Consolidación de la tecnología para la fabricación de un biosensor con aplicación en la detección del VPH 16 buscando reducción de costos

CONSOLIDACIÓN DE LA TECNOLOGÍA PARA LA FABRICACIÓN DE UN

BIOSENSOR CON APLICACIÓN EN LA DETECCIÓN DEL VPH 16 BUSCANDO

REDUCCIÓN DE COSTOS

Trabajo de Proyecto de Grado

por

DIANA ISABEL LÓPEZ VARGAS

KATILY ANGÉLICA RAMÍREZ MÉNDEZ

Presentado a la Universidad de los Andes

en cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de

INGENIERÍA QUÍMICA

Noviembre 2013

CONSOLIDACIÓN DE LA TECNOLOGÍA PARA LA FABRICACIÓN DE UN

BIOSENSOR CON APLICACIÓN EN LA DETECCIÓN DEL VPH 16 BUSCANDO

REDUCCIÓN DE COSTOS

Trabajo de Proyecto de Grado

por

DIANA ISABEL LÓPEZ VARGAS

KATILY ANGÉLICA RAMÍREZ MÉNDEZ

Presentado a la Universidad de los Andes

en cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de

INGENIERÍA QUÍMICA

Aprobado por:

Asesor,

Rocío Sierra Ramírez

Coasesor,

Johann Faccelo Osma Cruz

Jurado,

Andrés González

Director del departamento,

Oscar Alberto Álvarez Solano

Noviembre 2013

CONSOLIDACIÓN DE LA TECNOLOGÍA PARA LA FABRICACIÓN DE UN

BIOSENSOR CON APLICACIÓN EN LA DETECCIÓN DEL VPH 16 BUSCANDO

REDUCCIÓN DE COSTOS

Objetivo General

Consolidar la tecnología para la fabricación de un biosensor con aplicación en la

detección del VPH 16 buscando reducción de los costos de producción.

Objetivos Específicos

1.

Determinar condiciones de fabricación para la elaboración de un biosensor que pueda

usarse en la detección del VPH 16, probando diversas configuraciones del diseño y

diversos materiales que garanticen un biosensor robusto, sellable y de bajo costo.

2.

Construir un biosensor y comprobar su funcionalidad a través de mediciones de

impedancia y resistividad.

3.

Comparar costos de la técnica de fabricación del biosensor y de técnicas tradicionales de

ABSTRACT

Consolidación de la tecnología para la fabricación de un biosensor con aplicación en

la detección del VPH 16 buscando reducción de costos (Diciembre 2013)

Diana Isabel López Vargas & Katily Angélica Ramírez Méndez, Universidad de Los

Andes, Colombia

Asesor: Rocío Sierra Ramírez, PhD Coasesor: Johann Faccelo Osma

A biosensor is a biological receptor that detects a substance through biomolecule

interactions. It uses a transducer that performs the recognition reaction, which is

produced by the receptor and translated into a measurable signal. Previous studies

had designed a prototype of a static fluidic microsystem for HPV 16; however, the

design presents drawbacks in the self-assembling system that affects the

performance. Other problems are lack of robustness and high manufacturing cost,

factors that influence the prototype reproducibility and its possible inclusion in the

market. In this project, a new prototype has been obtained using cheaper materials

and techniques that does not present leaks. Therefore, this new prototype has a lower

cost than the one in the previous study. It was determined that the best operational

frequency was 446.02 MHz. However, at low frequencies the biosensor presented a

good performance. In order to verify the biosensor functionality, a field test was

performed, proving that the biosensor reached the objective. Finally, a comparison

between the biosensor and traditional HPV detection techniques was performed,

demonstrating that the biosensor is a competitive option in the market.

RESUMEN

Consolidación de la tecnología para la fabricación de un biosensor con aplicación en la

detección del VPH 16 buscando reducción de costos (Diciembre 2013)

Diana Isabel López Vargas & Katily Angélica Ramírez Méndez, Universidad de Los

Andes, Colombia

Asesor: Rocío Sierra Ramírez, PhD Coasesor: Johann FacceloOsma

Un biosensor es un receptor biológico que detecta una sustancia mediante interacciones

biomoleculares, y un transductor que interpreta la reacción de reconocimiento del

receptor traduciéndola a una señal cuantificable. Estudios anteriores han diseñado el

prototipo de un microsistema fluídico estático para la detección del VPH 16; sin

embargo, se reportaron inconvenientes en el auto-ensamblado, afectando el desempeño

del microsistema. Este modelo tenía fallas en su diseño y su costo de producción era

elevado dificultando así su reproducibilidad y posible incorporación en el mercado. En el

presente trabajo, se modificaron los materiales y su diseño logrando la fabricación de un

prototipo que no presenta fugas, y se redujeron los costos en comparación al prototipo

preliminar. Se determinó que 446.02 MHz es la mejor frecuencia de operación; sin

embargo, a bajas frecuencias es posible tener un buen funcionamiento del biosensor.

Para verificar su funcionalidad, se llevó a cabo una prueba de campo, en la cual se

demostró que el biosensor cumple con su objetivo. Finalmente, se realizó una

comparación entre el biosensor y las pruebas tradicionales de detección del VPH,

demostrando que es una opción competitiva en mercado.

DEDICATORIA

A Dios que nos dio fortaleza para llevar este proyecto adelante y a nuestras familias que

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a todas aquellas personas que participaron directa o indirectamente en la

realización de este proyecto:

•

Principalmente a Dios por darnos fortaleza para enfrentar todos los obstáculos

que se nos presentaron y poderlos superar satisfactoriamente.

•

Nuestra asesora Rocío Sierra y nuestro co-asesor Johann Faccelo Osma por

ayudarnos a realizar este proyecto, ya que sin su ayuda y colaboración a nivel

personal y profesional, no hubiese sido posible llevar a cabo el trabajo.

•

Personal de los departamentos de Ingeniería Química, Eléctrica y Electrónica por

su paciencia y disposición constante por colaborarnos.

•

Familiares Miryam Méndez, Alberto López, Isabel Vargas y Diego López por su

apoyo y amor en todos aquellos momentos en los que necesitamos una voz de

aliento.

•

Laboratorio PATOLAB por permitirnos hacer uso de su personal, espacio y

muestras para poder llevar a cabo la prueba de campo y verificar la funcionalidad

NOMENCLATURA

AFM

C

EIS

HC2

I

L

mAb5051

PAJ

PCR

PCR-RT

R

SAMs

SEM

V

VPH

X

X

X

Z

Microscopio de fuerza atómica

Capacitancia

Espectroscopía de Impedancia Electroquímica

Captura de híbridos 2

Corriente

Inductancia

Anticuerpo monoclonal 5051

Proceso Analítico Jerárquico

Reacción en cadena de la polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

Resistencia eléctrica

Self – Assembled Monolayers

Microscopio electrónico de barrido

Potencial de la resistencia eléctrica

Virus del Papiloma Humano

Reactancia

Reactancia inductiva

Reactancia capacitiva

Impedancia eléctrica

TABLA DE CONTENIDOS

Página

OBJETIVOS ...

iii

ABSTRACT ...

iv

RESUMEN ...

v

DEDICATORIA ...

vi

AGRADECIMIENTOS ... vii

NOMENCLATURA ... viii

TABLA DE CONTENIDOS ...

ix

LISTA DE FIGURAS ... xii

LISTA DE TABLAS ... xiv

CAPÍTULO I

I INTRODUCCIÓN

...

