PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTADA DE CIENCIAS
PROGRAMA DE POSGRADOS EN CIENCIAS BIOLOGICAS
DETERMINACION DE LA VIA
DE ACCESO A MEDULA ESPINAL UTILIZADA POR EL VIRUS
DE LA RABIA INOCULADO EN LA ALMOHADILLA PLANTAR DE RATON ADULTO
MYRIAM LUCIA VELANDIA ROMERO
DIRECTOR
MARLEN MARTINEZ GUTIERREZ M.Sc CODIRECTOR
JAIME EDUARDO CASTELLANOS PARRA M.Sc, Ph.D ASESOR
JAIRO ALONSO TOVAR FRANCO M.Sc, Ph.D
Bogotá, D.C., Colombia.
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra personas algunas, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
Artículo 23 de la Resolución No 13 de julio de 1946
DETERMINACION DE LA VIA
DE ACCESO A MEDULA ESPINAL UTILIZADA POR EL VIRUS
DE LA RABIA INOCULADO EN LA ALMOHADILLA PLANTAR DE RATON ADULTO
MYRIAM LUCIA VELANDIA ROMERO
APROBADO
__________________________ ___________________________
Marlén Martínez Gutiérrez M.Sc Jaime E. Castellanos M.Sc Ph.D
Director Co- Director
____________________ ____________________ __________________
Alejandro Múnera Orlando Torres H. Orlando Torres Universidad Nacional Instituto Nacional de Salud Universidad Javeriana
DETERMINACION DE LA VIA
DE ACCESO A MEDULA ESPINAL UTILIZADA POR EL VIRUS
DE LA RABIA INOCULADO EN LA ALMOHADILLA PLANTAR DE RATON ADULTO
MYRIAM LUCIA VELANDIA ROMERO
APROBADO
__________________________ ___________________________
Marlén Martínez Gutiérrez M.Sc Jaime E. Castellanos M.Sc Ph.D
Director Co- Director
Tabla de contenido
2. Resumen 8
3. Introducción 10
4. Objetivos 11
4.1 Objetivo General 11
4.2 Objetivos Específicos 11
5. Marco Conceptual 12
5.1 Nervio Ciático, Nervio Tibial, Ganglios Espinales 12
5.1.1 Nervio Ciático 12
5.1.2 Nervio Tibial 13
5.1.3 Ganglios Espinales 14
5.1.3.1 Clasificación de subpoblaciones neuronales de los ganglios espinales 15
5.1.3.1.1 Clasificación Morfológica 15
5.1.3.1.2 Clasificación Fisiológica 15
5.1.3.1.3 Clasificación Bioquímica 16
5.1.4 Médula Espinal 17
5.2 Trazado de tejido nervioso 17
5.2.1 Fluoro Gold 18
5.2.2 Los virus como neurotrazadores 18
5.3 Virus de la Rabia 19
5.3.1 La rabia: un problema de salud pública 20
5.3.2 Estructura viral 21
5.3.3 Ciclo viral 22
5.3.4 Transporte del virus de la rabia 23
5.3.5 Patogenia de la infección por virus de la rabia 25 5.3.5.1 Estudios de interacción de virus de la rabia y neuronas sensoriales
y motoras 26
5.3.5.1.1 Modelos de infección por virus de la rabia in vitro 26
5.3.5.1.2 Modelos de infección por virus de la rabia in vivo 27
6 Metodología 30
6.1 Estrategia Experimental 30
6.1.1 Determinación de la ubicación neuroanatómica de las neuronas sensoriales y motoras que inervan la almohadilla plantar
31
6.1.1.1 Cirugía 31
6.1.1.2 Aplicación del neurotrazador Fluoro Gold (FG) 31
6.1.1.3 Procesamiento de los tejidos 32
6.1.2 Determinación del tiempo de aparición de antígeno viral para virus de la rabia en neuronas sensoriales y motoras infectadas
32
6.1.2.1 Infección de los animales 32
6.1.2.2 Procesamiento de los tejidos 33
6.1.2.3 Inmunohistoquímica 34
6.1.3 Determinación del porcentaje de neuronas sensoriales infectadas por
Virus de la rabia 34
6.1.4 Determinación del perfil morfométrico de las neuronas sensoriales infectadas
por virus de la rabia 35
6.1.5 Análisis estadístico 35
7. Consideraciones éticas 36
8. Resultados 37
8.1 Determinación de la ubicación neuroanatómica de las neuronas sensoriales y motoras que inervan la almohadilla plantar
37
8.1.1 Región sacra: Vértebra sacra 1 40
8.1.2 Región lumbar: Vértebras lumbares L6- L1 40
8.1.3 Región Toráxica: Vértebras Toráxicas T13- T12 44
8.2 Determinación del tiempo de aparición de antígeno viral para virus de la rabia en neuronas sensoriales y motoras infectadas
44
8.3 Determinación del porcentaje de neuronas sensoriales infectadas por
virus de la rabia 49 8.4 Determinación del perfil morfométrico de las neuronas sensoriales infectadas
por virus de la rabia 55
9. Discusión 63
9.1 Aspecto Neuro- Anatómico 63
9.2 Aspecto Neuro- Virológico 65
9.3 Aspecto Virológico 73
10. Conclusiones 76
11. Recomendaciones 77
12. Bibliografía 78
Anexos
Contenido de figuras
Figura 1: Estructura del Virus de la rabia 21
Figura 2: Ciclo Viral 24
Figura 3: Resumen metodología 38
Figura 4: Sección transversal de columna vertebral y GE 39
Figura 5: Cortes transversales de la región Sacro- Lumbar de ratón adulto 42 Figura 6: Fotomicrografías de neuronas sensoriales de GE y ME marcadas con FG 43 Figura 7: Marcaje para virus de la rabia en neuronas sensoriales y motoras de
la región lumbar L2 a 120 h p.i. 46
Figura 8: Marcaje para virus de la rabia en neuronas sensoriales y motoras de las regiones L4 y S1 a 120 h p.i.
47
Figura 9: Fotomicrografía de ME de la región lumbar 2 a 96h p.i.
48
Figura 10: Porcentaje de infección obtenidos a 72h, 96 y 120 h p.i. de cada nivel vertebral (ANOVA)
50
Figura 11: Porcentaje de infección obtenido en GE ipsilaterales y contralaterales Comparando todos los niveles vertebrales a 96 y 120h p.i. (ANOVA)
51
Figura 12: Porcentaje de infección en ganglios ipsi y contralaterales a 96 y 120h p.i
(t- Student) 52
Figura 13: Esquema de distribución de antígeno viral para VR en médula espinal
(ME) y ganglios espinales GE 54
Figura 14: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales de GE presentes en cada nivel vertebral analizado.
55
Figura 15: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas en GE ipsi y contralaterales S1, L6 y L5
56
Figura 16: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas en GE ipsi y contralaterales L4, L3, L2 y L1 57 Figura 17: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas en los GE ipsi y contralaterales S1, L6 y L5 a 96 y 120h
58
Figura 18: Histograma de distribución de frecuencias de los diámetros de neuronas sensoriales infectadas en los GE ipsi y contralaterales L4, L3, L2 y L1 a 96 y 120h 59 Figura 19: Histograma de distribución de frecuencias de GE ipsilaterales a 96 y 120h 60
Figura 20: Histograma de distribución de frecuencias de GE contralaterales
a 96 y 120h 61
Figura 21: Modelo de transporte del virus de la rabia 75
Contenido de tablas
Tabla 1: Promedios de los diámetros de las neuronas infectadas a 96 o 120 h p.i.
de GE ipsi y contralaterales de cada nivel vertebral. 63 Tabla 2: Promedios de los diámetros de las neuronas infectadas de GE
ipsi y contralaterales de cada nivel vertebral a 96 o 120 h p.i.
