UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE ESTOMATOLOGÍA
ESCUELA PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGÍA
TESIS
“Efecto antibacteriano del Extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) frente a Streptococcus mutans, 2019”
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE CIRUJANO DENTISTA
AUTOR:
Gamboa Mendoza, Lener Albert
ASESOR:
Dr. Guardia Mendez, Gustavo
TRUJILLO-PERÚ 2020
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DEDICATORIA
En primera instancia, agradezco humildemente a quien ha forjado mi sendero y ha guiado mis pasos por el camino correcto, a Dios, el que siempre está conmigo enseñándome como aprender de mis errores para no cometerlos otra vez.
A mis padres Uwaldina y Juan, que al brindarme su infinito amor, comprensión, apoyo y educación, hicieron que sea una persona íntegra; es por eso que con gran respeto, reconozco que muchos de mis logros se los debo a ustedes entre los que se incluye este.
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A Sharon, una persona muy especial para mí, que me apoyó incluso en los días tormentosos, porque no fue sencillo culminar con éxito este proyecto, no obstante fuiste muy esperanzadora, me decías que lo lograría. Me ayudaste hasta donde te era posible, incluso más que eso y nunca lo olvidaré.
A todas esas personas anónimas, que trabajando en silencio y con esmero, aportaron una cuota de si en los momentos pertinentes para poder terminar este trabajo.
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AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Gustavo Guardia Méndez, mi asesor, por su guía, tiempo y paciencia por haberme ayudado a fijar los cimientos y orientarme durante el desarrollo y la culminación de esta investigación.
A la Dra. Elva Mejía Delgado, mi Co-asesora, por compartir conmigo sus conocimientos, la oportunidad de contar con su consideración y aprecio, y su detallado trabajo realizado conmigo durante la ejecución del proyecto.
A la Dra. Marilú Soto Vásquez, por brindarme sus conocimientos y su dedicado trabajo realizado en los inicios de la ejecución del proyecto.
A los docentes de la Facultad de Estomatología de la Universidad Nacional de Trujillo por impulsar mi formación con sus conocimientos, experiencias y valores.
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RESUMEN
El propósito del presente estudio de tipo experimental fue determinar el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de Solanum tuberosum (papa liofilizada:
chuño negro) frente a cepas de Streptococcus mutans. Se realizó la prueba de susceptibilidad, utilizando el método de difusión en pocitos ensayada sobre las concentraciones de 25%, 50% y 75% de extracto etanólico de Solanum tuberosum. Todas las concentraciones presentaron halos de inhibición y los tamaños aumentaron directamente proporcional a las concentraciones utilizadas.
Para hallar la Concentración Mínima Inhibitoria se empleó el método de dilución en tubos, ensayando las mismas concentraciones y el control respectivo; de cada cultivo se sembró en placas con Agar Mueller Hinton – Sangre para determinar las Unidades Formadoras de Colonias (UFC’s).
Los resultados mostraron que la concentración del 75% del extracto etanólico de Solanum tuberosum fue muy sensible evidenciando el halo de inhibición promedio más alto (16 mm) y la concentración mínima inhibitoria fue efectiva en las tres concentraciones, al no presentar unidades formadoras de colonias en las distintas repeticiones de la muestra analizada, de estas concentraciones la numéricamente menor fue la del 25%.
Finalmente, se concluye que el extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) posee actividad antibacteriana in vitro sobre el crecimiento de cepas de Streptococcus mutans.
Palabras claves: Solanum tuberosum, Streptococcus mutans, efecto antibacteriano.
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ABSTRACT
The purpose of this experimental study was to determinate the in vitro antibacterial effect of the ethanolic extract of Solanum tuberosum (lyophilized potato: black chuño) against strains of Streptococcus mutans. The susceptibility test was performed, using the well diffusion method tested on the concentrations of 25%, 50% and 75% of Solanum tuberosum ethanolic extract. All concentrations showed inhibition halos and the sizes increased directly proportional to the concentrations used.
To find the Minimum Inhibitory Concentration, the method of dilution in tubes was used, testing the same concentrations and the respective control; of each culture was plated with Mueller Hinton-Blood Agar to determine the Colony Forming Units (CFU's).
The results showed that the concentration of 75% of the ethanolic extract of Solanum tuberosum was very sensitive, showing the highest average inhibition halo (16 mm) and the minimum inhibitory concentration was effective in the three concentrations, as it did not present colony-forming units in the different repetitions of the analyzed sample, of these concentrations the numerically lower was 25%.
Finally, it is concluded that the ethanolic extract of Solanum tuberosum (black chuño) has antibacterial activity in vitro on the growth of Streptococcus mutans strains.
Key words: Solanum tuberosum, Streptococcus mutans, antibacterial effect.
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ÍNDICE
DEDICATORIA ……… ii
AGRADECIMIENTOS ……….... iv
RESUMEN ………. v
ABSTRACT ……… vi
INDICE ……… vii
I. INTRODUCCION ……… 1 - 13 II. MATERIAL Y MÉTODOS ………... 14 - 26 III. RESULTADOS ………. 27 - 32 IV. DISCUSIÓN ……….. 33 - 36 V. CONCLUSIONES ………... 37
VI. RECOMENDACIONES ……… 38
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……… 39 - 46
VIII. ANEXOS ………..… 47 - 66
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I. INTRODUCCIÓN
Desde los albores de la humanidad, el hombre ha buscado en la naturaleza la satisfacción a sus necesidades primordiales como alimento, vestido, abrigo, salud, etc.; esta conducta ha dado lugar a la creación empírica de una serie de remedios basados en los recursos que la naturaleza proporciona para el tratamiento de dolencias y enfermedades con la finalidad de mejorar la salud del usuario, paliar su dolor, prevenir afecciones y mejorar su calidad y esperanza de vida. Con el pasar de los años, el conocimiento empírico adoptó el método científico, y se realizaron diversas investigaciones sobre las propiedades que presentan dichos recursos naturales; siendo transmitidas de generación en generación, haciéndose uso incluso en la actualidad y representando un legado de suma importancia para los países y pueblos donde el avance científico y tecnológico es aún indiferente. Es así que la Organización Mundial de Salud (OMS) afirma que el 80% de la población de países en vías de desarrollo hacen uso de medicina tradicional para satisfacer sus necesidades de atención primaria por tradición cultural o porque no existen otras opciones.1
No es irrelevante decir, que la mencionada OMS así como la Organización de Naciones Unidas para la Educación, la Ciencia y la Cultura (UNESCO) son organismos internacionales que a escala mundial, fomentan la investigación científica sobre estos estudios. De forma similar en nuestra nación se resguarda la investigación científica por medio de instituciones como el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología del Perú y a través del empoderamiento de las Universidades. Por ello, en facultades y escuelas de las carreras pertinentes se promueve el estudio de los efectos que tienen las concentraciones de las plantas en algunas enfermedades.2
Por lo dicho anteriormente, sobre la formación de profesionales generadores de nuevos conocimientos e investigaciones; el ámbito estomatológico no es ajeno a esto, debido a la estrecha relación que guarda nuestra área de estudio con las enfermedades propias de otras zonas del cuerpo humano. La salud oral en la población, ya sea por falta de conocimiento, factor económico o simple decidía, se ha dejado de lado. Siendo evidenciada dicha déficit en los altos índices de caries, enfermedad periodontal, trauma oclusal, fluorosis y otras patologías dentro del marco bucal; siendo así que muchas personas solicitan atención solo
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cuando llegan a un estado crítico y donde se requiere que los tratamientos sean lamentablemente más invasivos y menos económicos. Por lo tanto convenientemente, es necesario dar importancia a la prevención primaria dentro de la historia natural de la enfermedad, motivo por el cual son numerosos los estudios que prueban y hacen uso de plantas con propiedades medicinales con el fin de prevenir y tratar distintas afecciones del sistema estomatognático. En el presente estudio, se reportarán las propiedades y beneficios de un extracto hecho a base de chuño negro y sobre todo su efecto antibacteriano, definiéndose este como la capacidad que tiene una sustancia para inhibir el crecimiento y desarrollo de bacterias o su eliminación,3 sobre uno de los principales microorganismos responsables de la enfermedad de la caries dental.
