Inhibición de la señal de “quorum sensing” de indol de
Escherichia coli, usando diseño asistido por computador
SANTIAGO MEDINA DUPONT
Asesor:
ANDRES GONZALEZ BARRIOS M.Sc. Ph.D
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA
BOGOTA D.C. JULIO DE 2009
NOTA DE ACEPTACIÓN
DIRECTOR:
Bogotá D.C. Julio de 2009
AGRADECIMIENTOS
Doy gracias a mi mamá por todo el apoyo que me dio durante toda mi
carrera y por brindarme todas las herramientas y condiciones necesarias
para alcanzar mis metas.
A mi asesor de Proyecto de Grado Andrés Fernando González por todo
su apoyo y dedicación. Por su asesoramiento científico y estimulo para
seguir creciendo intelectualmente.
RESUMEN
Estudios anteriores han demostrado que el indol es una señal de “quorum sensing” en Escherichia coli y otras bacterias. En el caso de Escherichia coli, esta señal hace que se regule la formación de biopelículas. La formación de biopelícula hace que estas bacterias se vuelvan más resistentes a antibióticos y a que se expresen genes que codifican para sustancias toxicas. Para el estudio de este comportamiento se presentan los posibles inhibidores de esta señal a los cuales se les hizo una evaluación computacional de su afinidad con el indol. Una vez evaluados se escogerá un inhibidor que tenga alta afinidad por el indol para así proponer posibles mutaciones para incrementar la afinidad de este por el indol y será nuevamente evaluado. Finalmente se realizaron estudios de dinámica molecular, usando el algoritmo de Verlet, para evaluar la estabilidad de las mutaciones. La enzima que se escogió para realizar las mutaciones tenia inicialmente una energía de enlace con el indol de -9,98 kcal/mol. Se reemplazaron los aminoácidos ASN201, ASP 205 y ASN 297 por ALA 201, LEU 205 y LEU 297 respectivamente. Este cambio mejoro la energía de enlace a -41,65kcal/mol. Esto nos permitiría atacar, no solo a Escherichia coli, sino a otras bacterias que usan al indol como señal de “quorum sensing” sin tener que usar antibióticos u tratamientos directos contra las bacterias.
ÍNDICE DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ...1
2. MARCO TEÓRICO ...2
2.1. Escherichia coli ...2
2.2. Formación de biopelícula ...3
2.3. Quorum sensing ...3
2.4. Indol ...5
2.4.1. Indol como señal de “quorum sensing” para la formación de biopelícula ...6
2.5. Quorum quenching ...8
2.6. Indol oxidasa ...8
2.7. Diseño molecular computacional ...9
2.7.1. Calculó de la energía de enlace ... 11
2.7.2. Gráfico de Ramachandran ... 12
2.7.3. Docking molecular ... 12
2.7.4. Dinámica molecular ... 13
3. METODOLOGÍA ... 15
3.1. Búsqueda de enzimas que tengan como ligando el indol. ... 15
3.2. Identificación del sitio activo de las enzimas ... 15
3.3. Evaluación de la afinidad del indol por las enzimas (Docking ... 16
3.4. Evaluación de la simulación hecha por AutoDock®. ... 17
3.5. Análisis de posibles mutaciones. ... 17
3.6. Evaluación de la estabilidad de los aminoácidos del sitio activo usando dinámica molecular ... 18
4. ANÁLISIS Y RESULTADOS ... 20
4.1. Enzimas que tengan como ligando al indol... 20
4.2. Identificación del sitio activo de las enzimas ... 20
4.4. Evaluación de la simulación hecha por AutoDock® ... 21
4.5. Resultados de las cinco enzimas que tienen al indol como ligando ... 22
4.5.1. Información y resultados de la Enzima 1 (185L) ... 22
4.5.2 Información y resultados de la Enzima 2 (1EG9) ... 35
4.5.3. Información y resultados de la Enzima 3 (1LH4) ... 46
4.5.4. Información y resultados de la Enzima 4 (1O7N) ... 58
4.5.5. Información y resultados de la Enzima 5 (1UUV) ... 70
4.6. Selección de enzima para realizar mutaciones ... 81
4.7. Mutaciones en 1O7N ... 83
4.8. Análisis de estabilidad molecular usando dinámica molecular ... 90
4.8.3. Dinámica molecular a temperatura constante ... 91
4.8.4. Dinámica molecular a Temperatura variable ... 99
5. CONCLUSIONES ... 108
6. PERSPECTIVAS ... 109
7. BIBLIOGRAFÍA ... 111
ÍNDICE DE IMAGENS
Imagen 1: Estructura de la molécula de Indol [29] ...5
Imagen 2: Estructura y átomos de la molécula de Indol [29] ...5
Imagen 3: Intercambio de indol en la célula [3] ...6
Imagen 4: Coordenadas del indol en la enzima (185L) [31] ... 23
Imagen 5: (185L) Ligandos [32] ... 24
Imagen 6: (185L) Interacciones Hidrofóbicas C-C [32] ... 25
Imagen 7: (185L) Interacciones hidrofóbicas polares [32] ... 26
Imagen 8: (185L) Aminoácidos escogidos para efectuar rotaciones en AutoDock® [33] ... 27
Imagen 9: (185L) La mejor conformación [34] ... 28
Imagen 10: (185L) Clusters (2.0 RMS) [34] ... 29
Imagen 11: (185L) Clusters (2.5 RMS) [34] ... 29
Imagen 12: (185L) Aminoácidos rotados para evaluar energía de enlace [33] ... 30
Imagen 13: (185L) Gráfico de Ramachandran después de la simulación [33] ... 31
Imagen 14: (185L) Gráfico de Ramachandran antes de la simulación [33] ... 31
Imagen 15: (185L) Conformación con la menor energía del ligando interactuando con la macromolécula [34] ... 32
Imagen 16: (185L) Interacciones entre los aminoácidos seleccionados y el ligando (esferas verdes) [34] ... 33
Imagen 17: (185L) Interacciones del indol con los 7 aminoácidos del sitio catalítico [34]... 34
Imagen 18: (1EG9) Coordenadas del indol en la enzima (1EG9) [31] ... 36
Imagen 19: (1EG9) Ligandos [32] ... 37
Imagen 20: (1EG9) Interacciones Hidrofóbicas C-C [32] ... 38
Imagen 21: (1EG9) Puentes de Hidrógeno [32] ... 39
Imagen 22: (1EG9) Interacciones Hidrofóbicas polares [32] ... 39
Imagen 23: (1EG9) Aminoácidos escogidos para efectuar rotaciones en AutoDock® [33] ... 40
Imagen 24: (1EG9) La mejor conformación [34] ... 41
Imagen 25: (1EG9) Clusters (2.0 RMS) [34] ... 42
Imagen 26: (1EG9) Clusters (2.5 RMS) [34] ... 43
Imagen 27: (1EG9) Aminoácidos rotados para evaluar la energía de enlace ... 43
Imagen 28: (1EG9) Gráfico de Ramachandran después de la simulación [33] ... 44
Imagen 29: (1EG9) Gráfico de Ramachandran antes de la simulación [33] ... 44
Imagen 30: (1EG9) Malla en donde se evaluaron las interacciones entre los aminoácidos seleccionados y el ligando (en esferas) [34] ... 45
Imagen 32: (1LH4) Ligandos (32] ... 48
Imagen 33: (1LH4) Interacciones Hidrofóbicas C-C [32] ... 49
Imagen 34: (1LH4) Interacciones Hidrofílicas [32] ... 49
Imagen 35: (1LH4) Interacciones Hidrofóbicas polares [32] ... 50
Imagen 36: (1LH4) Aminoácidos escogidos para efectuar rotaciones en AutoDock [33] ... 51
Imagen 37: (1LH4) La mejor conformación [34] ... 52
Imagen 38: (1LH4) Clusters (2.0 RMS) [34] ... 53
Imagen 39: (1LH4) Clusters (2.5 RMS) [34] ... 53
Imagen 40: (1LH4) Aminoácidos rotados para evaluar energía de enlace ... 54
Imagen 41: (1LH4) Gráfico de Ramachandran después de la simulación ... 55
Imagen 42: (1LH4) Gráfico de Ramachandran después de la simulación ... 55
Imagen 43: (1LH4) Malla en donde se evaluaron las interacciones entre los aminoácidos seleccionados y el ligando (en esferas) [34] ... 56
Imagen 44: Interacciones del indol con los 7 aminoácidos del sitio catalítico [34] ... 57
Imagen 45: Coordenadas del indol en la enzima (1O7N) [36] ... 59
Imagen 46: (1O7N) Ligandos [32]... 60
Imagen 47: (1O7N) Interacciones Hidrofóbicas C-C [32] ... 61
Imagen 48: (1O7N) Puentes de Hidrógeno [32] ... 61
Imagen 49: (1O7N) Interacciones Hidrofóbicas polares [32] ... 62
Imagen 50: (1O7N) Aminoácidos escogidos para efectuar rotaciones en AutoDock® [33] ... 62
Imagen 51: (1O7N) La mejor conformación [34] ... 63
Imagen 52: (1O7N) Clusters (2.0 RMS) [34] ... 65
Imagen 53: (1O7N) Clusters (2.5 RMS) [34] ... 65
Imagen 54:(1O7N) Aminoácidos rotados para evaluar energía de enlace [33] ... 66