63
A mi familia A Marlén.
Agradecimientos.
Agradezco infinitamente a
La Dra. Marlén Martínez por apoyarme, guiarme y enseñarme, además de confiar en mí sobre todo y a pesar de mis errores, temores y terquedad.
Al Dr. Jaime Castellanos, Por abrirme sin temor las puertas de los laboratorios de Neurociencias del Instituto Nacional de Salud y del Instituto de Virología de la Universidad El Bosque.
Gracias Jefe!
A José Hilarion, Histo- tecnólogo del laboratorio de patología del Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses, por permitirme ingresar y trabajar durante casi un año en su laboratorio.
A Rosalía, Nadia, Verónica, Efraín, Samanda y demás compañeros de ahora, de siempre, gracias por todo!
2. RESUMEN
Mediante modelos animales in vitro e in vivo se ha demostrado el marcado neurotropismo del virus de la rabia (VR), tropismo explicado parcialmente por la presencia de algunas moléculas de membrana de las células
susceptibles. Estas moléculas podrían actuar como posibles receptores para el virus; Sin embargo algunos eventos neuropatogénicos durante la infección aún no son conocidos ó no están bien entendidos.
Por ejemplo, no existe una clara evidencia que defina si existe una vía preferencial de captura y transporte que sea utilizada por el VR para acceder al SN. Algunos trabajos sobre el tema han demostrado que de acuerdo al sitio de inoculación y la técnica empleada es posible detectar antígeno viral en diferentes tiempos, tanto en neuronas motoras de médula espinal (ME) y/o en núcleos motores del encéfalo, como en neuronas sensoriales de ganglios espinales (GE) y núcleos sensitivos del encéfalo; por lo tanto estos resultados controversiales fueron la razón principal para realizar el presente trabajo: definir si existe una vía preferencial de captura y transporte del VR hasta SN.
Para abordar esta pregunta, postulamos un modelo animal de infección por VR en el cual se evaluó por inmunohistoquímica, si existe alguna preferencia por parte del virus hacia la vía sensorial o la vía motora para ser capturado y transportado hasta la ME y posteriormente al encéfalo, además utilizando diferentes tiempos post- infección, se describió la cinética de infección en las neuronas sensoriales y motoras de la región sacro- lumbar de ratón adulto.
Los resultados obtenidos demostraron que después de inocular VR en la almohadilla plantar, el virus fue capturado preferencialmente por las terminaciones sensoriales de la zona de inoculación, involucrando específicamente una subpoblación neuronal definida morfométricamente.
Esta susceptibilidad diferencial aumentó con el paso del tiempo post- inoculación (p.i.), mientras que la detección de antígeno viral en neuronas motoras de ME fue baja y confinada únicamente a las regiones lumbares L2 y L1. Por otra parte debido a la naturaleza altamente neurotrópica del VR, confirmamos su aplicación como un excelente neurotrazador.
Por lo tanto nuestros resultados, no solo aporta información neuroanatómica de tipo sensorial y motora de la almohadilla plantar de ratón adulto, se presenta por primera vez, el paso transináptico del virus hacia el lado contralateral al sitio de la infección tanto en ME como en GE, lo cual sugiere la utilización por parte del virus, de vías complejas de conectividad entre neuronas sensoriales y motoras de ambos lados de la ME y los GE, fenómeno que aumenta la capacidad de dispersión del VR en el SN.
3. INTRODUCCION
La patogenia del VR en el SN central y periférico, es debida al ingreso y replicación viral en los somas neuronales. Algunos modelos tanto in vitro como in vivo, han determinado que el marcado neurotropismo del virus esta
determinado por la presencia de algunas moléculas de membrana que pueden actuar como receptores para el virus. Tanto las neuronas sensoriales de los GE y las neuronas motoras de ME expresan en su membrana las 3 moléculas receptoras propuestas para el VR (RNAch, NCAM y p75NTR), sin embargo actualmente no hay claridad de la participación de cada una de ellas o su posible interacción en los diferentes procesos infecciosos, además no se conoce si por sí solas, determinan de algún modo la preferencia de captura y transporte del VR desde la periferia hasta la ME.
Por lo tanto, presentamos un modelo animal de infección por VR con el cual se evaluó, por inmunohistoquímica, la participación de las neuronas sensoriales y motoras de la región sacro- lumbar de ratón adulto, en la captura y transporte del virus hasta ME y posteriormente a encéfalo, en diferentes tiempos p.i. Los resultados obtenidos demostraron que existe una marcada preferencia por parte del virus hacia la vía sensorial y en esto proceso involucró en particular una subpoblación neuronal definida morfométricamente. Esta susceptibilidad diferencial se observó aumentada con el paso del tiempo post- inoculación (p.i.), mientras que la detección de antígeno viral en neuronas motoras de ME fue baja y confinada a las regiones lumbares L2 y L1. Por otro lado, confirmamos que el VR debido a su naturaleza altamente neurotrópica es un excelente neurotrazador lo cual nos permitió aportar información neuroanatómica del tipo de innervación presente en la almohadilla plantar de ratón adulto, si no que además reportamos por primera vez el paso transináptico del VR hacia el lado contralateral al sitio de la infección tanto en ME como en GE, lo cual demuestra la versatilidad por parte del virus para utilizar vías complejas de conectividad entre neuronas sensoriales y motoras de ambos lados de la ME.
4. OBJETIVOS PROPUESTOS
4.1 OBJETIVO GENERAL:
Determinar la vía de acceso a médula espinal utilizada por el virus de la rabia inoculado en la almohadilla plantar de ratón adulto.
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
4.2.1. Determinar la ubicación neuroanatómica de las neuronas sensoriales y motoras que participan en la inervación de la almohadilla plantar de ratón adulto.
4.2.2 Determinar el tiempo de aparición de antígeno viral en neuronas sensoriales y motoras infectadas con virus de la rabia.
4.2.3. Obtener el porcentaje de neuronas sensoriales infectadas por virus de la rabia.
4.2.4 Definir el perfil morfométrico de las neuronas sensoriales infectadas por virus de la rabia.
5. MARCO CONCEPTUAL
El VR puede utilizar las vías nerviosas (sensorial o motora) para llegar el SN luego de ser inoculado en la periferia. Las neuronas involucradas en la captura y transporte del virus poseen características morfológicas, fisiológicas y funcionales específicas de acuerdo a la función y tejido blanco que inervan, por lo tanto, su ubicación en GE y ME y su participación en la promoción de la infección en el SN fueron el objeto principal de estudio en el presente trabajo. Para abordar la problemática de la neuro- patogenia por el VR fue necesario hacer una revisión de los aspectos neuroanatómicos, neurobiológicos y finalmente virológicos, que presento a continuación.
