Quito - Ecuador
NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 1529-12:2000
FECHA DE CONFIRMACIÓN: 2012-10-29
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS.
RECUENTO DE HIFAS DE MOHOS.
Primera Edición
MICROBILOLOGICAL CONTROL OF FOODS MOLD HYPHAE COUNT.
First Edition
DESCRIPTORES: Alimentos; control microbiológico; ensayos: Howard, Geotrichum, podredumbre.
AL 01.05-319 CDU: 614.31:616.076 CIIU: 9320
ICS: 07.100.30
Norma Técnica Ecuatoriana
Voluntaria
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS.
RECUENTO DE HIFAS DE MOHOS.
NTE INEN 1529-12:2000
2000-02
1. OBJETO
1.1 Esta norma describe los métodos para determinar el porcentaje de hifas de mohos, realizar el recuento de hifas de mohos Geotrichum y el de fragmentos de podredumbre.
2. ALCANCE
2.1 Los métodos descritos en esta norma solo son aplicables al tipo de producto que se indica en cada procedimiento.
3. DEFINICIONES
3.1 Mohos. Son ciertos hongos multicelulares, filamentosos que al desarrollarse se presentan como una masa de aspecto aterciopelado o algodonoso denominada micelio.
3.2 Hifa. Es cada filamento del micelio.
3.3 Podredumbre. Son partículas de material celular del producto que tienen adheridos una o más hifas de mohos. Algunos pueden tener la apariencia de casi una masa compacta de mohos.
4. EQUIPOS, MATERIAL Y REACTIVOS 4.1 Equipos y material
4.1.1 Tubos de centrífuga, cónicos graduados, 40 cm3 y de 50 cm3.
4.1.2 Pipetas de 1,0 cm3, con un diámetro interno de 3,0 ± 0,5 mm, de punta ancha.
4.1.3 Lámina y cubreobjetos para el recuento de fragmentos de podredumbre. Lámina de vidrio de 55 mm x 100 mm x 1,5-4,0 mm de espesor con líneas transversales paralelas que disten entre sí 4,5 mm (su preparación ver en el Anexo A). Cubreobjetos de 50 mm x 85 mm y aproximadamente 1,5 mm de espesor.
4.1.4 Celda de Howard para recuento de mohos. Lámina de vidrio hecha de una sola pieza, con un círculo de superficie plana de aproximadamente 19 mm de diámetro o rectángulo de 20 mm x 15 mm, rodeado por una canaleta que linda a cada lado con un reborde 0,1 mm más alto que la superficie plana.
El cubreobjetos se coloca sobre el reborde y deja una profundidad de 0.1 mm entre la superficie inferior del cubreobjetos y la superficie plana. La superficie plana central, rebordes y el cubreobjetos tienen superficies talladas ópticamente. Para facilitar la calibración del microscopio, las láminas modernas son grabadas con un círculo de 1,382 mm de diámetro o con dos líneas paralelas finas distantes 1,382 mm.
4.1.5 Microscopio compuesto. Para el recuento de mohos, impurezas y otras alteraciones, el microscopio debe tener las siguientes especificaciones mínimas: cuerpo binocular con oculares inclinadas; 4 objetivos acromáticos parafocales de aproximadamente 4X, 10X, 20X y 40X; portaobjetivos giratorio de 4 lugares; condensador con una abertura numérica (N.A.) de 0,9; Huygenian u oculares 10X de campo amplio; ajuste fino; platina mecánica.
(Continúa) __________________________________________________________________________________
DESCRIPTORES: Alimentos; control microbiológico; ensayos: Howard, Geotrichum, podredumbre.
4.1.6 Microscopio estereoscópico de campo amplio. Cuerpo binocular con oculares inclinadas;
portaobjetivo corredizo o giratorio para acomodar tres objetivos; tres objetivos parafocales 1X, 3X, y 6 ó 7,5X pareados con oculares de campo amplio de 10X y 15X; armado en una base y apto para iluminación con luz transmitida y reflejada.
4.1.7 Centrífuga. Centrífuga Internacional tipo EXD con un cabezal No. 240 con ocho lugares, caparazón No.320, anillos soporte No.325 y protectores No.571 u otra centrífuga que dé el equivalente máximo de la fuerza centrífuga relativa. Se puede utilizar la siguiente fórmula para determinar la centrífuga equivalente:
N1 2 r1 = N2
2 r2
En donde:
N1 = 2 200 rpm;
r1 = 19,6 cm (distancia del centro del cabezal a la base del tubo de la centrífuga);
N2 = rpm de la centrífuga equivalente;
r2 = distancia del centro del cabezal a la base del tubo de la centrífuga equivalente.
4.1.8 Ciclón de laboratorio o pulpador. Consiste en un tamiz cilíndrico metálico, dentro del cual gira una paleta que empuja el material suave del alimento a través del tamiz. Los materiales duros tales como semillas, pieles, tallos, pedúnculos son llevados al extremo del cilindro y echados fuera. Se utiliza como fuente de energía un motor eléctrico de ¼ de caballo de fuerza, 110 V, 1725 rpm. El tamiz es hecho con un material de espesor 22, tiene por cm2 62 orificios de 0,69 mm de diámetro cada uno. El diámetro interno del tamiz es de 6,35 cm y su longitud útil de 7,62 cm. La paleta tiene dos aletas colocadas alternadamente, cada una tiene un ancho de 19,8 mm que se extienden del centro del eje 30,16 mm. El ciclón se alimenta por un embudo que conduce a una cubeta de 8,9 cm de largo y 6,35 cm de diámetro interno. La parte de la paleta con las aletas insertadas en un ángulo de 30° empuja el material de la cubeta dentro del tamiz. El ciclón es construido de tal manera que la abertura de los desperdicios pueda cerrarse, cuando sea necesario. El material tamizado es recogido en un protector y llevado por un conducto a un recipiente. El aparato se puede desarmar fácilmente para lavar.
4.1.9 Mezcladoras. (1) Alta velocidad. Utilizar un vaso de 1 litro con 4 lóbulos, ajustado con un dispositivo de 4 láminas, dos inclinadas hacia arriba aproximadamente 30° con un diámetro de 60 mm y dos láminas inclinadas hacia abajo aproximadamente 25° con un diámetro de 55 mm. Funciona a la velocidad indicada en el método, utilizando un transformador variable. (2) Alta velocidad - Motor suspendido. Es una alternativa para la mezcladora de alta velocidad. Mezcladora con 6 láminas de acero inoxidable con borde afilado e inclinadas que giran en el eje del motor suspendido y control de velocidad.
