“ANÁLISIS MOLECULAR DE GENES ENTEROTOXIGÉNICOS DE Staphylococcus aureus EN QUESOS ARTESANALES DE LA CIUDAD DE LOJA”

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(1)

U N I V E R S I D A D D E G U A Y A Q U I L

U N I D A D D E P O S G R A D O I N V E S T I G A C I Ó N Y

D E S A R R O L L O

M A E S T R Í A E N B I O T E C N O L O G Í A M O L E C U L A R

T E S I S P R E S E N T A D A P A R A O P T A R E L G R A D O

A C A D É M I C O D E M A G Í S T E R E N B I O T E C N O L O G Í A

M O L E C U L A R

A N Á L I S I S M O L E C U L A R D E G E N E S

E N T E R O T O X I G É N I C O S D E S t a p h y l o c o c c u s

a u r e u s E N Q U E S O S A R T E S A N A L E S D E L A

C I U D A D D E L O J A

A U T O R A : L c d a . A n d r e a E l i z a b e t h T o r r e s G u a l á n .

T U T O R A : M V Z . V a n e s s a H e r r e r a Y u n g a . M t r .

G U A Y A Q U I L

– E C U A D O R

(2)
(3)
(4)
(5)

D E C L A R A C I Ó N J U R A D A D E L A U T O R

Y o , A n d r e a E l i z a b e t h T o r r e s G u a l á n , d e c l a r o b a j o j u r a m e n t o a n t e l a

D i r e c c i ó n d e P o s g r a d o d e l a U n i v e r s i d a d d e G u a y a q u i l , q u e e l t r a b a j o a q u í

d e s c r i t o , a s í c o m o s u s r e s u l t a d o s , c o n c l u s i o n e s y r e c o m e n d a c i o n e s ,

p r e s e n t a d a e s d e m i a u t o r í a y e x c l u s i v a r e s p o n s a b i l i d a d , q u e e s i n é d i t o y

n o h a s i d o p r e v i a m e n t e p r e s e n t a d o p a r a n i n g ú n g r a d o o c a l i f i c a c i ó n

p r o f e s i o n a l .

L a r e p r o d u c c i ó n t o t a l o p a r c i a l d e e s t a t e s i s e n f o r m a i d é n t i c a o m o d i f i c a d a ,

n o a u t o r i z a d a p o r l o s e d i t o r e s t r a n s g r e d e l o s d e r e c h o s d e a u t o r í a .

C u a l q u i e r u t i l i z a c i ó n d e b e s e r p r e v i a m e n t e s o l i c i t a d a a l a U n i v e r s i d a d d e

G u a y a q u i l , a t r a v é s d e l a D i r e c c i ó n d e P o s g r a d o o a l a u t o r .

F i r m a . - - -

(6)

A G R A D E C I M I E N T O S

A g r a d e z c o a D i o s p o r t o d o l o r e c i b i d o e n e s t o s a ñ o s d e a p r e n d i z a j e y p o r

p e r m i t i r m e a l c a n z a r u n o d e m i s g r a n d e s s u e ñ o s . A s í m i s m o a g r a d e z c o a

m i s p a d r e s y h e r m a n o s p o r b r i n d a r m e a p o y o e m o c i o n a l p a r a e l

c u m p l i m i e n t o d e m i s u e ñ o e l s e r M a s t e r e n B i o t e c n o l o g í a M o l e c u l a r , s i n

U s t e d e s n o s o y n a d a .

A l a U n i d a d d e p o s g r a d o d e l a U n i v e r s i d a d d e G u a y a q u i l p o r b r i n d a r m e l a

d i c h a d e a p r e n d e r e s t a p r o f e s i ó n d e l a m a n o d e e x c e l e n t e s d o c e n t e s , q u e

n o s o l o m e h a n m o l d e a d o e n s a b e r e s c i e n t í f i c o s y p r á c t i c o s s i n o t a m b i é n

e n v a l o r e s m o r a l e s q u e l o s c u m p l i r é d í a a d í a e n e l e j e r c i c i o p r o f e s i o n a l .

A g r a d e z c o a l a D r a . Y v e t h C a s a r t , D r . R o d r i g o A b a d , D r a . R u t h M e d i n a ,

B Q . F . F r e d d y C a s t i l l o , I n g . V i n i c i o A l v a r a d o J a r a m i l l o y a m i t u t o r a d e t e s i s

l a D r a . V a n e s s a H e r r e r a , p o r e l g r a n i n t e r é s , c o l a b o r a c i ó n , e n s e ñ a n z a ,

p a c i e n c i a y t i e m p o q u e h a n d e d i c a d o e n e l p r e s e n t e t r a b a j o , p o r s u s b u e n a s

y e x c e l e n t e s o r i e n t a c i o n e s y a s u v e z p o r b r i n d a r m e e n r i q u e c e d o r e s

c o n o c i m i e n t o s .

A g r a d e z c o a l a s A u t o r i d a d e s d e l a U n i v e r s i d a d N a c i o n a l d e L o j a q u e

p e r m i t i e r o n e l u s o d e l o s L a b o r a t o r i o s p a r a e l d e s a r r o l l o d e l s i g u i e n t e

t r a b a j o i n v e s t i g a t i v o .

A n d r e a E l i z a b e t h T o r r e s G u a l á n

(7)

D E D I C A T O R I A

C o n t o d o a m o r y g r a t i t u d d e d i c o e s t e t r a b a j o a :

M i s p a d r e s M a r í a O l i v a y B o l í v a r , q u i e n e s

s i e m p r e h a n c r e í d o e n m i s c a p a c i d a d e s y

m e h a n b r i n d a d o e l a m o r , l a c o n f i a n z a ,

f o r t a l e z a y l a c o m p r e s i ó n n e c e s a r i a p a r a

n o d e s m a y a r e n c i r c u n s t a n c i a s q u e v i v í a

l o l a r g o d e m i v i d a a c a d é m i c a , s o n y

s i e m p r e s e r á n e l c i m i e n t o d e t o d o l o q u e

h a g o , m e s i e n t o b e n d e c i d a p o r t e n e r l o s

c o n v i d a y c e l e b r a n d o m i s t r i u n f o s q u e s o n

a h o r a s u y o s .

A u s t e d e s h e r m a n o s D i e g o , M a r í a

B e l é n y a m i p e q u e ñ a s o b r i n a

C a t a l i n a , p o r e s t a r s i e m p r e e n

t o d o s l o s m o m e n t o s , p o r d a r m e

a p o y o y p a l a b r a s d e á n i m o , p o r l o

q u e m e h a n m o t i v a d o a s e g u i r

a d e l a n t e c o n e s t e s u e ñ o q u e

f i n a l m e n t e s e c u m p l i ó .

A m i s q u e r i d o s d o c e n t e s y a m i g o s , p o r l a

p a c i e n c i a y a p o y o ; p r o m e t o l l e v a r l o s

s i e m p r e e n m i c o r a z ó n .

A n d r e a E l i z a b e t h T o r r e s G u a l á n

(8)

R E S U M E N

L a i n t o x i c a c i ó n e s t a f i l o c ó c i c a a l i m e n t a r i a e s u n a e n f e r m e d a d

g a s t r o i n t e s t i n a l c a u s a d a a l i n g e r i r a l i m e n t o s c o n t a m i n a d o s c o n t o x i n a s

p r o d u c i d a s p o r e l p a t ó g e n o S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s, u n a b a c t e r i a c a p a z d e

t o l e r a r l a s a l y c u y a s e n t e r o t o x i n a s s o n t e r m o r e s i s t e n t e s , c a r a c t e r í s t i c a s

q u e l e p e r m i t e n i n f e c t a r a v a r i o s t i p o s d e a l i m e n t o s c o m o e l q u e s o q u e e n

l a c i u d a d d e L o j a s e e l a b o r a s i n s e g u i r l a n o r m a t i v a v i g e n t e . E l o b j e t i v o d e l

p r e s e n t e e s t u d i o f u e d e t e c t a r l a p r e s e n c i a d e g e n e s e n t e r o t o x i g é n i c o s e n

q u e s o s a r t e s a n a l e s , l a m e t o d o l o g í a e m p l e a d a f u e e l a i s l a m i e n t o y

c a r a c t e r i z a c i ó n f e n o t í p i c a d e S . a u r e u s y l a d e t e c c i ó n d e l o s c i n c o

p r i n c i p a l e s g e n e s e n t e r o t o x i g é n i c o s p o r P C R - m ú l t i p l e x ; l o s r e s u l t a d o s d e

é s t a i n v e s t i g a c i ó n r e v e l a r o n l a p r e s e n c i a d e l 1 0 0 % d e l a s m u e s t r a s

a n a l i z a d a s m o s t r a r o n c o n t a m i n a c i ó n p o r S . a u r e u s; e l p r i n c i p a l g e n

e n t e r o t o x i g é n i c o e n c o n t r a d o f u e S E E c o n u n a p r e s e n c i a d e l 5 6 . 7 % d e l a s

c e p a s , e l r e s t o d e l o s g e n e s e n t e r o t o x i g é n i c o s n o m o s t r a r o n d i f e r e n c i a s

s i g n i f i c a t i v a s , 1 0 % d e S E C , e l 6 . 6 7 % c o r r e s p o n d i ó a S E A , 6 . 6 7 % S E D y

u n 3 . 3 3 % S E B . S e c o n c l u y e q u e l a u t i l i z a c i ó n d e l o s a n á l i s i s

m i c r o b i o l ó g i c o s y t é c n i c a s m o l e c u l a r e s p e r m i t i ó r e a l i z a r u n a f á c i l d e t e c c i ó n

d e l o s c i n c o p r i n c i p a l e s g e n e s e n t e r o t o x i g é n i c o s p r e s e n t e s e n l a s c e p a s d e

S . a u r e u s p r o v e n i e n t e s d e q u e s o s a r t e s a n a l e s q u e s e e x p e n d e n e n l o s t r e s

m e r c a d o s d e l a l o c a l i d a d , d e l o s c u a l e s e n g e n q u e c o d i f i c a p a r a l a

e n t e r o t o x i n a S E E p r e v a l e c i ó s o b r e l a s o t r a s ; e s i m p o r t a n t e c o n s i d e r a r l a

p r e s e n c i a d e l g e n e n t e r o t o x i g é n i c o S E B , a u n q u e e n m í n i m a c a n t i d a d , e n

a m b o s c a s o s s o n c o n s i d e r a d a s c o m o u n a p o t e n c i a l r i e s g o d e i n f e c c i ó n y a

q u e e s t a r í a n p r o d u c i e n d o i n t o x i c a c i ó n a l i m e n t a r i a e n l a p o b l a c i ó n .

