVO DE

SIEMBRA BACTERIOLOGICA

Índice

Sección Página

Objetivo 2

Alcance 2

Fundamento 2

Referencia 2

Terminología 2

Materiales, equipos y reactivos 3

Desarrollo 3

Registro 4

Tabla de modificaciones 4

Preparado por: Revisado por: Aprobado por:

TM. Lic. Patricio Peña Rioseco Encargado de Bacteriología Laboratorio Clínico

TM. Eduardo Osorio Nieto TM. Marcial Venegas Acuña Encargados Calidad

Laboratorio

TM. Carlos Figueroa Zaror Director de Laboratorio Clínico y Banco de Sangre.

(3)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

BACTERIOLOGICA

1

OBJETIVO

El propósito de este Procedimiento es establecer las pautas, definir la metodología para la siembra primaria bacteriológica y estandarizar proceso con seguridad.

2

ALCANCE

Este instructivo aplica para el personal técnico y profesional involucrado en el proceso de diagnóstico microbiológico de todas las muestras que llegan al laboratorio de microbiología del Hospital de Angol.

3.

FUNDAMENTO

La siembra primaria de muestras biológicas corresponde a la primera etapa de esta sección, por tal motivo es primordial que se realice de manera correcta, ya que de esto depende el resto del proceso y su calidad.

4.

REFERENCIA

- “Procedimientos técnicos de laboratorio clínico. Volumen I. Instituto de Salud Publica de chile. 1994”.

5.

TERMINOLOGIA

Siembra: acción de inocular una muestra para bacteriología en un medio de cultivo dado.

Medio de cultivo: solución líquida o solidificada que contiene todos los nutrientes necesarios para permitir el crecimiento bacteriano. Son adquiridos listos para el uso a proveedores con procesos certificados.

Asa graduada: instrumento de laboratorio que consta de una base, la cual puede estar hecha de platino, acero o aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno

(4)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

BACTERIOLOGICA

o platino, que termina en aro o en punta. Sirve para transportar o trasvasar inóculos de microorganismos desde la solución de trabajo o solución madre al medio de cultivo.

Inóculo: pequeño volumen que contiene microorganismos en suspensión.

Muestra Primaria: muestra original a la cual se le realiza un estudio bacteriológico.

Puede ser, orina, secreciones, sangre, deposiciones, etc.

6.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

6.1 Materiales: muestra primaria, asa graduada (o tórula), mechero, medio de cultivo, guantes, pechera (si corresponde), mascarilla.

7.

DESARROLLO

7.1 Corroborar datos de la muestra (debe venir rotulada con información de paciente), y dependiendo de esta, seleccionar medios de cultivo a utilizar (idealmente entibiar en estufa 10 minutos antes de usar).

7.2 Encender mechero, ubicando junto a él muestras y medios de cultivo.

7.3 Extraer un inóculo de muestra (con asa estéril o tórula) y depositar sobre una superficie pequeña del medio de cultivo.

7.4 Con el objetivo de obtener colonias aisladas de los distintos micro organismos presentes en la muestra, hacer estrías con el asa estéril a partir del lugar donde se depositó el inóculo, en una dirección que cubra una pequeña porción de la superficie del medio de cultivo, cambiando sucesivamente a otras direcciones sin volver a tocar la superficie estriada anterior. Repetir esto al menos 3 veces, de modo tal que en la zona del último estriado se obtengan colonias separadas unas de otras. Luego volver a esterilizar asa en mechero.

7.5 Almacenar medios de cultivo sembrados en estufa de cultivo para incubación.

(5)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

BACTERIOLOGICA

8.

REGISTROS

Identificación del registro

Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo de retención y disposición

IT-04-03-001

Oficina director.

Estante documentos oficiales.

Acceso

restringido al director del lab.

encargados de calidad.

Director del lab. 2 años y se elimina.

9.