1

Virus del papiloma humano ...

1

Biosensores

...

2

Inmovilización

...

4

Detección del VPH mediante anticuerpos ...

7

Deposición de oro ...

8

Elaboración de las SAMs ... 11

Estudio anterior, Universidad de los Andes 2012 ... 12

Comprobación de la inmovilización ... 13

Uso de anticuerpos en biosensores ... 18

Contenido del proyecto ... 18

CAPÍTULO II

II METODOLOGÍA

...

20

Preparación de los reactivos ... 20

Selección de los materiales para la elaboración del biosensor ... 20

Elaboración de láminas de acrílico ... 21

Elaboración de la capa nanométrica de oro ... 21

Fabricación de la monocapa autoensamblada ... 22

Observación de superficies inmovilizadas ... 23

Verificación del desempeño del biosensor ... 24

Verificación del desempeño del biosensor con VPH ... 25

Estimación y comparación de costos del biosensor con técnicas

tradicionales de detección ... 26

CAPÍTULO III

III RESULTADOS

...

28

Selección de materiales para la elaboración del biosensor... 28

Materiales

y

reactivos

...

31

Geometrías – láminas de acrílico ... 31

Evaporación de oro sobre láminas de acrílico ... 34

Adecuación para mediciones de resistencia e impedancia ... 34

Medición de conductividad ... 37

Observación de las superficies con SEM ... 37

Observación de las superficies con AFM ... 38

Mediciones de resistencia ... 39

Mediciones de impedancia a altas frecuencias ... 39

Mediciones con generador eléctrico y osciloscopio ... 46

Análisis del desempeño del biosensor con VPH ... 48

Comparación de costos del biosensor actual y el realizado en el estudio anterior . 54

Comparación del biosensor con técnicas tradicionales de detección 56

CAPÍTULO IV

III CONCLUSIONES

...

65

Trabajo

Futuro

...

68

ANEXO A ... 75

ANEXO B ... 80

LISTA DE FIGURAS

FIGURA Página

Figura 1 Detección de señales en el SEM ... 16

Figura 2 Plano-Configuración inicial de láminas de acrílico ... 32

Figura 3 Plano-Nueva configuración a incluir en la manufactura del prototipo ... 32

Figura 4 Lámina de acrílico con superficie lisa/continua ...

32

Figura 5 Lámina de acrílico con orificios interconectados ... 33

Figura 6 Lámina de acrílico con orificios separados por orificios menores ... 33

Figura 7 Conjunto de láminas requeridas para la fabricación de un biosensor ... 33

Figura 8 Metalizador DENTON VACUUM Desk IV ...

34

Figura 9 Pintura conductiva y aplicación ...

34

Figura 10 Geometría alternativa ... 35

Figura 11 Dispositivo final 1- Orificios circulares y pintura ... 36

Figura 12 Dispositivo final 2- Orificios cuadrados sin pintura ... 36

Figura 13 Biomicrosistema ... 36

Figura 14 Medición de conductividad ...

37

Figura 15 Comparación física de muestras realizada en mini SEM ... 38

Figura 16 Comparación física de muestras realizada en AFM ... 38

Figura 17 Comparación de resistencias (

Ω

) a frecuencia 0 ... 39

Figura 18 Impedancia vs frecuencia ...

40

Figura 19 Impedancia 446.025 MHz, 450.72 MHz y 455.415 MHz ... 43

Figura 21 Comparación de resistencias (

Ω

) ... 47

Figura 22 Cambios en la resistencia de las muestras ... 50

Figura 23 Análisis de fase impedancia a 1 KHz-1V ...

51

Figura 24 Impedancia a bajas frecuencias ...

53

Figura 25 Diagrama Jerárquico ...

60

LISTA DE TABLAS

TABLA Página

Tabla 1 Análisis de materiales para la base del biosensor ... 29

Tabla 2 Matriz de calificaciones para el método ELECTRA ... 30

Tabla 3 Resultados con el método ELECTRA ... 30

Tabla 4 Determinación de la mejor frecuencia...

42

Tabla 5 Errores porcentuales ... 44

Tabla 6 Cálculo de total de errores porcentuales... 45

Tabla 7 Resultados impedancia a 1 MHz ... 46

Tabla 8 Resultados resistencia con frecuencia cero ... 49

Tabla 9 Estimación de los costos del prototipo actual ... 55

Tabla 10 Información construir matrices de comparación por pares ... 61

Tabla 11 Comparación de criterios - Escala Saaty ... 61

Tabla 12 Comparación de alternativas - Escala de Saaty ... 61

Tabla 13 Respecto a costos ... 62

Tabla 14 Respecto al tiempo de análisis ... 62

Tabla 15 Respecto a la efectividad ... 62

Tabla 16 Respecto a la dificultad por contaminación ... 62

Tabla 17 Respecto a la dificultad por presencia de sangre ... 62

Tabla 18 Respecto a la cantidad de genotipos detectados ... 62

Tabla 20 Respecto a la meta global: Alternativas de detección ... 62

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN Y REVISIÓN DE LITERATURA

Virus del papiloma humano

Las enfermedades cancerígenas se desarrollan por el crecimiento descontrolado de

células malignas en el cuerpo. Estas se originan a partir de células normales, las cuales

se multiplican y mueren cuando dejan de ser necesarias para el organismo. El cáncer se

genera cuando las células tienen un crecimiento descontrolado o cuando pierden su

capacidad de morir, y puede presentarse en cualquier órgano o tejido, como lo son los

pulmones, los senos, la piel, los huesos, el tejido nervioso, etc (A.D.A.M., 2012).

En muchos casos la causa del cáncer resulta ser desconocida, sin embargo, se ha

establecido que algunas de las causas para su aparición son: Contacto continuo con

benceno y químicos aromáticos, consumo de alcohol en exceso, contaminación

ambiental por hongos venenosos, exposición a la luz solar en exceso, obesidad,

radiación, anomalías genéticas y virus (A.D.A.M., 2012).

El virus del papiloma humano (VPH), es un virus ADN de doble cadena el cual infecta células

epiteliales y se encuentra asociado a lesiones intraepiteliales cervicales de alto y bajo grado,

condolimas y cáncer de cérvix. En Colombia, el cáncer cervical ocupa el segundo lugar como

causa de muerte por cáncer en las mujeres, siendo el cáncer de seno el primero (Bravo,

Cómbita, & Coursaget, 2003). Se ha establecido que en promedio cada tres horas muere una

mujer como consecuencia del cáncer cervical (Profamilia Colombia, 2011). Estadísticamente, se

reporta que cada año se diagnostican aproximadamente 500.000 casos nuevos en el mundo y se

presentan aproximadamente 240.000 muertes a causa de éste (Ferlay J, 2010); 80% de los casos

se presenta en países en vía de desarrollo.

Actualmente, existen más de 100 clases de VPH entre los cuales se encuentran los tipos de bajo

asociados a la aparición de verrugas genitales, por su parte los tipos de alto riesgo como el

VPH16 y el VPH18 se encuentran asociados con la aparición de cáncer cervical (Bravo,

Cómbita, & Coursaget, 2003).

Hoy en día, se desarrollan diversos exámenes con el fin de llevar a cabo la detección del

VPH en etapas tempranas con el fin de desarrollar los tratamientos pertinentes y de esta

manera prevenir y/o combatir la aparición del cáncer cervical. Todos estos tratamientos

requieren de personal capacitado, instrumentación especializada, laboratorios, etc., para

que sean desarrollados con efectividad, por lo que muchos pueden implicar altos costos

para su implementación o desarrollo.