P A L A B R A S C L A V E : g e n e n t e r o t o x i g é n i c o, S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ,

(9)

A B S T R A C T

S t a p h y l o c o c c a l f o o d p o i s o n i n g i s a g a s t r o i n t e s t i n a l i l l n e s s c a u s e d b y e a t i n g

f o o d s c o n t a m i n a t e d w i t h t o x i n s p r o d u c e d b y t h e p a t h o g e n S t a p h y l o c o c c u s

a u r e u s, a s a l t - t o l e r a n t b a c t e r i u m w h o s e e n t e r o t o x i n s a r e h i g h l y h e a t

r e s i s t a n t , c h a r a c t e r i s t i c s t h a t a l l o w i t t o i n f e c t v a r i o u s t y p e s o f f o o d s u c h a s

c h e e s e t h a t i n t h e c i t y o f L o j a i s e l a b o r a t e d w i t h o u t f o l l o w i n g t h e c u r r e n t

r e g u l a t i o n s . T h e m a i n p u r p o s e o f t h e s t u d y w a s t o d e t e c t t h e p r e s e n c e o f

e n t e r o t o x i g e n i c g e n e s i n f r e s h a r t i s a n c h e e s e , t h e m e t h o d o l o g y u s e d w a s

t h e d e t e c t i o n o f e n t e r o t o x i c g e n e s b y M u l t i p l e x P C R . T h e m a i n r e s u l t s o f

t h e i n v e s t i g a t i o n s h o w e d t h e p r e s e n c e o f t h e f i v e m a i n g e n e n t e r o t o x i n s :

S E A , S E B , S E C , S E D a n d S E E o f S . a u r e u s f r o m m i c r o b i o l o g i c a l i s o l a t e s ;

1 0 0 % o f t h e a n a l y z e d s a m p l e s s h o w e d c o n t a m i n a t i o n b y S . a u r e u s ; T h e

m a i n r e s u l t s o f t h i s r e s e a c h s h o w e d t h e p r e s e n c e o f t h e f i v e m a i n

e n t e r o t o x i n s : S E A , S E B , S E C , S E D a n d S E E o f S . a u r e u s f r o m

m i c r o b i o l o g i c a l i s o l a t e s ; 1 0 0 % o f t h e a n a l y z e d s a m p l e s s h o w e d

c o n t a m i n a t i o n b y S . a u r e u s; T h e m a i n e n t e r o t o x i n w a s S E E w i t h a p r e s e n c e

o f 5 6 . 7 % o f t h e s t r a i n s , t h e r e m a i n i n g g e n e n t e r o t o x i n s d i d n o t s h o w

s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s , 1 0 % o f S E C , 6 . 6 7 % c o r r e s p o n d e d t o S E A , 6 . 6 7 %

S E D a n d 3 . 3 3 % S E B . I t i s c o n c l u d e d t h a t t h e u s e o f d i f f e r e n t m o l e c u l a r

m e t h o d o l o g i e s a n d t e c h n i q u e s a l l o w e d a n e a s y d e t e c t i o n o f t h e f i v e m a i n

s t a p h y l o c o c c a l e n t e r e t o x i n s p r e s e n t i n t h e s t r a i n s f r o m f r e s h a r t i s a n c h e e s e

a t l o c a l m a r k e t s , o f w h i c h S E E e n t e r o t o x i n p r e v a i l e d o v e r t h e o t h e r s . I t i s

i m p o r t a n t t o c o n s i d e r t h e p r e s e n c e o f e n t e r o t o x i n S E B , a l t h o u g h i n m i n i m a l

a m o u n t i t r e p r e s e n t s a p o t e n t i a l r i s k , i n b o t h c a s e s t h e y a r e c o n s i d e r e d a s

a s o u r c e o f i n f e c t i o n s i n c e t h e y w o u l d b e p r o d u c i n g f o o d p o i s o n i n g i n t h e

p o p u l a t i o n .

(10)
(11)

3 .4 . H I P Ó T E S I S ... ... ... ... 5 2

3 .5 . U B IC A C IÓ N ... ... ... ... 5 2

3 .6 . M A T E R I A L E S Y M É T O D O S ... ... ... 5 3

C A P Í T U L O I V . . . 1

4 . R E S U L T A D O S . . . 1

4 .1 . A n á li s i s m i c r o b io ló g i c o ... ... ... ... 1

4 .2 . A n á li s i s M o le c u la r ... ... ... ... 2

4 .3 . P r e s e n c ia d e g e n e s e n te r o to x ig é n ic o s e n c e p a s d e S . a u r e u s a p a r tir d e a is la d o s d e q u e s o s a r te s a n a le s . ... ... ... 3

4 .4 . P r e s e n c ia d e g e n e s e n te r o to x i g é n i c o s e n c e p a s d e S . a u r e u s . ... 5

C A P Í T U L O V . . . 8

5 . D I S C U S I Ó N . . . 8

C A P Í T U L O V I . . . 1 1

6 . C O N C L U S I O N E S . . . 1 1

C A P Í T U L O V I I . . . 1 2

7 . R E C O M E N D A C I O N E S . . . 1 2

B I B L I O G R A F Í A . . . 1 3

(12)

A B R E V I A T U R A S

E T A E n f e r m e d a d T r a n s m i t i d a p o r A l i m e n t o s .

S E o S E s E n t e r o t o x i n a e s t a f i l o c ó c i c a .

I A E I n t o x i c a c i ó n a l i m e n t a r i a e s t a f i l o c ó c i c a

P b p a r e s d e b a s e s

P C R R e a c c i ó n e n c a d e n a P o l i m e r a s a .

m - P C R R e a c c i ó n e n c a d e n a d e l a p o l i m e r a s a m ú l t i p l e

U F C U n i d a d f o r m a d o r a d e c o l o n i a s p o r g r a m o s . U n i d a d e n l a q u e

s e e x p r e s a l o s r e s u l t a d o s d e l o s c o n t e o s b a c t e r i o l ó g i c o s e n

a l i m e n t o s y e q u i v a l e n t e s .

aw A c t i v i d a d a c u o s a .

A g r R e g u l a d o r d e g e n e s a c c e s o r i o s .

C M H C o m p l e j o m a y o r d e h i s t o c o m p a t i b i l i d a d .

C P H C o m p l e j o p r i n c i p a l d e h i s t o c o m p a t i b i l i d a d .

Tm T e m p e r a t u r a d e m e l t i n g .

N T E N o r m a T é c n i c a E c u a t o r i a n a .

I N E N I n s t i t u t o E c u a t o r i a n o d e N o r m a l i z a c i ó n .

P h P o t e n c i a l d e h i d r o g e n o .

P V L L e u c o c i d i n a d e P a n t o n e - V a l e n t i n e

T S S T - 1 T o x i n a 1 d e l s í n d r o m e d e l s h o c k t ó x i c o .

A T C C A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n .

N C T C N a t i o n a l C o l l e c t i o n o f T y p e C u l t u r e s .

D O D e n s i d a d ó p t i c a .

H2O2 P e r ó x i d o d e H i d r ó g e n o .