5.1 NERVIO CIATICO, NERVIO TIBIAL Y GANGLIOS ESPINALES
La almohadilla plantar de las extremidades posteriores (zona de inoculación de VR utilizada en el presente estudio), de la mayoría de vertebrados esta constituida por los músculos abductor y flexor del quinto dedo, flexor plantar corto, interóseos plantares, aductor del primer dedo, músculos lubrícales de los dedos II- V, tendón del músculo aductor del primer dedo, flexor corto del primer dedo, abductor del primer dedo. Esta área está inervada principalmente por el nervio plantar medio y lateral, ramas principales del nervio tibial que a su vez proviene del nervio ciático (Willians, 2001).
5.1.1 NERVIO CIATICO
El nervio ciático (NC) es el nervio de mayor diámetro y longitud, en todo el organismo de todos los mamíferos, es continuación de la división superior del plexo sacro. El nervio sale de la pelvis por el agujero ciático mayor, debajo del músculo piramidal de la pelvis y desciende por el trocánter mayor del fémur y la tuberosidad isquiática, a lo largo de la parte posterior del muslo, hasta un tercio inferior donde se divide en dos grandes ramas denominadas nervio tibial y peroneo común. En la parte superior de su curso se sitúa por debajo del glúteo mayor y reposa sobre la superficie posterior
del isquion; a continuación cruza el obturador interno y los gemelos y pasa sobre el cuadrado femoral que lo separa del obturador externo y de la articulación de la cadera. Por su lado interno acompaña al nervio cutáneo posterior del muslo y a la arteria glútea inferior. Las ramas de innervación muscular del nervio ciático se distribuyen al bíceps femoral, al semi- tendinoso, al semi- membranoso y a la porción isquiática del aductor mayor (Willians, 2001).
Mediante las técnicas de inmunohistoquímica y de degeneración anterógrada, se ha descrito la distribución topográfica de las ramas lumbares 6, 5 y 4 (L6, L5, L4) que aportan al NC de rata, de esta forma se describió la distribución y el aporte de fibras provenientes de estas tres ramas lumbares. Sin embargo, los resultados sugieren que estas ramas no son las únicas que conforman este tronco nervioso en estos animales (Montoya et al, 2002). Por otro lado, mediante la técnica de trazado retrógrado con FluoroGold (FG), nuestro grupo describió que el NC de ratón esta conformado por fibras que provienen tanto de los ganglios L6, L5 y L4 como de regiones más caudales como la sacra 1 y zonas más cefálicas como lumbares 3, 2 y 1 y torácicas 13 y 12 (Velandia et al, 2002). Estos hallazgos confirman que este nervio es un plexo complejo que involucra en su origen espinal varios niveles vertebrales lo cual puede revelar la variedad y complejidad de información que transporta.
5.1.2 NERVIO TIBIAL
El nervio tibial en los mamíferos superiores (ciático poplíteo interno) es la mayor rama terminal del NC. Nace de los ramos de las divisiones ventrales de los nervios IV y V lumbares y II y III sacros en humanos. Desciende a lo largo de la cara posterior del muslo atravesando la fosa poplítea hasta el borde distal del poplíteo, donde pasa, junto con la arteria poplítea, por debajo del arco sóleo. En la parte superior del muslo está cubierto por los
músculos flexores de la rodilla y en la parte inferior de la fosa poplítea está cubierto por los márgenes del gastronemio para luego discurrir en línea recta hasta el maléolo interno y el tendón del calcáneo. Este nervio se divide en los nervios plantares interno y externo (Willians, 2001).
5.1.3 GANGLIOS ESPINALES
Los ganglios espinales (GE), sensoriales (GS) o de la raíz dorsal (GRD), están ubicados cerca de los espacios intervertebrales a cada lado de la médula y a lo largo de esta. Son agregados celulares los cuales se forman durante el desarrollo a partir de la migración de células de la cresta neural. Por ser neuronas seudo- unipolares, su única fibra se divide en dos ramas: una medial o central y otra lateral o periférica, Las ramas centrales se extienden hacia la ME haciendo sinapsis con neuronas ubicadas en el asta dorsal; las ramas periféricas se extienden y se unen con la raíz anterior proveniente de la médula, formando de este modo el nervio espinal (Dyck, 1993, Bustamante, 2001). Estos nervios espinales conformados por las ramas anteriores provenientes de la ME y posteriores provenientes de los GE se unen fuera de la columna vertebral, generando un nervio periférico que puede ser sensitivo o mixto (conformado por fibras motoras y sensitivas).
Las fibras de estos nervios inervan finalmente zonas del organismo como piel, músculo o vísceras.
La población neuronal presente en los GE fue descrita mediante la utilización de diversas técnicas histológicas, con las cuales se logró demostrar que estas neuronas son exclusivamente de tipo sensitivo, además se observó que existen entre ellas diferencias en tamaño, función y bioquímica. De este modo se logró clasificar las neuronas en poblaciones y subpoblaciones neuronales, esta clasificación se complementa a través de la identificación de moléculas marcadoras expresadas de forma diferencial entre las neuronas de tamaño pequeño (asociados a nocicepción), neuronas
intermedias y grandes (asociadas a mecanorecepción y propiocepción) (Martínez et al, 2000). Otros elementos celulares presentes en los GE son los fibroblastos y células glíales (células de Schwann y/o Células satélites). Los fibroblastos recubren el ganglio formando una cápsula de tejido conectivo y rodean a las células de la glía que encierran a cada neurona participando en funciones de soporte y barrera fisiológica para las neuronas (Bustamante, 2001).
5.1.3.1 CLASIFICACION DE SUBPOBLACIONES NEURONALES DE LOS GE.
Las neuronas del GE son diferentes morfológica, bioquímica y funcionalmente, por lo tanto es posible diferenciarlas en poblaciones y subpoblaciones neuronales, estas diferencias al parecer son determinadas durante el desarrollo del GE (Martínez et al, 2000).
5.1.3.1.1 CLASIFICACIÓN MORFOLÓGICA
El tamaño de las células neuronales permite dividirlas en dos grandes grupos: neuronas tipo A las cuales se observan grandes y claras, y tipo B las cuales son pequeñas y oscuras. La densidad de su citoplasma esta dado principalmente por la sustancia de Nissl (agregados de retículo endoplásmico rugoso), por lo tanto, las neuronas tipo A (claras) poseen la sustancia de Nissl distribuida heterogéneamente en el citoplasma, mientras que las neuronas tipo B (oscuras) lo presentan compacto (Rambourg et al, 1983). En algunas especies se ha podido determinar la presencia de subpoblaciones definidas por tamaños en neuronas grandes A, intermedias B y pequeñas C, sin embargo esta clasificación varia según la edad, la especie y las condiciones de obtención de las neuronas (in vitro ó in vivo).
Aunque es difícil determinar cual de los tipos neuronales son predominantes en los GE, la evidencia demuestra que las células de tamaño intermedio y grande son quienes ocupan buena parte del ganglio in vivo (Sommer et al, 1985).
5.1.3.1.2 CLASIFICACIÓN FISIOLÓGICA
Esta clasificación refiere principalmente a la función que cumplen las neuronas, es decir, al tipo de información que reciben y transportan al SNC.
El tipo de información puede ser nociceptiva, mecanoreceptiva o propioceptiva y de acuerdo a esto los tamaños y la velocidad de transmisión de las fibras varía, por lo tanto hay una relación importante entre la función, el tamaño de la neurona y el grosor de su fibra axónica. Por ejemplo las fibras delgadas tipo III y IV, asociadas a neuronas pequeñas amielínicas, transmiten principalmente información nociceptiva. La información mecánica se transporta principalmente por fibras tipo II y IV, mientras que la información propioceptiva es transmitida por fibras tipo I y II; estas modalidades sensoriales se relacionan con neuronas de tamaños intermedios y grandes (Harper y Lawson, 1985, Cameron et al, 1986).
