PCR y Lateral Flow Aspergillus

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Nuevas herramientas diagnósticas en

Aspergilosis invasiva

:

PCR y Lateral Flow Aspergillus

Dra. Paulette Legarraga Laboratorio Microbiología

Departamento de Laboratorios Clínicos Pontificia Universidad Católica de Chile

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Temas a tratar

1. Introducción métodos tradicionales

2. Lateral flow device

–

Desarrollo del test

–

Nuestra experiencia

–

Desempeño en la literatura

3. PCR

–

Generalidades del PCR

–

Estandarización

–

Experiencia

–

Comparación con literatura

–

Evidencia de la utilidad de este marcador

4. Conclusiones

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Métodos diagnósticos actuales para

infecciones fúngicas invasoras

Método

Características

Visualización directa /Cultivo • Baja sensibilidad (50%) y VPP 72%, colonización

vía aérea

• Dificultad toma de muestra

Galactomanano • Sensibilidad 29 a 100%:

• Varía según: tipo de muestra, paciente y punto de corte

• Falsos positivos entre 5 a 83% (reactividad cruzada) • Complejo? • Costo B-D-glucano • No es especifico • Sensibilidad 64 a 100%, especificidad 45 a 92% • Técnicamente complejo • Costo

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¿Habremos llegado?

PCR y Lateral Flow

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• Purificación de anticuerpos monoclonales MAb JF5 del

tipo IgG contra un epitope glicoproteico de Aspergillus

– Específicos para especies de Aspergillus pero con reactividad

cruzada para Penicillium y Paecilomyces variotii

– Sin reactividad cruzada con β lactámicos o ciclofosfamida

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 Inmunofluorescencia muestra presencia del antígeno en pared y secretada durante crecimiento activo pero no en conidias no germinadas

Localización

glicoproteína

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Desarrollo del test

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Meta-análisis

Pan Z et al. Journal of Medical Microbiology (2015), 64, 702–707

SUERO: Sensibilidad: 0,68(0,52-0,81) Especificidad: 0,87(0,8-0,92) LBA: Sensibilidad: 0,86(0,76-0,93) Especificidad: 0,93(0,89-0,96)

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Evaluación del LFD en muestras de suero y LBA para el

diagnóstico de Aspergilosis invasora en un Hospital

Universitario

• Análisis retrospectivo

• Se evaluaron los antecedentes clínicos de las muestras

de GM congeladas en nuestro laboratorio (2012-2015)

• Clasificación de las muestras según criterios EORTC:

– AI (+): AI probada/probable

– AI (-): no AI

– Se identificaron además las muestras de pacientes con AI

posible

Delama Ignacio 1_{, Legarraga Paulette}2,3_{, González Tamara}3_{, García Patricia}2, 3_{, Rabagliati Ricardo}1

1_{Departamento Enfermedades Infecciosas del Adulto, Pontificia Universidad Católica de Chile,}2_{Departamento de Laboratorios Clínicos,}

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Resultados

• Se analizaron 142 muestras:

– 113 suero

– 29 a LBA

• 98 pacientes:

– 33 AI probada/probable

(33.6%)

– 15 AI posible (15,3%)

– 53 sin AI (54%)

• Neoplasia más frecuente

LMA (25%)

Características pacientes

Mediana de edad 50,9 años

Sexo masculino 59 (60,2%)

Enfermedad de base

Neoplasia hematológica 43 (43,9%) Trasplante de órgano sólido 6 (6,1%) Trasplante de precursores hematopoyéticos 13 (13,3%) Tumor sólido 5 (5,1%) VIH/SIDA 5 (5,1%) Otro 20 (20,4%) Riesgo inmunológico RAN < 500 cel/mm3 11 (11,2%) RAN < 100 cel/mm3 31 (31,6%) Uso de corticoides 22 (22,4%) Terapia inmunosupresora 27 (27,5%)

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Resultados

Sensibilidad % (IC 95%) Especificidad % (IC 95%) LR(+) LR(-) Sangre 70.9%(57.86-81.23) 53.5%(38.92- 67.49) 1.5 (1.354 - 1.717) 0.54 (0.4468 - .662) LBA 83.3%(55.2- 95.3) 38.5%(17.71,-64.48) 1.3 (1.019 - 1.799) 0.43(0.08686-.162) Total 73.1%(61.48- 82.28) 50% (37.33- 62.67) 1.4 (1.344 - 1.592) 0.53(0.4493 -0.426)

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Concordancia con GM

Resultados GM

LFD Negativo Positivo Total general

Negativo 27 26 53

Positivo 27 61 88

Total general 55 87 142

• Concordancia entre ambos métodos de un 62.41%.