El diagnóstico del VPH se lleva a cabo mediante la captura de Híbridos y reacción en

cadena de polimerasa (PCR) (National Cancer Institute, 2013). En la captura de

híbridos, las células se desnaturalizan e hibridizan con una sonda de ARN altamente

específica en donde se capturan los híbridos en una placa con anticuerpos específicos, se

amplifica la señal mediante el uso de una enzima y un compuesto quimio-luminiscente

y se realiza la lectura en un luminómetro de microplacas (Akhila, 2009). En la reacción

en cadena de polimerasa se obtienen varios millones de copias de una secuencia blanco

de ADN, mediante la propiedad natural de las ADN polimerasas para identificar más

fácilmente el virus (Inmunolab Investigación Biomédica, 2011).

Biosensores

Los biosensores, son dispositivos cuyo contenido se caracteriza por ser un material

químico o biológico, como lo son las enzimas, los anticuerpos, los ácidos nucleicos, etc.

(Sánchez & Vázquez, 2007). Dicho material, interactúa con una sustancia o analito,

generando cambios en la respuesta física de un transductor (generalmente respuestas

etc. (Sánchez & Vázquez, 2007). Un transductor, es un dispositivo por medio del cual

se convierten señales de una forma física en otra de forma física diferente. Un

transductor bioeléctrico, genera una respuesta en forma de señal eléctrica, a partir de

una señal de entrada provista por un ser vivo (Pallás Areny R. , 1988).

Está constituido por un receptor biológico, que detecta específicamente una sustancia

mediante interacciones biomoleculares, y un transductor, que interpreta la reacción de

reconocimiento biológico que produce el receptor traduciéndola en una señal

cuantificable. Como elementos biológicos receptores se pueden emplear enzimas,

anticuerpos, receptores proteícos, secuencias de oligonucleótidos, fragmentos

subcelulares como mitocondrias, secciones de tejidos animales y vegetales, células

completas, etc. y como transductor dispositivos ópticos, electroquímicos, y

mecano-acústicos, etc. (Ciencia popular).

Para poder diseñar un biosensor que se aplique en la detección de un virus, se utiliza un

bioreceptor, el cual debe tener en cuenta la especificidad con los antígenos virales. Por

otro lado, el principal componente de los biosensores son los SAMs (

self-assembled

monolayers

), la cual se forma de manera espontánea por la adsorción de una sustancia

con afinidad específica a un sustrato generando arreglos moleculares ordenados en los

que es posible inmovilizar moléculas, la inmovilización de las biomoléculas facilita la

unión con el analito objetivo (Caygill R. L., 2010). Ahora bien, la biomolécula es

adherida a la superficie del transductor, dicha superficie generalmente es oro; cabe

resaltar que el sistema con mayor impacto en la actualidad consiste en arreglos de

monocapas de alcanotioles (CH

CH

-SH) sobre oro (Caygill R. L., 2010). Los tioles,

son análogos de azufre de los alcoholes con un grupo funcional -SH conocido como

partir de haluros de alquilo al desplazar S

2 con un nucleófilo de azufre, como lo es el

anión hidrosulfuro

SH (McMurry, 2008).

La organización molecular sobre las SAMs se lleva a cabo mediante la pérdida de un

átomo de hidrógeno del grupo sulfhídrico –SH por cada molécula organo-sulfurada.

Este enlace proporciona una inmovilización orientada con el sitio de reconocimiento de

los anticuerpos libremente disponible, para una mayor accesibilidad de los antígenos

(Daza M. , 2002).

Ahora bien, un anticuerpo, es una glicoproteína que se origina a partir del sistema

inmune de un animal, como respuesta a la presencia de moléculas extrañas conocidas

como antígenos (Harris, 2003).Los inmuno-sensores, son biosensores de afinidad con

anticuerpos como elementos de bio-reconocimiento ya que los anticuerpos se pueden

enlazar específicamente a una proteína, a otro anticuerpo, e incluso a un virus entero

con una alta afinidad (Caygill R. L., 2010). Sin embargo, los anticuerpos no poseen

afinidad intrínseca lo que hace necesario la utilización de mecanismos de detección

electroquímicos. Recientes estudios han implementado la utilización de superficies

modificadas oro-anticuerpo para su uso como biosensor en la detección de virus (K. K.

J. P. T. Justo Laíz, 2010). Cabe resaltar que una monocapa de tioles auto-ensamblada se

comporta como un microambiente celular con una estructura de bicapa lipídica, por lo

que se pueden inmovilizar sobre ellas biomoléculas como anticuerpos, ácidos nucleicos,

enzimas, etc. (Caygill R. L., 2010).

Inmovilización

La inmovilización de anticuerpos sobre un sustrato sólido es necesaria para la

realización de chips de anticuerpos, biosensores e inmunoensayos, entre otras técnicas

cumplir con una serie de requisitos dependiendo del tipo de sistema al que se quiera

aplicar. La inmovilización no debe de provocar grandes distorsiones del centro de

reconocimiento del anticuerpo y la zona de reconocimiento debe de estar lo más

expuesta posible al medio. Esto será clave si se pretende utilizar en el reconocimiento

de bio-macromoléculas o células, o si se pretende realizar la lectura mediante la

utilización de un segundo anticuerpo o biomacromolécula, ya que sólo las moléculas

cuyo centro activo estén expuestas al medio serán capaces de adsorber las

macromoléculas, de forma que el porcentaje de moléculas bien orientadas determinarán

la velocidad de adsorción del analito (biosensores) o la capacidad de carga de la

columna. La superficie final del soporte debe de ser lo más inerte posible, evitando

adsorciones inespecíficas de otras moléculas sobre el soporte, complicando los análisis

finales. En columnas de bioafinidad, la adsorción inespecífica de cualquier otro

compuesto reduciría drásticamente el uso potencial de este tipo de técnicas de

purificación. En el caso de biosensores, una adsorción inespecífica podrá también

disminuir las posibles aplicaciones del mismo (Pilar Batalla, 2008).

Se ha descrito un protocolo que permite inmovilizar anticuerpos según estas

características. El procedimiento está basado en la inmovilización del anticuerpo a

través de las cadenas glicosiladas oxidadas con periodato, en donde el anticuerpo se

inmoviliza covalentemente sobre soportes aminados, los cuales son capaces de adsorber

proteínas por intercambio aniónico y para evitarlo, se procede a un etapa de bloqueo con

dextrano-aspártico- aldehido, requiriéndose un control muy estricto de esta etapa para

evitar la modificación química de las zonas de reconocimiento del anticuerpo. Este

método permite recuperar anticuerpos con hasta un 60-70% de funcionalidad y sin que

adsorba proteínas de crudos de diferentes microorganismos. Sin embargo, el

se pretende recubrir el soporte de anticuerpos, debido a la relativa lentitud de la reacción

covalente azúcar oxidado-aminos primarios (Pilar Batalla, 2008).