Las láminas giran en el fondo del vaso de acero inoxidable que tiene 4 muescas que forman lóbulos.
4.1.10 Tamices. Nos. 2, 6, 8, 16, 40, 60, 70, 100, 140 y 230. Los tamices No. 100 o más finos deben ser de acero inoxidable y de "tejido llano" (no asargado) el cual se teje con un alambre alternadamente sobre y debajo del próximo.
4.2 Reactivos
4.2.1 Solución estabilizadora A.2 (ver Anexo A).
4.2.2 Solución de cristal violeta A.1 (ver Anexo A).
(Continúa)
5. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL RECUENTO DE HIFAS DE MOHOS POR EL MÉTODO DE HOWARD
5.1 Productos de tomate
5.1.1 Jugo. Los recuentos de mohos realizar en el jugo después de homogeneizar la muestra en el envase. Continuar como se indica en el capítulo 6.
5.1.2 Salsa, puré y pasta
5.1.2.1 Transferir 50 cm3 de solución estabilizadora a un frasco graduado de 100 cm3, adicionar 50 cm3 de la muestra de salsa homogeneizada y mezclar bien.
5.1.2.2 En el caso de puré y pasta añadir a la muestra agua hasta obtener una mezcla que a 20°C dé un índice de refracción de 1,3448 - 1,3454 (1,3442 - 1,3448 a 25°C).
5.1.2.3 Agregar 2 a 6 gotas de 2-octanol a cada 100 cm3 de muestra preparada para el recuento, y continuar según se indica en el capítulo 6.
5.1.3 Sopa de tomate
5.1.3.1 Colocar en agua caliente una lata cerrada y perforada y mantenerla hasta que el contenido se caliente completamente, y luego, abrirla.
5.1.3.2 Homogeneizar la muestra, transferir 10 cm3 a un tubo de centrífuga de 50 cm3. Si contiene almidón, adicionar 3 cm3 de NaOH (1 + 1). Agitar hasta que el almidón se disuelva y el tejido esté transparente.
5.1.3.3 Añadir agua hasta llenar el tubo y centrifugar. El tiempo necesario para centrifugar las muestras varía grandemente. En una centrífuga con un brazo de 13,34 cm de longitud y una velocidad de alrededor 1 600 rpm se requiere, en la mayoría de los casos, 20 min. En las sopas espesas, la gelatinización del mucho almidón interfiere a veces con la adecuada sedimentación de los sólidos durante la centrifugación. Si el líquido permanece turbio, puede ser necesario descartar la muestra e iniciar nuevamente tomando solo 5 cm3 de sopa y agregando 3 cm3 de la solución de NaOH.
5.1.3.4 Eliminar el sobrenadante cuando es claro; si no es completamente claro, antes de descartarlo, verificar la presencia de mohos en el sobrenadante.
5.1.3.5 Añadir suficiente agua al residuo del tubo hasta llevar al volumen original de la sopa, mezclar y contar las hifas de mohos según se indica en el capítulo 6.
5.1.4 Tomate en polvo (ver nota 1)
5.1.4.1 De la muestra bien mezclada, pesar 17 g en un vaso de licuadora de alta velocidad, añadir 150 cm3 de agua para obtener una mezcla equivalente al puré de tomate.
5.1.4.2 Homogeneizar a aproximadamente 3 200 rpm durante 30 segundos y, con una espátula de caucho remover cualquier material adherido a las paredes. Enjuagar las paredes con 30 cm3 de agua, completar el volumen hasta 200 cm3 y agitar 1 min.
5.1.4.3 Adicionar dos gotas de 2-octanol para dispersar la espuma y continuar según se indica en el capítulo 6.
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NOTA 1. En la preparación de la muestra del tomate en polvo para el recuento de hifas de mohos no se considera su contenido de humedad y, la dilución se realiza con agua hasta obtener una mezcla que tenga aproximadamente un contenido de sólidos totales de 8,5 %
(Continúa)
5.1.5 Tomates enlatados
5.1.5.1 Drenar el contenido de la lata en un tamiz No.2 durante 2 minutos. Para los envases de peso neto < 1,5 kg, utilizar un tamiz de 203,2 mm de diámetro; para los envases de peso neto igual o > 1,5 kg, utilizar un tamiz de 304,8 mm. Realizar el recuento de mohos según se indica en el capítulo 6.
5.1.5.2 Examinar los tomates enteros escurridos y anotar el número y tamaño de cualquier porción deteriorada.
5.1.5.3 Pasar los tomates escurridos por un pulpador de laboratorio. Realizar el recuento de hifas de mohos en los tomates hechos pulpa, proceder como para jugo según se indica en el capítulo 6.
5.2 Salsa de tomate de conservas de carne con fréjol, pastas, papas, etc. (Aplicable a la salsa que acompaña la carne con fréjol, tallarines, ravioles, papas, etc).
5.2.1 Colocar en agua caliente una lata cerrada y perforada y mantenerla hasta que el contenido se caliente completamente y luego abrirla.
5.2.2 Transferir el contenido a un tamiz No.6, drenar hasta que la mayor parte de la salsa haya pasado.
(Con algunos productos la salsa pasa inmediatamente; pero, con otros, como fréjoles y tallarines puede necesitarse 10 minutos o más).
5.2.3 Mezclar bien la salsa, transferir 10 cm3 a un tubo de centrífuga, adicionar 3 cm3 de NaOH (1 + 1) y proceder según se indica en 5.1.3.2 al 5.1.3.5 (ver nota 2).
5.3 Salsa de tomate de conservas de pescado
5.3.1 Colocar una lata cerrada y perforada en agua caliente (entre 90 y 95°C) y mantenerla hasta que el contenido se caliente completamente.
5.3.2 Abrir la lata y drenar el contenido en un tamiz No.6 hasta que la mayor parte de la salsa y el aceite hayan pasado.
5.3.3 Mezclar bien el líquido, colocar hasta 50 cm3 en un tubo de centrífuga de 50 cm3 y centrifugar como se indica en 5.1.3.3.
5.3.4 Marcar el volumen de la capa inferior de la salsa libre de aceite y desechar el aceite y parte de la capa acuosa exenta de mohos.