Imagen 55: (1O7N) Gráfico de Ramachandran después de la simulación [33] ... 66
Imagen 56: (1O7N) Gráfico de Ramachandran antes de la simulación [33] ... 67
Imagen 57: (1O7N) Interacciones entre los aminoácidos seleccionados y el ligando. (En esferas)[34] ... 68
Imagen 58: (1O7N) Malla en donde se evaluaron las interacciones entre los aminoácidos seleccionados y el ligando (en esferas) [34] ... 69
Imagen 59: Coordenadas del indol en la enzima (1UUV) [31]... 71
Imagen 60: (1UUV) Ligandos [32] ... 72
Imagen 61: (1UUV) Interacciones Hidrofílicas [32] ... 73
Imagen 62: (1UUV) Interacciones Hidrofóbicas C-C [32] ... 73
Imagen 63: (1UUV) Puentes de Hidrógeno [32] ... 74
Imagen 64: (1UUV) Interacciones Hidrofóbicas polares [32] ... 74
Imagen 65: (1UUV) Aminoácidos escogidos para efectuar rotaciones en AutoDock® [34] ... 75
Imagen 67: (1UUV) Clusters (2.0 RMS) [34] ... 77
Imagen 68: (1UUV) Clusters (2.5 RMS) [34] ... 78
Imagen 69: (1UUV) Aminoácidos rotados para evaluar la energía de enlace [33] ... 78
Imagen 70: (1UUV) Gráfico de Ramachandran después de la simulación [33] ... 79
Imagen 71: (1UUV) Gráfico de Ramachandran antes de la simulación [33] ... 79
Imagen 72: (1UUV) Interacciones entre los aminoácidos seleccionados y el ligando. (En esferas)[34] ... 80
Imagen 73: (1UUV) Interacciones del indol con los 7 aminoácidos del sitio catalítico [34] ... 81
Imagen 74: Optimización geométrica [35] ... 85
Imagen 75: Clusters (2.0 RMS) [34] ... 87
Imagen 76: Interacciones del indol con los aminoácidos mutados. [34] ... 88
Imagen 77: Interacciones entre los aminoácidos seleccionados y el ligando. (En esferas)[34] ... 89
Imagen 78: Gráfico de Ramachandran para los aminoácidos mutados [33] ... 90
Imagen 79: Distancia del aminoácido ALA 205 al Indol con temperatura constante [35] ... 91
Imagen 80: Distancia del aminoácido LEU 208 al Indol con temperatura constante [35] ... 92
Imagen 81: Distancia del aminoácido ALA 209 al Indol con temperatura constante [35] ... 93
Imagen 82: Distancia del aminoácido HIS 211 al Indol con temperatura constante [35] ... 94
Imagen 83: Distancia del aminoácido GLY 254 al Indol con temperatura constante [35] ... 95
Imagen 84: Distancia del aminoácido VAL 255 al Indol con temperatura constante [35] ... 96
Imagen 85: Distancia del aminoácido HIS 298 al Indol con temperatura constante [35] ... 97
Imagen 86: Distancia del aminoácido LEU 300 al Indol con temperatura constante [35] ... 98
Imagen 87: Distancia del aminoácido ALA 205 al Indol con temperatura variable [35] ... 99
Imagen 88: Distancia del aminoácido LEU 208 al Indol con temperatura variable [35] ... 100
Imagen 89: Distancia del aminoácido ALA 209 al Indol con temperatura variable [35] ... 101
Imagen 90: Distancia del aminoácido HIS 211 al Indol con temperatura variable [35] ... 102
Imagen 91: Distancia del aminoácido GLY 254 al Indol con temperatura variable [35] ... 103
Imagen 92: Distancia del aminoácido VAL 255 al Indol con temperatura variable [35] ... 104
Imagen 93: Distancia del aminoácido HIS 298 al Indol con temperatura variable [35] ... 105
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Características del indol [29] ...5
Tabla 2: (185L) Información básica de la enzima [30] ... 22
Tabla 3: (185L) Aminoácidos del sitio activo ... 25
Tabla 4: (185L) Datos de la conformación con menor energía de enlace [34] ... 28
Tabla 5: (185L) Energías de enlace de las otras posibles conformaciones [34] ... 28
Tabla 6: (1EG9) Información básica de la enzima [30] ... 35
Tabla 7: (1EG9) Aminoácidos del sitio activo ... 37
Tabla 8: (1EG) Datos de la conformación con menor energía de enlace [34] ... 41
Tabla 9: Energía de las otras posibles conformaciones [34] ... 42
Tabla 10: (1LH4) Información básica de la enzima [30] ... 46
Tabla 11: (1LH4) Aminoácidos en el sitio activo [32] ... 48
Tabla 12: (1LH4) Datos de la conformación con menor energía de enlace [34] ... 52
Tabla 13: (1LH4) Energías de enlace de las otras posibles conformaciones [34] ... 52
Tabla 14: (1O7N) Información básica de la enzima [30] ... 58
Tabla 15: (1O7N) Aminoácidos en el sitio activo ... 60
Tabla 16:(1O7N) Datos de la conformación con menor energía de enlace [34] ... 64
Tabla 17: (1O7N) Energías de enlace de las otras posibles conformaciones ... 64
Tabla 18: (1UUV) Información básica de la enzima [30] ... 70
Tabla 19: (1UUV): Aminoácidos en el sitio activo ... 72
Tabla 20: (1UUV) Datos de la conformación con menor energía de enlace [34] ... 76
Tabla 21: (1UUV) energías de enlace de las otras posibles conformaciones [34] ... 76
Tabla 22: Energía de enlace de las 5 enzimas. ... 82
Tabla 23: Mutaciones en 1O7N ... 84
Tabla 24: Datos de la conformación con menor energía de enlace [34] ... 86
Tabla 25: Energías de enlace de las otras posibles conformaciones. [34] ... 86
Tabla 26: Información básica del gen ... 109
Tabla 27: Modificación de bases nitrogenadas ... 110
Tabla 28: Modificación de bases nitrogenadas ... 110
1. INTRODUCCIÓN
Diferentes estudios realizados en Escherichia coli han demostrado que, aunque en su mayoría son inofensivas, existen algunas cepas capaces de producir infecciones intestinales y extra-intestinales, generalmente severas como infecciones en el aparato excretor, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia y neumonía. Ya se han visto casos donde es tan severa la infección que en niños de 1 a 8 años se ha llegado hasta etapas fatales. Entre estas cepas patógenas se encuentran (ECEI), (ECEH) entre otras. Uno de los mecanismos por lo cual es difícil de atacar a esta bacteria es debido a que estas forman biopelículas, controlada por diferentes elementos, uno de estos una señal “quorum sensing”, haciendo que en esta configuración estas se vuelvan más resistentes a los tratamientos con antibióticos. Esto debido a que en esta configuración le es difícil penetrar al antibiótico. Sin embargo se ha encontrado que aislando el gen rapA en E. coli hace que se forme de la misma biopelícula pero se reduce la resistencia a los antibióticos [1]. Por lo tanto son diferentes factores los que aumentan la resistencia a los antibióticos. Además, de esta forma, estas bacterias empiezan a expresar genes patógenos que solo se expresan al estar en esta conformación. Es por esta razón, que en los últimos años, se han hecho diferentes estudios, para la inhibición de la señal de “quorum sensing”, para controlar la formación de biopelículas no solo en E. coli sino es muchas otras bacterias [8]. Se sabe que el indol es un metabolito secundario que se produce a partir del metabolismo del triptófano. Se han realizado muchos estudios para identificar el papel del indol en la formación de biopelículas. Muchos estudios han comprobado que en el caso de E. coli, la presencia del indol disminuye la formación de biopelículas [8]. Debido a esto es de suma importancia entender los mecanismos de la formación de biopelículas en E. coli ya que se necesitan conocer todos los mecanismos para inhibir o fomentar la formación de biopelículas para poderlos controlar y manipular. Para esto se van a proponer moléculas con habilidad potencial de afectar la formación de biopelícula en E. coli k12 por medio de la degradación de indol. Primero se determinó la estructura terciaria, de las enzimas reportadas que tienen como ligando el indol, usando Deep View® y HyperChem®. A continuación se realizaron estudios de docking molecular usando AutoDock® para determinar y proponer posibles mutaciones en enzimas con habilidad potencial de afectar la formación de biopelícula en E. coli y de esta forma obtener más herramientas para el control de este fenómeno.