La caries dental es una de las enfermedades del sistema estomatognático con más alta prevalencia en el mundo.4La Dra. Le Galès-Camus, C (2019) Subdirectora General de la OMS para Enfermedades No Transmisibles y Salud Mental afirma que “Existe la idea de que la caries dental ha dejado de ser un problema en los países desarrollados, cuando en realidad afecta a entre el 60% y el 90% de la población escolar y a la gran mayoría de los adultos”. Es también la afección bucodental más frecuente en varios países asiáticos y latinoamericanos.5
En su definición, se le considera como un proceso multifactorial, dinámico y microbiotamente trasmisible; en la cual intervienen factores de carácter biológico, social y cultural, los cuales interactúan de manera directa o indirecta favoreciendo el desarrollo de microorganismos cariogénicos que forman parte de la biopelícula dental. Dicho en otras palabras, surge ante el desequilibrio fisiológico entre los componentes minerales de las piezas dentarias y los elementos integrantes de la biopelícula.6, 7
De la amplia y variada microflora oral presente, el Streptococcus sp, Lactobacillus sp y Actinomyces sp se encuentran relacionados con el inicio y progresión de la caries dental, siendo más específicos, principalmente en la actualidad, el Streptococcus del tipo Mutans (S. mutans) el que recibe mayor atención tanto por sus características fisiológicas como su adaptación para sintetizar glucanos, fijar compuestos y su aciduricidad.8, 9
Es así como, a partir del contacto con nutrientes exógenos, estos microorganismos interactúan con la película que cubre las piezas dentarias para finalmente generar ácidos producto del metabolismo de los carbohidratos.10
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El uso de diversos agentes como antisépticos orales y fluoruros en distintas presentaciones, cuyo mecanismo de acción implique la adherencia de la biopelícula y el metabolismo bacteriano, son de gran importancia en la prevención de la enfermedad.6 Dentro de los más popularmente utilizados encontramos la hexetidine y el gluconato de clorhexidina (Peridoaid 012%); siendo este último el que presenta mejores resultados respecto a la inhibición de crecimiento de S. mutans por su mayor sustantividad.11,12
Si bien el uso de fármacos modernos y medicamentos industrializados ayudan a tratar las distintas afecciones bucales, también traen consigo efectos adversos, 11, 12, 13 tales como la pigmentación de mucosas, dientes, alteración del gusto y resistencia antibiótica.14, 15. 16
Apoyándonos en la afirmación anterior, es pertinente mencionar que Santana, Rey et al.
Afirman que “en los momentos actuales y en contraposición con los avances alcanzados en la creación de nuevos medicamentos en el mundo, la utilización de la medicina natural, cobra cada vez más defensores y ejecutores” y concluyen que “la medicina natural tiene infinidad de aplicaciones en la especialidad de estomatología y se comprobó cómo puede dar solución a múltiples urgencias”.17
Por esta razón cada vez es mayor la búsqueda de productos naturales para el control de la biopelícula dental y afecciones orales relacionadas, debido a que presentan buenos resultados y menos efectos adversos. El término “producto natural” hace mención a una sustancia producida por un organismo viviente con efectos farmacológicos distintos, uno de los compuestos activos, derivados de estos productos naturales, más usado en el cuidado de la salud oral son los polifenoles, entre otros.18,19
Los polifenoles son metabolitos de plantas que tienen la habilidad de inactivar toxinas bacterianas, su clasificación es variada y los más mencionados son los ácidos fenólicos que forman estructuras poliméricas como taninos y flavonoides. Los flavonoides incluyen entre otros a los flavonoles, presentes en los alimentos, y la antocianina presente en los pigmentos responsables de varias frutas. Un ejemplo evidente, es el uso del extracto de cáscara de manzana, rico en polifenoles, como inhibidor de la vacuolación en células eucariotas por la toxina (VacA) de Helicobacter pilory.19 Además un gran número de polifenoles presentes en el té, juego de uvas, cacao, café y vino tinto, han demostrado inhibir la adhesión bacteriana inicial a la superficie del diente, especialmente en el caso de S. mutans. Incluso existen reportes de polifenoles inhibidores de la adhesión de patógenos periodontales, como es el caso de la planta Myrothamnus flabellifolia que inhibe a la P. gingivalis; posteriormente
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otros estudios evidenciaron resultados similares usando té y arándano sobre dicho microorganismo periodontal.Otro producto natural interesante con actividad antimicrobiana es la miel, aunque el número de estudios correspondientes es ínfimo, ha demostrado inhibir al S. mutans.19
De esto se deduce que la aplicación de la medicina tradicional ha permitido tratar distintas enfermedades de la cavidad oral y en la mayoría de estudios realizados, a lo largo del tiempo, estos productos naturales se usaron por medio de aceites, extractos acuosos o etanólicos a diferentes concentraciones (%).20
Dentro de los estudios donde se obtuvieron aceites o extractos, a partir de productos naturales, para inhibir a microorganismos de la cavidad oral , podemos mencionar a Cosco R. y su investigación (2010) “Actividad inhibitoria del crecimiento de S. mutans y de flora mixta salival por acción del aceite esencial de la Matricaria chamomilla manzanilla”, concluyendo que existe un efecto inhibitorio positivo a las concentraciones de 25%, 50% y 100% en cultivos de flora mixta salival, cepa aislada del grupo mutans de flora mixta salival y cepa patrón de S. mutans. Las concentraciones al 25% y 50% del no mostraron diferencias significativas entre ellas, sobre los tres grupos de estudio evaluados. Las concentraciones al 100% del aceite de manzanilla tiene una diferencia estadísticamente significativa con respecto a las concentraciones de 25% y 50%.21
Por su parte, Saldarriaga, E. (2017)en su tesis “Efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de Myrciari dubia (camu camu) sobre S. mutans”, concluye que las diferentes concentraciones del extracto si presentan efecto antibacteriano sobre cepas S. mutans.