5.1.3.1.3 CLASIFICACIÓN BIOQUÍMICA
La presencia de neuropéptidos, enzimas y algunos carbohidratos, ya sea sobre el tejido neural o las neuronas en cultivo, ha permitido clasificar y describir algunas de las subpoblaciones neuronales centrales o periféricas.
Algunos neuropéptidos pueden ser neurotransmisores, además, pueden actuar como mediadores de inflamación, estimulando algunas células del sistema inmune entre otros (Sommer et al, 1985).
Los neuropéptidos Sustancia P (SP, por sus siglas en inglés) y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP, por sus siglas en inglés), se distribuyen principalmente en la población de neuronas pequeñas presentes en los GE y se asocian al transporte de información sensorial nociceptiva (Snider, 1998). Por otro lado el neuropéptido Y (NPY, por sus siglas en inglés) y el péptido intestinal vasoactivo (VIP, por sus siglas en inglés) se encuentran en neuronas de tamaño intermedio y grande del GE, asociadas al transporte de información propioceptiva o mecanoreceptiva. Además, el
perfil de expresión de estos neuropéptidos esta asociado a la acción de los diferentes factores de crecimiento que son expresados en el tejido blanco y durante el desarrollo del GE determinan el fenotipo neuronal (Lawson et al, 1993)
5.1.4 MEDULA ESPINAL
La ME es la parte del SNC localizada en el interior del canal vertebral, se extiende desde la base del cráneo hasta la cuarta o quinta vértebra lumbar, es de de forma cilíndrica y su diámetro varia en algunas zonas. En ratón se divide en 7 segmentos cervicales, 13 dorsales o toráxicas, 6 lumbares y 5 sacros. Los cuerpos celulares de las neuronas se ubican a lo largo de la ME en la zona central de la misma, conocida como sustancia gris. Rodeando esta zona se encuentra la sustancia blanca conformada por los paquetes de las fibras que se proyectan desde los somas de la sustancia gris o descienden desde las neuronas del encéfalo. La sustancia gris medular contiene las neuronas de tipo sensitivo, las motoneuronas anteriores y las interneuronas. Las neuronas ubicadas en el asta dorsal conforman varios núcleos y en general estas células son contactadas por las fibras que provienen del GE. Las motoneuronas del asta ventral son neuronas grandes que emiten sus fibras a través de la raíz ventral hasta las fibras musculares esqueléticas, estas neuronas se clasifican en motoneuronas alfa y gamma.
Las primeras inervan las grandes fibras musculares esqueléticas, inervan hasta 3 fibras musculares por lo tanto, se conocen como unidad motora. Las motoneuronas gamma inervan fibras musculares de tamaño pequeño denominadas fibras intra- fusales. Las interneuronas están presentes en todas las áreas de la sustancia gris medular tanto en las astas dorsales como en el asta ventral, estas células son de tamaño pequeño fácilmente excitables, que pueden excitar a otras interneuronas o a las motoneuronas,
generando circuitos integrados en la médula (Guyton, 1989; Bustamante, 2001).
A pesar de que actualmente se cuenta con una vasta lista de estudios sobre estructura y función del SN, la determinación de conexiones y proyecciones de neuronas del sistema nervioso central (SNC) y/o del sistema nervioso periférico (SNP) es un campo poco explorado, debido a la complejidad de las mismas y las dificultades técnicas que se presentan. Actualmente para definir topográficamente la ubicación de algunos tractos nerviosos, se ha desarrollado la técnica de neurotrazado en la cual se utilizan moléculas orgánicas ó inorgánicas y algunos virus neurotrópicos.
5.2. TRAZADO DEL TEJIDO NERVIOSO
Las técnicas de trazado neuronal se han desarrollado para identificar, determinar y describir topográficamente vías neuroanatómicas de interés particular o general, cuando el procedimiento convencional de disección de los tejidos no es suficiente. Dentro del variado grupo de trazadores existen algunas moléculas complejas que emiten fluorescencia lo cual ofrece ventajas tanto en el procesamiento como en la observación de la muestra pues no se requiere realizar procedimientos adicionales a la misma. Aunque existen otras técnicas de descripción neuroanatómica, entre las cuales se hallan la técnica de degeneración anterógrada y/o retrógrada, hoy en día es muy frecuente usar trazadores fluorescentes para la identificación de rutas de primer orden en el SNC y SNP de ratas y otros mamíferos y que además puede ser aplicado a tejidos embrionarios y adultos vitales, fijados y/o postmortem (Vercelli et al, 2000, Wouterlood et al, 2002).
5.2.1 FLUORO GOLD
Dentro del grupo de trazadores fluorescentes de común aplicación, se encuentra el Fluorogold (FG, hydroxystilbamitide methanesulfato ) (Schmued, 1994). El FG se aplica y se incorpora en segmentos nerviosos normales y/o
lesionados, se acumula y transporta en vesículas usando el transporte axonal retrógrado. Una vez en el soma, la acumulación de vesículas fluorescentes da una apariencia granular en el citoplasma de las células marcadas (Vercelli et al, 2000, Kobbert et al, 2000). Es usado comúnmente in vivo para definición de destinos de inervación durante el desarrollo, (“fate mapping”) y en transplantes de células previamente marcadas para determinar el desplazamiento o el comportamiento de estas (Hernit- Grand y MacKilis, 1996, Onifet et al, 1993).
5.2.2 LOS VIRUS COMO NEUROTRAZADORES
Algunos virus selectivamente infectan células neuronales, por lo tanto son utilizados como neurotrazadores, (Vercelli et al, 2000). Comúnmente son utilizados el Virus de Pseudorabia (PrV) (Card, 1998), el Virus del Herpes Simplex (HSV- 1, HSV- 2) (Norgren et al, 1998) y el Virus de la rabia (VR) (Tang et al, 1999, Kelly y Strick, 2000). Estos virus son excelentes herramientas de neurotrazado, sin embargo su manejo debe ser cuidadoso puesto que su infección puede causar la muerte (como en el caso de la infección por el VR). El marcado tropismo de estos virus hacia el SN, es la característica principal con la cual se logran definir rutas específicas de conectividad en diferentes áreas del SN o entre la periferia y el SN. Los virus de PrV, HSV y VR pasan de una neurona a otra únicamente a través de las conexiones sinápticas, por lo cual solo infectan neuronas conectadas entre sí, de este modo se identifican conexiones neuronales específicas de primer, segundo y tercer y en muchos casos cuarto orden quienes conforman un tracto determinado en el SN (Kelly y Strick, 2000). El neurotropismo es un fenómeno que sugiere la existencia de moléculas de membrana en las neuronas, que favorecen la unión, ingreso y posteriormente el transporte del virus desde la periferia (sitio de inoculación) hacia los somas de las neuronas involucradas, facilitando el acceso del virus a la ME o al encéfalo.