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Escherichia coli
Escherichia coli es una bacteria anaerobia, facultativa y patógena que se encuentra en el intestino de los humanos y los animales. Esta bacteria ha desarrollado la capacidad de causar enfermedades gastrointestinales, urinarias o del sistema central nervioso [16]. Se conocen al menos seis cepas con diferentes categorías de patogenicidad, de las cuales las más estudiadas en la última década son: E. coli enteropatogena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (ECEH), y E. coli enteroagregativa (EAEC) [1].
Aunque E. coli es uno de los organismos más conocidos aún no se sabe como sus cepas, tanto comensales como patógenas, colonizan y/o causan enfermedades en el intestino de los mamíferos. Sin embargo, se tienen algunos indicios de las posibles maneras en las que esto sucede, entre las que se encuentran la inmunidad natal, la inmunidad adaptativa y la comunicación entre célula y célula, las cuales juegan un papel importante tanto en la patogénesis entérica, como en el cambio del número de células individuales, para cada uno de los 500 a 1000 diferentes especies comensales en el intestino [4].
Esta bacteria es la responsable de enfermedades como la diarrea neonatal, la cistitis y la bacteriemia [2]. La cepa ECEH es responsable de enfermedades como la colitis hemorrágica y el síndrome hemolítico ureico en los seres humanos. Actualmente se han cuantificado cerca de 73,000 pacientes con infecciones anuales producidas por ECEH en los Estados Unidos, de los cuales 60 han muerto por dicha infección [3].
Algunas de las estrategias patogénicas que han desarrollado algunas cepas de E. coli tienen una relación directa con las estructuras de las bacterias y con algunos mecanismos que éstas tienen para sensar señales extracelulares, y estos a su vez son determinantes para la formación de biopelícula [8]. De la misma manera, algunas funciones en la bacteria como la movilidad, los mecanismos de quorum sensing y la síntesis de adhesinas, son responsables del proceso de
adhesión de ésta a superficies abióticas y a tejidos vivos. Estudios realizados por Anderson et al. (2003) identificaron la manera en que diferentes cepas de E. coli invaden las células superficiales de la vejiga y maduran como biopelículas intracelulares [2].
2.2. Formación de biopelícula
Las bacterias pasan la mayor parte de sus vidas en comunidades de biopelículas unidas a sólidos o líquidos. Estas configuraciones hacen que las enfermedades, producidas por estas, sean más difíciles de controlar. Algunos ejemplos de estas enfermedades son: fibrosis cística, cistitis, endocarditis entre otras. Cuando las bacterias adquieren esta configuración se hacen más resistentes a los tratamientos con antibióticos.
La formación de biopelícula en E. coli se ve considerablemente influenciada por señales celulares, ya que regulan la expresión de genes. En el caso de E. co li se han encontrado diferentes mecanismos en los cuales se presenta la formación de biopelícula. Estudios anteriores han demostrado la señal autoinductora 2 (AI-2) fomenta y altera la arquitectura de la biopelícula a través de la proteína B3022 la cual altera la movilidad celular. Debido a esto el gen b3022 ha sido renombrado mqsR (m o t i l i t y q o u ru m s e n s i n g i n h i b i t o r) [16].
Con el fin de determinar patrones de la expresión de genes en biopelículas de E. coli y para determinar el control de biopelículas, se hicieron estudios reprimiendo los genes yliH y yceP. Los resultados demostraron que al reprimir estos genes aumenta la concentración extracelular de AI-2 ya que ambas proteínas, YliH y YceP están involucradas en la represión de la movilidad celular. Por lo tanto se observó un aumentó en la formación de biopelícula.
2.3. Quorum sensing
Este término hace referencia al mecanismo de comunicación entre células. En la mayoría de las bacterias muchos procesos fisiológicos como la resistencia a antibióticos, formación de
biopelícula, virulencia entre otros, están regulados por este tipo de comunicación. Esta comunicación se hace a través de señales químicas las cuales son detectadas por las células debido a estas están en la capacidad de detectar la densidad extracelular de unas sustancias conocidas como autoinductores [3]. En resumen, “quorum sensing” es la regulación de la expresión de genes que responden a un cambio en la densidad celular de señales químicas. La señal de “quorum sensing” en las bacterias es activada por moléculas que se conocen como autoinductores, los que se acumulan en el ambiente mientras que la población celular crece [6]. De esta forma, cuando se llega a una concentración de autoinductor que logra generar un estímulo en la célula, se activa el proceso de transcripción genética, el cual se ve reflejado en un cambio de comportamiento del organismo [5].
Se han podido identificar diferentes sistemas intercelulares en E. coli que controlan la expresión relacionada con los autoinductores. Estos sistemas son mediados por la SdiA homologa de la LuxR, por el sistema autoinductor 2 (AI-2), el sistema autoinductor 3 (AI-3) y por un sistema de señal regulado por indol [5] [6].
Se ha encontrado que algunas señales del medio tienen influencia sobre el nivel de producción y degradación del autoinductor en E. coli. La producción de estas moléculas se ve favorecida en ambientes en donde hay fuentes de carbono específicas, bajo pH, rápido crecimiento logarítmico y/o alta osmolaridad, mientras que condiciones como la fase estacionaria, la ausencia de fuentes de carbono específicas, pH neutro, y baja osmolaridad inducen la degradación del AI-2. [5]
El uso de señales químicas para la comunicación de bacterias es un fenómeno bastante conocido. En bacterias gram negativas estas señales pueden ser derivados de la lactona homoserina y de dipéptidos cíclicos. Actualmente se están llevando a cabo diferentes investigaciones con el fin de determinar si indol, un metabolito secundario generado por la hidrólisis de triptófano en E. coli, es una de estas señales o si es un producto metabólico. Sin embargo en un estudio realizado por la universidad de los Andes se comprobó que el indol juega un papel más importante como señal de “quorum sensing” que como parte del metabolismo de E. coli [3].
2.4. Indol
Indol es un metabolito secundario aromático que se produce por la hidrólisis de triptófano por la enzima triptofenasa. En la Imagen 1 y 2 podemos ver la estructura molecular del indol. De igual forma en la tabla 1 están las características principales de la molécula.