Determinándose que la c. mínima inhibitoria (CMI) del “camu camu” sobre el crecimiento de S. mutans fue de 25%. Se determinó que hubo inhibición bacteriana en las cuatro concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100%.22
De lo expuesto hasta ahora, me arriesgo a decir que la ciencia estomatológica ha encontrado en la naturaleza una vasta fuente de atractiva información, un gran caudal generador de nuevo conocimiento y un buen punto de partida para múltiples investigaciones buscando mejorar la calidad de vida de las personas ofreciendo menos desventajas y más beneficios, ya que apostamos por productos naturales. Hasta la actualidad se han estado utilizando diversos insumos naturales bajo la forma de extractos; sin embargo, son pocos los estudios de inhibición de microorganismos de la cavidad oral donde se utiliza uno de los recursos
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más abundantes de nuestra nación, como lo es la papa y más aún son demasiado escasas aquellas investigaciones donde se utiliza como insumo al chuño, que es obtenido de la deshidrocongelación (liofilización) de la misma.23
La papa (Solanum tuberosum) es originaria de América del Sur, cultivada en todo el mundo debido a sus tubérculos comestibles. Su domesticación comenzó aproximadamente hace 10000 años por los habitantes del altiplano Perú- Boliviano, posteriormente fue llevada a Europa por los conquistadores españoles por ser considerada más como algo exótico que como planta alimenticia, su consumo fue creciendo con el tiempo y su cultivo alcanzó reconocimiento mundial.24
La palabra papa es el nombre nativo (quechua) dado al tubérculo que es considerado como el tercer cultivo alimenticio más importante del mundo, en términos de consumo humano, luego del arroz y del trigo. Según el Instituto de Investigación de la Papa (CIP), “alrededor de 1.4 millones de personas consumen este tubérculo regularmente y la producción mundial es de 300 millones de toneladas métricas”.25
Con respecto a la taxonomía, la papá científicamente pertenece al Reino: Reino: Plantae, División: Magnoliophyta, Clase: Magnoliopsida, Sub Clase: Asteridae Orden: Solanales, Familia: Solanáceas, Género: Solanum, Especie: tuberosum. Nombre común: papa o patata (Europa).26
El centro de origen de la papa se ubica entre Perú y Bolivia, cerca del Lago Titicaca para la subespecie andigenum, aunque existen muchas especies silvestres en México, Guatemala, Ecuador y Chile. En 1537 Juan de Castellanos hizo la primera referencia de la papa cultivada en el Perú.27
Existen 5000 variedades de papa y en el Perú se cultivan más de 3000 variedades aproximadamente, lo que lo convierte en el país con mayor diversidad de papas en el mundo, al contar con 8 especies nativas domesticadas y 2,301 de las más de 4,000 variedades que existen en Latinoamérica. Además, Nuestro país posee 91 de las 200 especies que crecen en forma silvestre en casi todo nuestro continente y que generalmente no son comestibles.28 Se encuentra casi en todos los tipos de suelo, salvo donde son salinos o alcalinos. No crecen en terrenos compactados y pedregosos, ya que la profundidad del suelo debe ser mayor a 30 cm, tampoco debe ser muy húmedo porque el tubérculo sería muy acuoso y poco rico en fécula, lo que no permite su conservación. El pH óptimo del suelo debe ser de 5.2 a 6.4”.17
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Su valor biológico y nutricional posee un alto contenido de materia seca, (24 a 32 por ciento), fibra para favorecer la digestión y evitar el estreñimiento, fuente de hidratos de carbono para suministrar energía al cuerpo con poca grasa, sabor agradable, buena capacidad de almacenamiento, tubérculos con formas; así como un alto contenido de vitaminas B y C que ayudan a prevenir el escorbuto y son necesarias para el metabolismo, el sistema nervioso central y la formación de los glóbulos rojos, y minerales como el potasio que es imprescindible para el correcto funcionamiento de los músculos sin dejar de mencionar a el hierro, el magnesio y fosforo.29,30
La papa (S. tuberosum) es una planta suculenta, herbácea y anual por su parte aérea y perenne por sus tubérculos que se desarrollan al final de los estolones que nacen del tallo principal, y a veces de varios tallos, según el número de yemas que hayan brotado del tubérculo. Las flores son hermafroditas, tetracíclicas y pentámeras; en cuanto a las raíces se desarrollan principalmente en verticilo, en los nudos del tallo principal, su crecimiento es primero vertical y luego horizontal de 25 a 50 cm. El tubérculo es un sistema morfológico ramificado, los ojos de los tubérculos tienen una disposición rotada alterna desde el extremo proximal del tubérculo donde va inserto el estolón hasta el extremo distal, donde los ojos son más abundantes.31
En cuanto al valor nutritivo y la calidad de este tubérculo, están íntimamente relacionados con su composición química;32 siendo así tenemos entre sus elementos integrantes al agua (63.2% – 86.9%), proteínas, materia grasa, azucares reductores, carbohidratos totales, ácidos orgánicos, glicoalcaloides (0.2% - 41%), vitamina C, hierro, fósforo, potasio, ácido silico, ácido pantoténico, carotenos, niacina, piridoxina, riboflavina, tiamina y al último los antes mencionados polifenoles (5% - 30%).33, 35
Se han hecho investigaciones enfocadas en estos componentes químicos, tenemos así estudios donde se expone que los polifenoles, aparte de contar con su habilidad inactivadora de toxinas bacterianas19 mencionada en párrafos anteriores; también son antioxidantes (en especial la clase flavonoide) que juegan un papel muy importante en la defensa contra el cáncer y prevención de afecciones cardiovasculares y neurológicas.34 No obstante, no debemos olvidar que otro de los constituyentes químicos del S. tuberosum también son los glicoalcaloides, los cuales se encuentran en las hojas, frutos y hasta en los ojos del tubérculo.35
Los glicoalcaloides (GAT) se clasifican como metabolitos de estrés, constituidos por
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glucósidos esteroidales que contienen nitrógeno y componentes fitopatógenos que defienden a la planta del ataque de microorganismos como hongos, virus, bacterias, gusanos e insectos.36
Los glicoalcaloides que se pueden encontrar en la patata son la α-solanina, α-chaconina, mayoritariamente, y β-solanina, β-chaconina, γ-solanina, γ-chaconina, α-solamargina y β- solamargina en menor proporción”37. “De todos ellos la α-solanina y α-chaconina representan el 95% de glicoalcaloides totales en patata”.38
Partiendo de la frase, “la dosis hace al veneno” 39, los efectos que producen estos compuestos muy variados. Entre las principales alteraciones se pueden producir trastornos gastrointestinales a dosis media y si la dosis es elevada, se vuelven tóxicos llegando producir inhibición de la acetilcolinesterasa y efectos teratogénicos, desórdenes neurológicos, hemorragias en el tracto intestinal y en casos muy graves, edema cerebral e incluso la muerte”.40, 41
En contraparte a lo expuesto en el párrafo anterior, también se ha observado que los glicoalcaloides de las especies Solanum podrían ser útiles contra la infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y también contra las infecciones intestinales relacionadas con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), 42 no obstante son pocos los artículos que aborden este tema. Además, hay publicaciones donde se habla de los efectos curativos de la hierba mora debido a su principio activo, la solanina, que le confiere actividad analgésica y sedante, si es aplicada por vía externa.43 Además se le atribuyen propiedades diaforéticas y purgantes (a bajas concentraciones). También se puede aplicar de forma externa como ungüento para el tratamiento de heridas, herpes, artritis y contusiones.44 Existen estudios donde se relaciona el efecto positivo de la actividad de los glicoalcaloides sobre células cancerosas en ratas y sobre determinados tipos de herpes, así como su capacidad para ejercer control en algunas enfermedades por hongos, nemátodos e insectos.45 Es así que, por su parte, Olortegui, J. & Brañez, M. hizo una investigación donde se evidenció la actividad citotóxica y antimicrobiana de glicoalcaloides esteroidales, presentes en las hojas de Solanum albidum Dunal y Solanum oblongifolium Dunal, contra Escherichia coli, Salmonella entérica, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans y Aspergillus brasiliensis, luego de 30 minutos y de 24 horas de enfrentamiento.2
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Al exponerse las desventajas y excelentes beneficios de estos compuestos, es sabido que no existe legislación del contenido de glicoalcaloides, pero si un gran número de publicaciones donde se realizan estudios de sus efectos, así como las dosis que producen intoxicaciones.46 A nivel internacional, la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) junto con la Organización Mundial de la Salud (OMS) establecen en 1992 “un valor de ingesta diaria aceptable de valores no tóxicos entre 2-10 mg de glicoalcaloides por 100 gramos de peso fresco de patata de consumo humano”.47
Los niveles de glicoalcaloides en la papa van a depender de la forma de cultivo, variedad, almacenamiento y temperatura39, además se pueden ver afectados por el tratamiento culinario al que sea sometido el producto; y si de diversidad en la forma de presentación y de procesado se trata, la papa cuenta con una extensa variedad regional de métodos para la conversación de la misma; 41 las cuales pueden están a disposición de las personas y un claro ejemplo de ello, es el chuño.