TABLA DE MODIFICACIONES

Revisión Nº

Pág.

modificada

Motivo del cambio Fecha

aprobación

(6)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

SECRECIÓN FARÍNGEA

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

SECRECIÓN FARÍNGEA

Índice

Sección Página

Objetivo 2

Alcance 2

Fundamento 2

Referencia 2

Terminología 2

Desarrollo 3

Flujograma 4

Registro 5

Anexos 6

TM. Eduardo Osorio Nieto TM. Marcial Venegas Acuña Encargados Calidad

Laboratorio

(7)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

SECRECIÓN FARÍNGEA

1

OBJETIVO

El propósito de este Instructivo es establecer las pautas y definir la metodología para cultivo de secreción faríngea.

2

ALCANCE

Este instructivo aplica para el personal técnico y profesional involucrado en el proceso de diagnóstico microbiológico de todas las muestras de secreción faríngea que llegan al laboratorio de microbiología del Hospital de Angol.

3.

FUNDAMENTO

Existe una larga lista de infecciones del tracto aéreo superior, dentro de las cuales se encuentran: laringitis, otitis externa y media, epiglotitis, sinusitis y faringitis. A raíz de esta situación es de vital importancia un adecuado diagnostico e identificación de los agentes etiológicos que provocan infecciones a este nivel. Dentro de los más frecuentes: S.aureus, S. grupo A, S. pneumoniae, Haemophillus y Candida.

4.

REFERENCIA

- http://www.ispch.cl/lab_sal/doc/mues_trac.pdf

5.

TERMINOLOGIA

Siembra: acción de sembrar una muestra para bacteriología en un medio de cultivo dado.

Agar Chocolate: medio de cultivo usado ampliamente en microbiología es un medio de cultivo enriquecido y no selectivo. Es una variante del agar sangre.

(8)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

SECRECIÓN FARÍNGEA

Contiene glóbulos rojos, que han sido lisados por el suave calentamiento a 56 °C. Este agar se usa para el delicado y exigente crecimiento de bacterias respiratorias, como por ejemplo Haemophilus influenzae.

Agar Sangre: Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observación de reacciones de hemólisis.

Medio de Transporte Stuart: medio de transporte semisólido no nutritivo destinado a recolección, transporte y preservación de muestras clínicas aptas para estudio bacteriológico.

6.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

6.1 Materiales: tórula con muestra en medio Stuart, mechero, Agar Sangre, Agar Chocolate, guantes, pechera (si corresponde), mascarilla.

7.

DESARROLLO

7.1 La muestra debe llegar en una tórula con medio de transporte (Stuart) y se debe conservar a temperatura ambiente hasta su siembra.

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APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

SECRECIÓN FARÍNGEA

7.2 Flujograma

18-24 Hr 36°C

18-24 Hr 36°C

Se entrega el resultado a las 48 horas

SEMBRAR AGAR SANGRE

AGAR CHOCOLATE

NEGATIVO

NEGATIVO O FLORA NORMAL INFORMAR POSITIVO

IDENTIFICACION ANTIBIOGRAMA

SECRECION FARINGEA (tórula)

(10)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

SECRECIÓN FARÍNGEA

8.

REGISTROS

Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo de retención y disposición IT-04-03-002

Oficina director.

Acceso restringido al director del lab.

y al encargado de calidad.

9.

TABLA DE MODIFICACIONES

Revisión

Nº

Pág.

modificada

aprobación

(11)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

SECRECIÓN FARÍNGEA

10.

ANEXOS AGAR SANGRE

USO

El agar sangre a 5% es un medio de cultivo más común usado para aislar la mayoría de las bacterias aeróbicas no fastidiosas

FUNCIONAMIENTO

Por su contenido de nutrientes permite un buen desarrollo de las bacterias. Por otra parte, permite la identificación primaria de las bacterias por su morfología. El pH 6,8 es favorable para la conservación de los eritrocitos y para la formación de los halos hemolíticos claros.

Las bacterias con enzimas extracelulares que actúan en los GR producen β hemolisis a α hemolisis (hemolisis incompleta) o no tienen efecto (У hemolisis)

FORMULA

AGAR SOYA TRIPTICASA 20 g

AGUA DESTILADA 500 Ml

SANGRE HUMANA ESTÉRIL 25 Ml

pH FINAL 6,8

PREPARACION

Las Placas de Agar sangre son compradas a proveedores con procesos certificados.