Algunas consideraciones técnicas como la especie animal, el sitio de inoculación, la cantidad de virus inoculado, la cepa viral utilizada y el tiempo de infección, deben ser tenidas en cuenta a la hora de utilizar los virus neurotrópicos como trazadores. Por último es importante resaltar que esta técnica de trazado se pueden combinar con técnicas inmunoquímicas para detectar en los mismos tejidos, antígeno viral y marcadores específicos celulares, con lo cual se amplia y mejora la información neuroanatómica, bioquímica y fisiológica obtenida (Loewy, 1998, Vercelli et al, 2000).
El VR es un virus altamente neurotrópico, no lítico, que se mueve de manera tiempo dependiente a través del SN del animal infectado. Este virus ha sido ampliamente utilizado como trazador en el sistema oculomotor, motoneuronas del músculo hipogloso y bulbo - esponjoso (Ugolini, 1995, Tang, et al, 1999, Kelly y Strick, 2000, Granty et al 2002).
5.3 VIRUS DE LA RABIA
Los virus RNA de hebra sencilla no segmentada y de sentido negativo son agrupados dentro del orden de los Mononegavirales. Este orden esta conformado por 4 familias de virus, entre ellas se encuentra la familia Rhabdoviridae a la cual pertenece el género Lyssavirus cuyo representante es el virus de la rabia. Estos virus poseen una morfología similar a una bala, es decir con un extremo aplanado y el otro redondeado; sus dimensiones son de aproximadamente 200 nm por 75 nm, con una nucleocápside de tipo helicoidal. Estos virus infectan principalmente y preferencialmente a las neuronas del SNC y SNP de mamíferos, ocasionando generalmente una encefalitis mortal (Rose et al, 2001).
5.3.1 LA RABIA UN PROBLEMA EN SALUD PÚBLICA
A pesar de todo lo que actualmente se conoce respecto a la infección por el VR y aunque hace más de un siglo existe la vacuna antirrábica y el
tratamiento post- exposición temprano es efectivo, una vez que aparecen los signos neurológicos no existe ningún tipo de tratamiento posible y la muerte del individuo es inminente. Aunque en los últimos años el número de casos ha disminuido, la gravedad de la situación radica en la persistencia de casos humanos detectados tardíamente. La OMS estima que ocurren por lo menos 50000 muertes humanas cada año debidas a accidentes rábicos, la mayoría de ellas en países subdesarrollados de África, América Latina y principalmente Asia (Ministerio de Salud, 2000). Según el informe de la Oficina de Epidemiología del Ministerio de Salud de Colombia, el comportamiento de la rabia en los últimos años afecta la población rural y/o urbana de algunas ciudades de nuestro país. El último caso reportado sucedió en junio del 2004, donde un brote de rabia silvestre transmitida por murciélagos hematófagos afectó la población indígena Embera ubicada en la zona norte del Bajo Baudó, cobrando la vida de 13 niños (Acosta, 2000, Páez et al, 2003, Escobar, 2004). Por esta razón la circulación del virus y la enfermedad causada por este, debe ser considerada aún como un problema de salud pública en nuestro país.
La enfermedad por infección rábica sigue siendo un rompecabezas, pues su patogenia no esta totalmente comprendida y no hay explicación suficiente sobre su letalidad, por lo tanto, se hace necesario plantear modelos experimentales in vivo, que ayuden a los investigadores del país y del mundo a comprender los eventos tempranos de la patogenia viral, a descubrir las rutas de preferencia del virus para ingresar al SN y plantear futuras terapias farmacológicas o la construcción racional de vacunas que inhiban la infección, evitando de este modo la muerte del individuo.
5.3.2 ESTRUCTURA VIRAL
El RNA del virus esta conformado por 5 genes monocistrónicos que codifican para las 5 proteínas estructurales. Alrededor del RNA se ubica el complejo riboproteico denominado nucleocápside (NC) que involucra la nucleoproteína
(N), la fosfoproteína (P) y la polimerasa viral (L). La proteína M actúa como puente entre la nucleocápside y la membrana, además se asocia con el dominio citoplasmático de la glicoproteína (G). Se sabe que la proteína G del virus participa activamente en la unión del virus a las células hospederas y estimula la respuesta inmune del huésped (Wunner et al, 1988; Rose et al, 2001; Rupprechts et al, 2002, Faber et al, 2004).
El genoma del VR posee una secuencia líder ubicada en el extremo 3´ y una región no codificante en el extremo 5´. Los aproximadamente 12,000 nucleótidos codifican para las proteínas estructurales, N, P, L, M y G. El RNA del virus esta asociado a la proteína N actuando posiblemente como estabilizador del mismo, permitiendo la transcripción y replicación de la hebra. A este complejo riboproteico se denomina ribonucleoproteína (RNP), a su vez y sobre este complejo interactúa la proteína L y la fosfoproteína P.
Figura 1: Representación esquemática del genoma, proteínas y VR ensamblado.
La membrana del virus es proveniente de la célula de la cual fue liberado y es sobre esta que se proyecta hacia afuera la glicoproteína (G) conformada por trímeros. Entre la ribonucleoproteína y la membrana se encuentra la
N P M G L
3
´
5 Estructura de ´
las Proteínas Virales Virus
ensamblado
RNA Viral
proteína M la cual participa en estabilizar la RNP dentro del virus además de intervenir en el proceso de replicación viral (Finke et al, 2003).
Las proteínas P y N son proteínas que pueden ser fosforiladas, principalmente por quinasas celulares. Wu y Cols, 2002 demostraron que la fosforilación de la proteína N en la posición 389 es necesaria e indispensable para la transcripción, replicación y encapsidación de los nuevos virus. La polimerasa viral al parecer puede adenilar, metilar y fosforilar nucleótidos, sin embargo, su principal función es la de permitir el inicio de la hebra complementaria de RNA durante la replicación viral (Wunner et al, 1988, Wu et al, 2002).
5.3.3 CICLO VIRAL
El ciclo viral para los rabdovirus, se inicia con la unión del virus a moléculas de la superficie celular que pueden actuar como moléculas receptoras (Haywood, 1994). Una vez el virus se une a estas moléculas, se inicia el proceso de adsorción viral, normalmente este proceso sucede bajo las mismas condiciones celulares de la endocitosis. Para el caso particular del VR la proteína G es la responsable de la unión y posterior ingreso del virus al citoplasma celular (Faber et al, 2004). Las moléculas celulares que han sido postuladas como los posibles receptores para el VR son; el Receptor Nicotínico de Acetilcolina (RNACh) (Lentz et al, 1982), la Molécula de Adhesión Celular Neural (NCAM, por sus siglas en ingles) (Thoulouze et al, 1998), y el Receptor de Baja Afinidad para las Neurotrofinas (p75NTR, 75 kDa.
“Neurotrophin Receptor) (Tuffereau et al, 1998). Aunque otras moléculas como los gangliosidos (Superti et al, 1986), glicosaminoglicanos y fosfolípidos han sido reportadas como moléculas receptoras o captadoras del VR no esta definida su participación en la adsorción y penetración del VR (Castellanos, 2002). El endosoma formado, junto con el virus unido posiblemente a su receptor, sufre varios procesos fisiológicos y bioquímicos que permiten la fusión de la membrana viral con la membrana celular,
permitiendo el desnudamiento del virus, es decir la liberación del genoma viral dentro del citoplasma celular, y es allí donde se inicia la transcripción del RNA y la posterior replicación del mismo para la generación de las nuevas hebras de sentido negativo de la futura progenie viral (Figura 2).