5.3.5 Adicionar agua hasta completar el volumen marcado, mezclar y contar los mohos como se indica en el capítulo 6. Antes del recuento, si es necesario, retirar de la lámina los fragmentos de tejido del pescado (ver nota 2).
5.4 Jugos enlatados de cítricos y de piña. (Aplicable a jugos de concentración simple).
5.4.1 Verter el contenido de la lata en un vaso, mezclar bien transfiriendo entre el vaso y la lata por doce o más veces.
5.4.2 Del jugo mezclado, transferir 50 cm3 a un tubo de centrífuga cónico graduado de 50 cm3. 5.4.3 Centrifugar 10 min a 2 200 rpm.
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NOTA 2: En productos que contienen carne, realizar con mucho cuidado los recuentos de hifas de mohos para no confundirlas con las fibras musculares; pues, éstas aparentemente se parecen, pero las fibras musculares generalmente son más densas y sus estrías, frecuentemente visibles.
(Continúa)
5.4.4 Sin frenar y después que la centrífuga se haya parado completamente, retirar los tubos y leer el volumen del sedimento.
5.4.5 Decantar el sobrenadante sin revolver el sedimento.
5.4.6 Al jugo de piña añadir 0,5 cm3 de HCl (para disolver los cristales de oxalato).
5.4.7 Adicionar H2O al tubo para llevar a 10 cm3 y luego añadir 5 cm3 de la solución estabilizadora.
Mezclar bien el sedimento con el agua y la solución estabilizadora y verter en un vaso pequeño. Mezclar bien vertiendo entre el vaso y el tubo por seis o más veces. Agitar bien la mezcla en el vaso.
5.4.8 Hacer el recuento de hifas de mohos como se indica en el capítulo 6.
5.5 Néctares, purés y pastas de frutas 5.5.1 Preparación de la muestra
5.5.1.1 Néctares de frutas. De la muestra bien mezclada, transferir 40 cm3 a un tubo de centrífuga graduado de 40 cm3, y continuar como se indica en 5.5.2
5.5.1.2 Purés de frutas sin almidón añadido. De la muestra diluida 1+1 con H2O y bien mezclada, transferir 40 cm3 a un tubo de centrífuga graduado de 40 cm3, y continuar como se indica en 5.5.2 5.5.1.3 Purés de frutas con almidón añadido. En un vaso, pesar 50 g del puré de frutas y adicionar 50 cm3 de una solución de ácido clorhídrico (5 + 45). Mezclar bien y calentar 15 minutos en un baño de vapor. De esta muestra hidrolizada y bien mezclada, transferir 40 cm3 a un tubo de centrífuga graduado de 40 cm3, y continuar como se indica en 5.5.2
5.5.1.4 Pastas de frutas. Dispersar 1 parte de pasta en 3 partes de agua. Si es necesario, calentar suavemente para romper la gel. De esta muestra hidrolizada y bien mezclada, transferir 40 cm3 a un tubo de centrífuga graduado de 40 cm3, y continuar como se indica en 5.5.2
5.5.2 Centrifugación y corrección de la concentración
5.5.2.1 Centrifugar 10 minutos a 2 200 rpm, sin frenar dejar que la centrífuga se detenga completamente.
5.5.2.2 Retirar los tubos e inmediatamente, sin revolver el sedimento, decantar el sobrenadante. Golpear delicadamente el tubo para nivelar la superficie del sedimento.
5.5.2.3 Diluir el sedimento con la solución estabilizadora de la siguiente manera:
a) Durazno, albaricoque, mango y papaya: 1 + 1.
b) Pera y guayaba: 1 + 3.
c) Fresa, mora, frambuesa: 1 + 6.
5.5.2.4 Realizar el recuento de mohos por el método de Howard como se indica en el capítulo 6. Para los productos diluidos 1 + 1 (ver 5.5.2.3 literal a) dividir el número de campos positivos por 2 antes de calcular el % de mohos.
5.6 Fresas congeladas
5.6.1 Descongelar las fresas y reducirlas a pulpa con un pulpador y mezclar bien, al final, pasar el jugo por el pulpador.
(Continúa)
5.6.2 Si es necesario, remover las burbujas de aire por succión o mezclando aproximadamente 100 g de pulpa con 3 a 5 gotas de 2-octanol. Mezclar bien y realizar el recuento de mohos como se indica en el capítulo 6.
5.7 Especias en polvo (Aplicable a ajo molido, páprica, pimienta roja y de cayena, ají en polvo, chili y otros pimientos grandes).
5.7.1 De la muestra bien mezclada de la especia en polvo, pesar 10 g y transferir a una licuadora de alta velocidad.
5.7.2 Adicionar, en tres o cuatro porciones sucesivas, 200 cm3 de una solución de NaOH al 1%.
Después de cada adición homogeneizar a aproximadamente 13 000 rpm por 5 segundos, con la porción final de la solución de NaOH remover cualquier material adherido a las paredes de la licuadora.
5.7.3 Homogeneizar la mezcla 1 minuto a 13 000 rpm. Con una espátula de caucho, hacer caer en la mezcla cualquier material adherido a las paredes y repetir la homogeneización por 2 min más.
5.7.4 Adicionar dos o tres gotas de 2-octanol para deshacer la espuma.
5.7.5 Mezclar 100 g de esta muestra preparada con 50 g de la solución estabilizadora y continuar como se indica en el capítulo 7 (ver nota 3).
5.8 Alimentos infantiles en papilla
5.8.1 Antes del recuento, adicionar aproximadamente 0,2 g de NaOH en aproximadamente 6 g de producto y agitar bien hasta que el NaOH se disuelva. Continuar según se indica en el capítulo 6.
6. MÉTODO DE HOWARD 6.1 Procedimiento.
6.1.1 Limpiar la celda de Howard de manera que en los puntos de contacto, entre el reborde de la celda y el cubreobjeto, se produzcan los anillos de Newton. Mezclar bien la muestra, retirar el cubreobjeto, y con una lámina o escalpelo (de preferencia, plástico) colocar una pequeña gota sobre la superficie plana central (o disco) de la celda. Con el mismo instrumento, esparcir la gota uniformemente sobre toda la superficie plana central o del disco. Utilizar la cantidad suficiente de muestra solo para cubrir la superficie plana central hasta el borde (ver nota 4).
6.1.2 Colocar el cubreobjeto de la siguiente manera: mantener el cubre sobre la celda en una posición tal que forme un ángulo de 45°, luego, dejarlo caer con cierta rapidez, pero no demasiada.