Los inmunosensores, son una sub-clase de biosensores en la que el elemento de

reconocimiento es un anticuerpo. Estos dispositivos son ampliamente utilizados para

detectar y cuantificar varios tipos de objetivos tales como toxinas, bacterias o

contaminantes, tales que los anticuerpos específicos sean afines con estos. El reto

fundamental en el campo de immunosensores es la sensibilidad que depende

drástica-mente de la cantidad de anticuerpos y su accesibilidad. Debido a su conductividad,

reflectividad, y la robustez, el oro se utiliza a menudo como la transducción de

superficie. El oro presenta una gran afinidad con alquiltioles, los cualesforman

monocapas autoensambladas (SAMs) espontáneamente. Sin embargo, el uso de oro

como la superficie de transducción puede conducir a un número limitado de anticuerpos

accesibles. De acuerdo con esto, se ha estudiado la forma de aumentar la cantidad de

anticuerpos afines con la SAM, mientras que se preserva su accesibilidad. Una posible

solución es la construcción de una capa de oro 3D con nanopartículas de oro. Estas

partículas de oro de tamaño nanométrico, se han utilizado con éxito para mejorar la

sensibilidad de los ensayos de detección biomoleculares, ya sea mediante la mejora de

la inmovilización de anticuerpos, o mediante el aumento de la sensibilidad de algunas

de las técnicas de detección específicos como técnicas electroquímicas, resonancia

deplasmón de superficie ( SPR ), microbalanza de cristal de cuarzo ( QCM ) o superficie

de mayor dispersión Raman ( SERS ) (Morel A.-L. , 2010).

La interfaz biológica de un inmunosensor, se basa en anticuerpos que están

inmovilizados preferiblemente a la superficie del transductor a través de una capa de

anclaje en diversas formas. Las monocapas autoensambladas se han utilizado

diferentes químicas de superficie. La inmovilización óptima de moléculas de anticuerpo,

depende de la capa de anclaje de superficie y de sus grupos funcionales específicos, así

como de los residuos de reactivos disponibles presentes en anticuerpos o sus fragmentos

respectivos. La inmovilización se logra típicamente usando una gama de reactivos de

reticulación bifuncionales con grupos reactivos tales como aldehídos y ésteres de

succinimida. Estos forman enlaces covalentes selectivamente con grupos amino de la

lisina, en regiones expuestas de solventes de inmunoglobulinas (Billah M. M., 2010).

Los anticuerpos al azar, inmovilizados sobre la superficie del transductor pueden llegar

a ser inaccesibles para el reconocimiento del analito debido al impedimento estérico del

sitio de combinación. Sin embargo, el puente de disulfuro presente en la región bisagra,

puede ser sometido a un procedimiento de reducción controlada para generar una mejor

inmovilización. Adicionalmente, los -SH libres se pueden utilizar para proporcionar la

inmovilización orientada con el sitio de reconocimiento de anticuerpo libremente

disponible. Esto debe resultar en una mayor accesibilidad para los antígenos, una

cinética de interacción menos variable, y por lo tanto, la mejora del reconocimiento del

analito. El 4 –aminotiofenol( 4 - ATP ), ha generado la formación de monocapas bien

ordenados en el oro. Este método es sencillo, de bajo costo, y proporciona un mejor

control sobre el contacto entre el transductor y la proteína (Billah M. M., 2010).

Detección del VPH mediante anticuerpos

Métodos moleculares para la detección de virus se han estudiado significativamente,

estos métodos como lo son la microscopía de inmunoflourescencia, electrón inmune o

ligado a enzimas (ELISA), consisten en la interacción entre un antígeno viral y un

anticuerpo para lograr realizar la interacción mediante moléculas cromogénicas o

inmunohistoquímicas (detección del antígeno en la lesión) y las basadas en la detección

del ADN viral mediante hibridación o amplificación (Ramírez Cifuentes & Urrego

Hoyos, Estudio de la inmovilización de un anticuerpo monoclonal sobre oro y , 2012).

Respecto a los métodos inmunohistoquimicos, existen dos tipos: el método

inmunohistoquimico directo y el inmunohistoquimico indirecto. En el primer método, el

anticuerpo específico que es afín con una sustancia determinada, está marcado con

partículas detectables al microscopio como por ejemplo fluorescencia o peroxidasa,

mientras que en el segundo método la señal del anticuerpo se amplía realizando

sucesivas capas de anticuerpos o marcadores como peroxidasa/antiti-peroxidasa o

complejos de avidina biotina peroxidasa (Ramírez Cifuentes & Urrego Hoyos, Estudio

de la inmovilización de un anticuerpo monoclonal sobre oro y , 2012).

Otro de los métodos para la detección del VPH es el de Kornya et al, el cual consiste en

un diagnóstico molecular mediante el ensayo de

DigeneHybrid Capture

HPV-DNA, en

el que se emplea una prueba de hibridación líquida en una amplificación de la señal de

quiminioluminiscencia, para distinguir alguno de los 14 tipos de VPH que pertenecen a

los grupos de bajo riesgo, intermedio y alto sucesivamente. En este método las muestras

se hibridizan con una solución específica de VPH y ARN, este híbrido de ARN se

adhiere a la pared del tubo de ensayo la cual está recubierta con anticuerpos

monoclonales (Laurence Kornya, 2002).

Deposición de oro

Las propiedades de películas delgadas sobre superficies aisladoras son de gran interés

en la generación de nuevos dispositivos electrónicos, magnéticos y ópticos. Estas

propiedades tienen una estrecha relación con las características microestructurales de las

películas como por ejemplo el tamaño del grano, la estructura cristalina, la topografía

películas delgadas se clasifican en métodos puramente físicos como la evaporación

convencional, epitaxial y reactiva y métodos puramente químicos como procesos de la

fase química gas-líquido. La técnica más usada es la evaporación térmica convencional,

por ser una técnica económica y de buena eficiencia. El proceso consiste en la

producción de un vapor por ebullición o sublimación de un material fuente, seguido de

la transportación del material desde la fuente al substrato, finalmente el vapor se

condensa en una película sólida en la superficie del substrato (Gonzales E. , 2011).

Los principales parámetros físicos y químicos de las películas delgadas son los

siguientes: eléctricos como conductividad, resistencia, constante dieléctrica, rigidez

dieléctrica, estabilidad bajo polarización, polarización, permitividad, electromigración y

dureza de radiación; térmicos como coeficiente de expansión, conductividad térmica,

variación de la temperatura, estabilidad, temperatura térmica de fusión, presión de

volatilidad y vapor; mecánicos como tensión intrínseca del compuesto, anisotropía,

adhesión, dureza, densidad, ductilidad, elasticidad; morfológicos como cristalino o

amorfo, estructura y densidad de defectos, conformación, microestructura, topografía

superficia y orientación cristalográfica; ópticos como índice de refracción, adsorción,

birrefringencia, característica espectral. Dispersión, luminiscencia; magnético como

flujo de densidad de saturación, fuerza coercitiva, permeabilidad y finalmente química

como composición, impureza, reactividad con el substrato y ambiente, estabilidad

termodinámica, resistencia a la corrosión y erosión, toxicidad, hidroscoídad, barrera de

impurezas o efectiva generación, estabilidad química (Gonzales E. , 2011).

Por otro lado, mediante el método de evaporación en vacío, la primera etapa del sólido a

evaporar es sometida a una elevada temperatura, por encima de la temperatura de

ebullición, donde cambia de estado de agregación (líquido-vapor) consiguiendo formar

propiedades de recorrido medio, hasta sublimarse en un substrato donde adhiere en

forma de capa delgada (Gonzales E. , 2011).