CONTROL DE CALIDAD

Streptococcus grupo A ---hemolisis beta Streptococcus pneumoniae ---hemolisis alfa

MANTENCION

Mantener refrigerada a 2 - 8° C.

(12)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

SECRECIÓN FARÍNGEA

AGAR CHOCOLATE

USO

El agar chocolate es un medio usado para aislamiento primario de la mayoría de las bacterias aeróbicas incluyendo las más fastidiosas (Haemophilus, Gardnerella, Neisseria).

FUNCIONAMIENTO

El gar chocolate es preparado agregando sangre estéril a una base de soya tripticasa, el que está a aproximadamente 80°C, para lisar los GR y liberar los factores X y V, lo que lleva a un mejor desarrollo de las bacterias y permite además el aislamiento de haemophilus y neisserias.

FORMULA

SANGRE HUMANA ESTÉRIL 25 ML

PH FINAL 6,8

PREPARACION

Las Placas de Agar chocolate son compradas a proveedores con procesos certificados.

Haemophilus influenzae --- crece bien

MANTENCION

Mantener refrigerada a 2 – 8°C.

(13)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA LÍQUIDO CÉFALO

RAQUÍDEO (LCR)

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

LÍQUIDO CÉFALO RAQUÍDEO (LCR)

Índice

Sección Página

Objetivo 2

Alcance 2

Fundamento 2

Referencia 2

Terminología 2

Desarrollo 3

Flujograma 4

Registro 6

Anexos 7

TM. Eduardo Osorio Nieto TM: Marcial Venegas Acuña Encargados Calidad

Laboratorio

(14)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA LÍQUIDO CÉFALO

RAQUÍDEO (LCR)

1

OBJETIVO

El propósito de este Instructivo es establecer las pautas y definir la metodología para cultivo de líquido cefalorraquídeo.

2

ALCANCE

Este instructivo aplica para el personal técnico y profesional involucrado en el proceso de diagnóstico microbiológico de todas las muestras de LCR que llegan al laboratorio de microbiología del Hospital de Angol.

3.

FUNDAMENTO

El líquido cefalorraquídeo constituye un fluido estéril, por lo tanto la existencia de cualquier microorganismo en su contenido es indicativo de un proceso infeccioso, considerándose de vital importancia su rápida detección por el laboratorio de microbiología a fin de dar a la clínica un apoyo rápido y certero del agente etiológico.

4.

REFERENCIA

- http://www.ispch.cl/

5.

TERMINOLOGIA

Siembra: acción de sembrar una muestra para bacteriología en un medio de cultivo dado.

Agar Chocolate: medio de cultivo usado ampliamente en microbiología es un medio de cultivo enriquecido y no selectivo. Es una variante del agar sangre.

Contiene glóbulos rojos, que han sido lisados por el suave calentamiento a 56 °C. Este

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APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA LÍQUIDO CÉFALO

RAQUÍDEO (LCR)

agar se usa para el delicado y exigente crecimiento de bacterias respiratorias, como por ejemplo Haemophilus influenzae.

6.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

6.1 Materiales: tórula con muestra en medio Stuart, mechero, Agar Sangre, Agar Chocolate, guantes, pechera (si corresponde), mascarilla.

7.

DESARROLLO

La muestra debe llegar en un tubo seco y estéril en cantidad de 1 – 2 mL y se debe conservar a temperatura ambiente.

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APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA LÍQUIDO CÉFALO

RAQUÍDEO (LCR)

7.2 Flujograma

Centrifugación 3000 rpm / 5min.

18-24 Hrs. / 36°C

18-24 Hrs. / 36°C SEDIMENTO

GRAM SEMBRAR

AGAR SANGRE AGAR CHOCOLATE

NEGATIVO

POSITIVO NEGATIVO

INFORMAR

LCR

IDENTIFICACION ANTIBIOGRAMA

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APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA LÍQUIDO CÉFALO

RAQUÍDEO (LCR)

CONDICIONES ESPECIALES

Realizar de inmediato el Gram si se observan bacterias, debe informarse por teléfono al médico tratante y enviar en paralelo el informe escrito.

PLAZO DE ENTREGA DE RESULTADOS Resultado negativo: 48 horas.