(13)

Í N D I C E D E F I G U R A S

F i g u r a 1 . M i c r o g r a f í a e l e c t r ó n i c a d e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s. . . 2 2

F i g u r a 2 . E s t r u c t u r a d e l a p a r e d c e l u l a r e s t a f i l o c ó c c i c a . . . . 2 5

F i g u r a 3 . R e p r e s e n t a c i ó n c i r c u l a r d e l c r o m o s o m a d e S. a u r e u s ( N 3 1 5 ) y

l o s e l e m e n t o s g e n é t i c o s e s p e c í f i c o s d e M u 5 0 . . . . 3 3

F i g u r a 4 . F u n c i o n a m i e n t o d e l l o c u s a g r . . . . 3 4

F i g u r a 5 . E s t r u c t u r a c l á s i c a d e u n a n t í g e n o e s t a f i l o c ó c i c o . . . . 4 0

F i g u r a 6 . I m a g e n e s q u e m á t i c a d e u n m o d e l o d e d o s m o l é c u l a s M H C d e

c l a s e I I r e t i c u l a d a s p o r e l h o m o d í m e r o d e p e n d i e n t e d e S E D Z n 2 + . . . 4 2

F i g u r a 7 . P r o p o r c i ó n d e t t i p o s d e r e c e p t o r e s e n l i n f o c i t o s T . . . . 4 4

F i g u r a 8. a ) I n m u n o g l o b u l i n a y s u s p a r t e s y s u s i m i l i t u d c o n e l b ) R e c e p t o r

p a r a a n t í g e n o d e l l i n f o c i t o T j u n t o c o n p r o t e í n a s d e l c o m p l e j o C D 3 . . . 4 5

F i g u r a 9. V i s t a c l á s i c a d e l a r e l a c i ó n d e l a n t í g e n o y e l r e c e p t o r d e l

s u p e r a n t í g e n o . . . . 4 6

F i g u r a 1 0 . M u l t i p l e x P C R . . . 4 9

F i g u r a 1 1. U b i c a c i ó n d e l a i n v e s t i g a c i ó n e n l a c i u d a d d e L o j a . . . . 5 3

F i g u r a 1 2 . A m p l i f i c a c i ó n p o r m - P C R d e g e n e s d e e n t e r o t o x i n a s d e S .

a u r e u s . . . 2

(14)

Í N D I C E D E T A B L A S

T a b l a 1 . F a c t o r e s q u e a f e c t a n e l c r e c i m i e n t o y l a p r o d u c c i ó n d e

e n t e r o t o x i n a d e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s. . . . 2 3

T a b l a 2. F a c t o r e s n u t r i c i o n a l e s . . . 2 4

T a b l a 3 . C a r a c t e r í s t i c a s d e e n t e r o t o x i n a s s t a p h y l o c o c i c a s . . . 3 2

T a b l a 4 . A g r u p a c i ó n d e e n t e r o t o x i n a s b a s a d o s e n c o m p a r a c i ó n d e

s e c u e n c i a s d e a m i n o á c i d o s . . . 3 8

T a b l a 5. C a r a c t e r í s t i c a s ú n i c a s d e a l g u n a s S E c o m u n e s . . . . 3 8

T a b l a 6. C a r a c t e r i z a c i ó n f e n o t í p i c a d e S . a u r e u s . . . . 1

T a b l a 8 . E n t e r o t o x i n a s p r e s e n t e s e n d i f e r e n t e s a i s l a m i e n t o s d e c e p a s d e

S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . . . . 3

T a b l a 9 . Í n d i c e d e d o m i n a n c i a d e S i m p s o n e n c e p a s d e S . a u r e u s. . . 4

T a b l a 1 0. P r e s e n c i a d e S E A e n c e p a s d e S . a u r e u s c a l c u l a d o c o n p a q u e t e

e p i R . . . 5

T a b l a 1 1. P r e s e n c i a d e S E B e n c e p a s d e S . a u r e u s c a l c u l a d o c o n p a q u e t e

e p i R . . . . 6

T a b l a 1 2. P r e s e n c i a d e S E C e n c e p a s d e S . a u r e u s c a l c u l a d o c o n p a q u e t e

e p i R . . . 6

T a b l a 1 3. P r e s e n c i a d e S E D e n c e p a s d e S . a u r e u s c a l c u l a d o c o n p a q u e t e

e p i R . . . . 7

T a b l a 1 4 . P r e s e n c i a d e E S E e n c e p a s d e S . a u r e u s c a l c u l a d o c o n p a q u e t e

(15)
(16)

a l i m e n t a r i a . ( O r g a n i z a c i ó n M u n d i a l d e l a S a l u d , 2 0 1 5 ) . S e h a n n o t i f i c a d o

i n f e c c i o n e s p o r S . a u r e u s e n q u e s o s p a s t e u r i z a d o s e n d i f e r e n t e s p a r t e s d e

L a t i n o a m é r i c a , e n M é r i d a ( V e n e z u e l a ) s e o b t u v o 6 4 , 4 4 % ; e n L i m a ( P e r ú )

5 3 , 4 % ; e n C o r r i e n t e s ( A r g e n t i n a ) 4 5 % ; e n T a b a s c o ( M é x i c o ) 1 1 , 8 % ( F é l i x ,

e t a l , 2 0 0 6 ) y e n E c u a d o r e n u n e s t u d i o r e a l i z a d o e n n o v i e m b r e y d i c i e m b r e

d e 2 0 1 5 s e d e t e r m i n ó l a p r e v a l e n c i a d e S . a u r e u s e n u n 8 3 , 3 3 % d e l o s

q u e s o s a n a l i z a d o s ( Y u g c h a , 2 0 1 6 ) . A n i v e l d e l p a í s , o t r o e s t u d i o r e a l i z a d o

e n d i f e r e n t e s t i p o s d e q u e s o s ( a r t e s a n a l e s , p a s t e u r i z a d o s y m o z z a r e l l a )

d i s t r i b u i d o s l o s m e r c a d o s d e M i l a g r o e n e l a ñ o 2 0 1 6 , d e t e c t ó q u e a p a r t i r

d e 5 4 q u e s o s e s t u d i a d o s 3 0 ( 5 5 , 5 6 % ) r e s u l t a r o n c o n t a m i n a d o s c o n

S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s y l a m a y o r c a n t i d a d e n q u e s o s a r t e s a n a l e s

c o n c l u y e n d o q u e é s t o s t i e n e n m a y o r p o r c e n t a j e d e r e c u p e r a c i ó n d e l

m i c r o o r g a n i s m o ( P a z m i ñ o , 2 0 1 6 ) .

L o s e s t a f i l o c o c o s s e e n c u e n t r a n o m n i p r e s e n t e s e n e l m e d i o a m b i e n t e

y s e p u e d e e n c o n t r a r e n e l a i r e , p o l v o , a g u a s r e s i d u a l e s , e l a g u a , l a s

s u p e r f i c i e s a m b i e n t a l e s , s e r e s h u m a n o s y a n i m a l e s ( H e n n e k i n n e , 2 0 1 2 ) .

E l e m p l e o d e l a t é c n i c a d e r e a c c i ó n e n c a d e n a d e l a p o l i m e r a s a ( P C R )

p e r m i t e d e t e c t a r d e f o r m a s e n s i b l e y e s p e c í f i c a l a p r e s e n c i a d e g e n e s d e

e n t e r o t o x i n a s e n c e p a s d e S . a u r e u s o b t e n i d o s a p a r t i r d e m u e s t r a s d e

q u e s o s a r t e s a n a l e s .

L a i m p o r t a n c i a d e l p r e s e n t e e s t u d i o h a s i d o d e m o s t r a r q u e l o s q u e s o s

a r t e s a n a l e s q u e s e e x p e n d e n e n l o s m e r c a d o s d e l a c i u d a d d e L o j a s e

e n c u e n t r a p r e s e n t e l a b a c t e r i a S t a p h y l o c o c u s a u r e u s y c u y a s c e p a s

p u e d e n p r e s e n t a r l o s g e n e s q u e c o d i f i c a n p a r a l a s e n t e r o t o x i n a s , l a s c u a l e s

p o d r í a n e s t a r p r o d u c i e n d o i n t o x i c a c i ó n a l i m e n t a r i a .

1 . 1 . F O R M U L A C I Ó N D E L P R O B L E M A

S . a u r e u s p r o d u c e c i n c o e n t e r o t o x i n a s t í p i c a s s : l a e n t e r o t o x i n a A

(17)
(18)

E l p r e s e n t e e s t u d i o s e j u s t i f i c a p o r s u c o n t r i b u c i ó n a l a s a l u d p ú b l i c a ,

e n e s p e c i a l a l a p a r t e a l i m e n t a r i a d e m a n e r a p r i n c i p a l e n l a d e t e c c i ó n d e

g e n e s e n t e r o t o x i g é n i c o s q u e s e e n c u e n t r a n e n l o s a i s l a d o s m i c r o b i o l ó g i c o s

d e S . a u r e u s, l o s c u a l e s s e e n c u e n t r a n a l o j a d o s e n l o s a l i m e n t o s ,

e s p e c i a l m e n t e e n l o s q u e s o s q u e s e p r o d u c e n d e m a n e r a a r t e s a n a l .

U n a p o r t e d e g r a n i m p o r t a n c i a d e e s t e t r a b a j o e s t á o r i e n t a d o a l a

a c a d e m i a , a l o s d i f e r e n t e s t r a b a j o s q u e s e r e a l i z a n e n b i o t e c n o l o g í a

m o l e c u l a r , a t r a v é s d e l a a p l i c a c i ó n d e p r o c e d i m i e n t o s m i c r o b i o l ó g i c o s

t r a d i c i o n a l e s y P C R - m ú l t i p l e x q u e p e r m i t e s i m u l t á n e a m e n t e a m p l i f i c a r e n

u n a m i s m a r e a c c i ó n v a r i o s g e n e s e s p e c í f i c o s , o b t e n i e n d o u n d i a g n ó s t i c o

s e n s i b l e y e s p e c í f i c o d e l o s p r i n c i p a l e s g e n e s e n t e r o t o x i g é n i c o s q u e s e

e n c u e n t r a n e n l a s c o l o n i a s d e S . a u r e u s a i s l a d a s a p a r t i r d e q u e s o s

a r t e s a n a l e s .