Adicionalmente, los sustratos de oro policristalinos presentan una estructura granulada

caracterizada por múltiples fronteras, facetas, oclusiones y otras irregularidades. Un tipo

de defectos inherentes a la formación de la SAM en oro son las vacantes monoatómicas,

esto es, regiones donde la altura de la SAM es mayor que la del resto en una cantidad

igual a un diámetro atómico de oro. El origen de estos defectos se entiende

considerando la estructura de la superficie del oro previamente a la adsorción de la capa.

(Raya, 2009).

Los parámetros más importantes para la deposición de películas por evaporación

térmica en vacío son: la presión de la cámara de evaporación, la tasa de deposición y la

temperatura del sustrato. Adicionalmente la presencia de gases residuales en la cámara

afecta tanto la pureza como la estructura de la película. Los gases adsorbidos afectarán

la movilidad de los átomos en la superficie favoreciendo la formación de granos

pequeños si el gas es atrapado. Si el material es evaporado y el gas residual presenta

afinidad química, pueden presentarse formación de compuestos, por esta razón si se

desea películas relativamente puras se recomienda trabajar con presiones del orden de

10-6 Torr o menores (Gonzales E. , 2011).

Por su parte, a bajas velocidad de deposición, el porcentaje de formación de núcleos es

pequeño y el tiempo libre medio de la movilidad de los átomos en superficies cristalinas

de baja energía libre. Las películas obtenidas tienen baja aspereza y una estructura

medianamente compacta, sin embargo, al aumentar la velocidad y el porcentaje de

deposición, aumenta la densidad de la película y la suavidad de la superficie. En su

mayoría, el tamaño promedio de los granos es constante, pero a velocidades y

superficie presentan alta movilidad. En conclusión el tamaño posible de un cristal

depende del camino libre medio de los átomos en la superficie (Gonzales E. , 2011).

Con un aumento en la temperatura del substrato, se logra no solamente una limpieza en

la superficie sino que suministra átomos incidentes la energía de activación necesaria

para que estos adopten una posición de alineamiento con la red del substrato. Al

aumentar la temperatura del substrato se favorece la formación epitaxial (Gonzales E. ,

2011).

Elaboración de las SAMs

Las superficies de los metales tienden a adsorben el material orgánico ya que, de esta

manera se disminuye la energía libre de la interface entre el material y el ambiente,

estos adsorbatos alteran las propiedades interfaciales y pueden tener una influencia

importante en la estabilidad del metal. Los SAMs (monocapas autoensambladas) son

ensamblajes orgánicos formados por la adsorción de constituyentes moleculares desde

una disolución o fase gaseosa en la superficie de un sólido. Estos adsorbatos se

organizan espontáneamente originando estructuras cristalinas o semi-cristalinas (Raya,

2009).

Existen diferentes grupos cabeza que se unen a metales para formar la monocapa, las

más estudiadas son los alcanotioles en oro, esto se logra debido a la afinidad que

presentan los tioles en las superficies de metales nobles. (Raya, 2009)

La preparación de las SAMs en oro, plata, mercurio y otros metales consiste en la

inmersión del sustrato limpio en una disolución etanólica de tiol diluida, cabe resaltar

que existen una serie de factores experimentales que pueden afectar la estructura de la

SAM resultante y la velocidad de formación como son: el disolvente, la temperatura, la

concentración de oxígeno en la disolución, la limpieza del sustrato y la longitud de la

cadena (Raya, 2009).

Las SAMs formadas por alcanotiol se describieron originalmente como “

overlayers

” de

tiolato (estructuras quimisorbidas formadas por la activación delenlace SH en la

superficie del oro). La formación de un tiolato requiere la activación química del enlace

SH del tiol (o del S-S en el disulfuro). Aún no se ha determinado sin ambigüedad el

destino del H de los grupos SH, la interacción del enlace Au-S en el tiolato es suficiente

para retener las cadenas en la superficie en forma duradera y evitar una desorción

recombinativa del producto disulfuro a temperatura ambiente (Raya, 2009).

Estudio anterior, Universidad de los Andes 2012

Estudios anteriores han diseñado un prototipo de un microsistema fluídico estático, el

cual consta de una lámina de acrílico compuesta con orificios organizados en 7 filas y

14 columnas cada una de 2mm de diámetro e intercaladas por orificios de 1mm de

diámetro, en dichos orificios de 1mm se hayan filamentos metálicos de plata con el fin

de cuantificar la diferencia de impedancia en los orificios de 2mm de diámetro. Cabe

resaltar, que la lámina de acrílico es fijada a una lámina de vidrio con oro. En los

orificios de 2 mm se encuentra la reacción de formación para la capa de tioles o en otras

palabras, la inmovilización de anticuerpos. Se encontró que las mejores concentraciones

para una mayor inmovilización son de 20 mM para el 4-aminotiofenol y 100 µg/ml

para el anticuerpo (Ramírez Cifuentes & Urrego Hoyos, Estudio de la inmovilización de

un anticuerpo monoclonal sobre oro y , 2012). Sin embargo, el estudio presentó

inconvenientes en el auto-ensamblado primordialmente en el sellado, afectando el

desempeño del microsistema debido a la falta de robustez del mismo. Cabe resaltar que

el costo de manufactura fue elevado dificultando así su reproducibilidad y posible

Comprobación de la inmovilización

Con el fin de comprobar si existe inmovilización del anticuerpo sobre la SAMs, es

posible aplicar técnicas electroquímicas, análisis microscópico, entre otras. A

continuación, se describen las técnicas empleadas en el presente proyecto.

Análisis de Impedancia Eléctrica

La impedancia eléctrica (Z), es una propiedad inherente a los materiales electrónicos.

Esta propiedad, se refiere a la oposición de cada material al flujo de corriente alterna, a

una frecuencia determinada. Por medio de la ley de Ohm, la impedancia eléctrica se

define como el cociente entre la tensión sinusoidal del material (V) y la corriente

sinusoidal resultante (I) (Pallás Areny R. , 2006):

1

La impedancia, se describe a partir de un módulo definido como el cociente entre V e I,

y su fase definida como el desfase entre V e I. De acuerdo con esto, es posible definir la

impedancia a través de un número complejo como sigue (Pallás Areny R. , 2006):

2

Adicionalmente, representación polar está dada por (Pallás Areny R. , 2006):

| |

| |

3

En las ecuaciones 2 y 3, R representa la resistencia y la parte real de la impedancia, X

es la reactancia y la parte imaginaria de la impedancia,

| |

hace referencia al módulo

expresado en ohm, y es el ángulo de desfase entre I y V expresado en radianes. R y X,

varían en función de la frecuencia utilizada, dado que la impedancia difiere para cada

valor de la frecuencia de la señal empleada, y es constante en algunos rangos

determinados (Pallás Areny R. , 2006).

La impedancia, es una medida apropiada cuando se busca describir la conexión en serie

Los medidores de impedancia, permiten realizar la medición de los parámetros

descritos, con el fin de caracterizar componentes electrónicos o materiales. Las

mediciones de impedancia, pueden realizarse a diferentes frecuencias fijas por medio de

medidores LCR o RCL los cuales arrojan resultados numéricos, o en un rango

específico de frecuencias a través de analizadores de impedancia, los cuales presentan

resultados de forma gráfica y numérica, y permiten la selección de un modelo adecuado

para la realización de mediciones (Pallás Areny R. , 2006).