Debido al sentido negativo de la hebra del RNA, la enzima RNA polimerasa dependiente de RNA genera una hebra complementaria de sentido positivo (5´ - 3´ ) de tal forma que se obtiene mRNA de cada uno de los 5 genes virales, cada una con su secuencia de inicio y de terminación. Estos mensajero son procesados por ribosomas libres citoplasmáticos y si es necesario pueden ser llevadas hasta el aparato de Golgi donde sufren modificaciones post- traduccionales, luego de esto pueden ser exportadas al citoplásma ó hacia la membrana celular (Tordo, 1996). El ensamblaje de los nuevos virus se realiza muy cerca de la membrana celular, esto implica la presencia de G insertada en la membrana y la ubicación de las demás proteínas listas, para el acople y formación de una nueva partícula viral, la cual será liberada por gemación (Wagner 1990, Rose et al, 2001).
5.3.4 TRANSPORTE DEL VIRUS DE LA RABIA
Se ha demostrado que el VR ingresa al interior celular a través de la unión de la glicoproteína G viral con las posibles moléculas receptoras presentes en la membrana de las células, lo cual permite el ingreso del virus por endocitosis y la subsiguiente liberación del RNA viral en el citoplasma celular.
Sin embargo para la generación de progenie viral, fenómeno que sucede en el citoplasma neuronal, el virus debe ser transportado desde el sitio de inoculación hasta los somas ubicados, en algunos casos en zonas bastante lejanas al área, por tanto el virus utiliza los sistemas de transporte intracelular neuronal.
Figura 2: Esquema del ciclo viral para el VR. Se describen los numerosos eventos que suceden en el citoplasma de la célula, desde la adsorción (1) del virus hasta la gemación (13) de la progenie viral.
El VR utiliza el transporte retrógrado rápido mediante la asociación de elementos propios con elementos del cito - esqueleto y proteínas motoras tales como la dineina. En este aspecto se ha demostrado que la cadena ligera de la dineina (LC8) interactúa directamente con la fosfoproteína P del virus.
La zona de interacción de la proteína P corresponde a los residuos 138- 172 y en particular en la posición 162 de esta región donde existe una serina, por lo tanto, la fosforilación de P en este residuo puede regular la asociación
y activación del complejo motor de la dineina. Estos hallazgos sugieren la utilización por parte del VR de los sistemas de transporte y movilidad de las neuronas para desplazarse desde las terminaciones sinápticas hasta los somas y viceversa, procesos que permiten aumentar la dispersión y efectividad de la infección (Sodeik, 2000, Ploubidou y Way, 2001).
5 .3.5. PATOGENIA DE LA INFECCION POR VIRUS DE LA RABIA
La encefalitis, causada por el VR en todos los casos reportados, es mortal. La marcada preferencia del VR por las células neuronales (neurotropismo) ha sido objeto de varios estudios. En los últimos años los estudios sobre la patogenia de la infección por VR han estado enfocados principalmente a la búsqueda de las moléculas que expliquen el marcado neurotropismo, y su participación en la promoción de la infección (Schweighardt y Atwood, 2001;
Castellanos y Hurtado, 2001). La adquisición de la enfermedad es debida a la mordedura de un animal rabioso, sin embargo la eficiencia de la transmisión depende de la profundidad de la mordedura, de la cantidad de virus presente en la saliva y la cercanía al SNC. La evidencia experimental ha demostrado que la interacción de la glicoproteina del virus con algunas moléculas de membrana es uno de los factores determinantes para la adsorción y penetración viral. (Tuffereau et al, 2001, Sakai et al, 2004, Roche y Gaudin, 2004),
In vivo las moléculas NCAM y RNACh han sido ubicadas en los botones sinápticos de terminaciones sensoriales y motoras presentes en piel o músculo. Por tanto estas moléculas pueden promocionar el ingreso del virus a las fibras nerviosas sensoriales o motoras. Sin embargo, existen estudios que han demostrado que el virus puede o no sufrir un periodo de replicación en las células musculares, antes de ser capturado por las terminales nerviosas (Tsiang, 1988; Lewis et al, 2000). Una vez el virus es capturado y endocitado en los botones sinápticos, viaja rápidamente mediante el
transporte axonal retrógrado hasta los somas de neuronas motoras o sensoriales ubicados en el asta ventral de la ME o en los GE respectivamente, aquí el virus puede replicarse y ser nuevamente transportado retrógradamente hasta el encéfalo (Coulon et al, 1989, 1998), y desde allí a tejidos no neuronales como glándulas salivales, músculo estriado y cardiaco, glándulas suprarenales (Jogui et al, 2002)
5.3.5.1. ESTUDIOS DE INTERACCIÓN ENTRE VIRUS DE LA RABIA Y NEURONAS SENSORIALES Y/O MOTORAS
Como se dijo anteriormente en experimentos in vivo, el virus puede unirse a posibles receptores presentes en la membrana plasmática de terminaciones motoras o sensoriales existentes en el sitio de inoculación, para luego ser transportado hasta los somas de estas neuronas ubicadas en el asta ventral de la ME o en los GE. Sin embargo y aunque se ha encontrado antígeno viral en ambos tipos de células, los investigadores no han logrado establecer si existe una vía de preferencia para el acceso del virus desde la periferia hasta el SNC.
5.3.5.1.1 MODELOS DE INFECCIÓN POR VIRUS DE LA RABIA IN VITRO Utilizando cultivos primarios de GE de diferentes especies animales y en diferentes estadíos de desarrollo, se ha demostrado la capacidad de captura, transporte y replicación del VR en estas células, lo que sugiere que estas neuronas poseen una alta susceptibilidad a la infección, quizás mediante las mismas moléculas receptoras y demás mecanismos utilizados por las neuronas motoras (Tsiang et al, 1983, 1989, 1991, Coulon et al, 1989).
A partir del modelo de cultivo de GE desarrollado previamente (Castellanos y Hurtado, 1999) Martínez y cols mediante técnicas inmunocitoquímicas y morfométricas evaluando la susceptibilidad diferencial a la infección por VR en las subpoblaciones neuronales presentes en los cultivos de GE de ratón
adulto. Los resultados obtenidos demostraron que a pesar de la heterogeneidad de la población celular del cultivo, preferencialmente fueron infectadas por VR las neuronas de diámetros intermedio y grande. Estos resultados fueron confirmados mediante la caracterización bioquímica con neuropéptidos, donde se observó que las células infectadas fueron positivas NPY o VIP; estos neuropéptidos son marcadores de subpoblaciones neuronales grandes. En este estudio también se determinó la presencia y participación de las posibles moléculas receptoras para el VR (NCAM, RNACh y p75NTR) en las células infectadas, donde se observó que las neuronas infectadas expresan en su membrana el receptor p75 NTR o la subunidad alfa 4 del RNACh. Estos resultados sugieren que la susceptibilidad diferencial del VR por la población de neuronas grandes presentes en el cultivo puede ser debida al tipo de información que transportan, situación definida principalmente por el tejido blanco al que inervan y a la presencia de las moléculas p75NTR y la subunidad alfa 4 del RNAch, las cuales pueden estar incrementando el tropismo, acelerando la captura y el transporte del VR desde la periferia hasta el SN (Martínez et al, 2002, 2003, 2005).
5.3.5.1.2 MODELOS DE INFECCIÓN POR VIRUS DE LA RABIA IN VIVO Desde los primeros trabajos de investigación en la patogenia y patología rábica, se ha descrito que posterior a una inoculación periférica, el virus es capturado y transportado por los nervios sensitivos y motores hasta el SNC (Baer et al, 1968; Baer y Cleary, 1972; Dean et al, 1963; Murphy et al, 1973).