Resultado positivo: 72 horas.

AGENTES ETIOLOGICOS MAS FRECUENTES

• Haemophylus influenzae

• Neisseria meningitides

• Streptococcus pneumoniae

En recién nacidos:

• E. coli

• Streptococcus β hemolítico grupo B

• Listeria monocytogenes

(18)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA LÍQUIDO CÉFALO

RAQUÍDEO (LCR)

8.

REGISTROS

Oficina director.

9.

TABLA DE MODIFICACIONES

Revisión

Nº

Pág.

modificada

aprobación

(19)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA LÍQUIDO CÉFALO

RAQUÍDEO (LCR)

10.

ANEXOS AGAR SANGRE

USO

El agar sangre a 5% es El medio de cultivo más común usado para aislar la mayoría de las bacterias aeróbicas no fastidiosas.

FUNCIONAMIENTO

FORMULA

pH FINAL 6,8

PREPARACION

El Agar sangre utilizado en este Laboratorio es comprado a proveedores con procesos certificados.

MANTENCION

(20)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA LÍQUIDO CÉFALO

RAQUÍDEO (LCR)

AGAR CHOCOLATE

USO

El agar chocolate es un medio usado para aislamiento primario de la mayoría de las bacterias aeróbicas incluyendo las más fastidiosas (haemophilus, Gardnerella, Neisseria).

FUNCIONAMIENTO

El gar chocolate es preparado agregando sangre estéril a una base de soya tripticasa, el que está a aproximadamente 80°C, para lisar los GR y liberar los factores X y V, lo que lleva a un mejor desarrollo de las bacterias y permite además el aislamiento de haemophilus.

FORMULA

AGAR SOYA TRIPTICASA 20g

PH FINAL 6,8

PREPARACION

El Agar chocolate utilizado en este Laboratorio es comprado a proveedores con procesos certificados.

MANTENCION

(21)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA COPROCULTIVO

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

COPROCULTIVO

Índice

Sección Página

Objetivo 2

Alcance 2

Fundamento 2

Referencia 2

Terminología 3

Desarrollo 3

Flujograma 4

Registro 5

Anexo 6

TM. Lic. Patricio Peña Rioseco Encargado sección

Microbiología Laboratorio Clínico

Laboratorio

(22)

APL

1

OBJETIVO

El propósito de este Instructivo es establecer las pautas y definir la metodología para coprocultivos.

2

ALCANCE

Este instructivo aplica para todas las muestras de deposiciones que tengan solicitado cultivo y lleguen al laboratorio del Hospital de Angol en tórula con medio de transporte Cary Blair. El encargado de llevar a cabo lo contenido en este instructivo relacionado con la siembra es el personal Técnico Paramédico de la sección Bacteriología o que se encuentre realizando turno. El Tecnólogo Médico encargado de la sección es quien realiza el diagnóstico de las muestras.

3.

FUNDAMENTO

El coprocultivo es muy útil en la identificación de microorganismos que provocan trastornos gastrointestinales, por lo tanto es de vital importancia que el Laboratorio distinga flora patógena de flora normal, a fin de establecer de manera rápida y eficaz la identificación del agente presente en las deposiciones. Dentro de los más importantes se encuentran: Salmonella, Shigella y Yersinia.

4.

REFERENCIA

- http://www.ispch.cl/

(23)

APL

5.

TERMINOLOGIA

Siembra: acción de inocular una muestra para bacteriología en un medio de cultivo dado.

Agar SS: medio de cultivo selectivo diferencial muy útil para la identificación de Salmonella y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.

Medio de Transporte Cary-Blair: se utiliza primordialmente en el transporte de muestras para coprocultivos, debido a que la viabilidad de las especies de Shigella es superior que en otros medios de transporte.

6.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

6.1 Materiales: tórula con muestra en medio Cary Blair, mechero, Agar SS, Agar Mac Conkey, Caldo selenito, guantes, pechera (si corresponde), mascarilla.

7.

DESARROLLO

7.1 La muestra debe llegar en una tórula con medio de transporte Cary Blair y se debe conservar a temperatura ambiente hasta su siembra. Debe ser deposición fresca, recién emitida o un hisopado rectal en lactantes para búsqueda de Shigella spp.