1 . 3 . O B J E T I V O S

1 . 3 . 1 . G E N E R A L E S

 D e t e r m i n a r l a p r e s e n c i a d e g e n e s e n t e r o t o x i g é n i c o s d e

S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s e n q u e s o s a r t e s a n a l e s e x p e n d i d o s e n l o s

m e r c a d o s d e l a c i u d a d d e L o j a .

1 . 3 . 2 . E S P E C Í F I C O S

 A n a l i z a r y c a r a c t e r i z a r b i o q u í m i c a m e n t e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s, a

p a r t i r d e l a s c o l o n i a s o b t e n i d a s d e m u e s t r a s d e q u e s o s .

 I d e n t i f i c a r l o s g e n e s e n t e r o t o x i g é n i c o s m á s f r e c u e n t e s m e d i a n t e m

(19)

C A P Í T U L O I I

2 . M A R C O T E Ó R I C O

2 . 1 . G E N E R A L I D A D E S : S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s

L o s e s t a f i l o c o c o s s o n u n a m p l i o g r u p o d e b a c t e r i a s g r a m - p o s i t i v a s ,

q u e t i e n e n u n a g r a n c a p a c i d a d d e a d a p t a c i ó n , p o r l o c u a l a f e c t a n a t o d a s

l a s e s p e c i e s c o n o c i d a s d e m a m í f e r o s . E s p o r e l l o q u e , g r a c i a s a s u f á c i l

d i s p e r s i ó n , p u e d e n t r a n s m i t i r s e d e u n a e s p e c i e a o t r a , s i e n d o f r e c u e n t e s

l o s c a s o s e n t r e h u m a n o s - a n i m a l e s y v i c e v e r s a .

E n l o s ú l t i m o s a ñ o s , l a i n c i d e n c i a d e b a c t e r i e m i a p o r S t a p h y l o c o c c u s

h a a u m e n t a d o s i g n i f i c a t i v a m e n t e , y a q u e u n a e s p e c i e d e e s t a f a m i l i a

b a c t e r i a n a h a a u m e n t a d o s u f r e c u e n c i a d e a p a r i c i ó n ; s e t r a t a d e l a e s p e c i e

S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s, q u e s e h a c o n v e r t i d o e n l a p r i n c i p a l c a u s a d e

i n f e c c i o n e s e n e l t o r r e n t e c i r c u l a t o r i o e i n t o x i c a c i o n e s o c a s i o n a d a s p o r

a l i m e n t o s .

P a s a r o n 2 0 0 a ñ o s a n t e s d e q u e l o s c i e n t í f i c o s c o m e n z a r a n a

e s t u d i a r c o n m a y o r a t e n c i ó n y a c a r a c t e r i z a r e s t a b a c t e r i a , d e b i d o a q u e S .

a u r e u s s e v i v e e n l a p i e l y e n l a s m e m b r a n a s m u c o s a s d e a n i m a l e s y l o s

s e r e s h u m a n o s s i e n d o s u s p r i n c i p a l e s p o r t a d o r e s , p r o p o r c i o n a n d o a s í u n

e n t o r n o c á l i d o y h ú m e d o i d e a l p a r a q u e c o l o n i c e e s t a b a c t e r i a .

U n a d e l a s r a z o n e s i m p o r t a n t e s q u e s e c o n s i d e r a p a r a q u e S .

a u r e u s s e a t a n r e s i s t e n t e e s , d e b i d o a q u e s u p a r e d c e l u l a r e s

e x t r e m a d a m e n t e g r u e s a , é s t e e s p e s o r p e r m i t e q u e S . a u r e u s t e n g a u n a

a l t a p r e s i ó n i n t e r n a e n c o m p a r a c i ó n c o n o t r o t i p o d e b a c t e r i a s ( F r e e m a n ,

2 0 0 6 ) . S . a u r e u s f u e r e c o n o c i d o y d e s c r i t o h a c e t a n s ó l o 1 2 5 a ñ o s e s c a s i

s e g u r o é s t a b a c t e r i a i n f e c t o y m a t o a l o s s e r e s h u m a n o s d e s d e h a c e m i l e s

(20)
(21)

n e g a t i v o s p a r a l o c u a l d i v i d i ó a l o s e s t a f i l o c o c o s e n s e i s s u b g r u p o s

b a s á n d o s e e n p r u e b a s f i s i o l ó g i c a s y b i o q u í m i c a s ; a s í , e l s u b g r u p o I

c o n t e n í a l a e s p e c i e S . a u r e u s: c o a g u l a s a y f o s f a t a s a p o s i t i v a s q u e

g e n e r a l m e n t e p r o d u c í a n á c i d o a p a r t i r d e m a n i t o l a e r ó b i c a y

a n a e r ó b i c a m e n t e ; l o s s u b g r u p o s I I h a s t a V I c o n t e n í a n u n a ú n i c a e s p e c i e :

S . e p i d e r m i d i s, q u e s e d i f e r e n c i a b a e n l a p r o d u c c i ó n d e f o s f a t a s a y

a c e t o í n a , a s í c o m o l a c a p a c i d a d d e p r o d u c i r á c i d o a e r ó b i c a m e n t e a p a r t i r

d e l a l a c t o s a , m a l t o s a y m a n i t o l .

E n 1 9 6 5 , B a i r d P a r k e r d e f i n i ó a l o s s u b g r u p o s d e l I I h a s t a e l V I

c o m o b i o t i p o s d e l 1 a l 5 , e i n d i c ó q u e l a m a y o r í a d e e s t o s b i o t i p o s

m e r e c e r í a n t e n e r e l r a n g o d e e s p e c i e s . ( B o q u e t e , 1 9 9 6 ) ( B o s s c h e r & S m i t h ,

1 9 7 3 ). E n 1 9 6 5 e l C o m i t é I n t e r n a c i o n a l d e B a c t e r i o l o g í a e s t a n d a r i z a l o s

t e s t p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n d e S t a p h y l o c o c c u s y M i c r o c o c c u s u t i l i z a n d o l a

r e l a c i ó n G / C e n b a s e a l a c o m p o s i c i ó n d e l A D N , l a l i s i s d e

L y s o s t a p h i n e n d o p e p e t i d a s a y p r e s e n c i a d e á c i d o s t e i c o i c o s .

( K u s u m a n i n g r u m H . R . , 2 0 0 3 ) .

2 . 2 . T A X O N O M Í A

E l g é n e r o S t a p h y l o c o c c u s p e r t e n e c e a p h y l u m I I d e l D o m i n i o

B a c t e r i a , c l a s e I I I B a c i l l i, o r d e n I B a c i l l a l e s, f a m i l i a V I I I S t a p h y l o c o c c a c e a e

y s u b e s p e c i e a u r e u s. ( K o n e m a n , 2 0 0 4 ) S o l a m e n t e 1 8 e s p e c i e s d e

S t a p h y l o c o c c u s, h a n s i d o r e p o r t a d a s d e i m p o r t a n c i a e n a l i m e n t o s , s i e n d o

S . a u r e u s l a m á s i m p o r t a n t e e i n d i c a d o r a d e c o n t a m i n a c i ó n p o r

m a n i p u l a c i ó n i n a d e c u a d a .

2 . 3 . M O R F O L O G Í A

S . a u r e u s e s u n a b a c t e r i a g r a m p o s i t i v a , c o n m o r f o l o g í a

m i c r o s c ó p i c a t í p i c a d e c o c o s d i s p u e s t o s e n p a r e s , t é t r a d a s o g r u p o s

i r r e g u l a r e s s e m e j a n t e s a u n r a c i m o d e u v a s c o n u n t a m a ñ o

(22)

E s a n a e r o b i o f a c u l t a t i v o ( m e t a b o l i s m o r e s p i r a t o r i o o f e r m e n t a t i v o y

q u i m i o o r g a n o t r o f o s ) , m e s ó f i l o , n e c e s i t a d e a m i n o á c i d o s y v i t a m i n a s p a r a

s u c r e c i m i e n t o , e s c a p a z d e f e r m e n t a r l a g l u c o s a c o n p r o d u c c i ó n d e á c i d o

y e s t o l e r a n t e a c o n d i c i o n e s a m b i e n t a l e s m u y v a r i a b l e s . E s c a t a l a s a

p o s i t i v o , c o n u n a l t o c o n t e n i d o d e G + C e n l a c o m p o s i c i ó n d e l A D N d e 3 0 a

4 0 % . P o r l o g e n e r a l , l a s c e p a s p r o d u c t o r a s d e c o a g u l a s a s o n

t e r m o n u c l e a s a p o s i t i v a . E s u n a b a c t e r i a u b i c u a y p a t ó g e n a q u e p u e d e

c a u s a r i n t o x i c a c i ó n a l i m e n t a r i a . ( K o n e m a n , 2 0 0 4 ) ( A r b i z a , 2 0 0 6 ) .

F i g u r a 1 . M i c r o g r a f í a e l e c t r ó n i c a d e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s .

F u e n t e : F r e e m a n - C o o k & F r e e m a n - C o o k , 2 0 0 6 .

L o s e s t a f i l o c o c o s c r e c e n e n m e d i o s q u í m i c a m e n t e d e f i n i d o s , l o s

c u a l e s c o n t i e n e n g l u c o s a , s a l e s , a m i n o á c i d o s , t i a m i n a y á c i d o n i c o t í n i c o .