Imagen 1: Estructura de la molécula de Indol [29]
Imagen 2: Estructura y átomos de la molécula de Indol [29]
Tabla 1: Características del indol [29]
Características del Indol
Átomos totales 16
Átomos quirales 0
Número de enlaces 17
Enlaces aromáticos 10
Carga total 0
En E. coli indol se importa del ambiente extracelular principalmente por la permeasa Mtr, y el flujo de indol hacia el exterior de la célula se lleva a cabo por la bomba AcrEF. Inicialmente, se creía que el papel de la triptofenasa era sintetizar triptófano a partir de alguna fuente ambiental de indol. Sin embargo el equilibrio para esta reacción favorece la ruptura de triptófano para formar indol. En la siguiente Imagen se muestra el intercambio intra y extracelular de indol en la célula:
Imagen 3: Intercambio de indol en la célula [3]
El papel intracelular de indol aún es desconocido, especialmente considerando que altas concentraciones de indol (5mM) son tóxicas y pueden inhibir la división celular. El hecho de que existan mecanismos para importar indol indica que éste no es tan solo un producto tóxico de una reacción metabólica. [7]
2.4.1. Indol como señal de “quorum sensing” para la formación de biopelícula
Con base en estos indicios se han realizado estudios que indican un posible rol de indol como señal extracelular en E. coli, que se ha relacionado con la regulación de formación de biopelícula. La identificación de moléculas de señal en E. coli ha sido desarrollada con bastante
rigor en donde se hizo un tamizaje para identificar los genes que se activaban transcripcionalmente por la acumulación de señales extracelulares en el medio de cultivo [15]. Este estudio se llevó a cabo con un transposón Tn5 que contenía lacZ sin promotor y el gen de resistencia a la tetraciclina sin promotor el cual fue usado para generar fusiones transcripcionales aleatorias en E. coli. Las células que se tiñeron de azul en X-gal indicaban trascripción del gen lacZ en cualquier momento durante el crecimiento de la colonia, sin embargo las células en las que la trascripción era activada en la fase de crecimiento serían sensibles a la tetraciclina. Las células que mostraron estos dos fenotipos se seleccionaron para activación prematura por la adición de sobrenadante preparado a partir de células en estado estacionario. El estudio realizado arrojó como resultado la identificación de cuatro genes (gabT, astD, tnaB y cysK), a partir de las células que tenía el segundo fenotipo mencionado, en los cuales su activación dependía de la concentración de señales extracelulares producidas por E. coli [7].
El indol actúa como una señal extracelular en E. coli ya que regula la expresión de astD, tnaB y gabT. También se ha demostrado que cuando se reprimen los genes encargados de la síntesis del indol (tnal) se aumenta significativamente la formación de biopelículas. Con estos resultados se puede decir que el indol tiene un papel importante en la formación de biopelículas. Se comprobó que reprimiendo los genes trpE y tnaC, para llevar a cabo una reducción en la concentración intracelular del indol, hubo un aumentó en la movilidad de las baterías haciendo que se aumentara la formación de biopelículas. Por esto se pudo concluir que el indol disminuye la movilidad haciendo que aparentemente la reducción de la movilidad se vea reflejada en una disminución de la formación de biopelículas. Se demostró experimentalmente que estas bacterias responden a señales de indol que estas mismas no sintetizan por lo cual no se tiene que hacer una manipulación genética, para aumentar la producción de indol en las bacterias, para regular la formación de biopelículas a través del indol. No se puede decir con seguridad si el indol incrementa o previene la formación de biopelículas en E. coli debido a que sean realizado diferentes estudios los cuales unos presentan resultados experimentales donde demuestran que el indol es un inhibidor de la señal de “quorum sensing” para la formación de biopelículas mientras que otros muestran exactamente lo contrario.
5-hydroxyndole y 7-hydroxyindole y son de las pocas moléculas encontradas que no son toxicas para la inhibición de biopelículas en E. coli. Se observo que la bacteria E. coli forma biopelículas robustas a 30 C°. Como el indol y los hidroxindoles no son tóxicos para la bacteria, a concentraciones de formación naturales, se evaluó la capacidad de inhibir la formación de biopelículas para los diferentes tipos de hidroxindoles. Se concluyo que el indol, 5-hidroxindol y 7-5-hidroxindol fueron los más efectivos en reducir la formación de biopelículas mientras que el isatín aumentó la formación de estas. Moléculas como el índigo y el isoindigo no redujeron ni aumentaron la formación de biopelículas. En contraste se comprobó que mientras el 7-hidroxindol es el inhibidor más potente en la formación de biopelículas en E. coli este estimula esta formación en P. aeruginosa.
2.5. Quorum quenching
Quorum quenching es el proceso mediante el cual se interfiere con la señal de “quorum sensing” haciendo que el comportamiento coordinado de las bacterias no se pueda llevar a cabo. Debido a que el indol actual como señal de “quorum sensing”, para la formación de biopelícula en E. coli, toda molécula que use como estrategia degradar o inhibir dicha señal, se dice que usa como estrategia quorum quenching. Existe una enzima, que se aisló de pseudomona putida, llamada indol oxidasa que degrada el indol convirtiéndolo en índigo. Podemos decir que la estrategia quorum quenching es usada por esta enzima debido a que al degradar el indol, está interfiriendo con la señal de “quorum sensing” que esta transmite. Por esta razón vamos realizar estudios de docking molecular a esta enzima para determinar mejores moléculas con una mayor afinidad por el indol.
2.6. Indol oxidasa
Pseudomona putida es un especie con la capacidad de mineralización de compuestos bióticos (por ejemplo, alcanfor), xenobióticas (clorofenil y diversos compuestos de bifenilo) y las moléculas orgánicas combustibles fósiles (como el tolueno o naftaleno). Estas capacidades son generalmente codificados por grupos de genes recogidos en el operones extracromosómicos.
Un número de diferentes clases de enzimas están implicadas en la oxidación inicial de estos compuestos. Por ejemplo, el alcanfor es degradada por una P450 monooxigenasa mientras que el tolueno, y clorobifenilo bifenilo, y naftaleno se oxidan por dioxigenasas.
En la era de la biología molecular, se descubrió que, cuando ciertos aromáticos dioxigenasas fueron clonados en Escherichia coli y estos fueron cultivados en un medio rico, estos presentaron colonias de coloración azul. Más tarde se determinó que el color azul se debe a la conversión de triptófano en el medio a indol por E. coli triptofanasa y su posterior oxidación por el aromático dioxigenasa a indolediol, que a su vez, en presencia de oxígeno molecular, además oxida espontáneamente al índigo, lo que lleva a observar la coloración azul. Dioxigenasas, cuyo principal objeto son sustratos de compuestos heterocíclicos, especialmente cuando el sustrato es indol, no han sido previamente caracterizados en detalle. La deoxigenasa heterocíclica es capaz de oxidar el indol, lo que lleva a la formación de índigo [12].
La indol oxidasa o indol dioxigenasa lleva a cabo una oxidación del indol que se convierte espontáneamente en índigo. Por lo tanto es un método mejorado para la producción biocatalítica de índigo. Como ya habíamos citado el índigo es una molécula la cual no inhibe ni promueve la formación de biopelículas por lo cual no se vería afectado el procedimiento experimental ya que se solamente se degradaría el indol obteniendo así productos que no son señales de “quorum sensing” como el índigo. Es de suma importancia analizar las interacciones de esta enzima con el indol, así como su estructura tridimensional, para el análisis y diseño de nuevas moléculas con habilidad potencial de afectar la formación de biopelícula. Por lo tanto vamos a realizar estudios de docking molecular para esta enzima.
2.7. Diseño molecular computacional
En el diseño de productos químicos se busca crear productos que cumplan con ciertas especificaciones y que cumplan con las propiedades deseadas. Otra metodología utilizada es
cuando se trata de buscar algún aditivo que al ser adicionado a otro producto, químico o no químico, mejore sus propiedades funcionales. Este tipo de producto es comúnmente llamado formulación. Dados estos dos tipos de diseños de productos, podemos decir que en el diseño de de productos químicos, no sabemos cómo va a ser exactamente el producto, pero tenemos idea de cómo queremos que se comporte.
Por consiguiente el problema consiste en encontrarlos químicos más apropiados que exhiban el comportamiento deseado y una vez se encuentre un producto que cumple con el comportamiento deseado, computacionalmente, se tiene que determinar si puede ser elaborado y si es químicamente estable. Debido a esto se tiene que diseñar a su vez el proceso de elaboración teniendo en cuenta variables como el impacto ambiental que generaría, el nivel de seguridad que se debería tener y, así no sea el objetivo principal, ver las ganancias que generaría. Ya teniendo en cuenta todas las posibles variables y teniendo claras las propiedades deseadas, se da paso a determinar la estructura molecular que cumpla con las restricciones dadas y que maximice o minimice, dependiendo del caso, las propiedades anheladas.
Lo primero para diseños moleculares computacionales es identificar el problema donde se observa si existen límites de operación como por ejemplo la temperatura, presión y fase. Debido a esto sabemos que la molécula que se diseñara tiene que ser estable a condiciones naturales dado que tiene que actuar a las mismas condiciones de E. coli. Lo segundo es encontrar el criterio de evaluación del desempeño del producto debido a que este criterio es el que ayudara a definir la función de optimización.