La rotulación de la muestra es primordial, debe traer indicado la edad del paciente y diagnóstico

La recepción de las muestras es de lunes a viernes hasta las 10:00 horas.

(24)

APL

7.2 Flujograma

10 Hr 18-24 Hr a 36°C 36°C

18-24Hr / 36°C CALDO

SELENITO AGAR SHIGELLA -

SALMONELLA

AGAR MAC CONKEY

COLONIA SOSPECHOSA YERSINIA (COLONIA

PUNTIFORME LACTOSA -/+) COLONIA

SOSPECHOSA E.

COLI SEMBRAR EN AGAR

SALMONELLA SHIGELLA

SEMBRAR TSI/LIA

IDENTIFICACION

ENVIAR AL ISP IDENTIFICAR

SOLO EN BROTES O SHU

ENVIAR AL ISP COLONIA SOSPECHOSA

(INCOLORA) SHIGELLA O SALMONELLA

SEROLOGIA SEMBRAR 1-3 TSI 1-3 LIA

Deposición (tórula)

ANTIBIOGRAMA IDENTIFICACIÓN.EN

VIAR AL ISP

(25)

APL

Condiciones especiales: Se buscará Escherichia coli entero patógena solo ante presencia de brotes o en casos de síndrome hemolítico urémico (SHU). Toda cepa aislada se enviará al ISP.

Entrega de resultados: 48 a 72 horas.

8.

REGISTROS

Oficina director.

9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión

Nº

Pág.

modificada

aprobación

(26)

APL

10. ANEXOS

MEDIOS DE CULTIVO PARA COPROCULTIVO AGAR MAC CONKEY

USO

Es un medio selectivo y diferenciado utilizando para inhibir microrganismos Gram positivo.

Permite la selección y recuperación de Enterobacterias y bacilos Gram negativo entéricos relacionados.

FUNDAMENTO

Las sales biliares y cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivo y de algunas bacterias gram negativo fastidiosas. El indicador de pH, rojo metilo, da las características diferenciales. La lactosa es el único carbohidrato presente en el medio, las colonias fermentadoras de lactosa acidifican el medio como producto de su metabolismo causando la precipitación de las sales alrededor de las colonias y la caída de pH. El viraje del pH da el color rojo a las colonias. Las colonias no fermentadoras de lactosa permanecen incoloras.

FORMULA

AGAR MAC CONKEY 25 g

AGUA DESTILADA 500 ml PH FINAL 7.1 + 0.2

PREPARACION

Las placas preparadas con Agar Mac Conkey son compradas a proveedores con procesos certificados.

(27)

APL

REACCIONES

Cepas fermentadoras (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) producen colonias rojas rodeadas de sales biliares precipitadas.

Cepas fermentadoras débiles (Citrobacter, Providencia, Serratia, Hafnia) pueden aparecer incoloras o levemente rosadas a las 24-48 horas.

Proteus, Salmonella, Shigella, y Pseudomonas producen colonias transparentes.

Proteus --- colonia incolora E. coli --- colonia rosada

MANTENCION

Mantener refrigerado a 2-8°C

(28)

APL

AGAR SANGRE USO

El agar sangre al 5% es el medio de cultivo más común usado para aislar la mayoría de las bacterias aeróbicas no fastidiosas.

FUNCIONAMIENTO

Las bacterias con enzimas extracelulares que actúan en los GR producen β hemólisis (hemólisis completa- transparente) o α-hemólisis (hemólisis incompleta- color verde) o no tienen efecto (Gamma hemólisis).

FORMULA

AGAR SOYA TRIPTICASA 20 g AGUA DESTILADA 500 ml SANGRE CORDERO ESTÉRIL 25 ml pH FINAL 6,8

PREPARACION

Las placas preparadas con Agar sangre son compradas a proveedores con procesos certificados.

Streptococcus grupo A ---hemólisis beta - transparente Streptococcus pneumoniae ---hemólisis alfa – color verde

(29)

APL

MANTENCION

AGAR SALMONELLA SHIGELLA USO

Es agar SS es un medio muy selectivo para Salmonella y Shigella, e inhibe el desarrollo de bacterias coliformes. También permite diferenciar colonias fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras.