C r e c e n e n m e d i o s s u p l e m e n t a d o s , e n r a n g o s d e p H d e 4 . 8 a 9 . 4 y a

t e m p e r a t u r a s d e 2 5 ° C a 4 3oC , p e r o l a ó p t i m a e s 3 7 º C . ( V e l á z q u e z , 2 0 0 5 ) ( S c h e l i n , 2 0 1 1 ) . T o l e r a n a l t a s c o n c e n t r a c i o n e s d e N a C l h a s t a u n 2 0 % .

P o s e e u n a a c t i v i d a d a c u o s a aw e n t r e 0 . 8 3 ≥ 0 . 9 9 ( S c h e lin , 2 0 1 1 ) . L a s

e n t e r o t o x i n a s d e S t a p h y l o c o c c u s s o n p r o t e í n a s s i m p l e s , t e r m o t o l e r a n t e s y

d e b a j o p e s o m o l e c u l a r q u e o s c i l a e n t r e 2 6 . 0 0 0 a 3 4 . 0 0 0 D a . ( B r i z z i o ,

(23)

T a b l a 1 F a c t o r e s q u e a f e c t a n e l c r e c i m i e n t o y l a p r o d u c c i ó n d e e n t e r o t o x i n a d e

s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s.

F u e n t e : ( H e n n e k i n n e , 2 0 1 2 ) .

A s i m i s m o , s u s t o x i n a s s o n a l t a m e n t e e s t a b l e s , y r e s i s t e n t e s a l c a l o r ,

c o n g e l a c i ó n e i r r a d i a c i ó n , p o r l o q u e u n a v e z f o r m a d a s e n e l a l i m e n t o , e s

e x t r e m a d a m e n t e d i f í c i l e l i m i n a r l a s ( F u n d a c i ó n V a s c a p a r a l a S e g u r i d a d

A g r o a l i m e n t a r i a , 2 0 1 3 ) .

E l c r e c i m i e n t o d e S . a u r e u s y l a p r o d u c c i ó n d e S E t a m b i é n e s t á

i n f l u e n c i a d a p o r f a c t o r e s n u t r i c i o n a l e s , n o c r e c e b i e n e n p r e s e n c i a d e u n a

f l o r a c o m p e t i t i v o s . S u i n h i b i c i ó n s e d e b e p r i n c i p a l m e n t e a l o s p r o d u c t o s

á c i d o s , d i s m i n u c i ó n d e l p H , l a p r o d u c c i ó n d e H2O 2 u o t r a s s u s t a n c i a s

i n h i b i d o r a s c o m o a n t i b i ó t i c o s , c o m p u e s t o s v o l á t i l e s o l a c o m p e t e n c i a

n u t r i c i o n a l . ( H e n n e k i n n e , 2 0 1 2 ) . A l g u n o s d e l o s f a c t o r e s s e d e t a l l a n e n l a

(24)

T a b l a 2. F a c t o r e s n u t r i c i o n a l e s

F u e n t e : ( H e n n e k i n n e , 2 0 1 2 )

L a s c o l o n i a s d e l S . a u r e u s p r e s e n t a n u n c o l o r a m a r i l l o d o r a d o

c a r a c t e r í s t i c o d e b i d o a l a p r o d u c c i ó n d e c a r o t e n o i d e s d u r a n t e s u

c r e c i m i e n t o ( R o s e n b a c h , M o s h o n o v , & Y a r o n , 1 9 8 4 ) .

2 . 4 . E S T R U C T U R A

L a i n t e g r i d a d y l a f o r m a c e l u l a r e s p r o t e g i d a p o r l a p r e s e n c i a d e u n a

e s t r u c t u r a d e n o m i n a d a p a r e d c e l u l a r , l a c o n c e n t r a c i ó n d e s o l u t o s e n e l

(25)

q u e p r e s e n t e u n a e s t r u c t u r a q u e l e c o n f i e r a a l m i c r o o r g a n i s m o f o r m a y

r i g i d e z .

F i g u r a 2 . E s t r u c t u r a d e l a p a r e d c e l u l a r e s t a f i l o c ó c c i c a .

F u e n t e : ( K o n e m a n , 2 0 0 4 ) .

2 . 4 . 1 . P a r e d C e l u l a r

L a p a r e d c e l u l a r d e l a s b a c t e r i a s g r a m p o s i t i v a s e s t á n c o n f o r m a d a s p o r :

E l p e p t i d o g l i c a n o, r e p r e s e n t a l a m i t a d d e l p e s o d e l a p a r e d c e l u l a r

y p r o p o r c i o n a f o r m a y e s t a b i l i d a d a l m i c r o o r g a n i s m o ( H o n e y m a n A .

F . , 2 0 0 2 ). T i e n e a c t i v i d a d d e t i p o e n d o t o x i n a , p o r l o q u e i n t e r v i e n e

d e f o r m a i m p o r t a n t e e n l a p a t o g e n i a d e l a i n f e c c i ó n . ( P a h i s s a , 2 0 0 9 ) .

E s u n p o l í m e r o p o l i s a c á r i d o f o r m a d o p o r l a u n i ó n d e s u b u n i d a d e s

q u e s u m i n i s t r a e l e x o e s q u e l e t o r í g i d o d e l a p a r e d c e l u l a r .

L a e x p o s i c i ó n a u n á c i d o f u e r t e o a l i s o z i m a d e s t r u y e a l o s

p e p t i d o g l u c a n o s . E l p e p t i d o g l u c a n o e s i m p o r t a n t e e n l a p a t o g e n i a

d e l a i n f e c c i ó n : i n d u c e l a p r o d u c c i ó n d e i n t e r l e u q u i n a - 1 ( p i r ó g e n o

e n d ó g e n o ) y d e a n t i c u e r p o s o p s ó n i c o s p o r m e d i o d e l o s m o n o c i t o s ;

y p u e d e a t r a e r q u í m i c a m e n t e a l o s l e u c o c i t o s ( p o l i m o r f o n u c l e a r e s ) ,

p o s e e u n a a c t i v i d a d p a r e c i d a a e n d o t o x i n a , l o c u a l g e n e r a u n

f e n ó m e n o d e S h w a r t z m a n l o c a l i z a d o y a c t i v a a l c o m p l e m e n t o ,

( H e r n á n d e z , V a l d é s , & Z u a z o , 2 0 0 1 ) , a d e m á s t i e n e a c t i v i d a d d e t i p o

e n d o t o x i n a , p o r l o q u e i n t e r v i e n e d e f o r m a i m p o r t a n t e e n l a

(26)
(27)

u n i r s e a l a p r o t r o m b i n a p a r a a c t i v a r s e y c a t a l i z a r l a c o n v e r s i ó n d e l

f i b r i n ó g e n o e n f i b r i n a .

 O t r a s p r o t e í n a s d e s u p e r f i c i e m e d i a n l a a d h e r e n c i a a l o s t e j i d o s d e l

h u é s p e d m e d i a n t e u n i o n e s e s p e c í f i c a s a l c o l á g e n o , e l a s t i n a y

f i b r o n e c t i n a .

2 . 4 . 2 . M e m b r a n a c i t o p l a s m á t i c a

E s t á f o r m a d a p o r u n c o m p l e j o d e p r o t e í n a s , l í p i d o s e h i d r a t o s d e

c a r b o n o y s i r v e d e b a r r e r a o s m ó t i c a p a r a l a c é l u l a .

2 . 4 . 3 . C á p s u l a

A l g u n a s c e p a s d e S . a u r e u s e s t á n r e c u b i e r t a s p o r u n a c a p a d e

p o l i s a c á r i d o s e x t e r n o s , d e n o m i n a d a s l i m e o c á p s u l a m u c o i d e , q u e c o n f i e r e ,

e n c i e r t a s c o n d i c i o n e s u n a m a y o r c a p a c i d a d d e a d h e r e n c i a , a s í c o m o u n

a u m e n t o d e l e f e c t o a n t i f a g o c í t i c o . ( P a h i s s a , 2 0 0 9 ) .

L a s e s t r u c t u r a s b i o q u í m i c a s q u e s e h a n d e t e r m i n a d o e n l a s c á p s u l a s

d e p o l i s a c á r i d o s d e l o s s e r o t i p o s 1 , 2 , 5 , y 8 c o n t i e n e n á c i d o o s a m i n o u r o n i c o

h e x a g o n a l . E l t r i s a c á r i d o c a p s u l a r d e l a s u n i d a d e s d e t i p o 5 y d e t i p o 8 s o n

m u y s i m i l a r e s , c o m p a r t e n l a m i s m a c o m p o s i c i ó n d e a z ú c a r y d i f i e r e n s ó l o

e n l o s v í n c u l o s e n t r e l o s a m i n o a z ú c a r e s y l a p o s i c i ó n 6 1 0 d e O

-a c e t i l -a c i ó n . L -a s c á p s u l -a s d e l o s t i p o s 1 , 5 y 8 t -a m b i é n t i e n e n u n -a z ú c -a r e n

c o m ú n , N - a c e t y l f u c o s a m i n e ( H o n e y m a n , F r i e d m a n , & B e n d i n e l l i , 2 0 0 2 ) .