6.1.3 Descartar cualquier lámina que presente una distribución desigual, o ausencia de los anillos de Newton, o líquido escurrido por la canaleta o entre el reborde y el cubreobjeto.
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NOTA 3. Ocasionalmente, la mezcla homogeneizada contiene partículas de tejidos de hojas que dificultan la formación de los anillos de Newton en la cámara de Howard preparada para el recuento de mohos. El dispositivo ideado para mantener la lamínula en su lugar y obviar esta dificultad consiste en una lámina metálica con una abertura de 2,5 cm de diámetro, en el centro de la lámina; dos abrazaderas fijadas al borde de la lámina mantienen la lamínula en posición cuando se la coloca sobre la lámina. También, se pueden retirar las partículas de hojas de la cámara de Howard con una micro-pinza.
NOTA 4. Es de suma importancia que la gota se tome de la muestra muy bien homogeneizada y que se le distribuya uniformemente sobre toda la superficie plana central. De otro modo, cuando se coloca el cubreobjeto, el material insoluble, y consecuentemente los mohos, pueden concentrarse más en el centro de la celda.
(Continúa)
6.1.4 La celda preparada colocar en el microscopio y examinar con un aumento tal para que el campo visible sea de 1,5 mm2. Esta área es esencial y frecuentemente puede obtenerse tan solo ajustando el largo del cañón del microscopio de manera que el diámetro del campo sea de 1,382 mm (las celdas de Howard tienen dos líneas paralelas o un círculo para verificar el área del campo). Cuando es imposible este ajuste, colocar en el ocular un diafragma cuya abertura sea exactamente la deseada. El diámetro del área del campo puede determinarse con un micrómetro. Cuando el instrumento está adecuadamente ajustado, el volumen del líquido examinado por campo es 0,15 mm3. Utilizar un aumento de 90 a 125X.
Cuando en un campo estándar es difícil percibir las características de las hifas de mohos, utilizar un aumento de aproximadamente 200X (objetivo de 8 mm) para confirmar la identidad de las hifas de mohos previamente observadas en el campo estándar (en el Anexo B se describen las características de las hifas de mohos).
6.1.5 De cada dos o más preparaciones, examinar mínimo 25 campos tomados de manera que se obtenga un resultado representativo de todas las secciones de la preparación.
6.1.6 Examinar cada campo, observar la presencia o ausencia de hifas y registrar el resultado como positivo o negativo; ningún campo puede registrarse como positivo más de una vez. Un campo se considera como positivo si cualquiera de las siguientes longitudes excede 1/6 del diámetro del campo (para tener como positivo un campo, no es suficiente 1/6 del campo, la suma de las longitud debe
"exceder" 1/6 del diámetro del campo):
6.1.6.1 La longitud de un solo filamento, sin ramas.
6.1.6.2 La longitud de un solo filamento más la longitud de sus ramas (longitud agregada).
6.1.6.3 La longitud agregada de dos filamentos de mohos.
6.1.6.4 La longitud agregada de tres filamentos de mohos (no pueden sumarse las longitudes de más de tres filamentos de mohos).
6.1.6.5 La longitud agregada de todos los filamentos de un grumo de mohos (a un grumo de mohos se le considera una sola pieza y están consideradas las longitudes de todos los filamentos).
6.1.7 Se deben preparar dos láminas y la diferencia entre el número de campos positivos obtenidos no debe ser mayor que 3; caso contrario, se preparará una tercera lámina. Para mayor precisión preparar un número mayor de láminas.
6.2 Cálculos e informe de resultados
6.2.1 Calcular el porcentaje de campos positivos utilizando la siguiente fórmula:
% .
de campos posit ivos No de campos posit ivos. No de campos examinados x
= 100
6.2.2 Informar los resultados como % de campos positivos.
7. RECUENTO DE HIFAS DE MOHOS GEOTRICHUM
7.1 Preparación de la muestra 7.1.1 Bebidas no alcohólicas
(Continúa)
7.1.1.1 Determinar la masa neta, M, del envase y transferir el contenido a un tamiz de 76 mm de malla No.230.
7.1.1.2 Transferir el residuo del tamiz a un tubo de centrífuga de 50 cm3 graduado y diluir hasta 10 cm3. 7.1.1.3 Adicionar una gota de solución colorante de cristal violeta (ver A.1), y mezclar bien.
7.1.1.4 Adicionar 10 cm3 de la solución estabilizadora (ver A.2), y llevar el volumen total, V, a 20 cm3. 7.1.1.5 Hacer el recuento de mohos Geotrichum en dos láminas como se indica en 7.2 y 7.3 7.1.2 Jugos de Cítricos
7.1.2.1 Los jugos de concentración simple examinarlos sin diluir; los concentrados, diluirlos hasta la concentración simple.
7.1.2.2 Transferir un volumen ≤ 250 cm3 a un tamiz de 127 mm No.40 colocado sobre un baso de 2 litros (anotar el volumen y el peso utilizados).
7.1.2.3 Con una piceta, lavar el envase con agua transfiriendo los enjuagues al tamiz. Reservar el residuo, líquido y enjuagues.
7.1.2.4 Transferir cuantitativamente el líquido y los enjuagues a un tamiz de 127 mm No. 140 colocado sobre un segundo vaso de 2 litros. Lavar el primer vaso y transferir los enjuagues a un tamiz No. 140.
Reservar el residuo, líquidos y enjuagues.
7.1.2.5 Transferir cuantitativamente el líquido y los enjuagues del tamiz No.140 a un tamiz de 127 mm No. 230. Lavar el segundo vaso sobre el tamiz. Descartar el líquido y los enjuagues, pero, guardar el residuo.
7.1.2.6 Con una piceta y una espátula, transferir cuantitativamente los residuos de los tamices Nos. 40 y 140 al tamiz No. 230.
7.1.2.7 Inclinar el tamiz hasta aproximadamente un ángulo de 30°, lavar el residuo y llevarlo con agua hasta el borde del tamiz.
7.1.2.8 Con una piceta y una espátula, transferir el residuo del tamiz No. 230 a un tubo de centrífuga graduado de 50 cm3.
7.1.2.9 Si el volumen transferido es ≤ 20 cm3, diluir con agua hasta 20 cm3. Adicionar cinco gotas de solución de cristal violeta, mezclar bien y diluir con la solución estabilizadora hasta 40 cm3 (ver Anexo A).