FUNCIONAMIENTO

Es un medio altamente selectivo formulado para aislar Salmonella y Shigella de muestras clínicas y del medio ambiente. La presencia de sales biliares y verde brillante inhibe el desarrollo de bacterias gram positivo y disminuye el crecimiento de bacterias gram negativo entéricas no patógenas y coliformes. La lactosa es el único carbohidrato incorporado al medio y permite diferenciar entre lactosa positivo y negativo. El tiosulfato es una fuente de azufre. Algunas bacterias producen gas sulfuro de hidrógeno, las que son detectadas por un precipitado negro formado con un citrato férrico y sulfato férrico.

FORMULA

AGAR SS 50 g

AGUA DESTILADA 500 ml

PREPARACION

Las placas preparadas con Agar SS son compradas a proveedores con procesos certificados.

(30)

APL

REACCIONES

Salmonella aparece como una colonia incolora con el centro negro por producción de H2S.

Shigella aparece como colonias incoloras de distintos tamaños

Shigella --- colonia incolora con centro negro E. coli --- colonia rosada a roja

MANTENCION

(31)

APL

INFORME DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS SENSIBILIDAD EN MUESTRAS DE DEPOSICIÓN

SHIGELLA

Antimicrobiano

Interpretación de CIM

Observación

R I S

Ampicilina <13 14-16 >17 Cotrimoxazol <10 11-15 >16 Ciprofloxacino <15 16-20 >21

Nitrofurantoína <14 15-16 >17 Informar como furazolidona.

SALMONELLA

Antimicrobiano

Interpretación de CIM

Observaciones

R I S

Ampicilina <13 14-16 >17 Cotrimoxazol <10 11-15 >16 Ciprofloxacino <15 16-20 >21

Cloranfenicol <12 13-17 >18 Informar solo en aislamientos extraintestinales

Cefotaxima <14 15-22 >23 Informar solo en aislamientos extraintestinales

*NCCLS M100-S13 (M2) FEBRERO 2003 Importante:

1. Las cefalosporinas de 1° y 2° generación y aminoglicósidos pueden ser sensibles in vitro para salmonella spp. y shigella spp., pero clínicamente resistentes.

(32)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA

HEMOCULTIVO

Índice

Sección Página

Objetivo 2

Alcance 2

Fundamento 2

Referencia 2

Terminología 3

Desarrollo 4

Registros 5

Anexos 6

TM. Lic. Patricio Peña Rioseco Encargado sección

Microbiología Laboratorio Clínico

Laboratorio

(33)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

1

OBJETIVO

El propósito de este Instructivo es establecer las pautas y definir la metodología para la realización de hemocultivos.

2

ALCANCE

Este instructivo aplica para el personal técnico y profesional involucrado en el proceso de diagnóstico microbiológico de todas las muestras para Hemocultivo aeróbico que llegan al laboratorio de microbiología del Hospital de Angol.

3.

FUNDAMENTO

El hemocultivo se utiliza en el laboratorio de microbiología principalmente frente a la sospecha de una bacteriemia, situación en donde hay paso de bacterias al torrente circulatorio. De este modo se hace indispensable, ante una sospecha de bacteriemia, de la rápida acción para aislar e identificar al potencial agente patógeno que se encuentra en sangre (revisar Anexos).

El cultivo de la sangre debe complementarse con el de otros fluidos como líquido cefalorraquídeo, orina, muestras del tracto respiratorio inferior o líquido sinovial en pacientes con sospecha de meningitis, pielonefritis, neumonía o artritis séptica, respectivamente.

Existen métodos manuales y automatizados (revisar Anexos), correspondiendo al primero el que se realiza en nuestro laboratorio.

4.

REFERENCIA

- http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap3a.htm#1 - http://www.ispch.cl/lab_sal/doc/proc_emo.pdf

(34)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

5.