2 . 5 . T O X I N A S Y E N Z I M A S

L o s e s t a f i l o c o c o s p u e d e n p r o d u c i r e n f e r m e d a d e s t a n t o p o r s u

c a p a c i d a d p a r a m u l t i p l i c a r s e y e x t e n d e r s e e n l o s t e j i d o s , c o m o p o r l a

p r o d u c c i ó n d e m u c h a s s u s t a n c i a s e x t r a c e l u l a r e s ; a l g u n a s d e e s t a s

s u s t a n c i a s s o n e n z i m a s , o t r a s s e d e n o m i n a n t o x i n a s .

M u c h a s d e l a s a n t e r i o r e s s e e n c u e n t r a n b a j o e l c o n t r o l g e n é t i c o d e

(28)
(29)
(30)
(31)
(32)

T a b l a 3 . C a r a c t e r í s t i c a s d e e n t e r o t o x i n a s s t a p h y l o c o c i c a s

F u e n t e : ( H e n n e k i n n e , 2 0 1 2 ) .

2 . 8 . G e n o m a

A c t u a l m e n t e s e h a n r e p o r t a d o 7 2 s e c u e n c i a s g e n ó m i c a s

c o m p l e t a s y 4 5 3 2 g e n ó m a s e n s a m b l a d o s . S . a u r e u s p o s e e u n c r o m o s o m a

c i r c u l a r d e a p r o x i m a d a m e n t e 2 8 0 0 p b , c o n p r o f a g o s , p l á s m i d o s y

t r a m p o s o n e s y ge n e s d e v i r u l e n c i a y r e s i s t e n c i a a l o s a n t i b i ó t i c o s q u e s e

e n c u e n t r a n e n e l c r o m o s o m a , a s í c o m o l o s e l e m e n t o s e x t r a c r o m o s ó m i c o s .

E s t o s g e n e s s o n t r a n s f e r i d o s e n t r e l a s c e p a s e l e s t a f i l o c o c o , e s p e c i e s u

(33)

F i g u r a 3 . R e p r e s e n t a c i ó n c i r c u l a r d e l c r o m o s o m a d e S. a u r e u s ( N 3 1 5 ) y l o s

e l e m e n t o s g e n é t i c o s e s p e c í f i c o s d e M u 5 0 .

F u e n t e : ( K u r o d a , 2 0 0 1 ) .

2 . 9 . R e g u l a d o r d e g e n e s a c c e s o r i o s ( a g r )

L a v i r u l e n c i a d e l a s c e p a s d e S . a u r e u s e s r e g u l a d a g e n é t i c a m e n t e p o r

e l a g r, e l c u a l c o n t r o l a l a e x p r e s i ó n d e l o s f a c t o r e s d e v i r u l e n c i a ( e x o t o x i n a s ,

e n t e r o t o x i n a s y e n z i m a s c o m o h e m o l i s i n a s , P V L . ) E s t e g e n c o m p r e n d e u n a

s e r i e d e g e n e s c u y o s p r o d u c t o s e s t a b l e c e n u n m e c a n i s m o r e g u l a t o r i o d e

d e t e c c i ó n d e l a d e n s i d a d d e l a p o b l a c i ó n b a c t e r i a n a ; l a a c t i v a c i ó n d e l

s i s t e m a d e p e n d e d e l a p r o d u c c i ó n y d e t e c c i ó n d e u n a s e ñ a l d e l p é p t i d o

a u t o i n d u c t o r ( A I P ) . ( R e y n o l d s & W i g n e s h w e r a r a j , 2 0 1 1 ) .

E l s i s t e m a d e r e g u l a c i ó n t i e n e u n a a c c i ó n d u a l q u e s e o b s e r v a p o r l a

r e p r e s i ó n d e l a t r a n s c r i p c i ó n d e g e n e s q u e c o d i f i c a n u n n ú m e r o d e

p r o t e í n a s a s o c i a d a s a l a p a r e d ( p r o t e í n a A , c o a g u l a s a , p r o t e í n a s d e u n i ó n

a f i b r o n e c t i n a ) , y l a a c t i v a c i ó n d e v a r i a s e x o p r o t e í n a s ( T o x i n a - a l f a ,

h e m o l i s i n a - b e t a , T S S T - 1 , l e u c o t o x i n a s ) d u r a n t e l a f a s e e s t a c i o n a r i a . E l

e f e c t o r a g r e s u n a m o l é c u l a d e R N A , R N A I I I q u e m o d u l a l a e x p r e s i ó n d e

l o s f a c t o r e s d e v i r u l e n c i a a n i v e l d e t r a n s c r i p c i ó n y t r a d u c c i ó n . ( R o c h a ,

L o z a n o , & M a r t í n e z , 2 0 0 4 ) .

E l a g r r e g u l a l a a c t i v a c i ó n d e g e n e s q u e f a v o r e c e n l a e x p r e s i ó n d e

f a c t o r e s d e v i r u l e n c i a y r e p r i m e n l o s f a c t o r e s d e s u p e r f i c i e , t a l e s c o m o

(34)

E l o p e r ó n a g r s e e n c u e n t r a e n e l c r o m o s o m a d e l S . a u r e u s , s e

c o n s i d e r a p a r t e d e l g e n o m a c e n t r a l y n o u n a i s l a d e p a t o g e n i c i d a d . E l l o c u s

c o n t i e n e d o s p r o m o t o r e s d i v e r g e n t e s P 2 y P 3 , s u j e t o s a l a r e g u l a c i ó n

t r a n s c r i p c i o n a l : R N A I I ( P 2 ) e l c u a l s e e n c a r g a d e c o d i f i c a r c u a t r o p r o t e í n a s :

( A g r A , A g r B , A g r C y A g r D ) ; A g r C e s e l r e c e p t o r d e t r a n s m e m b r a n a d e

h i s t i d i n a q u i n a s a y A g r A e s e l r e g u l a d o r d e l a r e s p u e s t a d e u n i ó n a l A D N y

e s e l p r i n c i p a l a c t i v a d o r d e l a t r a n s c r i p c i ó n d e l o p e r o n a g r y l a t r a n s c r i p c i ó n

y R N A I I I ( P 3 ) e s e l e f e c t o r p l e i o t r ó p i c o d e l o p e r ó n a g r e l c u a l r e g u l a l a

e x p r e s i ó n d e g e n e s q u e c o d i f i c a n f a c t o r e s d e v i r u l e n c i a e n t e r o t o x i n a s ,

s u p e r a n t í g e n o s c o m o T S S T - 1 , S E B , S E C , S E D , e n z i m a s . L a e x p r e s i ó n d e

R N A I I y R N A I I I e s t á c o n t r o l a d a p o r l o s p r o m o t o r e s P 2 y P 3

r e s p e c t i v a m e n t e . ( R e y n o l d s & W i g n e s h w e r a r a j , 2 0 1 1 ) .

F i g u r a 4 . F u n c i o n a m i e n t o d e l l o c u s a g r .

F u e n t e : ( N o v i c k , 2 0 0 8 ) .

2 . 1 0 . P A P E L D E L A C Á P S U L A E S T A F I L O C Ó C I C A S E N L A

V I R U L E N C I A

E l p a p e l d e l a s c á p s u l a s d e t i p o m u c o i d e d e S . a u r e u s e s t á

f u n d a m e n t a d a e n l a v i r u l e n c i a q u e h a s i d o b i e n e s t a b l e c i d a . L o s p r i m e r o s

(35)
(36)
(37)
(38)
(39)
(40)

p r e s e n t a n u n a p r o p i e d a d d e n o m i n a d a r e s t r i c c i ó n C M H : s ó l o p u e d e n

d e t e c t a r u n a n t í g e n o s i é s t e v i e n e p r e s e n t a d o p o r u n a m o l é c u l a d e l

c o m p l e j o m a y o r d e h i s t o c o m p a t i b i l i d a d ( C M H ) d e l m i s m o i n d i v i d u o ( A b b a s

& L i c h t m a n , C h . 4 A n t i g e n r e c o g n i t i o n i n t h e a d a p t i v e i n m u n e s y s t e m » .

B a s i c I m m u n o l o g y . F u n c t i o n s a n d d i s o r d e r s o f t h e i m m u n e s y s t e m , 2 0 0 9 ) .

L a s t o x i n a s s u p e r a n t i g é n i c a s p u e d e n e v o c a r u n a r e s p u e s t a i n m u n e

m e d i a d a p o r c é l u l a s T q u e e s h a s t a c u a t r o v e c e s m a y o r e n m a g n i t u d q u e

l a i n d u c i d a p o r l o s a n t í g e n o s o r d i n a r i o s , d a n d o l u g a r a u n a r e a c c i ó n

i n f l a m a t o r i a m a s i v a q u e e s l e t a l .

E l t r a b a j o p i o n e r o d e M a r r a c k y o t r o s a f i n a l e s d e l o s a ñ o s 1 9 8 0 y

1 9 9 0 d e m o s t r ó q u e e l s u p e r a n t í g e n o l o g r a e s t o u n i e n d o d i r e c t a m e n t e ,

c o m o p r o t e í n a i n t a c t a , a l a m o l é c u l a p r i n c i p a l d e h i s t o c o m p a t i b i l i d a d c l a s e

I I ( M H C - I I ) e n l a c é l u l a p r e s e n t a d o r a d e a n t í g e n o y e l r e c e p t o r d e c é l u l a s T

( T C R ) e n l a c é l u l a T , s i n n e c e s i d a d d e p r o c e s a m i e n t o d e a n t í g e n o s y e l u d i r

l a r e s t r i c c i ó n t í p i c a d e l o s a n t í g e n o s c o n v e n c i o n a l e s ( K a e m p f e r , e t a l 2 0 1 3 ) .