Chuño o chuno, voz originaria de los andes centrales (aimara, quechua: chuñu, papa procesada), es el resultado de la deshidratación (por lo general por liofilización o deshidrocongelación) de la papa.23 Estatécnica milenaria de transformación de este tubérculo es realizada por los nativos desde las culturas prehispánicas en búsqueda de conservar el alimento en épocas de escases, encontrándole también un uso medicinal. Estas tecnologías de procesamiento aún se mantienen vigentes a lo largo de la zona Andina, en las regiones quechua, jalca o puna, por encima de los 3,500 msnm.48 Es por eso, que el chuño no se hace en cualquier sitio, cualquier zona o cualquier clima; las regiones apropiadas para su elaboración son solamente la suni y la puna.
Debido a la compleja utilización de la papa, se decidió agruparlas en dulces y las amargas, sólo nos centraremos en esta última, ya que es la que destinada a la elaboración del chuño.
Hay que tener presente que el grupo de la variedad de papas amargas requiere un tratamiento especial, diferente al de las papas dulces: exigen distintas clases de suelo, humíferos o francos ubicados en diferentes zonas; éstas por su resistencia a las heladas pueden ser cultivadas en zonas más altas que las dulces y no son afectadas por la excesiva humedad o la sequía.49 Aunque la siembra se realiza casi al mismo tiempo que las papas dulces, la cosecha es relativamente tardía. La elaboración de los diversos productos que se obtienen por deshidratación de la papa amarga comienza tempranamente, después de terminada la cosecha y la preparación varía de acuerdo al tipo de producto, el mismo que recibe un
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nombre distinto. Teniendo este conocimiento presentamos a las 6 formas más mencionadas en diferentes publicaciones, las cuales son: la lojota o chuño fresco, el khachu-chuñu, la muraya, el tocosh, el chuño blanco o tunta y el chuño negro.49
La primera y segunda forma mencionadas presentan un procedimiento de elaboración similar, con la diferencia relevante que la lojota se prepara con fines inmediatamente comerciales y el khachu-chuñu únicamente es destinado al consumo familiar. Las siguientes variantes conocidas como muraya y tocosh, se obtienen por fermentación dentro del agua y es por eso que esta cuarta forma contiene penicilina natural, debido a la “papa podrida” que le confiere propiedades bactericidas. No obstante, es necesario aclarar que existe otro tipo de muraya que se obtiene del kholunku (chuño de mala calidad). En cuanto al chuño blanco y negro, ambos tienen similar forma de obtención, con la diferencia significativa que la tunta tiene un paso adicional final, el cual consiste en remojar las papas procesadas, para liberar los glicoalcaloides, responsables del sabor amargo característico; esta última maniobra es en cierto modo contraproducente, ya que hace que esta quinta forma pierda las propiedades que dichos compuestos brindan y que en párrafos anteriores han sido citadas.49, 50
Las personas ajenas a esta información, llaman con el nombre de chuño tanto a la sexta forma, la cual es protagonista de la presente investigación y será descrita a detalle a partir de ahora (chuño negro), como a los otros cinco mencionados.49
El Chuño negro o chuño propiamente dicho, se expone de 5 a 10 días a las heladas nocturnas y luego a un fuerte sol; por lo que no es necesario cubrirla, y consecuentemente de esta manera adquieren el color negro característico, es necesario recalcar que este chuño no se remoja.51
Según el tamaño de las papas seleccionadas entre las amargas se clasifica el chuño en tres clases: de primera (papas de tamaño grande), de segunda (tamaño mediano), y de tercera (tamaño chico). Desde luego, se utiliza el mismo procedimiento para elaborar las tres clases y debe tenerse presente que de tres quintales de papa se obtiene un quintal de chuño seco.49 El proceso de obtención, comienza con la selección de las papas, luego se las extiende separadamente según el tamaño y se dejan cuatro o cinco noches y días a la intemperie. De noche se congelan y de día, con el calor del sol se descongelan; hay que tener mucho cuidado en no moverlas porque en este caso es difícil pelarlas y el producto pierde en calidad. Luego, con la ayuda de los niños, se preparan unos montoncitos de aproximadamente cinco kilos
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para que las mujeres los pisen con los pies descalzos, especialmente con los talones, haciendo reventar las papas y tratando en lo posible de extraer todo el líquido.51
El chuño, según estudios, tiene mejor composición nutricional que la papa fresca, debido a que la obtención de sus nutrientes se da mediante procesos de transformación que dentro de la papa va ocurriendo por acción a la exposición a las fuertes heladas.52
Investigaciones, como la de Kuon y Alfaro (1966), determinan que el porcentaje de proteínas en el chuño se encuentra entre 6.07 a 6.53% según el tipo de variedad de papa usada. Por su parte, Christiansen en (1977) reporta que las proteínas en el chuño negro son de 4% y en chuño blanco es 3.8%; Asimismo, Arratea, B. & Mamani, Y. en su tesis “actividad antibacteriana del extracto acuoso Solanum tuberosum (papa fermentada) y aceite esencial Thymus vulgaris (tomillo), frente a cepa Staphylococcus aureus, estudio in vitro” señalan que el extracto de papa fermentada tiene actividad antibacteriana considerada como sensible según CLSI y sumamente sensible para Duraffourd; y con respecto a el aceite esencial de tomillo, se evidencia que tiene actividad antibacteriana considerada como intermedia según CLSI y muy sensible para Duraffourd frente a cepas Staphylococcus aureus.51
No obstante, el Solanum tuberosum también ha sido materia prima y punto de partida en varias investigaciones en el presente siglo. Tenemos así que: Bontempo P. et al. (2013), realizaron un estudio experimental utilizando una variedad de Solanum tuberosum que posee pigmentos antibacterianos y ligera actividad anti fúngicas. Los resultados indicaron que la más afectada fue el Staphylococcus aureus y el hongo Rhyzoctonia solani, Además, se encontró que en diferentes modelos de células cancerosas dichos pigmentos causan la inhibición de la proliferación y la apoptosis de una manera dependiente de la dosis.58
Soto M. et al. (2014), realizaron un estudio experimental, titulado "Actividad antinociceptiva y antibacteriana de los alcaloides totales de dos especies de la familia Solanaceae.”