TERMINOLOGIA

Frasco de hemocultivo: debe contener un 0,025 a un 0,05 de SPS (polianetol sulfonato de sodio) como anticoagulante. En este Laboratorio se usan medios para Hemocultivo comprados a un proveedor certificado (Bact Alert PF (Pediátrico) y Bact Alert PA (Adultos). Frascos ADULTOS, ideal 10 cc de sangre como máximo (4 a 10 cc), MEZCLAR, llevar al Laboratorio.

Frascos PEDIÁTRICOS, ideal 4 cc de sangre como máximo (2 a 4 cc), MEZCLAR, llevar al Laboratorio.

Agar Mac Conkey: medio de cultivo usado ampliamente en microbiología por sus propiedades al utilizarse para asilamiento y cultivo de Bacilos Gram Negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios.

Traspaso: acción de traspasar un inoculo de muestra del frasco de hemocultivo a medios Mac Conkey y Sangre.

6.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

6.1 Materiales: frasco de hemocultivo, mechero, estufa de cultivo, agar Mac Conkey, agar Sangre, Asa graduada, Jeringa estéril.

6.2 Equipo: Incubador Hemocultivos Bio Merieux Bact /Alert 3D 60.

(35)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

7.

DESARROLLO

7.1 Procedimientos Generales.

Mantener las precauciones de bioseguridad universales para nivel II para el manejo de líquidos corporales, en la toma de muestra y en el transporte (ver Anexos).

- Los hemocultivos corrientes se encuban por 7 días a 35° C en atmosfera normal y en endocarditis bacteriana subaguda hasta 14 días.

- Observar diariamente el aspecto macroscópico en busca de signos que indiquen desarrollo bacteriano: hemolisis, turbidez, presencia de gas, colonias, etc. En ese momento hacer tinción de gram directo de la siguiente forma: homogeneizar el contenido del frasco de hemocultivo por agitación suave, colocar una gota en el extremo del porta objeto y extender con un cubre objeto en ángulo 45°. Subcultivar a una placa de agar chocolate suplementado y a una placa de agar sangre de cordero al 5%.

- Realizar subcultivos ciegos aunque no se observen evidencias de desarrollo a las 24 horas y al 7° día de incubación, independientemente del aspecto macroscópico que presente la botella.

- Observar características macroscópicas de las colonias y hacer tinción de gram directo.

- Efectuar las pruebas bioquímicas y estudio de susceptibilidad antimicrobiana que corresponda al tipo de aislamiento.

7.2 Procedimientos Específicos.

En sospecha de brucelosis incubar hasta 30 días en atmosfera con 5-10% CO₂.

Para hemocultivos anaeróbicos si se utilizan medios comerciales especifico, incubar en atmosfera normal por 7 días.

Los cultivos para leptospira deben incubarse en oscuridad a 28 – 29° C por 4 – 6 semanas, el medio de cultivo es un medio enriquecido que consiste en un caldo adicionado de suero de conejo.

(36)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

Otros medios son:

a) Sistema bifásico (brucella spp)

b) Medios específicos para anaeróbicos: caldo tioglicolato.

c) Medios específicos para aislamiento de hongos.

d) Medios específicos para aislamiento de micro bacterias

8.

REGISTROS

Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo de retención y disposición

IT-04-03-005

Oficina director.

Acceso

restringido al director del lab.

9.

TABLA DE MODIFICACIONES

Revisión Nº

Pág.

modificada

aprobación

(37)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

10.

ANEXOS.

10.1 Condiciones en que debe llegar la muestra al laboratorio

La muestra debe llegar en un frasco pediátrico (1 ml sangre + 9 ml caldo) o en matraz erlenmeyer (5ml sangre + 45 ml caldo) en adultos. Debe mantenerse a temperatura ambiente hasta que sea posible incubar a 36°C

10.2 Flujograma.

(38)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

Condiciones especiales

Ante sospecha de haemophilus, incubar la placa de agar chocolate por 48 horas. En caso de aislamiento de Staphylococcus coagulasa negativo, se requerían dos hemocultivos (+) a igual agente y se estudiara solo una cepa por paciente.

Plazo de entrega de resultados.

En caso de un resultado negativo, se entregara en informe al 8° día. Ante un resultado positivo, se enviara un pre informe con resultado del Gram.