7.1.2.10 Mezclar bien y proceder como se indica en 7.2.
7.1.2.11 Si el volumen transferido es ≥ 20 cm3, adicionar cinco gotas de la solución cristal violeta y centrifugar 6 min a 2 200 rpm, sin frenar, y después que la centrífuga se haya detenido completamente, retirar los tubos y leer el volumen del sedimento.
7.1.2.12 Diluir los grumos con agua hasta 20 cm3, mezclar bien, y diluir hasta 40 cm3 con solución estabilizadora.
7.1.2.13 Mezclar bien y proceder como se indica en 7.2 y 7.3.
(Continúa)
7.1.3 Vegetales, Frutas y Jugos Enlatados. Aplicable a productos donde los mohos no están enmascarados por grandes cantidades de tejidos.
7.1.3.1 Determinar la masa neta (g) del contenido de la lata.
7.1.3.2 En un recipiente, drenar el contenido 3 min utilizando un tamiz de 203,2 mm No.8. Con una cuchara, retirar la fruta del tamiz y descartar.
7.1.3.3 Con una piceta, lavar la lata y el tamiz con aproximadamente 300 cm3 de agua, reservar el líquido y los enjuagues.
7.1.3.4 El líquido y los enjuagues, juntos, transferir cuantitativamente a un tamiz de 127 mm No.16 colocado sobre un vaso de 2 litros.
7.1.3.5 Lavar el residuo del tamiz con aproximadamente 50 cm3 de agua y descartar el residuo.
7.1.3.6 Cuantitativamente transferir el líquido y los enjuagues juntos a un tamiz de 127 mm No.230, inclinar hasta aproximadamente un ángulo de 30°, y descartar el líquido y los enjuagues.
7.1.3.7 Lavar el tejido, y con agua juntarlo en el borde del tamiz.
7.1.3.8 Con una piceta, espátula y un mínimo de agua, transferir el residuo del tamiz a un tubo de centrífuga graduado de 50 cm3 y de pared gruesa. Dependiendo del volumen, proceder de la siguiente manera:
a) Volúmenes ≤ 10 cm3.
a.1) Diluir hasta 10 cm3.
a.2) Adicionar una gota de solución colorante cristal violeta (ver A.1), y mezclar bien.
a.3) Añadir 10 cm3 de solución estabilizadora (ver A.2), llevar el volumen total hasta 20 cm3. a.4) Proceder como se indica en 7.2.
b) Volúmenes >10 cm3 pero ≤ 30 cm3. b.1) Diluir hasta 40 cm3.
b.2) Adicionar tres gotas de solución de cristal violeta. Mezclar bien.
b.3) Centrifugar aproximadamente 6 min a 2 200 rpm, como se indica en 7.1.2.11.
b.4) Decantar y descartar el sobrenadante.
b.5) En el tubo de centrífuga, adicionar agua al sedimento hasta aproximadamente la marca 5 cm3. b.6) Señalar el volumen del sedimento con el agua, adicionar igual volumen de solución estabilizadora
y mezclar bien, pero, delicadamente.
b.7) Anotar el volumen total de la mezcla que se encuentra en el tubo de centrífuga, (V).
b.8) Proceder como se indica en 7.2.
(Continúa)
c) Volúmenes >30 cm.
c.1) Transferir a una probeta graduada con tapa.
c.2) Diluir hasta ≥ 100 cm3 [V (preparación)] y mezclar bien.
c.3) En dos tubos separados de centrífuga, rápidamente transferir dos alícuotas de 25 cm3 [V(alícuotas) = suma de alícuotas tomadas] y proceder como se indica en 7.1.3.8 literal b) c.4) Mantener iguales los volúmenes finales después de diluidos con la solución estabilizadora;
V(dilución) = suma del volumen en los dos tubos.
c.5) Con una pipeta preparar una lámina de cada alícuota diluida y proceder como se indica en 7.2.
7.1.3.9 Cálculos. Calcular los fragmentos miceliales/500 g de producto utilizando la siguiente fórmula:
N = [S/V(láminas)] x (500/M) x V(dilución) x [V(preparación) /V(alícuota)]
En donde:
S = total de fragmentos miceliales contados;
V = (láminas) = volumen total examinado (0.5 cm3/lámina);
M = masa neta de la muestra, g;
V (dilución) = suma del volumen de ambos tubos de centrífuga, después de diluido con la solución estabilizadora;
V (preparación) = volumen antes de retirar las alícuotas;
V (alícuota) = suma del volumen de las alícuotas tomadas.
7.1.4 Frutas y Vegetales Triturados
7.1.4.1 Néctares de frutas. A un tubo de centrífuga de 40 cm3 adicionar 40 cm3 de néctar y 10 gotas de solución cristal violeta (ver A.1). Mezclar bien y continuar como se indica en 7.1.4.5.
7.1.4.2 Purés sin almidón añadido. A un tubo de centrífuga de 40 cm3 adicionar 20 cm3 de puré y 10 gotas de solución cristal violeta. Mezclar bien. Llevar el volumen a 40 cm3 con agua y mezclar bien.
Continuar como se indica en 7.1.4.5.
7.1.4.3 Purés con almidón añadido. Adicionar 50 cm3 de una solución de HCl (5+45) a 50 g de puré de fruta. Mezclar bien y calentar con agitador magnético hasta que el almidón se aclare. Neutralizar la solución a pH 7,0 ± 1,0 con KOH al 50% ó NaOH al 50%. Transferir 40 cm3 de la solución a un tubo de centrífuga de 40 cm3 y adicionar 20 gotas de solución cristal violeta. Mezclar bien, y continuar como se indica en 7.1.4.5.
7.1.4.4 Pastas. Mezclar una parte de pasta con tres de agua. Si es necesario, calentar suavemente para romper el gel. Transferir 40 cm3 de la solución a un tubo de centrífuga de 40 cm3 y adicionar 10 gotas de solución cristal violeta. Mezclar bien y continuar como se indica en 7.1.4.5.
7.1.4.5 Centrifugación. Centrifugar 10 min a 2 200 rpm. Inmediatamente después de centrifugar, decantar la capa acuosa y leer el volumen del sedimento. Diluir una parte del sedimento con tres de solución estabilizadora (volumen/volumen). Proceder como se indica en 7.2.