El virus inoculado, puede entrar directamente al SN o sufrir un período de amplificación en el músculo esquelético (Baer et al, 1968; Charlton y Casey, 1979; Shankar et al, 1991). Estos eventos se suceden una vez el virus se une a la posible molécula receptora presente en la membrana de la célula neuronal o muscular, la cual por endocitosis permite el ingreso del virus al citoplasma de las células, de tal manera que el proceso de adsorción del virus se inicia muy temprano después de la inoculación (Lewis et al, 2000).
Una vez el virus ingresa a las neuronas es transportado retrógradamente hasta los cuerpos de las neuronas ubicadas en ME, de allí posteriormente es transportado retrógradamente y liberado al cerebro, donde se disemina produciendo la encefalitis que generalmente es mortal. Posteriormente el virus puede colonizar tejido no neuronal como glándulas salivares y córnea entre otros (Tsiang et al, 1983, Jogui et al, 2002).
Existe una amplia evidencia experimental que demuestra que el VR al ser inoculado en zonas musculares inervadas principalmente por terminaciones motoras, es capturado y transportado rápidamente al SNC detectando antígeno viral en áreas motoras de la corteza cerebral y además en el hipocampo, tálamo, sustancia nigra, tectum de cerebro medio y en la capa de células de Purkinje del cerebelo. La infección en estas áreas varía de acuerdo al tiempo post- inoculación, sitio, cantidad y cepa de virus inoculado. Luego el virus replicado en estas zonas, es transportado de modo centrífugo hacia tejidos no neuronales, completando la dispersión viral (Coulon et al, 1989, Jackson, 1991,2002a, 2002b, 2003, Tang et al, 1999, Guigoni y Coulon, 2002),
Por otro lado, cuando se realizan inoculaciones del VR en el músculo masetero de ratón, este es capturado y transportado por las neuronas sensoriales que inervan este músculo, detectando antígeno y RNA virus- específico en neuronas del trigémino, neuronas de tipo sensorial similares a las presentes en los GE, en las cuales el transporte del virus es bastante rápido (Jackson, 1991, 2002a, 2002b, 2003; Shankar et al, 1991). Cuando se realizan inoculaciones de VR vía intranasal, la aparición del antígeno viral en el trigémino es más tardía (unos 6- 8 días) (Jenson et al, 1969; Coulon et al, 1989; Astic et al, 1993). Después de inocular por vía intramuscular con virus
“calle”, se detecta material viral en perimisio y endomisio del músculo esquelético, seguido de la detección en las fibras musculares.
Posteriormente, entre las 18 y 24 horas, se encuentra material inmunoreactivo en GE y luego se incrementa el número de neuronas sensoriales infectadas (Baer et al, 1968; Charlton y Casey, 1979; Watson et al, 1981). De esta forma se ha evidenciado mediante modelos in vivo la participación de las terminaciones y neuronas sensoriales en la captura e ingreso del virus al SNC.
Dean y cols (1963) desarrollaron un experimento para evaluar y dilucidar cual de las vías (sensorial o motora) captura con mayor eficiencia el virus. En este estudio los autores seccionaron la raíz ventral y la raíz dorsal de los GE lumbares de diferentes ratones adultos. Posteriormente a estos mismos animales se les inoculó VR en la almohadilla plantar y se evaluó a diferentes tiempos p,i. Los resultados demostraron que independiente de la lesión en la raíz ventral (vía motora) o la raíz dorsal (vía sensorial) los animales murieron por encefalitis rábica, lo cual demuestra que ambos tipos de neuronas son susceptibles a la infección y pueden promover la infección hasta SNC. Los resultados enunciados anteriormente han sido obtenidos e interpretados de acuerdo a los diferentes modelos y técnicas experimentales utilizadas. En este último aspecto, la mayoría de estos trabajos evalúan por separado la infección en secciones de ME y ganglios lumbares, previa extracción de los tejidos de la columna vertebral (cavidad medular y agujeros intervertebrales, respectivamente) (Tsiang et al, 1983, 1988; Coulon et al, 1989; Guigoni y Coulon, 2002), desafortunadamente esto ocasiona la desconexión total de los ganglios a la médula y viceversa. Esta desconexión no permite evaluar de modo real la interconexión que existe entre las neuronas sensoriales y motoras y el paso del virus de un sistema al otro. Por otro lado por disposiciones anatómicas, la sustancia gris de la ME termina a la altura de las vértebras lumbares 1 o 2 del ratón, así que las regiones medulares que conectan con los GE más caudales se hallan muy distantes al agujero intervertebral donde se alojan estos ganglios. Por esta razón los GE de las regiones lumbar y sacra poseen largas raíces dorsales que los conectan con
el asta dorsal correspondiente, por lo tanto, las zonas medulares vecinas a los ganglios ubicados en la zona sacro- lumbar no corresponden a la misma zona vertebral. Este análisis no ha sido tomado en cuenta en la mayoría de estudios, por lo tanto, lo descrito hasta el momento en la infección in vivo de GE y ME por virus de la rabia, presenta estos errores de interpretación neuroanatómicos que alteran la correcta interpretación de los resultados. Por ejemplo Tang y cols, (1999); Coulon y cols, (1989) reportan infección primaria en motoneuronas, a los tres días p.i. y de modo tardío (4 o 5 días) reportan infección en las neuronas sensoriales de los GE, como consecuencia del transporte centrífugo del virus, sugiriendo de esta forma la infección secundaria de estas neuronas (Coulon et al, 1989; Tang et al, 1999).
Por este motivo se debe buscar un modelo experimental que permita describir por un lado la cinética y la preferencia (si la hay), entre las vías sensorial y motora a la infección por VR y el tipo de subpoblaciones neuronales involucradas en la infección. Por otro lado evaluar al mismo tiempo y en un mismo nivel vertebral la ME y los GE, lo cual permitirá confirmar la interacción neuroanatómica directa y el paso transináptico del VR entre ellos, así se podrá demostrar la importancia que poseen las neuronas sensoriales en los proceso de dispersión y patogenia de la enfermedad, puesto que definitivamente estas neuronas son una de las puertas de entrada del virus al SNC.
6. METODOLOGIA
6.1. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Los materiales y métodos están descritos de acuerdo a los requerimientos experimentales, utilizados en cada uno de los objetivos específicos planteados. Con esta metodología se buscó definir inicialmente mediante la utilización de la molécula neuro- trazadora FG, el área vertebral específica donde se ubicaron las neuronas sensoriales y motoras que conforman el NC
y sus principales ramas, entre las cuales se cuentan las fibras involucradas en la inervación de la almohadilla plantar. Una vez identificada el área vertebral donde se alojó el mayor número de neuronas sensoriales y motoras que conforman el NC, se tomaron ratones ICR los cuales fueron inoculados con VR en la almohadilla plantar y sacrificados a diferentes tiempos post- inoculación. De estos animales se obtuvieron secciones transversales de la columna vertebral las cuales fueron procesados por inmunohistoquímica, así se determinó el sitio y el tiempo de aparición de antígeno viral en neuronas sensoriales y motoras en los diferentes niveles vertebrales analizados. A continuación sobre estas mismas secciones se cuantificó el número de neuronas infectadas en los diferentes tiempos y niveles analizados, con estos datos se realizó un análisis por ANOVA y DMS con el cual se comparó el porcentaje de infección obtenido en los GE a 72, 96, y 120h p.i, en cada nivel vertebral. Por último y sobre estos mismos tejidos se definió el perfil morfométrico de las neuronas infectadas y no infectadas procesadas por inmunohistoquímica, los datos obtenidos fueron analizados mediante la prueba no paramétrica de Kolmogorov- Smirnov y t- Student con el cual se comparó la distribución por diámetros de las neuronas de cada GE de los niveles vertebrales analizados a 96 y 120h p.i.