Para lograr un buen diseño molecular se requiere unir los métodos y herramientas necesarias para que se pueda trabajar de una manera integrada. Debido a esto se deben tener en cuenta los siguientes aspectos para lograr un diseño exitoso:
· Hay que definir de manera cuidadosa el rango de propiedades que van a ser calculadas para generar la molécula para que esta cumpla con las especificaciones deseadas. Cada una de estas propiedades va a tener una constante asociada indicando el límite superior o inferior que se debe cumplir.
· El nivel de la propiedad: Esto está relacionado con el nivel de complejidad de las propiedades deseadas. Esta es una medida teórica de la cantidad de información requerida para calcular la propiedad basada en: El tipo de información molecular requerido para la designación del método requerido.
· Revisar si la propiedad depende de otras propiedades para así tener en cuenta las variables independientes de la propiedad deseada.
Los elementos de una técnica para un diseño molecular computacional pueden ser divididos en etapas algorítmicas tratando con la generación de moléculas y las pruebas de estas moléculas generadas. Estos pasos son entonces: 1) el de generar la molécula y 2) el de la evaluación de la molécula generada. Las principales características para la etapa de síntesis molecular son: selección del grupo, caracterización del grupo y reglas de viabilidad de la molécula. El resultado de la etapa de síntesis molecular es un número de estructuras moleculares viables. Las principales características para la etapa de evaluación molecular son: métodos de contribución del grupo para la estimación de la propiedad deseada, cálculo de propiedades y de las constantes respectivas que se la van a dar a estas propiedades. Finalmente el resultado es un paquete de posibles candidatos todos calificados.
2.7.1. Calculó de la energía de enlace
En la formación del complejo proteína-ligando es un proceso complicado en el cual actúan fuerzas como las interacciones de van der Waals, interacciones de Coulomb, puentes de hidrógeno, interacciones polares y apolares, cambios en la entropía rotacional y cambios en la energía interna del complejo y sus componentes. Al variar la posición de la proteína y el ligando se puede minimizar este potencial y de esta forma encontrar la energía de enlace teórica. Sin embargo el cálculo de todos estos factores para hallar la energía de enlace hace que sea un proceso muy complejo aún para programas computarizados. Los simuladores que existen trabajan con funciones diferentes para encontrar la energía de enlace, donde se ignoran muchos de estos tipos de interacciones. Estas funciones usadas para encontrar la energía de enlace pueden ser: Las llamadas
funciones basadas en el “force field”, funciones basadas en datos experimentales o funciones basadas en la experiencia.
2.7.2. Gráfico de Ramachandran
Este gráfico, creado por el bioquímico Narayana Iyer G. N. Ramachandran , permite aproximar cual será la estructura de los aminoácidos que componen un polipéptido. En este se grafican los ángulos dihédricos psi y phi y dependiendo en la zona donde quede se puede predecir si están en configuración de hélices alfa, laminas beta, giro beta o si es una configuración inestable. Sin embargo siempre se presentan algunas excepciones causadas por efectos estéricos entre los residuos donde se encuentran aminoácidos en posiciones inestables.
2.7.3. Docking molecular
El docking molecular es un método el cual tiene la habilidad de predecir la orientación tridimensional de átomos en moléculas usando diferentes funciones de puntaje. Usualmente se usa para predecir la afinidad entre posibles moléculas pequeñas con su respectiva proteína. Debido a esto el docking molecular juega un papel de suma importancia en la elaboración de nuevos medicamentos.
Para esto se trabajan con programas computacionales con herramientas automatizadas de acoplamiento que están diseñados para predecir como pequeñas moléculas, tales como los sustratos de drogas o posibles candidatos de inhibición estérica, se unen a un receptor conocido, con una estructura 3D igualmente conocida. Programas como AutoDock® trabaja con un puntaje de energía libre basada en análisis de regresiones lineales. Para hacer esta evaluación, entre las enzimas encontradas y el ligando, primero se genera un algoritmo que genera diferentes modos de enlace entre el ligando y el sitio activo. Después, a través de una función de optimización de energía de enlace, se obtienen los valores de energía de enlace de las diferentes conformaciones que hayan sido encontradas en el primer paso. Una configuración exitosa, está definida por la raíz media de la suma de los cuadrados de la configuración encontrada, comparada con la configuración original o cristalizada que es como están inicialmente las enzimas en los formatos PDB.
2.7.4. Dinámica molecular
La dinámica molecular es una simulación en la cual átomos y moléculas pueden interactuar por un periodo de tiempo.
El objetivo del estudio de la dinámica molecular es investigar los patrones normales de las vibraciones de las moléculas en el tiempo. Para encontrar, por ejemplo, la energía potencial de una partícula A es necesario sumar la interacción de la partícula A con el resto de partículas presentes. Estas interacciones se pueden representar con la siguiente ecuación:
Donde es la energía potencial de la partícula A, j es el número total de partículas presentes en el sistema y es la energía potencial de la interacción A con j. Podemos encontrar la fuerza de la partícula A diferenciando con respecto a las coordenadas de la partícula A.
Para un par de partículas de Lennard-Jones donde
4
Donde es la profundidad del potencial, es la distancia finita en la que el potencial entre las partículas es 0 y es la distancia entre la partícula A y B. La expresión para el gradiente de U quedaría:
Resolviendo esta ecuación quedaría:
Y finalmente utilizando la segunda ley de Newton podemos conectar la fuerza y la aceleración:
Esta última ecuación es una ecuación diferencial de segundo orden y existen diferentes metodologías para resolverla.
Para solucionar estas ecuaciones, usando métodos numéricos, HyperChem® utiliza el algoritmo de Verlet. Este algoritmo es una modificación de la serie de Taylor en donde se expande hacia adelante y hacia atrás asumiendo que son despreciables los términos de tercer orden en adelante.
Δ Δ 1
2 Δ
Δ Δ 1
2 Δ
Sumando las dos ecuaciones anteriores y despejando para Δ se obtiene
Δ 2 Δ Δ
La aceleración se puede obtener de la fuerza experimentada por el átomo A en el tiempo t. La velocidad se puede obtener utilizando la siguiente ecuación ya que la velocidad es la pendiente de la posición contra el tiempo:
Δ Δ
2Δ
El algoritmo de Verlet itera la posición y la aceleración en el tiempo t, la posición en el tiempo Δ y asi poder calcular la posición en Δ . Todos estos valores son guardados en cada iteración para poder reproducir la simulación.
3.
METODOLOGÍA
3.1. Búsqueda de enzimas que tengan como ligando el indol.
Estudios anteriores han identificado que en Pseudomona putida están presentes unas enzimas llamadas dioxigenasas o indol oxidasas, cuyos principales ligandos son sustratos de compuestos heterocíclicos, y tiene aun mayor afinidad cuando el sustrato es indol. La deoxigenasa es capaz de oxidar el indol y transformarlo en índigo. El índigo es una molécula la cual no inhibe ni promueve la formación de biopelículas por lo cual usando este tipo de enzimas, que solamente degradan el indol, se podría comprobar la acción que tiene el indol en la formación de biopelículas en E. coli. Estas se encontraron usando el programa Ligand Structure, creado por “James R. Weeks and BioElectroMech” publicado en 1998. Este programa tiene la base de datos de las estructuras de los ligando de todas las enzimas reportadas en el PDB (Protein Data Bank). La entrada es la estructura del ligando y la salida son las enzimas reportadas que tienen como ligando la estructura introducida
.
3.2. Identificación del sitio activo de las enzimas
Para evaluar la energía de enlace del indol con las enzimas se tiene que tener conocimiento de los aminoácidos que componen el sitio catalítico, así como las interacciones de estos con el indol, por lo cual es de suma importancia tener esta información antes de evaluar la energía de enlace. Además, con esta información, dependiendo del tipo de interacciones y de la cercanía de estos con el indol, se propondrán posibles mutaciones. Para realizar la evaluación de la energía de enlace también es necesario el conocimiento de las coordenadas del sitio activo en el archivo PDB de las enzimas previamente a la simulación para encontrar la energía de enlace. Para hallar las coordenadas del sitio activo se utilizo el programa King 2.12® y para hallar los aminoácidos que componen el sitio activo se uso el programa Ligand Structure®. Estos dos programas se encuentran
en el PDB como visores de las proteínas.