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¿Positivo débil?

• Línea leve en todas las muestras incluso con buffer

• Requeriría de establecimiento de “punto de corte” (Held et al. Infection

(2013) 41:1163–1169)

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Estudio multicéntrico

Eigl et al. Critical Care (2015) 19:178

• Alto valor predictivo negativo 96%

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PCR Aspergillus

• Desarrollada hace más de 20 años

• PCR in house

• Muestras: suero, sangre total y LBA

• Desempeño técnica presenta gran variabilidad entre los

estudios

– Muestra utilizada

– Partidores (rRNA, mitocondrial, otro)

– Método de extracción

– Criterios de positividad utilizados

No incluida en los criterios EORTC por falta de

estandarización de los métodos disponibles

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• Recomendaciones

• Estándar acordado por la

WHO que permitirá tener

material para programas de

control de calidad externo

Estandarización

White PL et al. JCM 2010, 48(10):3753 White PL et al. JCM 2011, 49(11):3842.

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Kits comerciales

• PCR-RT desarrollada por PathoNostics (AsperGenie)

• Detección de Aspergillus sp – A. fumigatus

– A. terreus

• Detecta resistencia a azoles (L98H, Tandem repeat 34, T289A, Y121F)

• Uso en muestras LBA

• Tiempo de reacción: 2,5 hrs

• Validado para ser utilizado en LightCycler 480 (Roche), Gene 6000 (Corbett) and Rotor-Gene Q (Qiagen)

• PCR-RT desarrollado por Myconostica • Validado para muestras de suero y

respiratorias • Aprobación CE

• Disponible Kit de extracción

• Tiempo de procesamiento +/-4 hrs (completo)

• Cepheid SmartCycler®, AB7500 (1.4), LightCycler® 2.0 y Stratagene Mx3000 series

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• Objetivo: Desarrollar un test para detección de A. fumigatus en

muestras de sangre, suero, o LBA de pacientes con riesgo de AI

basado en una reacción de Q-PCR dirigida al rRNA 28S

• Se analizaron de manera prospectiva 41 muestras (sangre, suero,

tejido o LBA) de 23 pacientes con riesgo de AI provenientes del

Hospital Clínico de la Universidad Católica.

• Clasificación de los pacientes según criterios EORTC (factores de

riesgo, imagenología, resultados de GMN y cultivo)

• Pacientes con AI posible fueron considerados como negativos

“

Desarrollo de un RT-PCR para la detección de Aspergillus

fumigatus en pacientes con riesgo de aspergilosis

invasora”

Wozniak A, Sanhueza F, Rabagliati R, Vizcaya C, Rivera G, Pérez R, Flores J, Miranda C, Castillo C y P García

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• Partidores dirigidos a zona específica del RNA ribosomal 28S de A.

fumigatus y sonda Taqman (Challier y cols., 2004; J Clin Micro 42:

844-846).

• Se utiliza la plataforma de PCR Tiempo real de Applied Biosystems

(StepOne) con una temperatura de annealing 57°C.

StepOne

(Applied Biosystems)

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Diagnóstico Clínico

Positivo Negativo Total Q-PCR Positiva 15 0 15 Negativa 3 23 26 Total 18 23 41

LOD: 3,85 esporas/reacción

Sensibilidad = 83%

Especificidad = 100%

VPP = 100%

VPN = 88%

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GM

Positivo Negativo Total

Q-PCR Positiva 5 7 12

Negativa 2 23 25

Total 7 30 37

Concordancia (ʎ) = 5 + 23 / 37 = 76%

Índice kappa = ʎ - P_e / 1 - P_e = 0,76 – 0,61 / 1 – 0,61 = 0,38 P_e= 0,61 (proporción de concordancia por azar)

Grado de concordancia real: Discreto

Escala de valoración de kappa según Landis y Koch:

Kappa grado de acuerdo

< 0,00 sin acuerdo >0,00 - 0,20 insignificante 0,21 - 0,40 discreto >0,41 - 0,60 moderado 0,61 - 0,80 sustancial 0,81 - 1,00 casi perfecto