6.1.1. Determinación de la ubicación neuroanatómica de las neuronas sensoriales y neuronas motoras que inervan la almohadilla plantar
6.1.1.1 Abordaje quirúrgico: Para la ubicación especifica de las neuronas sensoriales y motoras que conforman el NC y sus ramas principales, se utilizaron dos (2) ratones machos jóvenes de 30- 35 g de la cepa ICR (Institut Cancer Research). Los animales fueron anestesiados previa aplicación de atropina (0,02 mg/kg) con una mezcla de ketamina (15 mg/kg) y xilazina (90 mg/kg). Después que los animales perdieron el reflejo patelar, se realizó una incisión entre la cresta ilíaca y la parte distal del fémur de ambas
extremidades, los músculos fueron cuidadosamente apartados en el borde caudal del músculo gluteus maximus , donde se localizó el nervio ciático.
Sobre este nervio se realizaron los procedimientos descritos más adelante, una vez terminada la aplicación del trazador se suturaron los músculos con sutura re- absorbible y la piel con sutura 5,0. Los animales antes, durante y al finalizar los procedimientos fueron mantenidos en condiciones de bioterio por el tiempo definido con agua y comida ad libitum.
6.1.1.2 Aplicación del Neurotrazador FluoroGold (FG): Para la identificación de las neuronas sensoriales de los GE y de las neuronas motoras de ME, se utilizó la implantación de una cámara de silicona la cual contenía en su interior el trazador retrógrado FG, para esto se seccionó por completo el nervio ciático, el cabo proximal se introdujo en una cámara de silicona de 7mm de longitud, con uno de sus extremos sellados, luego se colocaron 10 µl de solución de FluoroGold al 5% en NaCl 0,15M. El cabo proximal se dejó en contacto con la solución y se fijo a la cámara con dos puntos de sutura 9- 0. Para evitar la salida de la solución y la impregnación de los tejidos vecinos, se colocó silicona de uso odontológico en la zona de unión de la cámara y el nervio.
6.1.1.3 Procesamiento de los Tejidos
El tiempo de exposición al trazador fue de 6 días. Luego de este tiempo los ratones fueron nuevamente anestesiados y se perfundieron a través de la arteria aorta, con buffer fosfato salino (PBS, pH 7,4) seguido por un fijador (paraformaldehído 4% en PBS). Posteriormente se realizó la disección de la totalidad de la columna vertebral, se retiró el exceso de músculo y se post- fijaron las columnas en la misma solución fijadora durante 48 horas. Las columnas con el tejido nervioso dentro y restos de tejido muscular alrededor, fueron descalcificadas en una solución de ácido fórmico al 10%
más paraformaldehído al 4% en agua, durante 15 días (de acuerdo a lo
reportado previamente por Velandia et al, 2002), Los tejidos fueron criopreservados en una solución de sacarosa al 20% y se almacenaron a 4ºC hasta el día de corte. Los segmentos ubicados por debajo de la cintura pélvica fueron desechados, las vértebras del resto de la columna fueron enumeradas en dirección rostral con el fin de determinar los sitios exactos de aparición del marcaje.
A partir de los diferentes segmentos vertebrales se realizaron cortes seriados de 16 m de espesor en crióstato (Tissue- tek II, Modelo No, 4551),μ los cuales fueron recogidos en láminas pretratadas con poli- L- lisina (100 µg/ml) y se realizó un montaje húmedo con glicerol tamponado pH 9,0, Los cortes a analizar contenían ME y los respectivos GE, los cuales fueron observados usando un microscopio Nikon dotado de un sistema de epifluorescencia utilizando el filtro de excitación adecuado (480 nm). De esta manera se determinaron los GE y neuronas motoras que aportan fibras al nervio ciático de los niveles vertebrales ubicados.
6.1.2. Determinación del tiempo de aparición de antígeno viral para virus de la rabia en neuronas sensoriales y motoras infectadas.
6.1.2.1 Infección de animales: Se tomaron dos (2) ratones adultos jóvenes machos de la cepa ICR por cada tiempo analizado; estos animales fueron infectados con 50 µl de inóculo viral (106.7 dosis letales) en el cojinete plantar de la pata posterior derecha, con la cepa de virus CVS (Challenge Virus Standard) mantenido y pasajeado en cerebros de ratones adultos (CVS- CR). El título de este virus fue determinado por inoculación intracerebral de diluciones seriadas en ratones de 14- 16 gr. Los animales antes y durante los tiempos post- inoculación fueron mantenidos en condiciones de bioterio con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas, comida y agua ad libitum .
6.1.2.2 Procesamiento de los tejidos: Para determinar la cinética (tiempo y ubicación) de detección de antígeno viral se evaluaron dos (2) animales
correspondientes a los tiempos de 24, 48, 72, 96 y 120 horas p.i., los cuales fueron anestesiados con una mezcla de Ketamina 15mg /Kg peso y Xilaxina 90mg /Kg peso. Una vez que en los animales se observó la ausencia del reflejo podal, se procedió mediante la apertura de la cavidad toráxica a la canalización de la arteria aorta para la iniciación del proceso de perfusión, de esta manera se dio inicio a la circulación de la solución salina de fosfatos (PBS, pH 7,4) seguida por un fijador (paraformaldehído 4% en PBS). La columna vertebral fue disecada, se retiró el exceso de músculo y se dejaron las columnas en post- fijación en la misma solución fijadora durante 48 horas. Las columnas con el tejido nervioso dentro y restos de tejido muscular alrededor, fueron descalcificados en una solución de ácido fórmico al 10% más paraformaldehído al 4% en agua, durante 15 días. Los tejidos fueron criopreservados en una solución de sacarosa al 20% y almacenados a 4 ºC hasta el día en que fueron cortados. Los cortes fueron de 12 µm de espesor obtenidos en crióstato (Tissue- Tek II, Modelo No, 4551), procesando las regiones vertebrales determinadas en el numeral 6.1.1, estos cortes fueron recogidos en láminas pretratadas con poli- L- lisina (200 µg/ml) distribuidos de la siguiente forma: el primer corte obtenido, fue recogido en la primera lámina, el segundo en la segunda y así sucesivamente hasta montar 5 cortes por lámina en 16 láminas por nivel vertebral seccionado, de esta forma se obtuvo en cada lámina diferentes niveles de ME y de los GE, lo cual nos permitió detectar antígeno viral en diferentes zonas de los GE. Las láminas con los cortes fueron almacenadas a
- 20ºC hasta ser procesados por inmunohistoquímica.
6.1.2.3 Inmunohistoquímica
De un total de 112 láminas por ratón, se escogieron 8 láminas con la distribución de cada corte descrita anteriormente, estos cortes fueron hidratados con PBS pH 7,2 por 10 minutos, luego se permeabilizaron por 30