3.3. Evaluación de la afinidad del indol por las enzimas (Docking).
Para hacer esta evaluación, entre las enzimas encontradas y el ligando, primero se genera un algoritmo que genera diferentes modos de enlace entre el ligando y el sitio activo. Después, a través de una función de optimización de energía de enlace, se obtienen los valores de energía de enlace de las diferentes conformaciones que hayan sido encontradas en el primer paso. Una configuración exitosa, está definida por la raíz media de la suma de los cuadrados de la configuración encontrada, comparada con la configuración original o cristalizada que es como están inicialmente las enzimas en los formatos PDB. Para encontrar las posibles rotaciones e interacciones de los aminoácidos con el sitio activo es necesario la creación de una malla (grid) la cual discretiza el espacio en el cual se realizaran las posibles torsiones. Esto con el objetivo de minimizar el tiempo de corrida ya que al hacer esto se están despreciando las interacciones con las moléculas que queden por fuera de la malla. Posteriormente se hace uso de una búsqueda estocástica o aleatoria la cual realiza torsiones al azar para minimizar la energía de enlace. La evaluación de la energía de enlace es un proceso en donde interfieren interacciones como interacciones de Coulomb, Interacciones intermoleculares, interacciones de van der Waals, puentes de hidrógeno, interacciones polares y no polares. La suma de estas energías se conoce como el “force field”. Debido a la complejidad de este cálculo la mayoría de programas desprecian una parte de estas interacciones y usan funciones empíricas y funciones basadas en la experiencia para calcular la energía de las interacciones entre la proteína y el ligando. En el caso de AutoDock®, este calcula solo algunos de los términos del “force field”. Estos son: los términos intermoleculares como la energía relacionada a la fuerza, la torsión y el ángulo de enlace, las interacciones de van der Waals, las cuales son calculadas usando el potencial 6-12 de Lennard-Jones, y las interacciones de Coulomb. Teniendo la energía en función de los términos mencionados anteriormente, encuentra el mínimo de energía usando el algoritmo genético. Los términos entrópicos e intermoleculares son ignorados completamente. A continuación se presenta la ecuación donde se encuentran los términos para encontrar la mínima energía de enlace:
∑ ∑ ∑ ∑ ∑ ∑
atómicas asociadas al elongamiento, ∑ es la sumatoria de la energía de las interacciones atómicas asociadas al ángulo de enlace, ∑ es la sumatoria de la energía de las interacciones atómicas asociadas al ángulo de dihedral, ∑ es la sumatoria de la energía de las interacciones atómicas asociadas al ángulo potencial fuera del plano, ∑ es la sumatoria de la energía asociada a las interacciones de van der Vaals, puentes de hidrógeno, interacciones polares y no polares y , ∑ que es la sumatoria de las interacciones atómicas asociadas con las fuerzas generadas por carga. Esta simulación se ejecutó con AutoDock® 4.0 en el cual se creó una malla cúbica de 40 Å3, centrada en las coordenadas del sitio activo (estas dimensiones son aconsejadas al trabajar con proteínas de más de 400 aminoácidos por el tutorial de AutoDock®).Posteriormente calcula la mínima energía de enlace de 10 posibles conformaciones. Esta energía nos la da en kcal/mol y nos dice que tan afín es la enzima por el indol. Entre este número sea negativamente mayor, esta unión será más favorable.
3.4. Evaluación de la simulación hecha por AutoDock®.
Para asegurarse que las torsiones realizadas por AutoDock® son posibles, se realizó un gráfico de Ramachandran después de cada evaluación de afinidad ya que este puede proponer configuraciones inestables. El gráfico de Ramachandran tiene como coordenada en “y” el ángulo Psi y en el “x” al ángulo Phi, los cuales son los ángulos de los enlaces del carbono quiral, de los aminoácidos, con el grupo amino y con el grupo carboxilo respectivamente. Este gráfico nos puede decir si los ángulos forman una hélice alfa, una lámina beta, un bucle o si están en una configuración inestable. Este gráfico se puede construir usando el programa Deep View/ Swiss PDB-View®.
3.5. Análisis de posibles mutaciones.
Una vez hallada la energía de enlace del indol con cada una de las enzimas encontradas se procederá a mutar algunos de los aminoácidos ubicados en el sitio catalítico de una enzima que dependiendo de los resultados será escogida. Una vez mutados se optimizara su estructura geométrica para tratar de predecir la estructura terciaria real de la enzima. Para esto se ejecutará una minimización de energía usando el programa HyperChem®, el cual usa AMBER como “force
field”, el cual es usado cuando se trabaja con aminoácidos y proteínas. Se utilizó la constante dieléctrica constante e igual a 1 y no se desprecio ningún aminoácido en la enzima. La estructura se optimizó usando el algoritmo de Polak-Ribiere o algoritmo del gradiente conjugado. Este algoritmo encuentra una solución numérica de un sistema de ecuaciones lineales usando un valor mínimo de 0,1 para el gradiente como criterio de convergencia Ya obtenida la estructura terciaria, de la enzima mutada, se realizará nuevamente la evaluación de la afinidad de la enzima por el indol. Esto con el objetivo de encontrar mutaciones las cuales aumenten la afinidad de la enzima original con el indol.
3.6. Evaluación de la estabilidad de los aminoácidos del sitio activo usando
dinámica molecular
Los estudios de dinámica molecular permiten simular el movimiento de las moléculas. Estos cálculos pueden servir para analizar la estabilidad durante la evolución del tiempo, propiedades de equilibrio, comportamiento cinético o a identificar conformaciones de baja energía entre otros. Con el objetivo de ver si la enzima, con los nuevos aminoácidos insertados, es estable en el tiempo, se hizo un estudio de dinámica molecular en la cual podemos ver que tan estable son las distancias de los aminoácidos del sitio activo con el indol. Esta simulación se ejecutó en HyperChem® en donde se observó el cambio de la distancia en el tiempo de los aminoácidos del sitio activo y el indol. Esta simulación se ejecutó a temperatura variable y constante. Primero HypeChem® busca el mínimo de energía, de las moléculas seleccionadas, utilizando simulado recocido como algoritmo. Una vez calculada esta energía por diferenciación se obtiene la fuerza. Ya obtenida la fuerza se tiene que resolver la ecuación de la segunda ley de Newton
Esta ecuación es equivalente a dos ecuaciones diferenciales de primer orden
Para solucionar estas ecuaciones, usando métodos numéricos, HyperChem® utiliza el algoritmo de Verlet. Este algoritmo es una modificación de la serie de Taylor en donde se expande hacia adelante y hacia atrás asumiendo que son despreciables los términos de tercer orden en adelante.
Δ Δ 1
2 Δ
Δ Δ 1
2 Δ
Sumando las dos ecuaciones anteriores y despejando para Δ se obtiene
Δ 2 Δ Δ
La aceleración se puede obtener de la fuerza experimentada por el átomo A en el tiempo t. La velocidad se puede obtener utilizando la siguiente ecuación ya que la velocidad es la pendiente de la posición contra el tiempo:
Δ Δ
2Δ
El algoritmo de Verlet itera la posición y la aceleración en el tiempo t, la posición en el tiempo Δ y asi poder calcular la posición en Δ . Todos estos valores son guardados en cada iteración para poder reproducir la simulación.
4.
ANÁLISIS Y RESULTADOS
4.1. Enzimas que tengan como ligando al indol
Para esta búsqueda se utilizó el programa Ligand Structure® en el cual se encontró, que no solo las indol oxidasas, presentes en Pseudomona putida, están en la capacidad de degradar el indol, si no que en total existen 7 enzimas reportadas en Protein Data Bank (PDB). De estas 7 enzimas se descartaron 2 indol oxidasas, una presente en humanos y otra presente en Rhodococcus sp, debido su gran tamaño, su alta complejidad y su sitio catalítico donde estas son afines a una conformación de 2 moléculas de indol lo cual no permite hacer la evaluación de afinidad.