aplicándose la técnica de difusión en agar con discos impregnados, se trabajó con tres cepas:
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25992) y Pseudomona aeruginosa (ATCC 27853), obteniendo alcaloides que presentaron actividad antinociceptiva a las dosis de 2,5 mg/kg, 5 mg/kg y 10 mg/kg, mostrando mayor porcentaje de inhibición, a dosis de 10 mg/kg, además que los alcaloides presentes inhibieron el crecimiento de S.
aureus, E. coli, y P. aeruginosa, a concentraciones de 2 mg/mL y 4 mg/mL, hallando mayor efecto antibacteriano en S. aureus.59
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Amanpour R. et al. (2015), y su estudio in vitro titulado “Efectos antibacterianos de la cáscara Solanum tuberosum en extracto etanólico sobre S. pyogenes, Staphylococcus aureus PTCC 1113, Pseudomonas PTCC 1430 y Klebsiella pneumoniae PTCC 1053;
dando como resultados que dicha cáscara posee propiedades antibacterianas y sus compuestos fenólicos poseen acciones antibacterianas, antivirales y anti fúngicas.60
Pesantes P. (2015), realizó un estudio experimental titulado “Efecto antibacteriano in vitro de S. tuberosum (papa fermentada) en cepas de E. coli comparado con gentamicina y ceftriaxona”, Concluyendo que el extracto tiene acción antibacteriana frente E. coli y que es moderadamente sensible frente a la ceftriaxona, y siendo más sensible que la gentamicina.61 Y por último, pero no menos relevante, citaremos a López Y. (2017), y su reciente estudio experimental “Efecto inhibitorio in vitro de S. tuberosum (papa fermentada) comparado con vancomicina y oxacilina sobre cepas de Staphylococcus aureus”. Obteniendo como resultado que S. aureus fue muy sensible frente al extracto al 25% (17,75 ± 1,05 mm), mientras que en el extracto al 50% y el extracto al 100% fue sumamente sensible obteniendo como resultados: (22,17 ± 0,94 y 25,42 ± 1,62 mm respectivamente), los resultados de la CMI fue: 500 mg /dL (extracto al 50%). Con estos resultados se confirmó la hipótesis de manera positiva concluyendo que S. tuberosum (papa fermentada) posee efecto inhibitorio in vitro sobre cepas de Staphylococcus aureus comparado con vancomicina y oxacilina.62 Siendo conscientes de la vasta y diversa cantidad de las propiedades curativas que presenta la papa así como los múltiples beneficios de su milenaria forma procesada como lo es el chuño, son muchas las razones motivadoras, que generan el interés para realizar una labor de investigación y poder determinar la actividad antibacteriana que presenta uno de los recursos naturales más abundantes de nuestra nación, bajo su forma liofilizada: chuño negro, a través del uso de un extracto etanólico a base de este último; frente al S. mutans. Lo cual sería un aporte al bagaje científico, validaría los pocos trabajos similares realizados además de transformarse en una fuente de información y conocimientos, que serán base de datos y puntos de partida tomados por futuras generaciones para el desarrollo de nuevos trabajos de investigación promovedores de una mejor calidad de vida y salud, debido a que a partir de dicho insumo podrían elaborarse una gama de productos efectivos para el control y prevención de la caries dental, y por consiguiente la preservación de las piezas dentarias, beneficiando a la población por ser una materia prima natural y económica.
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Teniendo en cuenta las diversas propiedades curativas que presenta el S. tuberosum (chuño negro); motiva mi interés determinar su actividad antibacteriana, por medio de un extracto etanólico, sobre el S. mutans. Así mismo haría validar los trabajos similares realizados, además de convertirse en una base de datos para investigaciones a ulterior, puesto que a partir de dicha sustancia natural podrían elaborarse diversos productos efectivos para el control y prevención de la caries dental, y por ende la preservación de las piezas dentarias, beneficiando a la población por ser una materia prima económicamente accesible.
Por lo tanto, el propósito del siguiente proyecto de investigación será evaluar el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de Solanum tuberosum (papa liofilizada: chuño negro) sobre el crecimiento de Streptococcus mutans.
1.1. PROBLEMA
¿Cuál es el efecto antibacteriano in vitro de las diferentes concentraciones del 25%, 50% y 75% del extracto etanólico de Solanum Tuberosum (chuño negro) sobre el crecimiento de Streptococcus mutans (ATCC 25175)?
1.2. HIPOTESIS
1.2.1. Hipótesis Nula (H0): Ninguna concentración de extracto etanólico de Solanum Tuberosum (chuño negro) presenta un efecto antibacteriano variado, inhibiendo sensiblemente el crecimiento bacteriano in vitro del Streptococcus mutans (ATCC 25175).
1.2.2. Hipótesis Alternativa (H1): Las diferentes concentraciones de extracto etanólico de Solanum Tuberosum (chuño negro) presenta un efecto antibacteriano variado, inhibiendo sensiblemente el crecimiento bacteriano in vitro del Streptococcus mutans (ATCC 25175).
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1.3. OBJETIVOS
1.3.1. Objetivo General
Evaluar el efecto antibacteriano in vitro de las concentraciones de 25%, 50% y 75% del extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) sobre el crecimiento de S. mutans (ATCC 25175)
1.3.2. Objetivos Específicos
Determinar la susceptibilidad in vitro de las concentraciones al 25%, 50% y 75%
del extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) sobre el crecimiento de S. mutans (ATCC 25175).
Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) in vitro de las concentraciones 25%, 50% y 75% del extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) sobre el crecimiento de S. mutans (ATCC 25175).
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II. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. TIPO Y ÁREA DE ESTUDIO
Tipo de investigación.
La presente investigación fue básica (de acuerdo con su orientación), experimental “in vitro”.
Área de estudio
Este estudio se desarrolló en el Laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo y en Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.
2.2. DEFINICIÓN DE LA POBLACIÓN MUESTRAL
La población bajo estudio estuvo conformada por el conjunto de Placas Petri con la siembra adecuada de S. mutans (3 x 108 UFC), con las diferentes concentraciones del extracto etanólico de S. tuberosum (papa liofilizada: chuño negro) en el Laboratorio de microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo en el año 2019.
2.2.1. Criterios de inclusión
Tubo de ensayo con la macrodilución de caldo tioglicolato de la cepa de S.
mutans ATCC 25175 y extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) a la concentración correspondiente.
Placa Petri con la macrodilución en agar soya tripticasa del microorganismo de prueba: S. mutans ATCC 25175 y la concentración de extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) correspondiente.
Placa Petri en medio agar sangre del microorganismo de prueba: S. mutans ATCC 25175 y la concentración de extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) correspondiente.
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2.2.2. Criterios de exclusión
Placa Petri que después del proceso de incubación, presentaron contaminación por otros microorganismos (otras bacterias u hongos).
Tubo de ensayo con la macrodilución que presente algún tipo de daño o rajadura en su estructura durante el proceso de incubación.
Tubo de ensayo con la macrodilución cuyo resultado en el proceso de incubación pueda ser dudoso.
Placa Petri con la macrodilución que presente algún tipo de daño o rajadura en su estructura durante el proceso de incubación.
Placa Petri con la macrodilución cuyo resultado en el proceso de incubación pueda ser dudoso.
2.2.3. Criterios de eliminación
Tubo de ensayo con la macrodilución que sufra deterioro, daño o rajadura durante la conservación y los procedimientos que no permitan su medición posterior.
Placa Petri con la macrodilución que sufra contaminación por agente externo durante la conservación y los procedimientos que no permitan su medición posterior.