(Continúa)
7.1.4.6 Cálculos. Calcular el número de fragmentos de micelio utilizando la siguiente fórmula:
N = S x 100 En donde:
S = total de fragmentos de micelio/cm3 de muestra preparada en la que se realizó el recuento (0,5 cm3/lámina).
7.1.4.7 Informe de resultados. Expresar los resultados como fragmentos de micelios por 100 cm3 de muestra preparada.
7.1.5 Crema de cereales
7.1.5.1 En un tamiz de 127 mm No.16, colocado sobre un recipiente, pesar 250 g de producto.
7.1.5.2 Sobre el tamiz, lavar la lata y el residuo con aproximadamente 1,5 litros de agua caliente (44- 55°C), reservar el líquido y los enjuagues.
7.1.5.3 Descartar el residuo y volver a lavar el tamiz con aproximadamente 300 cm3 de agua caliente.
7.1.5.4 Cuantitativamente, transferir el líquido y los enjuagues juntos a un tamiz de 127 mm No.70.
7.1.5.5 Lavar el residuo del tamiz con aproximadamente 1 litro de agua caliente, reservar el líquido y los enjuagues pero, desechar el residuo.
7.1.5.6 Cuantitativamente, transferir el líquido y los enjuagues juntos a un tamiz de 127 mm No.230 inclinar hasta aproximadamente un ángulo de 30°.
7.1.5.7 Lavar el residuo con aproximadamente 500 cm3 de agua caliente y desechar el líquido y los enjuagues.
7.1.5.8 Lavar el tejido y con agua caliente juntarlo en el borde del tamiz.
7.1.5.9 Con una piceta y una espátula transferir el residuo del tamiz a un tubo de centrífuga graduado de 100 cm3.
7.1.5.10 Diluir hasta 50 cm3 con agua. Adicionar 20 gotas de solución de cristal violeta, y mezclar bien.
7.1.5.11 Diluir hasta 100 cm3 con solución estabilizadora. Mezclar bien y continuar como se indica en 7.2 y 7.3. Realizar los recuentos en dos láminas.
7.2 Determinación
7.2.1 De la muestra bien mezclada, con una pipeta, tomar 0,5 cm3 y distribuirla en rayas de aproximadamente 4 cm de largo en una lámina para recuento de fragmentos de podredumbre (ver 4.1.3).
Si es necesario, soplar la última gota. Preparar otras láminas de la misma manera.
7.2.2 Examinar cada lámina a 30-40X utilizando una iluminación de fondo con luz transmitida difusa.
7.2.3 Contar en dos láminas completas los fragmentos de micelio Geotrichum (con tres o más ramificaciones características de hifas (ver Anexo B, literal B.7, figuras (B.I.5 y B.II).
(Continúa)
7.3 Cálculos e informe de resultados
7.3.1 Calcular los fragmentos de micelios/500 g de producto de la siguiente manera:
N = [S/V (láminas)] x (500/M) x V (dilución) En donde:
S = total de fragmentos de micelios contados;
V (láminas) = volumen total examinado (0,5 cm3/lámina);
M = masa neta de la muestra, g;
V (dilución) = volumen después de la dilución final con la solución estabilizadora.
7.3.2 Informar los resultados como número de fragmentos de micelio/500 g de producto.
8. PODREDUMBRE EN PRODUCTOS DE TOMATE (Triturados) 8.1 Recuento de Fragmentos de Podredumbre
8.1.1 Pesar la muestra directamente en un vaso de 400 cm3, utilizar una balanza con lectura de 0,1 g, con una precisión de ± 0,05 g, y 1 200 g de capacidad.
8.1.2 En caso de puré o pasta, diluir con agua hasta obtener un índice de refracción de 1,3448 - 1,3454 a 20°C (1,3442 -1,3448 a 25°C). Utilizar 5,0 g de s alsa o puré diluido o pasta; y de jugo, 10 g.
8.1.3 En un vaso, adicionar a la muestra aproximadamente 100 cm3 de agua destilada, y con una varilla de vidrio agitar hasta que el material de la muestra se disperse bien.
8.1.4 Adicionar 12 gotas de solución cristal violeta (ver A.1), agitar y dejar en reposo durante 5 min.
8.1.5 Añadir 200 cm3 de agua y directamente del vaso transferir a un tamiz No.60 de 76,2 mm de diámetro interno.
8.1.6 Enjuagar el vaso con otros 200 cm3 de agua y directamente verter el agua sobre el tamiz, como se indica anteriormente.
8.1.7 Esparcir delicadamente la muestra sobre el tamiz.
8.1.8 Inclinar el tamiz hasta aproximadamente un ángulo de 30°, lavar cuidadosamente el tejido y con el chorro de agua de una piceta llevarlo hasta el borde del tamiz.
8.1.9 Dejar que el tejido se escurra. Si es necesario, repetir los enjuagues y drenados hasta que el tejido de tomate se concentre en el borde inferior del tamiz.
8.1.10 Con una micro-cuchara o una pequeña espátula tipo cuchara, poner una porción adecuada de tejido en el fondo de un tubo graduado de aproximadamente 12 cm x 3 cm.
8.1.11 Se debe enjuagar el tejido que resta en el tamiz, hasta juntarlo en el borde inferior, como anteriormente.
8.1.12 Mantener el tamiz en un ángulo de aproximadamente 80-90°, de manera que en el borde de éste se retenga algo de agua y de tejido.
8.1.13 Inmediatamente, con un gotero que su punta tenga un diámetro interior de 2 mm, transferir el agua y el tejido a un tubo graduado.
(Continúa)
8.1.14 Con una piceta, repetir el lavado del tejido hasta que todo el tejido se junte en el borde del tamiz y sea transferido.
8.1.15 Con agua, completar el volumen del tejido y del agua hasta 10 cm3.
8.1.16 Adicionar la solución estabilizadora (ver A.2), llevar el volumen a 20 cm3 y mezclar bien utilizando una microcuchara o espátula.
8.1.17 Pipetear por separado 4 porciones de 0,5 cm3 utilizando una pipeta. Antes de retirar cada porción, agitar la preparación de la muestra con la pipeta y aspirar aproximadamente del centro de la preparación.
8.1.18 Delicadamente poner una porción de 0,5 cm3 sobre cada una de 4 láminas de recuento (ver 4.1.3), dejando que el material fluya lentamente, y esparcir uniformemente en el centro de la lámina hasta cubrir un área de aproximadamente 6 cm x 2 cm.