Un estudio anterior, desarrolló la comprobación de inmovilización de anticuerpos sobre

una SAMs, empleando un analizador de impedancias ubicado en el laboratorio de Sala

Limpia de la Universidad de los Andes. Por medio de este, fue posible observar

variaciones de impedancia bajo diferentes configuraciones y variaciones en la

concentración de 4-aminotiofenol y anticuerpo utilizados, así como la comprobación de

la inmovilización del anticuerpo utilizado (Ramírez Cifuentes & Urrego Hoyos, Estudio

de la inmovilización de un anticuerpo monoclonal sobre oro y , 2012).

Generador eléctrico y osciloscopio

Un generador eléctrico, es un dispositivo el cual mantiene una diferencia de cargas

eléctricas o voltaje entre dos puntos. Este principio se da por medio del cambio de la

energía mecánica en eléctrica, y se conoce como

acción del generador

o principio de

inducción. De esta forma, el voltaje se induce cuando en un conductor dentro de un

campo magnético, cuando el flujo magnético se corta por el conductor (Harper, 2004).

Un osciloscopio, es un instrumento de medidas precisas que permite analizar señales

variables con el tiempo y comparar la señal a dos magnitudes diferentes. Un

osciloscopio, permite medir diferencias de potencial, a partir de lo cual es posible

determinar de forma indirecta intensidades de corriente y otras magnitudes (Gómez

Al utilizar un generador y un osciloscopio de forma simultánea, es posible determinar la

diferencia entre las resistencias totales de una muestra con solo oro, oro-tiol y

oro-tiol-anticuerpo sobre una SAMs. Esto se da por medio de la relación entre el voltaje

aplicado por el generador, y la medida de las resistencias en diferentes puntos de cada

muestra:

4

En la ecuación 4, es el voltaje que pasa por cada resistencia de una muestra

(determinado a partir del osciloscopio), es el voltaje aplicado por el generador, es

la resistencia total de un punto en la muestra y

es la resistencia total de la muestra

estimada previamente a 1 MHz de frecuencia.

Microscopio Electrónico de Barrido SEM

El microscopio electrónico de barrido SEM, permite obtener imágenes de una

superficie, empleando altas resoluciones y apariencias tridimensionales en un intervalo

de aumentos. El SEM, permite desarrollar microanálisis de muestras con el fin de

determinar la presencia cualitativa o cuantitativa de elementos a nivel microscópico.

La construcción de las imágenes en el SEM, se da a partir de la emisión de electrones

secundarios de una muestra, al incidir un haz enfocado de electrones de alta energía

sobre ésta. Adicionalmente, se presenta emisión de rayos X, los cuales aportan

información sobre la composición del material de estudio. Las señales se detectan a

través de un detector como se ilustra en la Figura 1 (Hernández Albañil & Espejo Mora,

Figura 1

Detección de señales en el SEM: Emisión de electrones, rayos X y fotones a partir de la interacción de un

haz incidente de electrones

(Hernández Albañil & Espejo Mora, 2001)

.

A partir de colisiones generadas entre los electrones del haz incidente y los electrones dl

material de la muestra, se genera la emisión de electrones y rayos X. Estas colisiones

pueden ser elásticas e inelásticas. Las primeras, hacen que los electrones del haz

primario salgan de la superficie de la muestra sin una significativa pérdida de energía.

Por el contrario, las colisiones inelásticas, como ocurre en la mayoría de los casos,

emiten electrones de baja energía llamados electrones secundarios (Hernández Albañil

& Espejo Mora, 2001).

A partir del análisis de muestras por medio de un SEM, es posible determinar

diferencias físicas entre una muestra con solo oro, oro-tiol y oro-tiol-anticuerpo, con el

fin de determinar una posible inmovilización de anticuerpo monoclonal del VPH.

Estudios anteriores, determinaron una posible inmovilización de un anticuerpo, a partir

del análisis de muestras en un SEM, observando diferencias físicas significativas entre

una muestra con solo oro, oro-tiol y oro-tiol-anticuerpo (Ramírez Cifuentes & Urrego

Microscopio de Fuerza Atómica AFM

El Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) es un instrumento mecano-óptico capaz de

detectar fuerzas del orden de los nanonewton. (Habana, Universidad de la habana,

2013)Al analizar una muestra, registra continuamente la altura sobre la superficie de

una sonda o punta cristalina muy aguda de un par de micras de largo y menos de 100 Å

de diámetro con forma piramidal. La punta se localiza al final del brazo del cantilever

de 100 a 200 micras de largo. La fuerza entre la punta y la superficie de la muestra hace

que el cantilever se doble o flexione, un detector mide esta flexión que ocurre

conforme la punta barre la superficie y con ello se obtiene un mapa topográfico, este

tipo de medida puede ser aplicada tanto a materiales aislantes, semiconductores o

conductores. Varias son las fuerzas que contribuyen a la flexión del cantilever siendo la

más común la fuerza de van der Waals. (Microscopia de Efecto Túnel y Fuerza

Atómica, 2013)

Como dato adicional, este microscopio no utiliza la luz para poder analizar su objetivo,

la punta descrita anteriormente “siente” la superficie del objeto , A veces, científicos

ponen nanotubos de carbono en el extremo de la punta para hacerla aún más puntiaguda.

Una punta de nanotubos de carbono es tan puntiaguda, que es solamente unos pocos

átomos de ancho. ( National Nanotechnology Infrastructure Network, 2005)

La resolución del instrumento es de menos de 1 nm, y la pantalla de visualización

permite distinguir detalles en la superficie de la muestra con una amplificación de varios

millones de veces (Habana, Universidad de la habana, 2013). Como principal ventaja,

tiene la posibilidad de hacer medidas sin ningún tratamiento previo de la muestra a

medir y sin la necesidad de emplear vacío (Centro nacional de microscopia electronica,

Uso de anticuerpos en biosensores

Paolo Actis y colaboradores proponen un modelo que se fundamenta en nanopeptidas

sensibles para la detección de antígenos de VPH basado en la fijación de un

biomarcador como un aticuerpo o proteína; sin embargo, el prototipo realiza una sola

prueba para un determinado tipo de VPH dependiendo del anticuerpo que se utiliza, la

detección de virus se hace voltametría cíclica dificultando la medición por parte de la

persona a cargo y aunque los costos se reduzcan en la fabricación del modelo, se

incrementa en la medición de las pruebas. (Actis, Umehara, Karhanek, Cheng, &

Pourmand, 2009)

KelsieTimbie propone la construcción de un biosensor que sea capaz de distinguir entre

las células cancerosas y normales por medio de una medición de espectroscopía de

impedancia electroquímica (EIS). Este biosensor se compone de un portaobjetos de oro

recubierta directamente de anticuerpos, y electrodos, contraelectrodos y un electrodo de

referencia de Ag/AgCl para las repectivas mediciones. (Timbie, 2009). Otros estudios,

analizan biosensores basados en biomarcadores para diagnósticos médicos. (mascini &

Tombelli, 2008) ( Stephen , Sang , & Castro , 2010)

Contenido del proyecto

El presente trabajo, se busca consolidar la tecnología de fabricación de un biosensor, en

el cual se inmoviliza un anticuerpo monoclonal sobre oro, y sobre una capa

auto-ensamblada de tioles con el fin de detectar la presencia del virus del papiloma humano

tipo 16. El anticuerpo, actúa como bioreceptor en la detección del virus, proponiendo así

una alternativa rápida y eficaz en la medicina, en comparación a estudios alternos que

requieren de tiempos mayores para la obtención de diagnósticos, preparación de

muestras, etc. Actualmente, el método más aplicado en la detección del virus se conoce

examina la presencia de secuencias de ADN del virus del papiloma humano. Se basa en

una obtención de muestra de células bien sea tomada para una prueba Papanicolau, o

una muestra separada tomada después de la primera. Existen cuatro pruebas de VPH; la

más común, busca verificar si una mujer presenta VPH de alto riesgo, la segunda

detecta el ADN de los tipos 16 y 18, la tercera detecta el ADN de los virus de alto riesgo

indicando a su vez si se trata de VPH-16 o 18 y la última consiste en la detección del

ARN de los tipos más comunes de VPH de alto riesgo (GeoSalud, 2012).