2.3. CONSIDERACIONES ÉTICAS
Para la investigación que nos ocupa se prestó atención a aquellos factores que puedan causar daño al medio ambiente como los materiales inflamables y derechos orgánicos.
La manipulación de los desechos de la cepa S. Mutans se realizó según el protocolo estipulado en el manual de Bioseguridad en los laboratorios de Microbiología y Medicina durante la ejecución del trabajo.
Se procedió a la ejecución de la investigación contando con la autorización del Comité Permanente de Investigación de la Facultad de Estomatología de la Universidad Nacional de
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Trujillo y el permiso de la Sección de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo para la ejecución, la cual seguirá los principios de la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial, adoptada por la 64° Asamblea General (Fortaleza-Brasil 2013).53
2.4. DISEÑO ESTADISTICO DE MUESTREO
2.4.1. Unidad de observación
Para determinar la inhibición bacteriana: Cada una de las placas Petri con medios de cultivo que se utilizaron, las que contenían agar Mueller Hinton – Sangre, el inóculo de S. mutans ATCC 25175 y el extracto etanólico de S. tuberosum (chuño negro).
Para determinar la CMI: Cada una de las placas Petri con agar Mueller Hinton – Sangre inoculadas con las suspensiones que se obtuvieron a partir de las diluciones del inóculo con el extracto etanólico de S. tuberosum (chuño negro).
2.4.2. Unidad de análisis
Cada una de las repeticiones de Placas Petri con los medios de cultivo que contengan la cepa de S. mutans que cumplan con los criterios de selección.
2.4.3. Unidad de muestreo
La totalidad de Placas Petri con los medios de cultivo que contenían la cepa de S.
mutans.
2.4.4. Tamaño de muestra
Para determinar el tamaño de muestra, se hizo uso de la fórmula que nos proporciona el muestreo cuando el interés es comparar dos grupos de estudio para variable cualitativa.
Donde:
𝑛 = (𝑍𝛼/2+ 𝑍𝛽)2 2(𝐷𝐸)2 𝑑2
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𝑍𝛼/2= 1.96 𝑃𝑎𝑟𝑎 𝑢𝑛𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑓𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑑𝑒𝑙 95%
𝑍𝛽 = 0.84 𝑃𝑎𝑟𝑎 𝑢𝑛𝑎 𝑝𝑜𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 80%
𝐷 = 0.9𝑑 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑎𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜 𝑝𝑜𝑟 𝑛𝑜 ℎ𝑎𝑏𝑒𝑟 𝑒𝑠𝑡𝑢𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑠𝑖𝑚𝑖𝑙𝑎𝑟𝑒𝑠 Reemplazando, se obtiene:
𝑛 = (1.96 + 0.842)22(0.9𝑑)2
𝑑2 = 13
Por lo tanto, la muestra estará conformada por 13 repeticiones para cada grupo 2.4.5. Diseño de contrastación:
Experimental pura: Diseño con posprueba únicamente y grupo de control.
RG1 X1 O1
RG2 X2 O2
RG3 X3 O3
RG4 + O4
RG5 __ O5
Donde:
R: Asignación al azar o aleatoria.
G1-5: Grupos; para el caso: Placas Petri con Cepas de S. mutans en Agar Mueller Hinton antes de iniciar el experimento.
X1-3: Tratamiento con extracto etanólico de S. tuberosum (chuño negro) en sus diferentes niveles de concentración 25%, 50%,75% respectivamente.
O1-3: Placas Petri después de la aplicación del tratamiento en las concentraciones de 25%, 50% y 75% respectivamente.
O4: Placa Petri después de la aplicación del tratamiento con penicilina procaínica O5: Placa Petri sin aplicación de tratamiento.
__: Ausencia de estímulo: nivel 0% de tratamiento, que designa al grupo control.
+: Tratamiento al grupo control con penicilina procaínica.
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2.5. VARIABLES DE ESTUDIO Y ESCALAS DE MEDICIÓN
2.5.1. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES
VARIABLE INDICE INDICADOR TIPO DE
VARIABLE
NIVEL DE MEDICIÓN
Extracto etanólico de S. tuberosum (papa liofilizada:
chuño negro) INDEPENDIENTE
Concentración utilizada de extracto
etanólico de chuño negro sobre cepa de S.
mutans
(Porcentaje %) 25% - 50% - 75%
Tiene efecto o no tiene efecto
Variable Cualitativa
Nominal
Efecto antibacteriano in
vitro, sobre el Streptococcus
mutans
DEPENDIENTE
Susceptibilidad Halo de inhibición
según el diámetro (mm)
Escala de Durafford
Nula -
Variable Cualitativa
Nominal Sensible
+ Muy sensible
++
Sumamente sensible
+++
Concentración mínima Inhibitoria
(CMI) unidad formadoras de
colonias (UFC/ml)
Efectiva
No efectiva
Variable Cualitativa
Nominal
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Para la presente investigación se consideró como efecto antibacteriano si los resultados de una o ambas técnicas (Técnica de los halos de inhibición y técnica de conteo de UFC), son admisibles dentro de los parámetros y criterios establecidos por cada indicador.
2.5.2. DEFINICIÓN DE VARIABLES 2.5.2.1. Variable Independiente
Extracto etanólico de Streptococcus tuberosum (chuño negro) 2.5.2.1.1. Definición conceptual
Sustancia que se obtiene a partir del proceso de liofilización de la papa: chuño negro, por diversos procedimientos.51
2.5.2.1.2. Definición operacional
En la presente investigación el extracto etanólico de S. tuberosum (chuño negro) estará disponible a diferentes concentraciones: 25%, 50% y 75%.
2.5.2.2. Variable Dependiente
Efecto antibacteriano in vitro sobre S. mutans ATCC 25175 2.5.2.2.1. Definición conceptual
Cepa estándar de S. mutans con nomenclatura 25175 asignada por la American Type Culture Collection.51
Halo de inhibición: Zona alrededor del disco donde una sustancia antibacteriana es capaz de impedir el crecimiento de una bacteria después de 18 a 24 horas de incubación.36
Concentración inhibitoria: Mínima concentración del aceite que inhibe el crecimiento del microorganismo luego de su incubación51.
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2.5.2.2.2. Definición operacional
Para efectos de la investigación, la definición coincidió con la conceptual siendo valorado mediante el Halo de inhibición y el conteo en UFC/ml.
Halo de inhibición:
Se usará como medida los diámetros de estas zonas en mm, según la escala de Duraffourd54, la cual se usa para determinar cualitativamente el efecto inhibitorio in vitro y presenta los siguientes indicadores:
Nula (-): Diámetro inferior a 8 mm
Sensibilidad limite (sensible = +): Diámetro entre 8 a 13 mm.
Medio (muy sensible= ++): Diámetro entre 14 y 20 mm.
Sumamente sensible (+++): Diámetro superior a 20 mm.
Concentración mínima inhibitoria:
Coincide con la conceptual al ser valorada mediante el número obtenido en mg/ml del extracto etánolico de S. tuberosum (chuño negro) donde se apreciará la inhibición total del crecimiento de S.
mutans ATCC 25175 mediante el conteo UFC/mL. Considerándose como no efectiva cuando a la inspección visual se registre formación de colonias (UFC > 200), y efectiva cuando no se observe la formación de colonias (UFC< 200) del crecimiento del S. mutans ATCC 25175.