8.1.19 Tocar varias veces la lámina con la punta de la pipeta para asegurar la completa remoción del material. Si es necesario, soplar la última gota de material.
8.1.20 Examinar cada lámina a 40-45X, utilizando luz transmitida.
8.1.21 Contar el número de fragmentos de podredumbre en cada una de las cuatro láminas.
8.2 Cálculos e informe de resultados
8.2.1 Calcular el número de fragmentos de podredumbre de la siguiente manera:
8.2.1.1 Jugos. Sumar los resultados de las cuatro láminas para obtener el número de fragmentos de podredumbre/g de jugo.
8.2.1.2 Salsa, o pasta o puré diluidos. Sumar los resultados de las cuatro láminas y multiplicar por 2 para obtener los resultados en 5/g de muestra (salsa, o puré o pasta diluidos).
8.2.2 Informar los resultados como número de fragmentos de podredumbre en gramos de producto.
9. INFORME DE RESULTADOS
9.1 Deben indicarse el método usado y el resultado obtenido. Debe mencionarse, además, cualquier condición no especificada en esta norma o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado.
9.2 Deben incluirse todos los detalles para la completa identificación de la muestra.
(Continúa)
PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y MATERIALES
A.1 Solución de cristal violeta Composición:
Cristal violeta 10,0 g
Etanol 100,0 cm3
Preparación. Disolver el cristal violeta en el alcohol y filtrar.
A.2 Solución estabilizadora Composición:
Formol (solución acuosa al 37% m/m de HCHO) 12,0 cm3 Carboximetilcelulosa de sodio * 2,5 g
Agua destilada 500,0 cm3
* Alternativamente, se puede utilizar pectina de 3% al 5%
Preparación. Colocar 500 cm3 de agua hirviente en el vaso de una licuadora, agitar a alta velocidad, añadir la carboximetilcelulosa y los 10 cm3 formol directamente al agua mientras se agita a alta velocidad, mezclar por aproximadamente 1 minuto (si no se dispone de una licuadora, mezclar la carboxi con alcohol para facilitar la incorporación con el agua). Eliminar las burbujas de aire, tratando la solución al vacío o calentándola. Para preservar la solución, añadir 2 cm3 de formol por cada 100 cm3 de solución estabilizadora. Ajustar el pH entre 7,0 y 7,5 y filtrar la solución en una membrana filtrante de 8 µm.
A.3 Lámina para contar fragmentos de podredumbre.
Preparación.
A.3.1 A una lámina de vidrio de 55 mm x 100 mm y 1,5-4,0 mm de espesor, cuidadosamente, cubrir toda la superficie con una capa de resina protectora, evitando cualquier orificio diminuto. El barniz de asfalto da una excelente resina protectora; también se puede utilizar cera de parafina.
A.3.2 Através de la capa de resina protectora y a 15 mm de cada extremo, cuidadosamente trazar líneas paralelas transversales que disten 4,5 mm. Si se utiliza barniz de asfalto, las líneas pueden trazarse con una rueda nueva de acero inoxidable para cortar vidrio.
A.3.3 Colocar la superficie rayada de la lámina hacia abajo sobre un envase de polietileno que contenga ácido fluorhídrico. Determinar en forma práctica la exposición adecuada a los vapores ácidos.
A.3.4 Luego del ataque, colocar la lámina en agua con detergente para remover la resina protectora. Si frotando, no se elimina fácilmente la resina protectora, limpiar con tolueno.
A.3.5 Pegar la mitad, aproximadamente 11 mm x 50 mm, de una lamínula rectangular No.2 de aproximadamente 22 mm x 50 mm, en cada extremo de la placa de recuento para levantar el cubre objetos sobre la lámina rayada.
A.3.6 Alternativamente usar láminas de plástico claro, de 55 mm x 100 mm y 4-6 mm de espesor con un cubreobjetos de vidrio de 50 mm x 85 mm, de aproximadamente 2 mm de espesor. Preparar la lámina de la siguiente manera:
(Continúa)
A.3.6.1 A 15 mm de cada extremo, cuidadosamente, con una aguja puntiaguda trazar líneas paralelas transversales que disten 4,5 mm, como se indica en la figura 1.
Figura 1. Lámina para recuento de fragmentos de podredumbre
A.3.6.2 Se pueden hacer varias láminas al mismo tiempo utilizando láminas de plástico de 100 mm de ancho y de cualquier largo que sea múltiplo de 55 mm y dejando una longitud extra para compensar por cada corte de 2-3 mm de espesor.
(Continúa)
CARACTERÍSTICAS DE LAS HIFAS DE MOHOS
B.1 Paredes Paralelas. Las hifas de mohos son tubulares, viéndose al microscopio como dos líneas paralelas de espesor uniforme. Sin embargo, existen excepciones. En algunos mohos más grandes, las paredes pueden estar colapsadas o torcidas. En algunos mohos las hifas pueden tener protuberancias a lo largo de los lados, de manera que las paredes no son paralelas. Las hifas de los Mucor y Geotrichum son frecuentemente ahusadas (ver figuras B.I.5 y B.II).
B.2 Septos. Muchos tipos de mohos filamentosos poseen septos que los dividen en segmentos o secciones. Generalmente, los Mucor y algunos pocos mohos no poseen septos.
B.3 Gránulos. El protoplasma que contienen las hifas de paredes finas puede verse a través de estas paredes, y al observar al microscopio adquiere una apariencia granular o punteada. Esto se ve muy claramente en algunos mohos del género Mucor y Rhizopus. En algunos mohos finos las granulaciones del protoplasma no son evidentes, como en el que produce la antracnose. En algunos mohos desaparecen dejando la pared fina, transparente, casi como tubos invisibles. Este moho vacío es extremamente difícil de contar. A veces, puede torcerse, pareciéndose a una fibra de algodón.
Frecuentemente el protoplasma se separa intermitentemente, formando una línea de enlaces cortos o cadenas conectadas por paredes casi invisibles de hifas (ver figuras B.I) .
B.4 Ramificaciones. La mayoría de los hongos presentan ramificaciones que les distingue de otras células vegetales, mas, muchas veces, en los fragmentos pequeños no se observan. Las ramificaciones y el tronco principal casi siempre tienen el mismo diámetro (ver figuras B.I).