En resumen, se desea adaptar técnicas de fabricación con el fin de reducir el costo del

uso de reactivos y de fabricación de la monocapa autoensamblada para poder obtener un

prototipo mucho más robusto y con un diseño mejorado. Se busca hacer del prototipo un

producto de fácil manipulación, tal que cualquier persona se encuentre en la capacidad

de utilizarlo sin necesidad de tratarse de un especialista. Finalmente, se identificará un

modelo de decisión adecuado con el fin de analizar y comparar la técnica desarrollada

de auto-ensamblaje con las alternativas estándares de detección del VPH 16, aplicando

conceptos de la teoría de decisión, con el fin de determinar cuál de las alternativas es la

más conveniente a utilizar bajo determinados escenarios, teniendo en cuenta los criterios

CAPITULO II

METODOLOGÍA

Preparación de los reactivos

Solución de tioles: Para obtener una concentración de 20 mM de 4-aminotiofenol (4-

ATF), se disuelven 0.0245 g de 4-ATF en 9.8 mL de etanol (Ramírez Cifuentes &

Urrego Hoyos, Estudio de la inmovilización de un anticuerpo monoclonal sobre oro y ,

2012).

PBS-Tampón fosfato salino: Se realiza una mezcla con 0.16 g de cloruro de sodio, 0.04

g de cloruro de potasio, 0.023 g de fosfato de sodio dibásico, 0.04 g de anhídrido de

fosfato de potasio y 20 ml de agua des-ionizada. Posteriormente, es necesario llevar a

cabo un ajuste del pH resultante en la mezcla, adicionando hidróxido de sodio o ácido

clorhídrico según se requiera hasta llevar la solución a un pH de 7.2 (Ramírez Cifuentes

& Urrego Hoyos, Estudio de la inmovilización de un anticuerpo monoclonal sobre oro y

, 2012).

Selección de los materiales para la elaboración del biosensor

Se realiza una amplia revisión de literatura con el fin de determinar la compatibilidad

entre los materiales a utilizar, a partir del reconocimiento de sus propiedades físicas y

químicas y de los costos que genera la utilización de éstos.

En el estudio realizado anteriormente, la placa base de vidrio y las placas superiores de

acrílico, presentaron problemas de sellabilidad, ocasionando que los reactivos se

esparcieran y contaminaran los demás orificios (Ramírez Cifuentes & Urrego Hoyos,

Al contaminar los orificios contiguos se obtenían fallas experimentales, por tal razón es

necesario eliminar este problema y obtener un prototipo más robusto en comparación

con el diseño preliminar.

Elaboración de las láminas de acrílico

Debido a la falta de sellabilidad del prototipo preliminar, se elaboran diferentes planos

en el software Corel DRAW® Graphics Suit con el fin de modificar la geometría para

obtener un diseño más robusto. Una vez diseñados los planos, las láminas de acrílico se

cortan con la máquina de corte laser serie CF, modelo CF1306.

Para hacer el ensamblaje se cortan tres láminas de acrílico (por cada biosensor a

fabricar), cada una de 2 mm de grosor, 2.5 cm de ancho y 7.5 cm de largo. La primera,

se mantiene completamente lisa en su superficie, mientras que las otras dos se cortan de

acuerdo a las geometrías previamente determinadas (cortes realizados con láser). Una de

éstas, consta de orificios organizados en 7 filas y 14 columnas, cada una de 2mm de

diámetro e intercaladas por orificios de 1mm de diámetro. La otra, está compuesta por

orificios organizados en 7 filas y 14 columnas, cada una de 2 mm de diámetro con los

orificios interconectados unos con otros de forma horizontal. A continuación, se pega la

lámina de superficie sólida y/o continua, a la lámina con orificios interconectados.

Elaboración de la capa nanométrica de oro

Se evapora oro sobre la lámina de acrílico, por medio del metalizador DENTON

VACUUM Desk IV, ubicado en el centro de Microscopía de la Universidad de los

Andes, alcanzando aproximadamente 35 nm de grosor sobre éstas. Las láminas

porta-muestras, se ubican sobre la placa del evaporador, de tal forma que se optimice el área

de evaporación maximizando el número de porta-muestras recubiertas en oro. Las

Presión de vacío del sistema: Por debajo de 100 mTorr.

Corriente del equipo: Depende de la presión en el mismo, en general varió entre 39 y

41 mAMP.

Tiempo de evaporación: 660 seg

Cabe resaltar que el tiempo de evaporación del equipo se determinó variando el tiempo

y comprobando que la deposición de oro fuera adecuada, en el primer experimento se

seleccionó un tiempo de 720 seg, en el segundo de 240 seg, el tercero de 480seg y el

cuarto de 660seg.

A continuación, se realiza una limpieza sobre las láminas evaporadas de tal forma que el

recubrimiento con oro quede únicamente sobre la lámina de superficie continua, y se

une la tercera lámina de acrílico (orificios separados) sobre las otras dos previamente

recubiertas en oro.

La adecuación del porta-muestras para las mediciones, se obtiene recubriendo los

orificios de las láminas de acrílico de 1mm de diámetro con pintura conductiva

electrónica, posteriormente, ubicando filamentos metálicos de plata en los mismos, para

habilitar distintos puntos de medición de resistencia e impedancia.

Fabricación de la monocapa autoensamblada

Se adicionan las concentraciones determinadas en el estudio realizado por Ramírez &

Urrego (2012), para dar lugar al enlace amino4-ATF-oro. Por medio de la adición

oxidativa del enlace S-H a la capa nanométrica de oro, seguida de una eliminación

reductiva del hidrógeno, se da lugar a la formación de una estructura ordenada a partir

de las moléculas. A continuación, se genera la unión del oro-amino4-ATF-mAb 5051, la

cual se da de forma espontánea por la gran afinidad entre el grupo carboxilo de la cola

Procedimiento para realizar la monocapa autoensamblada: Se adiciona la solución de

4-ATF a la capa de oro, se deja actuar durante 4 horas, a continuación se lava con etanol y

agua desionizada para retirar los 4-ATFes que no fueron adheridos a la monocapa

autoensamblada. Posteriormente, se adiciona el mAb 5051 y se deja incubar durante 1

hora a temperatura de 37°C, finalmente se lava con PBS y agua desionizada.

Las concentraciones definidas para llevar a cabo la inmovilización, son de 20 mM para

el 4-ATF y 100 µg/ml para el mAb 5051 (Ramírez Cifuentes & Urrego Hoyos, Estudio

de la inmovilización de un anticuerpo monoclonal sobre oro y , 2012).