Es así que el efecto antibacteriano se evidenciará cuando las concentraciones (25%, 50% y/o 75%) del extracto logren inhibir el crecimiento bacteriano, y esto quedará demostrado ya sea por la prueba de susceptibilidad, al medir el diámetro del halo de inhibición, o bien al determinar la concentración mínima inhibitoria y obtener como resultado una ausencia de unidades formadoras de colonias después de las 24hrs de realizada la siembra.
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2.6. MÉTODO, TÉCNICAS, PROCEDIMIENTO E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS.
El extracto etanólico de la S. tuberosum (chuño negro) se obtuvo en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina de la universidad nacional de Trujillo.
2.6.1. Método
Experimental
2.6.2. Descripción del procedimiento (Ver anexo N°03)
2.6.2.1. De la aprobación del proyecto
El primer paso para la realización del presente estudio de investigación fue la obtención del permiso para su ejecución, tras la aprobación del proyecto por parte de la Comisión de Investigación de la Facultad de Estomatología de la Universidad Nacional de Trujillo.
2.6.2.2. Obtención de la muestra de Solanum tuberosum (papa liofilizada:
chuño negro)
Las muestras de S. tuberosum (chuño negro) fueron obtenidas del mercado “San Pedro” de la provincia de cuzco, departamento de Cuzco.
Un ejemplar completo de la planta se llevó al Herbarium Trixillense (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo para su determinación e identificación taxonómica.
2.6.2.3. Preparación de la muestra
Los ejemplares recolectados fueron trasportados al laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo.
Se procedió a realizar la preparación de la siguiente manera:
Selección:
Se seleccionaron las papas liofilizadas sanas (chuño negro) y se eliminaron los que estaban en malas condiciones (sustancias extrañas como hongos).51,63 (Fig. 1)
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Pulverización
Se procedió a pulverizar el chuño manualmente con un molino hasta obtener polvo.51,63 (Fig. 3 y 4)
Tamizaje
Luego el polvo de chuño fue homogenizado a través del tamiz N° 0.75 para hacer semejante el tamaño de las partículas. 51 (Fig. 5 y 6)
Almacenamiento
El polvo resultante del tamizaje se guardó en varios frascos de vidrio de color ámbar de boca ancha.51,63 (Fig. 7)
2.6.2.4. Preparación del extracto etanólico de Solanum Tuberosum (papa liofilizada: chuño negro)
Se pesaron 600 gramos de chuño negro pulverizado y tamizado; que posteriormente fueron colocados en un recipiente de vidrio de boca ancha color ámbar. Luego, se añadió etanol de 70° Gay Lussac (G.L.) 1,700 Ml y se mezcló bien, teniendo en cuenta que la mezcla debe ocupar como máximo las ¾ partes del recipiente. Se tapó el recipiente y se maceró por 7 días, agitándose 15 minutos, dos veces al día. (Fig. 9)
Transcurrido el tiempo de maceración, se filtró el líquido al vacío, con papel filtro de Whatman n° 1. Al líquido resultante y filtrado se le denominará extracto etanólico. (Fig. 10)
A continuación, el extracto etanólico se concentró en un rotavapor hasta obtener un extracto blando. Este se llevó a secar a la estufa a 40ºC. Al producto resultante se le denominó extracto seco. A partir de este producto, se preparó las concentraciones de 25% (250mg/mL), 50% (500mg/mL) y 75% (750mg/mL) disueltas en etanol de 70° G.L. Finalmente, los extractos fueron guardados en frascos de vidrio de color ámbar estériles y se fueron sometidos a una refrigeración de 4°C, hasta su posterior utilización. 51,63 (Fig. 11 y 12)
2.6.2.5. Obtención de la cepa:
En el presente estudio se utilizó un cultivo liofilizado de la cepa de Streptococcus mutans ATCC (American Type Culture Collection) 25175, el cual se obtuvo del
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Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo. (Fig. 13)
2.6.2.6. Preparación de la Cepa
Se cultivaron las cepas de S. mutans ATCC 25175, en tubos de ensayo que contenían el medio Agar Soya Tripticasa- sangre y se incubaron bajo condiciones de microanaerobiosis a 37° con el fin de obtener colonias jóvenes. Luego de 48 horas, de la cepa de S. mutans ATCC 25175, se obtuvieron colonias jóvenes; las cuales se diluyeron en caldo de tioglicolato, en un tubo de ensayo, el cual se agitó durante 30 segundos hasta que se obtuvo una turbidez semejante a un tubo número 05 de la escala de Mac Farland, es así como se obtuvo una solución que contenía aproximadamente de 1 a 2x108 unidades formadoras de colonias (UFC/ml) para S. mutans. Posteriormente se procedió al sembrado distribuyendo el microorganismo adecuadamente.55 (Fig. 14)
2.6.2.7. Sembrado
Se colocó en placas Petri 20 ml de agar Muller Hinton–Sangre, solidificado el agar se hisopó uniformemente. Las placas recién sembradas fueron colocadas dentro de una estufa a 37° de temperatura en condiciones de anaerobiosis durante 10 minutos.55 (Fig. 15 y 16)
2.6.2.8. Prueba de Susceptibilidad: Preparación de los “pocitos”
Sobre la placa sembrada, se prepararon unas depresiones de forma esférica (5mm de diámetro) en el espesor del agar simulando la forma de “pocitos”, para luego agregar las concentraciones de extracto etanólico de 25%, 50% y 75% así como los controles positivo (penicilina procaínica) y negativo (etanol 70°) en ellos.
Grupo I: Extracto etanólico de chuño al 25% - 13 repeticiones
Grupo II: Extracto etanólico de chuño al 50% - 13 repeticiones
Grupo III: Extracto etanólico de chuño al 75% - 13 repeticiones
Grupo IV: Penicilina procaínica - 13 repeticiones
Grupo V: Etanol 70° – 13 repeticiones
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Posteriormente los medios de cultivo inoculados fueron colocados en una jarra de anaerobiosis y llevados a incubar a 37°C, realizando las lecturas de los halos de inhibición a las 24 horas mediante el uso de una regla milimetrada, calibrador o pie de rey.54, 56, 57 (Fig. 17 - 22)
2.6.2.9. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria y concentración mínima bactericida mediante el método de diluciones en tubos.
La concentración mínima inhibitoria fue la mínima concentración de las tres, que llegó a inhibir el desarrollo de gérmenes.
La CMI del extracto etanólico de S. tuberosum (chuño negro) se determinó realizando lo siguiente: se procedió a colocar 1.6 ml de cada concentración del extracto etanólico (etanol al 70%) de chuño negro (25% 50% y 75%), respectivamente en 1 tubo de ensayo, los que tuvieron previamente rotulados.