F i g u r a 5 . E s t r u c t u r a c l á s i c a d e u n a n t í g e n o e s t a f i l o c ó c i c o .

F u e n t e : K a e m p f e r , e t a l 2 0 1 3.

L a F i g u r a 5 s e m u e s t r a e l p l i e g u e d e p o l i p é p t i d o s p a r a S E B. L a s

h é l i c e s e s t á n c o l o r e a d a s e n r o j o , l o s h i l o s e n v e r d e y l o s b u c l e s e n a m a r i l l o .

E l g i r o h e l i c o i d a l 31 0 e n e l d o m i n i o C - t e r m i n a l s e e t i q u e t a c o m o h é l i c e α 1 y

s e d i b u j a m á s d e l g a d a m e n t e q u e l a s h é l i c e s a n o r m a l e s . L o s t e r m i n a l e s N

y C e s t á n m a r c a d o s . E l p u e n t e d i s u l f u r o s e m u e s t r a e n r e p r e s e n t a c i ó n d e

p a l a n c a y p a l o . L o s s i t i o s d e u n i ó n a M H C y T c R s e i n d i c a n m e d i a n t e

(41)
(42)

M H C . E n s u l u g a r , i n d u c e h o m o d i m e r i z a c i ó n d e S E D y , p o r c o n s i g u i e n t e ,

c a d a m o n ó m e r o e s c a p a z d e u n i r s e a m o l é c u l a s d e M H C c l a s e I I d e l a

m i s m a m a n e r a q u e S E B . S i n e m b a r g o , b a j o c i e r t a s c o n d i c i o n e s S E D p u e d e

a c t u a r c o m o u n m o n ó m e r o y u n i r s e a m o l é c u l a s d e M H C d e c l a s e I I e n u n

m o d o s i m i l a r a l S E A ( P a p a g e o r g i o u & T r a n t e r , 1 9 9 8 ) .

F i g u r a 6 . I m a g e n e s q u e m á t i c a d e u n m o d e l o d e d o s m o l é c u l a s M H C d e c l a s e I I

r e t i c u l a d a s p o r e l h o m o d í m e r o d e p e n d i e n t e d e S E D Z n 2 +

F u e n t e : ( K r a u l i s , 1 9 9 1 ) y R a s t e r 3 D ( M e r r i t t , E . ; M u r p h y , M . , 1 9 9 4 ).

E n t e r o t o x i n a S E E : L a q u i n t a c l á s i c a e n t e r o t o x i n a , s e h a i n f o r m a d o

p o c o e n l o s a l i m e n t o s y e n l o s a l i m e n t o s p r o v e n i e n t e s d e a n i m a l e s , y s u

p a r t i c i p a c i ó n e n I n t o x i c a c i ó n a l i m e n t a r i a e s t a f i l o c ó c i c a ( I A E ) s ó l o s e h a

d e m o s t r a d o e n r a r a s o c a s i o n e s . S i n e m b a r g o , s e i s b r o t e s d e I A E , q u e

o c u r r i e r o n e n F r a n c i a a f i n a l e s d e 2 0 0 9 , f u e r o n c a u s a d o s p o r S E E p r e s e n t e

e n q u e s o b l a n d o h e c h o d e l e c h e n o p a s t e u r i z a d a .

E s t a e n t e r o t o x i n a t a m b i é n s e h a a s o c i a d o c o n b r o t e s e n l o s E E . U U .

y e l R e i n o U n i d o ( A r g u d í n , M e n d o z a , & R o d i c i o , 2 0 1 0 ) . A l i g u a l q u e S E A ,

S E D y S E E s o n t o d o s d e p e n d i e n t e s d e Z n2 + p a r a l a a l t a a f i n i d a d d e u n i ó n a m o l é c u l a s M H C c l a s e I I ( S u n d s t r ö m , A b r a h m s é n , & A n t o n s s o n , 1 9 9 6 ) .

S e g ú n W i e n e k e , R o b e r t s , & G i l b e r t , ( 1 9 9 3 ) l a p r o d u c c i ó n d e S E E p o r c e p a s

d e S . a u r e u s e s r a r a y s ó l o t r e s b r o t e s f u e r o n c a u s a d o s p o r e s t a

e n t e r o t o x i n a e n R e i n o U n i d o , p o r o t r a p a r t e , e l e s t u d i o e p i d e m i o l ó g i c o

(43)
(44)

c u e r p o ( e s t i m a d a s e n 1 01 1- 1 01 3 c é l u l a s e n u n h u m a n o a d u l t o ) a u n q u e a l g u n o s a u t o r e s s e ñ a l a n q u e o c u p a n c e r c a d e l 2 0 % ( A c t o r , 2 0 0 7 ) . L o s

l i n f o c i t o s t i e n e n d o s c l a s e s d e r e c e p t o r e s B y T q u e s o n s i m i l a r e s

e s t r u c t u r a l m e n t e p e r o m u y d i f e r e n t e s e n f u n c i o n a l i d a d .

L o s r e c e p t o r e s e s p e c í f i c o s d e a n t í g e n o s e n l o s l i n f o c i t o s - T ( T C R p o r s u s

s ig la s e n in g lé s ) e s t á n c o m p u e s t a s p o r α y β g lu c o p r o t e í n a s r e c e p t o r a s y

s o n q u i e n e s r e c o n o c e n e l a n t í g e n o .

F i g u r a 7 . P r o p o r c i ó n d e t t i p o s d e r e c e p t o r e s e n l i n f o c i t o s T .

F u e n t e : i n t e r n e t

E n l a F i g u r a 7 s e m u e s t r a q u e l o s l i n f o c i t o s T t i e n e n m á s d e l 9 0 % d e

r e c e p t o r e s t ip o α - β y u n a p o b la c ió n m in o r it a r ia γ - δ q u e e s u n r e c e p t o r

a l t e r n a t i v o m e n o s e v o l u c i o n a d o , a m b o s t i p o s c e l u l a r e s e x p r e s a n l a

p r o t e í n a C D 3 + ( d e l i n g l é s c l u s t e r o f d i f f e r e n t i a t i o n ) c u y a f u n c i ó n b i o l ó g i c a

e n l a c é l u l a e s i n t e r v e n i r e n l a t r a n s d u c c i ó n d e s e ñ a l e s , e x p r e s i ó n d e l T C R

e n l a s u p e r f i c i e d e l a c é l u l a y a s o c i a c i ó n a e s t e ú l t i m o r e c e p t o r . L o s

r e c e p t o r e s α - β p u e d e n s e r c o o p e r a d o r e s o c it o t ó x ic o s ( A b b a s & F la v e ll,

1 9 9 6 ) .

E l r e c e p t o r p a r a a n t í g e n o d e l l i n f o c i t o T ( T C R ) , t i e n e u n a s i m i l i t u d

e s t r u c t u r a l i g u a l a l a i n m u n o g l o b u l i n a c o m o s e p u e d e o b s e r v a r e n l a ¡ E r r o r !

o s e e n c u e n t r a e l o r i g e n d e l a r e f e r e n c i a .b ( y a q u e p e r t e n e c e n a l a

m is m a f a m ilia ) d o n d e s e p u e d e a p r e c ia r la s c a d e n a s α - β , d o s p a r e ja s d e

p r o t e í n a s C D 3 α - δ - ε q u e a d if e r e n c ia d e T C R n o t ie n e n c a d e n a s d e

(45)

i n t r o p l a s m á t i c a ; e s e l e n c a r g a d o d e r e c o n o c e r a l a n t í g e n o y l e i n d i c a a l a

c é l u l a c o m o t i e n e q u e a c t i v a r s e a t r a v é s d e l o s d o m i n i o s i n t r a c e l u l a r e s C D 3

y d e la c a d e n a ζ ζ ( I T A M e n la f ig u r a ) ( A b b a s & F la v e ll, 1 9 9 6 ) .

F i g u r a 8. a ) I n m u n o g l o b u l i n a y s u s p a r t e s y s u s i m i l i t u d c o n e l b ) R e c e p t o r p a r a

a n t í g e n o d e l l i n f o c i t o T j u n t o c o n p r o t e í n a s d e l c o m p l e j o C D 3 .

L o s o r g a n i s m o s q u e c a u s a n e l T S S ( S í n d r o m e d e S h o c k T ó x i c o )

p r o d u c e n u n a t o x i n a q u e a c t i v a l o s l i n f o c i t o s T ( T C e l l e n i n g l é s ) d e l

h u é s p e d e n u n a m a n e r a a n o r m a l . E s t a t o x i n a t i e n e p r o p i e d a d e s

s u p e r a n t i g é n i c a s , p u e d e u n i r s e a l a s m o l é c u l a s M H C t i p o I I y a l a s u p e r f i c i e

l a t e r a l d e l r e c e p t o r d e l i n f o c i t o s T s i n p r o c e s a m i e n t o p o r c é l u l a s

p r e s e n t a d o r a s d e a n t í g e n o .