Observación de superficies inmovilizadas

Elaboración de portamuestras: Con el fin de observar una aparente inmovilización del

mAb 5051, se realizan tres cortes de acrílico de 1.5 x 2.5 cm de lado y se evaporan en

oro bajo las condiciones anteriormente establecidas. Una de las láminas se deja con solo

oro, a la segunda se le adiciona la solución de 4-ATFes y en la última se desarrolla el

proceso de inmovilización del mMMAb 5051.

Observación de la superficie en SEM: Se observan las láminas en el mini SEM ubicado

en el Laboratorio 418 del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de los

Andes. Se obtienen imágenes de la lámina con solo oro, oro – 4-ATF y oro – 4-ATF –

mAb 5051, y se observan las diferencias físicas de las muestras.

Observación de la superficie en AFM: Se observan las láminas en AFM ubicado en el

Departamento de Microscopía de la Universidad de los Andes. Se obtienen imágenes de

la lámina con solo oro, oro – 4-ATF y oro – 4-ATF – mAb 5051, y se observan las

Verificación del desempeño del biosensor

Verificación de una adecuada deposición de oro: Después de realizar la evaporación

sobre las láminas se determina si la deposición de oro fue correcta. Para esto existen

diferentes maneras de comprobarlo, una de estas es eléctricamente, como por ejemplo,

determinar si el sistema presenta conductividad o no. Con ayuda de un multímetro

digital “Peak Tech Multifunction Tester 3725”se mide la conductividad en diferentes

partes de la lámina de oro, si hay conductividad significa que la deposición de oro fue

adecuada.

Comprobación de la calidad del sellado: Se realizan lavados con etanol, isopropanol y

agua destilada con el fin de verificar la fortaleza del enlace (oro-amino4-ATF-mAb

5051).

Verificación de la inmovilización mediante mediciones de resistencia con multímetro:

Se desarrollan pruebas de medición de resistencia, por medio de un multímetro digital

“Peak Tech Multifunction Tester 3725”, comprobando que el enlace

oro-amino4-ATF-mAb 5051 haya sido correcto, observando las diferencias de resistencia en cada una de

las mediciones realizadas.

Verificación de la inmovilización mediante mediciones de impedancia a altas

frecuencias: Se desarrollan pruebas de medición de impedancia a altas frecuencias

(hasta 939 MHz),con el analizador de impedancias ubicado en el Laboratorio Sala

Limpia del Departamento de Ingeniería Eléctrica y Eléctrónica de la Universidad de los

Andes, omprobando que el enlace oro-amino4-ATF-mAb 5051 haya sido correcto

mediante el análisis de las diferencias en la medición con la capa libre de enlaces,

oro-amino4-ATF y oro-oro-amino4-ATF-mAb 5051 (Tanto para las mediciones de resistencia

medición, dado que el valor resultante en cada uno de los casos varía con la distancia

entre punto y punto).

Verificación de la inmovilización mediante mediciones de resistencia con generador

eléctrico y osciloscopio: Se estima la resistencia de cada pozo del biosensor, a partir de

mediciones de voltaje en cada uno de estos. El voltaje se mide por medio de un

osciloscopio“OSCI8489 Tektronik - TDS 1002 Two Channel Digital Storage

Oscilloscope”, el cual funciona de forma simultánea con un generador eléctrico “GENE

554 - Programable Function Generator HM8130 HAMEG”. El generador se condiciona

a 1 MHz de frecuencia y se realizan mediciones para 0.7 V, 1.4 V y 2.1 V. Finalmente,

se estima la resistencia total del biosensor con solo oro, oro-4-ATF y oro-4-ATF-mAb

5051, a partir de la ecuación 4.

Determinación del mejor rango de frecuencias en la medición de impedancia: A partir

de los resultados obtenidos con las mediciones de impedancia, se determinan rangos y

valores específicos de frecuencias en las cuales es posible detectar las diferencias más

significativas entre las muestras con solo oro, oro-4-ATF y oro-4-ATF-mAb 5051.

Verificación del desempeño del biosensor con VPH

Para la verificación del desempeño del biosensor se realiza una prueba en campo, con la

colaboración de la Doctora Esperanza Tuezaba Torres, médica patóloga, directora

general y científica de PATOLAB (PATOLAB LTDA, 2013), Laboratorio de Patología

y Citología con 24 años de experiencia.

Aplicación de VPH 16 en el biosensor: La prueba consistió en agregar muestras con

controles positivos (prueba VPH 16 positivo) y negativos (sin presencia de VPH 16), a

con solo oro, oro – 4-ATF y oro – 4-ATF – mAb 5051. Posteriormente se dejan incubar

las muestras durante 1 hora a 37°C, se lavan y finalmente se hacen mediciones de

resistencia impedancia para analizar los cambios observados en la etapa final.

Verificación de la detección de VPH 16 mediante mediciones de resistencia con

multímetro: Se desarrollan pruebas de medición de resistencia, por medio de un

multímetro digital “Fluke 79 III True RMS Multimeter”, comprobando que los pozos en

donde se aplicó muestra con control positivo, presenten diferencias significativas antes

y después de adicionar las muestras con control positivo. De forma similar, se

comprueba que no existan diferencias significativas en los pozos en los cuales se agregó

el control negativo antes y después de éste.

Verificación de la detección de VPH 16 mediante mediciones de impedancia a bajas

frecuencias: Se desarrollan pruebas de medición de impedancia a bajas frecuencias

(1kHz, 120 Hz y 100 Hz), por medio de un medidor de impedancias “Standford

Research Systems Model SR 715 LCR Meter”. Se realiza una comparación entre las

mediciones obtenidas con los controles positivos y negativos para el oro, oro – 4-ATF y

oro – 4-ATF – mAb 5051.

Estimación y comparación de costos de la técnica de fabricación del biosensor y de

técnicas tradicionales de detección.

Costos del biosensor: Se determinan los costos de fabricación del biosensor realizado en

el presente proyecto y del prototipo desarrollado en el estudio anterior, con el fin de

comparar los costos resultantes de fabricación en cada caso (Ramírez Cifuentes &

Urrego Hoyos, Estudio de la inmovilización de un anticuerpo monoclonal sobre oro y ,

Costos de alternativas tradicionales: Se identifican las alternativas estándares de

detección del VPH16 y sus respectivos costos de implementación.

Modelo de comparación: Se identifica un modelo basado en la teoría de la decisión, con

el fin de comparar las alternativas tradicionales de detección con el biosensor fabricado,

teniendo en cuenta los costos establecidos.

Resultados de la comparación: Se analizan los resultados obtenidos a partir de la

aplicación del modelo de decisión, determinando cuál es la mejor opción para llevar a

CAPITULO 3

RESULTADOS

Selección de los materiales para la elaboración del biosensor

En la Tabla 1 se presentan las ventajas y desventajas de diferentes materiales con el fin

determinar la mejor condición para hacer la base del biosensor donde se realizará la

deposición de oro.

Debido a que el acrílico parece ser el material más adecuado para la realización de la

base del biosensor, se desarrollan comparaciones de éste con cada uno de los materiales

candidatos.

Posteriormente, con las descripciones de cada material, se realiza la selección final

aplicando el método ELECTRA, el cual permite comparar de manera simultánea varios

elementos sin perder la integridad de cada uno de ellos. Este método, se basa en la

ponderación y valores otorgados a cada uno de los criterios. Las calificaciones del

método se asignan teniendo en cuenta que 0 es desfavorable, 1 no significativo, 2