Luego se colocó un inóculo de 0.4ml del cultivo preparado de S. mutans, en cada uno de los tubos que contenían las diferentes concentraciones del extracto; así como al tubo que contenía el control positivo (tubo de penicilina procainica) y al control negativo (tubo con el cultivo de S. mutans sin ningún tratamiento). Al final se obtuvo respectivamente 2ml de volumen. Estos se llevaron a incubación por 24 horas en condiciones de anaerobiosis. (Fig. 23)
Pasadas las 24 horas se midió el efecto utilizando el espectrofotómetro y se realizó el siguiente paso para corroborar el efecto antibacteriano. Se tomó 0.1 ml de las diluciones de cada tubo y se colocará en las placas Petri con agar Mueller Hinton – Sangre previamente preparadas y con ayuda del asa de Driglasky se procedió a dispersar las diluciones. Luego del sembrado, se llevaron las placas a incubación a 37°C por 24 horas en una jarra Gaspak en condiciones de microanaerobiosis con 5 a 10% de CO2. (Fig. 24)
Posteriormente a las 24 horas se realizó el conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC) de cada una de las placas (10 placas para cada dilución)
Todo esto se procedió a realizarse bajo condiciones adecuadas dentro del diámetro de 10cm de la llama de un mechero.51, 55 (Fig. 25)
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2.6.2.10. Controles
2.6.2.10.1. Control para la susceptibilidad
Se utilizó como control positivo, discos de penicilina y como control negativo etanol 70°.
2.6.2.10.2. Controles para la determinación de la CMI
Se utilizó como control positivo, penicilina G procaínica y como control negativo, la suspensión estándar de S. mutans.
2.6.3. Método de selección
La muestra estuvo constituida por 13 repeticiones en cada combinación de concentración del extracto (3) lo que hizo un total de 3 grupos y 13 subgrupos adicionando un 1 grupo y 1 subgrupo.
GRUPO 1: Concentración de extracto etanólico de S. tuberosum (chuño negro) al 25%.
13 repeticiones en tres placas petri con siembra de S. mutans ATCC 25175.
GRUPO 2 Concentración de extracto etanólico de S. tuberosum (chuño negro) al 50%.
13 repeticiones en tres placas petri con siembra de S. mutans ATCC 25175.
GRUPO 3: Concentración de extracto etanólico de S. tuberosum (chuño negro) al 75%.
13 repeticiones en tres placas petri con siembra de S. mutans ATCC 25175.
GRUPO 4: Control
13 repeticiones en tres placas Petri con siembra de S. mutans ATCC 25175, utilizando Penicilina.
UFC = N/4 x A x D Dónde:
N: Número de colonias A: Área
D: Dilución
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2.6.4. Instrumento de recolección de datos
2.6.4.1. Instrumento para la determinación de la susceptibilidad y su efecto antibacteriano
Se midió los halos de inhibición de forma visual directa empleando una regla milimetrada.
2.6.4.2. Instrumento para la determinación de la CMI
Turbidez y el uso del espectrofotómetro; método de cuentas viables (Unidad formadora de colonias) mediante inspección visual y el equipo contador de colonias.
2.6.4.3. Ficha de Recolección de Datos
El instrumento de recolección de datos fue estructurado en una ficha para el registro de la Susceptibilidad y la Concentración mínima inhibitoria. (Anexo 1 y 2 respectivamente).
2.6.5. Análisis estadístico de la información
Los datos recopilados de la ficha de recolección fueron ingresados a una matriz de datos en Microsoft Excel 2016 y posteriormente fueron importados al paquete estadístico IBM SPSS STATISTICS V.22 para su respectivo procesamiento.
Para estudiar la información se construirá una tabla de frecuencias de una entrada con sus valores absolutos, promedios, desviación estándar y gráficos.
Para determinar el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) frente a la cepa de S. mutans ATCC 25175, se utilizó un análisis de varianza de un diseño completamente al azar; luego se empleó la prueba de Duncan para comparaciones múltiples.
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III. RESULTADOS
El presente estudio de tipo experimental “in vitro”, se desarrolló en los ambientes de la sección de Microbiología Médica de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo; tuvo como propósito determinar el efecto antibacteriano del extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, para lo cual se utilizaron 3 concentraciones al 25%, 50% y 75%, y un grupo control, encontrándose los siguientes resultados:
Las concentraciones de 25%, 50% y 75% del extracto etanólico de Solanum tuberosum (chuño negro) presentaron efecto antibacteriano in vitro sobre el Streptococcus mutans ATCC 25175
Los promedios de halo de inhibición de crecimiento del Streptococcus mutans al 25% fue de 8.54 mm, al 50% de 10.08 mm, al 75% de 16 mm y el grupo control de 13.85 mm.
El promedio de unidades formadoras de colonias obtenidas de las 3 diferentes concentraciones fueron: al 25% 0 UFC’s, al 50% 0UFC’s, al 75% 0 UFC’s, el grupo control negativo 106 UFC’s y el grupo control positivo 0 UFC’s.
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Tabla 1.
Efecto antibacteriano del extracto etanólico de S. tuberosum (chuño negro) en las concentraciones de 25, 50 y 75% y Control Penicilina procaínica G frente a cepa S.
mutans, según halos de Inhibición (mm) y unidades formadoras de colonias (UFC)
Fuente: datos obtenidos por el investigador, año 2019.
En la tabla 1, se observa en la división superior el promedio de los halos de inhibición del extracto etanólico de chuño negro al 25%, 50% y 75% y el grupo control. Observándose que el mayor diámetro se evidencia al 75% (16mm) con una Desviación Estándar de 1.68 y del grupo control es de 13.85mm. En cuanto a la división inferior se muestra 0 UFC para dichas concentraciones.
Halos de inhibición para cada concentración de extracto etanólico de chuño negro
ni Promedio Desv. Est.
Penicilina procaínica G 13 13.85 0.80
25% 13 8.54 0.66
50% 13 10.08 0.76
75% 13 16.00 1.68
UFC para cada concentración de extracto etanólico de S. tuberosum (chuño negro)
ni Promedio Desv. Est.
Cultivo Puro sin Tratamiento 13 1000000.0 0.00
Penicilina procaínica G 13 0.0 0.00
25% 13 0.0 0.00
50% 13 0.0 0.00
75% 13 0.0 0.00
E F E C T O A N T I B A C T E R I A N O
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Tabla 1.1
Análisis de Varianza para el Efecto antibacteriano del extracto etanólico de Solanum tuberosum (papa liofilizada: chuño negro) en las concentraciones de 25, 50 y 75% y Control Penicilina procaínica G frente a cepa Streptococcus mutans, según halos de Inhibición (mm).
FV SC gl CM F P
Entre grupos 455.46 3 151.82 135.34 0.0000
Dentro de grupos 53.85 48 1.12
Total 509.31 51
Fuente: datos obtenidos por el investigador, año 2019.
En la tabla 1.1, se muestra el análisis de varianza, y se obtuvo como resultado que existe una diferencia estadística significativa (p<0.001) del diámetro de halo de inhibición del crecimiento de Streptococcus mutans de acuerdo a la concentración del extracto etanólico de Solanum tuberosum aplicada.
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Tabla 1.2
Prueba de Duncan
Concentraciones de extracto etanólico de S.
tuberosum (chuño negro)
ni
Grupos para alfa = 0.05
G1 G2 G3 G4
25% 13 8.54
50% 13 10.08
Penicilina procaínica G 13 13.85
75% 13 16.00
Fuente: datos obtenidos por el investigador, año 2019.
En la tabla 1.2, se aplicó la Prueba de Duncan para determinar diferencias significativas entre los grupos experimentales se encontró cuatro grupos significativos, en el grupo N°1 (G1) formado por la concentración de 25% del extracto etanólico de Solanum tuberosum, en el grupo N°2 (G2) formado por la concentración de 50%, en el grupo N° 3 (G3) formado por el grupo control Penicilina procaínica, en el grupo N° 4 (G4) formado por la concentración de 75%; de los 4 grupos formados se encontró que el mayor halo de inhibición se da con la concentración al 75%.