A s í a c t i v a u n a p r o p o r c i ó n d e l i n f o c i t o s T C D 4 + m u c h o m a y o r q u e u n

a n t í g e n o c o n v e n c i o n a l ( 2 - 2 0 % d e l o s l i n f o c i t o s T ) , i n d u c i e n d o u n a

e x p a n s i ó n p o l i c l o n a l y l a p r o d u c c i ó n d e u n a g r a n c a n t i d a d d e c i t o c i n a s . 2 E l

n i v e l a l t o d e e f e c t o r e s i n f l a m a t o r i o s t a l e s c o m o I L - 1 , I L - 2 , y T N F -α a u m e n t a

l a p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r . L a d i s m i n u c i ó n d e v o l u m e n e h i p o t e n s i ó n

p r o m u e v e n e l f a l l o o r g á n i c o m ú l t i p l e y o t r o s s í n t o m a s d e l a c o n d i c i ó n .

(46)

F i g u r a 9. V i s t a c l á s i c a d e l a r e l a c i ó n d e l a n t í g e n o y e l r e c e p t o r d e l

s u p e r a n t í g e n o .

E n l a F i g u r a 9 s e o b s e r v a ( a ) E s q u e m a d e a c o p l a m i e n t o d e l r e c e p t o r

m e d i a n t e a n t í g e n o s c o n v e n c i o n a l e s . E l a n t í g e n o p r o c e s a d o ( A g , p u n t o

r o j o ) s e p r e s e n t a p o r l a m o l é c u l a p r i n c i p a l d e h i s t o c o m p a t i b i l i d a d c l a s e I I

( M H C - I I ) e x p r e s a d a e n l a c é l u l a p r e s e n t a d o r a d e a n t í g e n o ( A P C ) a l

r e c e p t o r d e c é l u l a s T ( T C R ) e x p r e s a d o e n l a c é l u l a T ( T h ) a u x i l i a r .

S o la m e n t e la s c a d e n a s α y β d e l T C R s e m u e s t r a n p o r s im p lic id a d ; V β

r e p r e s e n t a la r e g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a β . S e p r o p o r c io n a c o n t r o l

p o s i t i v o a t r a v é s d e l a s e ñ a l i z a c i ó n d e l r e c e p t o r c o e s t i m u l a d o r B 7 / C D 2 8 y

c o n t r o l n e g a t i v o a t r a v é s d e r e c e p t o r e s c o e s t i m u l a d o r e s B 7 / C T L A - 4 ; C D 2 8

y C T L A - 4 f u n c i o n a n c o m o h o m o d í m e r o s . ( b ) E s q u e m a d e l a c l á s i c a

r e l a c i ó n d e l r e c e p t o r p o r s u p e r a n t í g e n o s . E l s u p e r a n t í g e n o i n t a c t o ( s A g ) s e

p r e s e n t a s i n p r o c e s a m i e n t o f u e r a d e l a c é l u l a a m o l é c u l a M H C d e c l a s e I I

y T C R , a c o p la n d o s u c a d e n a V β . T o m a d o d e K a e m p f e r , e t a l ( 2 0 1 3 ) .

2 . 1 4 . R e a c c i ó n e n c a d e n a d e l a p o l i m e r a s a ( P C R )

L a s t é c n i c a s d e b i o l o g í a m o l e c u l a r e s t á n f u n d a m e n t a d a s e n l a

d e t e c c i ó n y m a n i p u l a c i ó n d e u n g r a n n ú m e r o d e m o l é c u l a s . E l d e s a r r o l l o

(47)
(48)
(49)

M u l t i p l e x P C R

E s u n a t é c n i c a q u e s e a p l i c a e n b i o l o g í a m o l e c u l a r u t i l i z a d a p a r a l a

a m p l i f i c a c i ó n d e m ú l t i p l e s o b j e t i v o s e n u n ú n i c o e x p e r i m e n t o d e P C R . E n

u n e n s a y o d e m u l t i p l e x a c i ó n , m á s d e u n a s e c u e n c i a d i a n a p u e d e s e r

a m p l i f i c a d o m e d i a n t e e l u s o d e m ú l t i p l e s p a r e s d e c e b a d o r e s e n u n a

m e z c l a d e r e a c c i ó n . C o m o u n a e x t e n s i ó n p a r a e l u s o p r á c t i c o d e P C R , e s t a

t é c n i c a t i e n e e l p o t e n c i a l d e p r o d u c i r u n a h o r r o c o n s i d e r a b l e e n t i e m p o y

e s f u e r z o e n e l l a b o r a t o r i o s i n c o m p r o m e t e r l a u t i l i d a d d e l e x p e r i m e n t o .

T i p o s d e P C R m ú l t i p l e

R e a c c i ó n S i n g l e T e m p l a t e P C R . E s t a t é c n i c a u t i l i z a u n a ú n i c a

p l a n t i l l a q u e p u e d e s e r u n A D N g e n ó m i c o , j u n t o c o n v a r i o s p a r e s d e

c e b a d o r e s d i r e c t o e i n v e r s o p a r a a m p l i f i c a r r e g i o n e s e s p e c í f i c a s

d e n t r o d e u n a p l a n t i l l a .

R e a c c i ó n M ú l t i p l e T e m p l a t e P C R . S e u t i l i z a m ú l t i p l e s p l a n t i l l a s y

v a r i o s c o n j u n t o s d e c e b a d o r e s e n e l m i s m o t u b o d e r e a c c i ó n . L a

p r e s e n c i a d e m ú l t i p l e s c e b a d o r e s p u e d e d a r l u g a r a h i b r i d a c i ó n

c r u z a d a e n t r e s í y c o n l a p o s i b i l i d a d d e e r r o r e s d e c e b a d o c o n o t r a s

p l a n t i l l a s .

F i g u r a 1 0. M u l t i p l e x P C R

(50)

P a r á m e t r o s d e d i s e ñ o d e c e b a d o r e s p a r a P C R m u l t i p l e x

E s u n d i s e ñ o d e c o n j u n t o s d e c e b a d o r e s e s p e c í f i c o s e s e s e n c i a l p a r a

u n a r e a c c i ó n m u l t i p l e x e x i t o s a . L a s i m p o r t a n t e s c o n s i d e r a c i o n e s d e d i s e ñ o

d e c e b a d o r e s d e s c r i t o s a c o n t i n u a c i ó n s o n u n a c l a v e p a r a l a a m p l i f i c a c i ó n

e s p e c í f i c a c o n a l t o r e n d i m i e n t o .

1 . L o n g i t u d . E n s a y o s M u l t i p l e x P C R i m p l i c a n e l d i s e ñ o d e u n g r a n n ú m e r o

d e c e b a d o r e s , p o r l o t a n t o , s e r e q u i e r e q u e e l c e b a d o r d i s e ñ a d o d e b e

s e r d e l o n g i t u d a p r o p i a d a . P o r l o g e n e r a l , s e u t i l i z a n c e b a d o r e s d e c o r t a

l o n g i t u d , e n e l i n t e r v a l o d e 1 8 - 2 2 b a s e s .

2 . T e m p e r a t u r a d e f u s i ó n. C e b a d o r e s c o n T m s i m i l a r e s , p r e f e r i b l e m e n t e

e n t r e 5 5 ° C - 6 0 ° C s e u t i l i z a n p a r a l a s s e c u e n c i a s c o n a l t o c o n t e n i d o d e

G C , s e r e c o m i e n d a n c e b a d o r e s c o n u n a T m m á s a l t a ( p r e f e r i b l e m e n t e

7 5 ° C - 8 0 ° C ) .

3 . E s p e c i f i c i d a d . E s i m p o r t a n t e t e n e r e n c u e n t a l a e s p e c i f i c i d a d d e l o s

c e b a d o r e s d i s e ñ a d o s p a r a l a s s e c u e n c i a s d i a n a , m i e n t r a s s e p r e p a r a u n

e n s a y o m ú l t i p l e , s o b r e t o d o p o r q u e e x i s t e c o m p e t e n c i a c u a n d o m ú l t i p l e s

s e c u e n c i a s d i a n a e s t á n e n u n s o l o r e c i p i e n t e d e r e a c c i ó n .

V e n t a j a s d e M u l t i p l e x P C R

C o n t r o l e s i n t e r n o s . L o s p r o b l e m a s p o t e n c i a l e s e n u n s i m p l e P C R

i n c l u y e n f a l s o s n e g a t i v o s d e b i d o a l a f a l t a d e r e a c c i ó n o f a l s o s

p o s i t i v o s d e b i d o a l a c o n t a m i n a c i ó n . L o s f a l s o s n e g a t i v o s a m e n u d o

s e r e v e l a n e n e n s a y o s m u l t i p l e x , p o r q u e c a d a u n o d e a m p l i f i c a c i ó n

p r o p o r c i o n a u n c o n t r o l i n t e r n o p a r a l o s o t r o s f r a g m e n t o s

a m p l i f i c a d o s .

E f i c i e n c i a . E l g a s t o d e l o s r e a c t i v o s y e l t i e m p o d e p r e p a r a c i ó n e s

m e n o r e n P C R m u l t i p l e x q u e e n l o s s i s t e m a s d o n d e s e u t i l i z a n v a r i o s

t u b o s d e P C R U N I P L E X . U n a r e a c c i ó n m ú l t i p l e e s i d e a l p a r a l a

Figure

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Referencias

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