Agentes etiológicos mas frecuentes

• Entero bacterianas (E. coli, Klebsiella, Salmonella)

• Bacilos no fermentadores ( Pseudomonas, acinetobacter)

• Haemophylus (cocobacilos G (+) en niños pequeños)

• Neisseria meningitidis

• Neisseria gonorrhoeae

• Cocaceas G (+): Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa negativo, Enterococo, Streptococcus viridans.

• Listeria monocytogenes (bacilo G (+)pequeño en RN y embarazadas)

(39)

APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

AGAR MAC CONCKEY

USO

Es un medio selectivo y diferenciado utilizando para inhibir microrganismos Gram positivo.

Permite la selección y recuperación de Enterobacterias y bacilos Gram negativo entéricos relacionados.

FUNDAMENTO

Las sales biliares y cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivo y de algunas bacterias gram negativo fastidiosas. El indicador de pH, rojo metilo, da las características diferenciales. La lactosa es el único carbohidrato presente en el medio, las colonias fermentadoras de lactosa acidifican el medio como producto de su metabolismo causando la precipitación de las sales alrededor de las colonias y la caída de pH. El viraje del pH da el color rojo a las colonias. Las colonias no fermentadoras de lactosa permanecen incoloras.

FORMULA

AGAR MAC CONKEY 25 g

AGUA DESTILADA 500 ml PH FINAL 7.1 + 0.2

PREPARACION

Disolver el agar en el agua destilada mediante calor y agitación, idealmente en una platina calefaccionada con bastón magnético. Esterilizar en autoclave 15 min. a 121°C. Enfriar a 45° - 50° C y distribuir en placas (25 ml por placa aproximadamente).

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APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

REACCIONES

Cepas fermentadoras (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) producen colonias rojas rodeadas de sales biliares precipitadas.

Cepas fermentadoras débiles (Citrobacter, Providencia, Serratia, Hafnia) pueden aparecer incoloras o levemente rosadas a las 24-48 horas.

Proteus, Salmonella, Shigella, y Pseudomonas producen colonias transparentes.

Proteus --- colonia incolora E. coli --- colonia rosada

MANTENCION

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APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

AGAR SANGRE

USO

El agar sangre a 5% es l medio de cultivo más común usado para aislar la mayoría de las bacterias aeróbicas no fastidiosas

FUNCIONAMIENTO

FORMULA

pH FINAL 6,8

PREPARACION

Disolver el agar soya tripticasa en el agua destilada y calentar con agitación.

Esterilizar el autoclave 15 min. A 121°C. enfriar a 45° - 50° C y agregar la sangre estéril en forma aséptica. Mezclar bien y distribuir en placas (25 Ml por placa aproximadamente)

MANTENCION

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APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

AGAR CHOCOLATE

USO

El agar chocolate es un medio usado para aislamiento primario de la mayoría de las bacterias aeróbicas incluyendo las más fastidiosas (haemophilus, Gardnerella, Neisseria)

FUNCIONAMIENTO

El gar chocolate es preparado agregando sangre estéril a una base de soya tripticasa, el que está a aproximadamente 80°C, para lisar los GR y liberar los factores X y V, lo que lleva a un mejor desarrollo de las bacterias y permite además el aislamiento de haemophilus.

FORMULA

AGAR SOYA TRIPTICASA 20g

PH FINAL 6,8

PREPARACION

Disolver al agar soya tripticasa en el agua destilada y calentar con agitación...

Esterilizar el autoclave 15 min. A 121°C.mantener el medio a 80°C y agregara sangre estéril en forma aséptica. Mezclar bien agitando frecuentemente por unos 10 minutos, hasta que el medio adquiera un color café achocolatado y distribuir en placas (25 Ml por placa aproximadamente).Si se calienta en exceso se inactiva el factor.

MANTENCION

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APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

10.1 CLASIFICACIÓN DE HEMOCULTIVOS.

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APL

INSTRUCTIVO DE SIEMBRA HEMOCULTIVO

10.2 COMPARACIÓN DE SISTEMAS MANUALES VS AUTOMATIZADOS.

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APL