B.5 Extremos redondeados. El extremo natural de un filamento generalmente es claramente redondeado. Los filamentos raramente son puntiagudos, excepto en las hifas fértiles. Ocasionalmente, se dilatan y forman una bola o cabeza, especialmente cuando se está formando el agregado reproductor.
Los extremos fragmentados de un filamento, normalmente son rectos. La porción de hifa adyacente al extremo fragmentado puede colapsarse y no contener protoplasma.
B.6 Apariencia no refringente Las hifas no refractan fuertemente la luz. Algunos objetos encontrados en una preparación de mohos pueden parecer hifas pero, tienen una apariencia altamente refringente.
B.7 Características de los mohos Geotrichum.
B.7.1 Los fragmentos de micelios Geotrichum tienen las mismas características de las hifas de mohos ya descritas anteriormente. Además, los filamentos de los mohos Geotrichum son septados, las puntas tienden a ahusarse y las ramificaciones forman un ángulo de 45°, dando al moho una apariencia plumosa como se ven en las figuras B.II.
(Continúa)
FIGURA B.I Hifas de mohos en productos de tomate (100x)
1, Hifas ramificadas de mohos en células de tomate. 2, moho grande con paredes no paralelas, paredes paralelass, ramificaciones, granulaciones y exstremos romos. 3, mohos muy finos. 4, moho presentando inicio de esporulación en el extremo de la hifa. 5, moho Geotrichum presentando paredes septadas y una apariencia plumosa característica de la sucie4dad de la maquinaria. 6, esporo de Alternaria adherida a una hifa.
(Continúa)
(Continúa)
FIGURA B.III Fragmentos de podredumbre en puré de tomate
(Continúa)
Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR Esta norma no requiere otras para su aplicación
Z.2 BASES DE ESTUDIO
OFFICIAL METHOS of ANALYSIS 16th Edition, 1995 Association of Official Analytical Chemists. Volume One.
Documento:
NTE INEN 1529-12
TITULO: CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS. RECUENTO DE HIFAS DE MOHOS
Código:
AL 01.05-319
ORIGINAL:
Fecha de iniciación del estudio:
1997-03-28
REVISIÓN:
Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo Oficialización con el Carácter de por Acuerdo No. de
publicado en el Registro Oficial No. de Fecha de iniciación del estudio:
Fechas de consulta pública: de a
Comité Interno del INEN:
Fecha de iniciación: 1998-07-31 Fecha de aprobación: 1999-03-24 Integrantes del Subcomité Técnico:
NOMBRES:
Dr. Ramiro Gallegos (Presidente) Ing. Bolívar Cano
Ing. Enrique Troya Bioq. Miriam Romo
Bioq. Flor Elena Salazar
Dra. Hipatia Navas (Secretaria Técnica)
INSTITUCIÓN REPRESENTADA:
SUBDIRECTOR TÉCNICO
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
DIRECTOR DE PROTECCIÓN AL CONSUMIDOR DIRECCIÓN DE DESARROLLO Y CERTIFICACIÓN DE CALIDAD
DIRECCIÓN DE VERIFICACIÓN FÍSICA DIRECCIÓN DE VERIFICACIÓN ANALÍTICA
Otros trámites: Esta NTE INEN 1529-12:2000, reemplaza a la NTE INEN 386:1986
Esta NTE INEN 1529-12: 2000, ha sido confirmada en 2012-10-29 CARÁCTER: Se recomienda su aprobación como: VOLUNTARIA
Aprobación por Consejo Directivo en sesión de 1999-11-10 como: Voluntaria
Oficializada como: Voluntaria
Por Acuerdo Ministerial No. 2000127-A de 2000-01-20 Registro Oficial No. 17 de 2000-02-15
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN ---- Baquerizo MorenBaquerizo MorenBaquerizo MorenBaquerizo Moreno E8o E8o E8----29 y Av. 6 de Diciembreo E829 y Av. 6 de Diciembre29 y Av. 6 de Diciembre29 y Av. 6 de Diciembre Casilla 17
Casilla 17 Casilla 17
Casilla 17----01010101----3999 3999 3999 ---- Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 3999 Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 ---- Fax: (593 2) 2 567815Fax: (593 2) 2 567815Fax: (593 2) 2 567815 Fax: (593 2) 2 567815 Dirección General: E
Dirección General: E Dirección General: E
Dirección General: E----Mail:[email protected] Mail:[email protected] Mail:[email protected] Mail:[email protected] Área Técnica de Normalización: E
Área Técnica de Normalización: E Área Técnica de Normalización: E
Área Técnica de Normalización: E----Mail:Mail:Mail:normalizacionMail:normalizacionnormalizacion[email protected] @inen.gov.ec @inen.gov.ec @inen.gov.ec Área Técnica
Área Técnica Área Técnica
Área Técnica de Certificación: de Certificación: de Certificación: de Certificación: EEE----Mail:EMail:Mail:Mail:certificacioncertificacion[email protected] certificacion@inen.gov.ec @inen.gov.ec @inen.gov.ec Área Técnica
Área Técnica Área Técnica
Área Técnica de Verificación: Ede Verificación: Ede Verificación: E----Mail:de Verificación: EMail:Mail:Mail:verificacionverificacion[email protected] verificacion@inen.gov.ec @inen.gov.ec @inen.gov.ec Área Técnica de Servicios Tecnológicos: E
Área Técnica de Servicios Tecnológicos: EÁrea Técnica de Servicios Tecnológicos: E
Área Técnica de Servicios Tecnológicos: E----Mail:Mail:Mail:inencatiMail:inencatiinencati[email protected]@inen.gov.ec@inen.gov.ec@inen.gov.ec Regional Guayas: E
Regional Guayas: E Regional Guayas: E
Regional Guayas: E----Mail:Mail:Mail:Mail:inenguayasinenguayasinenguayas[email protected] @inen.gov.ec @inen.gov.ec @inen.gov.ec Regional Azuay: E
Regional Azuay: E Regional Azuay: E
Regional Azuay: E----Mail:[email protected]Mail:[email protected]Mail:[email protected]Mail:[email protected].ec.ec.ec Regional Chimborazo: E
Regional Chimborazo: E Regional Chimborazo: E
Regional Chimborazo: E----Mail:inenriobamba@inenMail:inenriobamba@inenMail:inenriobamba@inenMail:[email protected].gov.ec.gov.ec.gov.ec URL:www.inen.gov.ec
URL:www.inen.gov.ec URL:www.inen.gov.ec URL:www.inen.gov.ec