4.2. Identificación del sitio activo de las enzimas
Usando los programas King 2.12® y RCSB PDB Ligand explorer 3.2® se identifico, tanto los aminoácidos del sitio catalítico del indol de cada enzima, como las coordenadas de este. Estos datos los necesitamos para medir la afinidad del indol con cada enzima ya que usando AutoDock® necesitamos definir los aminoácidos más cercanos al indol y las coordenadas tridimensionales. El sitio activo se encontró usando RCSB PDB Ligand Explorer 3.2® el cual nos da información de los aminoácidos del sitio catalítico. De esta forma podemos identificar los aminoácidos, del sitio activo de las enzimas, y el tipo de interacción de estas con el indol. Estas interacciones pueden ser hidrofóbicas polares, hidrofóbicas carbono-carbono, hidrofílicas o puentes de hidrógeno. Las coordenadas del sitio activo se encuentran con la ayuda del programa King 2.12® en el cual se observan todos los ligando de la enzima y nos dice las coordenadas tridimensionales de estos.
4.3. Evaluación de de la afinidad del indol por las enzimas.
En este procedimiento lo primero que se hace es abrir el archivo PDB de la macromolécula. Para que los archivos PDB no tengan ningún tipo de interacción externo, previo al proceso de simulación, se debe remover las moléculas de agua, en caso de que este las tenga, y se agregan
hidrógenos polares ya que esta es la forma como AutoDock® realiza una simulación. Debido a que algunos aminoácidos en el sitios activo y el mismo ligando se torsionan a la hora del enlace entre la enzima y el ligando, se seleccionan las torsiones permitidas del indol y se seleccionan 3 o 4 aminoácidos, los cuales están en el sitio activo y sean los que están más cerca al indol, para evaluar posibles torsiones.
A continuación se crea una malla donde se introducen las coordenadas del indol y se escoge el tamaño de la malla para que dentro de esta se evalúe las interacciones entre el sitio activo y el indol. Para escoger el tamaño de la malla se aconseja que esta cúbica y a menos que sean enzimas demasiado grandes se deje de un tamaño de 40 puntos cúbicos. A continuación se procede con la evaluación de la energía de enlace. Para hacer la simulación en AutoDock® se uso el algoritmo genético en el cual se usaron 250000 iteraciones y este toma un tiempo entre 15 y 25 minutos dependiendo del tamaño de la enzima.
Esta simulación arroja 10 posibles conformaciones dando la información de la energía de enlace de cada una de estas. En este trabajo se trabajara siempre con la conformación con la menor energía ya que esta sería la conformación óptima del ligando-enzima. A estas 10 conformaciones se les puede hacer un análisis de la simulación, donde se puede saber a simple vista si la simulación se hizo de forma correcta o hubo algún error. Este análisis se hace reagrupando las 10 posibles conformaciones con una desviación estándar definida en diferentes grupos. Si en este análisis efectivamente se agrupan varias conformaciones se puede decir que la simulación dio exitosa ya que esta comparación se hace con la estructura cristalizada, o no torsionada, por lo cual podemos concluir que la energía de enlace es muy parecida entre la estructura original y las otras posibles conformaciones.
4.4. Evaluación de la simulación hecha por AutoDock®
Para comprobar que las torsiones realizadas por AutoDock® fueran estéricamente posibles si hizo un gráfico de Ramachandran antes y después de la simulación. En caso que, en el gráfico de Ramachandran, aparecieran ángulos imposibles la simulación se repetiría. Esto nos puede decir que por los ángulos propuestos torsionados cumplen con una estabilidad estérica. En ninguna de las 5
enzimas evaluadas resultaron ángulos en una zona de impedimento estérico. Por último se pudo hacer un análisis visual en AutoDock®, evaluando si efectivamente el ligando esta dentro del sitio activo del la enzima y evaluando si las interacciones de este en efecto son con los aminoácidos del sitio activo. Estas imágenes sirvieron para ver si efectivamente están interactuando los aminoácidos del sitio catalítico.
4.5. Resultados de las cinco enzimas que tienen al indol como ligando
A continuación se presentan la información básica de las 5 enzimas a las que se le hicieron estudios de docking molecular y los resultados obtenidos. La información básica contiene el nombre original de la enzima, los autores que reportaron las enzima, el método experimental en el que se encontró la estructura terciaria, el código PDB, la fuente en donde se encuentra la enzima, el grupo de enzima a la que pertenece, los ligandos y el articulo en donde fue reportada por primera vez.
4.5.1. Información y resultados de la Enzima 1 (185L)
Tabla 2: (185L) Información básica de la enzima [30]
SPECIFICITY OF LIGAND BINDING IN A BURIED NON‐POLAR
CAVITY OF T4 LYSOZYME: LINKAGE OF DYNAMICS AND
STRUCTURAL PLASTICITY
Autores Morton, A., Matthews, B.W.
Método
Experimental
Difracción de rayos X
Código PDB 185l
Fuente Coliphage
Clasificación Hidrolasa
Formula
Ligandos Indol C8 H7 N
2‐Hidroxil disulfuro
Cloro Cl
Morton, A., Matthews, B.W. (1995) Specificity of ligand
binding in a buried nonpolar cavity of T4 lysozyme: linkage of
dynamics and structural plasticity. Biochemistry 34: 8576‐
8588
Primero para poder hacer correctamente el docking molecular usamos el programa KING 2.12® para ver las coordenadas del indol en la enzima. Las coordenadas de este en su respectivo sitio activo es (28.556, 7.358, 3.183). Esto se puede observar en la Imagen 4.
Imagen 4: Coordenadas del indol en la enzima (185L) [31]
En la Imagen 5 observamos la estructura terciaria de la enzima 185L con sus respectivos ligandos. En este caso se va a trabajar solo con el indol como ligando.
Imagen 5: (185L) Ligandos [32]
Usando el programa RCSB PDB Ligando Explorer 3.2 se puede observar las interacciones hidrofóbicas C-C (Imagen 6) y las Interacciones hidrofóbicas polares (Imagen 7) entre el indol y los aminoácidos del sitio catalítico de la enzima. Esto nos ayudara a evaluar posibles mutaciones que se le puedan hacer a la enzima para aumentar la afinidad por el indol. También se obtuvo la información de el sitio catalítico de esta y el tipo de interacción con el ligando (tabla 5). Los aminoácidos escogidos, para hacer torsiones en la simulación de AutoDock®, por su proximidad e interacciones con el ligando fueron: LEU 84, ALA 99, MET 102, VAL 111, LEU 118, LEU 121, PHE 153
Tabla 3: (185L) Aminoácidos del sitio activo
Sitio Activo del indol ILE 78; LEU 84; VAL 87; TYR 88; ALA 99; MET 102; VAL 103; THR 109; GLY 110; VAL 111: ALA 112: GLY 113; PHE 114; LEU 118; LEU 121; LEU 133;
PHE 153;
Hidrofílicas ‐
Hidrofóbicas C‐C ALA 99; VAL 111; LEU 118; LEU 121; PHE 153;
Puentes de
hidrógeno
‐
Hidrofóbicas polares LEU 84; ALA 99; MET 102; PHE 153;
Imagen 6: (185L) Interacciones Hidrofóbicas C-C [32]
Imagen 7: (185L) Interacciones hidrofóbicas polares [32]
Simulación en AutoDock® (185L)
Esta simulación se ejecutó realizando torsiones en 7 aminoácidos del sitio catalítico y fueron escogidos debido a las interacciones con tanto hidrofóbicas como hidrofílicas con el ligando y la proximidad de estos con el indol. Se les encontraron 22/32 enlaces rotables para hacer la simulación. Estos aminoácidos fueron los siguientes: LEU 84, ALA 99, MET 102, VAL 111, LEU 118, LEU 121, PHE 153
Imagen 8: (185L) Aminoácidos escogidos para efectuar rotaciones en AutoDock® [33]
Para hacer la simulación en AutoDock® se uso el algoritmo genético en el cual se usaron 250000 iteraciones con 7 aminoácidos seleccionados para realizar torsiones. Este cálculo tomo un tiempo 13 minutos 30.19segundos en un computador con un procesador Intel® CoreTM 2 Duo y una memoria RAM de 2GB.
Después de hacer el docking molecular se encontró que la conformación con menor energía de enlace fue la número 1 con un total de 19,64 kcal/mol. Estos datos se pueden observar en la Imagen 9 y los datos completos se observan en la tabla 4. Esta energía es bastante lógica ya que ni la macromolécula ni el ligando han sido alterados y es una energía negativa por lo cual se puede decir que esta asociación ocurre espontáneamente. Diez conformaciones más son propuestas y podemos ver la energía en la tabla 5. Sin embargo solo analizaremos la conformación que tenga la menor energía de enlace.
