Unidad 13 GCMS LCMS

(1)

Unidad 13:

Cromatografía – Espectrometría de

Masa

(2)

TAI / Dr. Gerardo Caballero 2

Acoplamiento GC - MS

GC –

interfase

– MS

760 torr 10

-5

_torr

0.5 – 15 ml/min < 2 ml/min

Columna

d.i.

(mm)

Flujo típico

(ml/min)

Interfase

“Narrow bore"

0.1

0.2

0.25 0.1 – 1.0

Conexión directa

“Wide bore"

0.32 1 – 3

“Splitters"

Separadores jet

“Mega bore"

0.53 3 – 15

“Splitters"

(3)

(4)

(5)

GC - MS (Q): barrido completo (

full scan

)



Usado para identificaciones:

búsqueda en bases de espectros



Baja sensibilidad: se pierden la

mayoría de los iones

(6)

GC - MS (Q): monitoreo selectivo de iones (

SIM

)



SIM es más selectivo y sensible.

Se usa para cuantificaciones



Se usa un ion cuantificador y dos

calificadores



Frecuencias de barrido de 100 Hz

(7)

(8)

(9)

(10)

Espectrometría de masa en tándem (MS/MS)

(11)

Modos operativos de un triple cuadrupolo

Barrido de iones producto

Barrido de iones precursores

Barrido de pérdidas neutras

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

Trampa de iones lineal

(a) Esquema tomado de: R.G. Cooks

et al., “Rectilinear Ion Trap

Concepts, Calculations, and

Analytical Performance of a New

Mass Analyzer”,

Anal. Chem.

2004

,

76 , 4595

(22)

Analizador Orbitrap (I)

(a)

Vista en corte del orbitrap. [Ref: A. Makarov, “Electrostatic Axially Harmonic Orbital Trapping: A

(23)

Analizador Orbitrap (II)

Frecuencias características:



Frecuencia de rotación

w

_j



Frecuencia de oscilaciones radiales

w

_r



Frecuencia de oscilaciones axiales

w

_z

(24)

Compresión electrodinámica:

Orbitrap: ingreso de iones (I)

(25)

• Los iones son almacenados y enfríados en

un cuadrupolo curvado de solo RF, de forma

de una letra “C”: la trampa-C

• La RF se baja y se aplican voltajes DC a las

varillas de la trampa-C creando un campo a

través de la trampa perpendicular al eje

curvado de la trampa-C.

• Los iones son eyectados a lo largo de

líneas que convergen con el polo de

curvatura hacia la entrada del Orbitrap

mediante lentes de curvatura apropiada.

• Debido a los pulsos rápidos de iones desde

la trampa-C, los iones de cada valor de

m/z

llegan a la entrada del Orbitrap como

paquetes concentrados en 1 mm

3 _que

corresponde a tiempos de vuelo de unos

0,3

m

s. De esta manera no hay tiempo para

que se desarrollen efectos de carga espacio

(26)

(27)

Esquema de un instrumento GC/Q-Orbitrap

Características:



Resolución hasta 100.000 (FWMH) a m/z 272



Exactitud sub ppm

(28)

(29)

Estudio de relaciones isotópicas por MS

(GC-IRMS)

Expresión del contenido isotópico:

1000

1 (

13

x

















estándar

muestra

C

/

C

/

C

‰)

C

₁₃ ₁₂

12 13



Estándar: PDB (Pee-Dee-Belemnita,

La relación de abundancia isotópica

13 _{C /}

12 C promedio es 0.011200 (± 0.000450)

(30)

GC-IRMS en la detección

de esteroides endógenos

T/E 14.7

T/E 1.3

Sustancia



13 C ‰

Testosterona

- 29.4

Androsterona

- 32.1

Etiocolanolona

- 34.5

5α–Androstan-3α,17β-diol - 34.7

5β–Androstan-3α,17β-diol - 30.7

Pregnandiol

- 30.4

Pregnantriol

- 30.7

Valores de 

13 C ‰ de

(31)

(32)

Características incompatibles entre LC y MS

LC

MS

Fase móvil líquida con gran proporción de agua

(caudal típico 1 mL / min)

Opera en fase gaseosa con presión del orden de

10

-6

_torr

Temperatura de trabajo: 25 - 50 °C

Temperatura de trabajo: 100 - 3 50 °C

La mayoría de los analitos son relativamente

involátiles y/o lábiles térmicamente

Volatilidad deseable (no pueden ionizarse por

EI o CI)

No hay limitación de PM

Limitación en PM

Usa buffers

No tolera bien ciertos buffers

(33)

(34)

(35)

(36)

ESI: ionización por evaporación de iones

(37)

ESI: modelo de Dole de los residuos cargados

(38)

(39)

(40)

(41)

(42)

ESI: formación de iones con cargas múltiples (III)

Mioglobina de caballo disuelta

en agua (1% ácido fórmico) :

acetonitrilo (1:1), 20 pmol/L,

caudal de inyección de 5

m

L/min.

La masa molecular relativa promedio

medida es 16951,09 ± 0,3 u.

(43)

(44)

(45)

Espectros ESI de nucleósidos y oligonuclétidos

rRNA 5S (E. coli) --- T

₁

-→

….pNpMpGp…..

(46)

(47)

Comparación entre buffers

Análisis por ESI (+) de beta bloqueantes.

Fase móvil: MeCN 20%, 80% fosfato de

potasio 20 mM (pH = 3), 1,0 mL/min.

(48)

Disociación inducida por colisión en la fuente ESI

(49)

Disociación inducida por colisión en la fuente ESI

Anatoxina A

(50)

(51)

Separación por movilidad iónica (IM): principios

V

_d

: velocidad de deriva

E

: campo eléctrico

K

: movilidad del ion

Sistema de movilidad iónica de tiempo de deriva (DTIMS)

K

₀

: movilidad reducida

L

: longitud de la celda de deriva

t

_d

: tiempo de deriva

(52)

Instrumentos de IM acoplados a masa (I)

(53)

Separaciones mediante IM-QTOF

(54)

(55)

(56)

(57)

Separación por IM-QTOF de los estados de

carga de ubiquitina (disuelta en 50:50

agua:metanol 0,1% acético). Algunos estados

de carga muestran picos de deriva múltiples

(58)