Imagen 9: (185L) La mejor conformación [34]
Tabla 4: (185L) Datos de la conformación con menor energía de enlace [34]
Energía de enlace (kcal/mol): ‐19,64 kI : 4,0 fM
Energía intermolecular : ‐3,19
Energía Interna : ‐17,74
Energía torsional : 0
Tabla 5: (185L) Energías de enlace de las otras posibles conformaciones [34]
Puesto: 2 ‐17,54 Puesto: 3 ‐16,84
Puesto: 4 ‐19,58
Puesto: 5 ‐16,33
Puesto: 6 ‐15,67
Puesto: 7 ‐18,54
Puesto: 8 ‐16,62
Puesto: 9 ‐15,81
De las 10 conformaciones, 3 las podemos agrupar usando una desviación de 2.0 rms (raíz media de cuadrados). Si aumentamos la desviación a 2.5, como vemos en la Imagen 10, vemos que se pueden agrupar 8 conformaciones. Debido a esto podemos decir que los resultados son bastante buenos ya que 8 conformaciones diferentes nos dan energías de enlace muy parecidas.
Imagen 10: (185L) Clusters (2.0 RMS) [34]
Imagen 11: (185L) Clusters (2.5 RMS) [34]
Los aminoácidos que se observan en la imagen 12 a los cuales se les realizaron torsiones para evaluar la energía de enlace. Para asegurarse que estas torsiones son permitidas se realizó el gráfico de Ramachandran (Imagen 13) el cual nos da información de los ángulos Psi y Phi para ver si están
en una zona permitida o no. Para asegurarnos que estos ángulos ya hayan estado en una zona permitida antes de la simulación en la Imagen 14 podemos ver el gráfico de Ramachandran de estos aminoácidos, antes de hacer la simulación. Como podemos ver todos los ángulos están en zonas permitidas por lo cual podemos validar la simulación hecha por AutoDock®.
Imagen 13: (185L) Gráfico de Ramachandran después de la simulación [33]
Imagen 14: (185L) Gráfico de Ramachandran antes de la simulación [33]
Como podemos ver en la Imagen 15 y en la Imagen 16 se puede sugerir que el docking se realizó de forma correcta ya que el ligando esta dentro del bolsillo catalítico interactuando con los
aminoácidos de este mismo. Las esferas en verde que se ven en la Imagen 16 son los átomos de la molécula de indol que son resaltados de esta forma para poder observar su posición en el sitio catalítico.
Imagen 15: (185L) Conformación con la menor energía del ligando interactuando con la
Imagen 16: (185L) Interacciones entre los aminoácidos seleccionados y el ligando (esferas
verdes) [34]
En la Imagen 17 vemos las interacciones, representadas por esferas, de los 7 aminoácidos del sitio catalítico.
Imagen 17: (185L) Interacciones del indol con los 7 aminoácidos del sitio catalítico [34]
4.5.2
Información
y
resultados
de
la
Enzima
2
(1EG9)
Tabla 6: (1EG9) Información básica de la enzima [30]
NAPHTHALENE 1,2‐DIOXYGENASE WITH INDOLE BOUND IN
THE ACTIVE SITE.
Autores Morton, A., Matthews Carredano, E., Karlsson, A., Kauppi, B., Choudhury, D., Parales, R.E., Parales, J.V., Lee, K., Gibson, D.T., Eklund, H., Ramaswamy, S. , B.W. Método Experimental Difracción de rayos X
Código PDB 1EG9
Fuente Pseudomona putida
Clasificación Oxidoreductasa
Formula
Ligandos
Indol C8 H7 N
FE2/S2 cluster (Inorgánico)
Fe2 S2
FE(III) ión Fe Ión sulfato SO4 Carredano, E., Karlsson, A., Kauppi, B., Choudhury, D.,
Parales, R.E., Parales, J.V., Lee, K., Gibson, D.T., Eklund,
H., Ramaswamy, S. (2000) Substrate binding site of
naphthalene 1,2‐dioxygenase: functional implications of
indole binding. J.Mol.Biol. 296: 701‐712 Coordenadas del sitio activo del indol: (13.71, 51.348, 82.159) (Imagen 18)
Imagen 18: (1EG9) Coordenadas del indol en la enzima (1EG9) [31]
En la Imagen 19 observamos la estructura terciaria de la enzima 1EG9 con sus respectivos ligandos. En este caso se va a trabajar solo con el indol como ligando.
Usando el programa RCSB PDB Ligando Explorer 3.2 se puede observar las interacciones hidrofóbicas C-C (Imagen 20), los puentes de hidrógeno (Imagen 21) y las Interacciones hidrofóbicas polares (Imagen 22) entre el indol y los aminoácidos del sitio catalítico de la enzima. Esto nos ayudara a evaluar posibles mutaciones que se le puedan hacer a la enzima para aumentar la afinidad por el indol. También se obtuvo la información de el sitio catalítico de esta y el tipo de interacción con el ligando (tabla 7). Los aminoácidos escogidos, para hacer torsiones en la simulación de AutoDock®, por su proximidad e interacciones con el ligando fueron: ASN201, ASP205, ASN 297.
Imagen 19: (1EG9) Ligandos [32]
Los aminoácidos escogidos, para hacer torsiones en la simulación de AutoDock®, por su proximidad e interacciones con el ligando fueron: ASN201, ASP205, ASN 297. Esto nos da un total de 9/32 enlaces rotables.
Tabla 7: (1EG9) Aminoácidos del sitio activo
Sitio Activo del indol ASN 201; ASP 205; HIS 208; VAL 209; VAL 252; LEU 253; HIS 295; LEU 296; ASN 297; LEU 307;
Hidrofílicas ‐
Puentes de hidrógeno VAL 252; LEU 253; LEU 296; ASN 297;
Hidrofóbicas polares ASN 201; ASP 205; HIS 208; ASN 297;
Imagen 20: (1EG9) Interacciones Hidrofóbicas C-C [32]
Imagen 21: (1EG9) Puentes de Hidrógeno [32]
Imagen 22: (1EG9) Interacciones Hidrofóbicas polares [32]
Simulación en AutoDock® (1EG9)
Esta simulación se ejecutó realizando torsiones en 3 aminoácidos del sitio catalítico con un total 6/32 enlaces rotables. Estos fueron ASN 201; ASP 205; ASN 297 y se pueden ver en la Imagen 23:
Imagen 23: (1EG9) Aminoácidos escogidos para efectuar rotaciones en AutoDock® [33]
Después de hacer la simulación se encontró que la conformación que tiene la menor energía de enlace es la conformación nueve con una energía de enlace de 6,18kcal/mol. El tiempo de la simulación 6 minutos y 13,92 segundos en un computador con un procesador Intel® CoreTM 2 Duo y una memoria RAM de 2GB. Estos datos se pueden observar en la Imagen 24 y los datos completos se observan en la tabla 8. Diez conformaciones más son propuestas y podemos ver la energía en la tabla 9. Sin embargo solo analizaremos la conformación que tenga la menor energía de enlace.
Imagen 24: (1EG9) La mejor conformación [34]
Tabla 8: (1EG) Datos de la conformación con menor energía de enlace [34]
Energía de enlace (kcal/mol): ‐6,36 kI : 21,94uM
Energía intermolecular : ‐3,96
Energía Interna : ‐2,96
De las 10 conformaciones, 3 las podemos agrupar usando una desviación de 2.0 rms (raíz media de cuadrados). Si aumentamos la desviación a 2.5, como vemos en la Imagen 25, vemos que se pueden agrupar 2 grupos de 5 conformaciones. Debido a esto podemos decir que los resultados son bastante buenos ya que 5 conformaciones diferentes nos dan energías de enlace muy parecidas.
Imagen 25: (1EG9) Clusters (2.0 RMS) [34] Tabla 9: Energía de las otras posibles conformaciones [34]
Puesto: 2 ‐6,3 Puesto: 3 ‐6,26
Puesto: 4 ‐6,32
Puesto: 5 ‐6,13
Puesto: 6 ‐6,29
Puesto: 7 ‐6,2
Puesto: 8 ‐6,18
Puesto: 9 ‐6,17
